PL221899B1 - Czysta albumina oraz sposób jej otrzymywania i detekcji - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Albumina surowicza wołowa (BSA) jest jednym z najtańszych handlowo dostępnych białek. Ma szerokie zastosowanie, jako modelowe białko w badaniach podstawowych [1-4] i szeregu praktycznych aplikacjach [5-18]. Mieszanina wolnych aminokwasów uzyskana w wyniku hydrolizy BSA jest powszechnie stosowana jako standard do określania zawartości aminokwasów w badanych białkach. Komercyjna BSA używana do tego celu jest dostatecznie czysta, pomimo możliwej zawartości zanieczyszczeń cukrowych. W wyniku hydrolizy substancje domieszkowe podlegają degradacji i nie przeszkadzają w analizie aminokwasów. Albumina jest transporterem kwasów tłuszczowych i innych substancji hydrofobowych w krążeniu. Przed aplikacją BSA do badań celowe jest zatem usuwanie hydrofobowych zanieczyszczeń za pomocą charkoalu. BSA jest wykorzystywane w detekcji białka GFP (Green fluorescent protein) pozwalając na ultraczułe fluorescencyjne obrazowanie badanych komórek [6]. Modyfikowaną BSA koniugowaną na powierzchni kropek kwantowych zastosowano w analitycznej detekcji jonów metali [7]. Ponieważ białko to okazało się efektywnym nośnikiem fotouczulaczy użytecznych w terapii fotodynamicznej, można je wykorzystywać jako transporter aktywnych czynników w terapii chorób zapalnych i nowotworowych [9-12]. Ponadto, jako nośnik małych cząsteczek. BSA wzmaga immunogenność przyłączonych związków, co pozwala uzyskać wysokoczułe i specyficzne przeciwciała potrzebne do detekcji małocząsteczkowych substancji w testach ELISA [13,14]. BSA jest także wykorzystywana w konstruowaniu koniugowanych szczepionek. Po związaniu z białkiem antygenów polisacharydowych można otrzymać skuteczne i bezpieczne szczepionki przeciwko patogenom. W podobnym systemie BSA jest również wykorzystywana w terapii nowotworów [15-18]. W takich zastosowaniach powinna być używana BSA o wysokim stopniu czystości, szczególnie pozbawiona zanieczyszczeń węglowodanami. Wcześniejsze doniesienia wskazują na obecność w komercyjnych preparatach BSA wysokocząsteczkowych pochodnych [19]. Wysokospolimeryzowane agregaty mogą być tworzone w wyniku reakcji białka z reaktywnymi związkami karbonylowymi w procesie glikacji [20-23]. Ryzyko pojawienia się takich agregatów jako zanieczyszczeń jest możliwe. jeśli w środowisku białka obecne są cukry redukcyjne. Szereg doniesień wskazuje, że białka są glikowane przez fruktozę, glukozę, galaktozę, laktozę i dekstran podczas modyfikacji termicznej w warunkach suchych oraz w formulacjach w postaci suchego pudru [24-27]. Fischer i współprac, analizował produkty glikacji różnych terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych podczas ich przechowywania w formulacjach zawierających bufor ze składnikami cukrowymi oraz po krótkotrwałej inkubacji tych białek w workach infuzyjnych z dekstrozą, pospolicie używanych w praktyce klinicznej do podawania białek terapeutycznych [28]. Zaobserwowano naturalną glikację komercyjnej BSA [19]. Albumina ławo ulega glikacji in vivo jako najbardziej pospolite białko osocza [29,30]. Proces agregacji obserwowano także podczas reakcji BSA z aldoheksozami w syntezie wysokotemperaturowej w warunkach suchych [31]. Produkty zaawansowanej glikacji wykryto po inkubacji BSA z glukozą i fruktozą [25,29,31,32]. Analiza GLC-MS zanieczyszczonych cukrami komercyjnych preparatów BSA wykazała obecność octanów alditolu, ujawniając obecność mannozy, glukozy i galaktozy w molowych proporcjach 1:1.6:1. odpowiednio. Występowanie galaktozy w BSA po jej inkubacji z laktozą opisano we wcześniejszym doniesieniu [26]. Znane są różnorodne metody izolowania białek, wykorzystujące różnice w wielkości cząsteczek białkowych [19], w ich ładunku powierzchniowym [33], w powinowactwie do określonego nośnika [34]. W literaturze przedmiotu nie są znane sposoby wydzielania z komercyjnych BSA czystej monomerycznej albuminy. Pomimo podawanej w charakterystyce odczynnika około 98% czystości określanej w analizie elektroforetycznej w żelu agarozowym, wykrywane są w preparatach komercyjnych w warunkach elektroforezy denaturującej w żelu poliakrylamidowym (SDS/PAGE) [35] pochodne białkowe o wyższych ciężarach cząsteczkowych. Korzystne jest zatem określanie czystości preparatu BSA metodą elektroforezy SDS/PAGE. Znane jest występowanie wysokocząsteczkowych produktów białkowych w preparacie handlowym - frakcji V Cohna (Sigma, A7888, Polska) [19], Opisano oddzielenie monomeru BSA od takich wyżej cząsteczkowych agregatów białkowych metodą frakcjonowania w kolumnie wypełnionej żelem dekstranowym Sephadex G-200 (Pharmacia, Szwecja), zrównoważonym PBS (phosphate-buffered saline) pH 7,5 zawierającym 0,02% NaN3 w temperaturze pokojowej

[19], Wykazano jednak obecność w uzyskanym produkcie 0,25% zanieczyszczeń cukrowych [19]. Niekorzystne jest zatem stosowanie żelu Sephadex G-200 jako sita molekularnego, ponieważ zanieczyszczenie cukrami izolowanego białka wzrasta wskutek możliwego udziału cząsteczek dekstranu pochodzących z żelu, w modyfikacji białka i innych reakcjach. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, BSA może ulegać modyfikacji przez dekstran w reakcji Maillarda i tworzyć koniugaty BSA-dekstran

PL 221 899 B1 o różnych ciężarach cząsteczkowych [36]. Obecność cukrowych zanieczyszczeń i wysokocząsteczkowych pochodnych w dostępnych komercyjnych preparatach BSA wyklucza wykorzystywanie takich reagentów w badaniach podstawowych w obszarze biologii molekularnej. W tym celu niezbędne jest opracowanie prostej metody otrzymywania albuminy BSA z preparatów handlowych monomerycznej pozbawionej domieszek cukrowych. Nieoczekiwanie przedstawiony problem rozwiązał prezentowany wynalazek.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest czysta do analizy monomeryczna surowicza albumina wołowa, pozbawiona wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych, oznaczana elektroforetycznie w SDS/PAGR w 12% żelu rozdzielającym. W korzystnej realizacji wynalazku średnica cząstek BSA wynosi zasadniczo 7 nm.

Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania monomerycznej surowiczej albuminy charakteryzujący się tym że obejmuje: a) przygotowanie próbki preparatu BSA: b) oczyszczanie chromatograficzne otrzymanej próbki z etapu a) na żywicy HW-55, zrównoważonej buforem, korzystnie 0,1 M buforem octanowym o pH 5,65 zawierającym 1% n-butanolu. za pomocą buforu równoważącego. W korzystnej realizacji wynalazku etap a) zawiera usunięcie ligandów hydrofobowych, korzystnie poprzez przepuszczanie próbki przez charakoal. W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku oczyszczanie w etapie b) zachodzi w temperaturze pokojowej z szybkością 1,2 ml/10 min.

Trzecim przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji próbki zawierającej czystą do analizy monomeryczną surowiczą albuminę wołową, pozbawioną wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych, polegający na tym, że przeprowadza się pomiar średnicy cząstek surowiczej albuminy wołowej w próbce za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, charakteryzujący się tym, że przeprowadza się dodatkowo analizę elektroforetyczną w SDS/PAGE oraz analizę zanieczyszczeń cukrowych, przy czym średnica cząstek wynosząca około 7 nm wskazuje, że próbka zawiera czystą do analizy monomeryczną surowiczą albuminę wołową, pozbawioną wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych.

Główną zaletą monomerycznej frakcji BSA otrzymanej według wynalazku jest homogenność uzyskanego białka i brak zanieczyszczeń cukrowych. Jednorodność otrzymanego białka określaną konwencjonalną metodą elektroforezy denaturującej potwierdzono dodatkowo, wyznaczając w uzyskanych z kolumny HW-55S frakcjach białkowych średnice ich cząsteczek metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) [37]. Wartości rozmiarów cząsteczek potwierdzały obecność monomerycznej BSA i odpowiadały wcześniejszym doniesieniom literaturowym [38]. Korzystna jest identyfikacja otrzymanego monomeru BSA metodą DLS ze względu na możliwość określania tą metodą również stopnia jednorodności (%) uzyskanych frakcji albuminy. Istotną zaletą jest mniejsza czasochłonność metody w porównaniu z analizą czystości w elektroforezie SDS/PAGE. Korzystne jest użycie metody fenolowej w warunkach kwaśnych [39], do określania całkowitej zawartości cukrów w uzyskanej frakcji monomeru BSA. Brak zanieczyszczeń cukrowych w otrzymanym preparacie stanowi o przewadze metody będącej przedmiotem wynalazku, nad dwoma innymi sposobami wydzielania monomeru albuminy wołowej, opisanymi w przykładach jako niekorzystne. Dodatkową zaletą wydzielania monomeru BSA z preparatów komercyjnych wg wynalazku jest prosta metodyka i niski koszt realizacji.

Przykłady realizacji wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia profile elucji BSA komercyjnej (Sigma-Aldrich A3294): A) po chromatografii na HW-55S; B) po filtracji żelowej na Sephadex G-200; C) chromatografii anionowymiennej na DEAE-Sephadex A-50, fig. 2 przedstawia analizę SDS/PAGE w 12% żelu rozdzielającym próbki BSA, gdzie: ścieżka 1) standardy białkowe ciężarów cząsteczkowych: 2) 6 pg komercyjnej próbki BSA (Sigma-Aldrich A3294): ścieżki 3) i 4), odpowiednio: po 3 pg frakcji A i B uzyskanych po HW-55S chromatografii: ścieżka 5) 6 pg frakcji C eluowanej z kolumny HW-55S; ścieżka 6) i 7) odpowiednio, po 2 pg frakcji A and B po kolumnie Sephadex G-200; ścieżka 8) 3 pg frakcji C uzyskanej po frakcjonowaniu w Sephadex G-200; ścieżki 9), 10) and 11) odpowiednio, po 2 pg frakcji 90-100, 115-123 and 124-150 po oczyszczaniu na DEAE-Sephadex A-50, fig. 3 przedstawia badania metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) rozmiarów cząsteczek białkowych i stopnia oczyszczania albuminy wołowej w uzyskanych w chromatograficznym oczyszczaniu na HW-55S frakcjach. A) Średnice cząsteczek białka eluowanego z kolumny: linią ciągłą z czarnymi trójkątami przedstawiono absorbancję A280 jako miarę ilości białka we frakcji, linia ciągła z czarnymi kwadratami ilustruje średnice cząsteczek, linią przerywaną zaznaczono średnicę 7 nm jako referencyjną albuminy wołowej. B) Określanie stopnia czystości (w %) frakcji białkowych - szare słupki frakcji 58-60 przedstawiają białko o średnicy referencyjnej albuminy wołowej (7 nm) i o 100% czystości, a fig. 4 przedstawia elektroforezę w 12% SDS/PAGE produktów

PL 221 899 B1 modyfikacji BSA oligosacharydem rdzeniowym (modyfikacja białka 200-krotnym molowym nadmiarem oligosacharydu przez 16 godzin w 37°C): ścieżka 1 - standardy białkowe ciężaru cząsteczkowego: 2 - komercyjna BSA inkubowana z oligosacharydem; na ścieżkach 3 - i 4 - kontrolne próbki, odpowiednio, komercyjnej i monomerycznej BSA (uzyskana po oczyszczaniu w kolumnie HW 55-S) inkubowane w tych samych warunkach bez oligosacharydu, ścieżka 5 - monomer BSA modyfikowany oligosacharydem.

Przedmiot wynalazku przedstawiono w przykładach wydzielania monomeru BSA z preparatu handlowego Sigma-Aldrich (frakcja V Cohna, A3294 o ponad 98% czystości określonej przez producenta metodą elektroforezy agarozowej). Przed frakcjonowaniem chromatograficznym próbki komercyjnej BSA przepuszczano przez charkoal w celu usunięcia potencjalnych ligandów hydrofobowych, głównie kwasów tłuszczowych. Poziom cukrów określonych metodą fenolową w komercyjnej BSA wynosił 0,7% (Tab. 1).

P r z y k ł a d 1.

Sposób wydzielania monomeru BSA z próbki komercyjnego preparatu w kolumnie z żywicą

HW-55S

Na szczyt kolumny (1,6x100 cm) wypełnionej żywicą HW-55S (Toyopearl, Tosh Bioscience) zrównoważonej 0,1 M buforem octanowym pH 5,65 zawierającym 1% n-butanol naniesiono 60 mg BSA komercyjnej. Potwierdzono w analizie 12% SDS/PAGE polidyspersyjność prepartu handlowego: oprócz monomerycznej albuminy o ciężarze cząsteczkowym 69 kDa obserwowano obecność agregatów o Mw ponad 200 kDa oraz niżejcząsteczkowe pochodne (fig. 2, ścieżka 2). Białko eluowano z kolumny buforem równoważącym, w temperaturze pokojowej, z szybkością 1,2 ml/10 min. We frakcjach wypływających z kolumny w szczycie D (fig. 1A) występowało homogenne białko o ruchliwości elektroforetycznej odpowiadającej albuminie (ciężar cząsteczkowy 69 kDa), co wykazano w analizie elektroforetycznej w 12% SDS/PAGE (fig. 2, ścieżka 5). Wydzielone białko identyfikowano jako albuminę nową metodą, określając średnicę cząsteczek białkowych metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) w analizatorze Zeta-seizer NanoZS (Malvern, GB). Średnica cząsteczek obserwowanych we frakcjach 53-58 zebranych z kolumny HW-55S wynosiła 7 nm (fig. 3, linia ciągła z czarnymi kwadratami), co odpowiada danym literaturowym dla monomerycznej BSA [39].

Wykonana metodą fenolową analiza całkowitej zawartości cukrów w otrzymanych frakcjach wykazała brak zanieczyszczeń cukrowych (Tab. 1).

P r z y k ł a d 2.

Sposób wydzielania monomeru BSA z próbki komercyjnego preparatu metodą sączenia molekularnego w żelu polidekstranowym Sephadex G-200 (Amersham Pharmacia).

Próbkę 50 mg komercyjnej BSA nanoszono na szczyt kolumny Sephadex G-200 zrównoważonym PBS (phosphate-buffered saline) pH 7,5 zawierającym 0,02% NaN3. Elucję białka wykonywano buforem równoważącym w temperaturze pokojowej, z prędkością 1,2 ml/15 min. Na niejednorodność komercyjnej BSA wskazuje profil elucji białka z kolumny - frakcje albuminy wypływały w trzech szczytach białkowych (fig. 1B). Analiza SDS/PAGE wykazała, że monomer BSA znajdował się w szczycie C (fig. 2, ścieżka 8). Stanowił on 60% masy nanoszonego preparatu komercyjnego. Wykryta metodą analizy fenolowej zawartość ok. 1% domieszki cukrowej w otrzymanym białku monomerycznym była nieco wyższa, niż w próbce komercyjnej (Tab. 1), co sugeruje, że jest tak wskutek pojawienia się zanieczyszczeń dekstranem. Wskazuje to na nieprzydatność metody sączenia molekularnego w żelu Sephadex G-200 do uzyskiwania czystego monomeru BSA.

P r z y k ł a d 3.

Sposób wydzielania monomeru BSA z próbki komercyjnego preparatu metodą chromatografii jonowymiennej na anionicie DEAE-Sephadex A-50 (Amersham Pharmacia).

Kolumnę (3x25 cm) wypełnioną anionitem DEAE-Sephadex A-50 zrównoważono 0,02 M buforem fosforanowym pH 8,0 i naniesiono 600 mg BSA komercyjnej rozpuszczonej w 1 ml buforu równoważącego. Związaną z wymieniaczem albuminę wymywano w gradiencie stężeń 0,02-0,03 M fosforanu pH 8,0. Białko wypływające z szybkością 1 ml/20 min, przy niższym zakresie stężeń buforu elucyjnego, w szczycie A (Rys. 1C) było jednorodne elektroforetycznie (fig. 2, ścieżka 9). W analizie w 12% SDS/PAGE wykazano, że wysokocząsteczkowe agregaty białkowe handlowej próbki eluowano przy większym gradiencie stężeń fosforanu, w szczycie C (fig. 2, ścieżka 11). Prawdopodobnie, w wyniku nieenzymatycznej modyfikacji białek przez węglowodany w procesie glikacji, powstające pochodne białkowe mają bardziej ujemny ładunek (dostępne reszty aminokwasów zasadowych zostały zablokowane przez czynnik glikujący) i zostają silniej związane z anionitem.

PL 221 899 B1

Całkowita zawartość cukrów w frakcjach zebranych w szczycie A, określona metodą fenolową wynosiła 0,9% (Tab. 1) Z tego względu użycie wymieniacza anionowego typu DEAE-Sephadex jest nieprzydatne w otrzymywaniu czystego monomeru BSA.

P r z y k ł a d 4.

Znaczenie wynalazku objaśnione jest na przykładzie wykorzystania monomeru BSA w tworzeniu glikokoniugatów z oligosacharydem rdzeniowym lipopolisacharydu bakterii Shigella sonnei PhII.

Próbkę komercyjnej BSA i monomerycznej albuminy (otrzymanej po frakcjonowaniu na HW-55S) inkubowano z oligosacharydem bakteryjnym (relacja molowa białka do oligosacharydu 1:200) w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Warunki modyfikacji dobrano na podstawie wcześniejszych doniesień [22.23] i produkty reakcji analizowano elektroforetycznie w SDS/PAGE w 12% żelu rozdzielającym. W próbce monomeru BSA inkubowanej z oligosacharydem obserwuje się glikokoniugaty, podczas gdy inkubacja kontrolnej próby bez oligosacharydu nie generuje takich produktów (fig. 4, ścieżka 5 i 4 odpowiednio). W wyniku modyfikacji handlowego preparatu BSA otrzymano glikokoniugaty o Mw w zakresie 130-530 kDa, widoczne na ścieżce 2 w Rys. 4. Podobny skład pochodnych, chociaż o nieco niższej intensywności, obserwowano w kontrolnej próbie komercyjnej nie traktowanej oligosacharydem (fig 4, ścieżka 3). Zatem stosowanie komercyjnej BSA jako białka modelowego w badaniach modyfikacji białek powinno być wykluczone ze względu na duże zafałszowanie wyników. Tylko oczyszczony monomer BSA pozwała uzyskać prawidłowe rezultaty: z tego względu wskazane jest wykorzystywanie żywicy HW-55S do jego izolowania z preparatu handlowego.

T a b e l a 1

Zawartość całkowita cukrów w próbkach BSA

próbka	zawartość cukrów (%)
Komercyjna BSA (Sigma-Aldrich A3294)	0,7
BSA monomeryczna po Sephadex G-200	1,0
BSA monomeryczna po DEAE Sephadex	0,9
BSA monomeryczna po HW-55S	0

REFERENCJE:

[1] T. Chakraborty, I. Chakraborty, S.P. Moulik. S. Ghosh, Physicochemical and conformational studies on BSA-surfactant interaction in aqueous medium, Langmuir 25 (2009) 3062-3074.

[2] H. Yoneyama, M. Yamashita, S. Kasai. K. Kawase. R. Ueno, H. Ito, T. Ouchi. Terahertz spectroscopy of native-conformational and thermally denatured bovine serum albumin (BSA), Phys. Med. Biol. 53 (2008) 3543-3549.

[3] L. Jin, Y.X. Yu, G. H. Gao, A molecular-thermodynamic model for the interactions between globular proteins in aqueous solutions: applications to bovine serum albumin (BSA), lysozyme, alpha-chymotrypsin. and immune-gamma-globulins (IgG) solutions. J. Colloid Interface Sci. 304 (2006) 77-83.

[4] A.E. Ategria, P. Sanchez-Cruz, A. Kumar. C. Garcia, F. A. Gonzalez, A. Orellano, B. Zayas,

M. Gordializa, Thiols oxidation and covalent binding of BSA by cyclolignanic quinones are enhanced by the magnesium cation, Free Radical Res. 42 (2008) 70-81.

[5] J. R. Brown, Albumin structure, function and uses (Rosenover, V. M., Oratz, M., Rothschild, M. A. Eds.), Pergamon Press. (1977) Oxford, UK.

[6] Q. Pan, M. Zhao, S. Liu, Combination of on-chip field amplification and bovine serum albumin sweeping for ultrasensitive detection of green fluorescent protein, Anal. Chem. 81 (2009) 5333 -5341.

[7] J. H. Wang. H. Q. Wang, H. L. Zhang, X. Q. Li., X. F. Hua, Y. C. Cao, Z. L. Huang, Y. D.

Zhao, Purification of denatured bovine serum albumin coated CdTe quantum dots for sensitive detection of silver(l) ions, Anal. Bioanal. Chem. 388 (2007) 969-974.

[8] E. Alarcón, A. M. Edwards. A. M. Garcia. M. Muńoz, A. Aspee, C. D. Borsarelli, F. A. Lissi, Photophysics and photochemistry of zinc phthalocyanine/bovine serum albumin adducts, Photochem. Photobiol. Sci. 8 (2009) 255-263.

[9] J. Kang, O. Lambert, M. Ausborn, S. P. Schwenderman. Stability ofproteins encapsulated in injectable and biodegradable poly(lactide-co-glycolide)-glucose millicylinders, Int. J. Pharm. 357 (2008) 235-243.

PL 221 899 B1

[10] J. Li, P. Yao, Self-assembly of ibuprofen and bovine serum albumin-dextran conjugates leading to effective loading of the drug, Langmuir 25 (2009) 6385-6391.

[11] N. Seedher, S. Bhatia, Complexation of cox-2 inhibitors with bovine serum albumin: interaction mechanism, Pharm. Dev. Technol 14 (2009) 343-349.

[12] L. Yang, F. Cui, D. Cun, A. Tao, K. Shi, W. Lin, Preparation, characterization and biodistribution of the lactone form of 10-hydroxycamptothecin (HCPT)-loaded bovine serum albumin (BSA) nanoparticles, Int. J. Pharm. 340 (2007) 163-172.

[13] P. Branaa, J. Naar, M. Chinain, S. Pauillac, Preparation and characterization of domoic acid-protein conjugates using small amount of toxin in a reversed micellar medium: application in a competitive enzyme-linked immunosorbent assay, Bioconjug. Chem. 10 (1999), 1137-1142.

[14] J. Das Sarma, C. Duttagupta, E. Ali, T. K. Dhar, T. K. Antibody to folic acid: increased specificity and sensitivity In ELISA by using ε-aminocaproic acid modified BSA as the carrier protein,

J. Immunol. Methods 184 (1995) 1-6.

[15] Paulovicovά, J. Korcovά, P. Farkas, S. Bystricky. Immunological efficacy of glycoconjugates derived from Vibrio cholerae Ol serotypc Ogawa detoxified LPS in mice, J Med Microbiol. 59 (2010), 1440-1448.

[16] P. Farkas, J. Korcovά, J. Kronek, S. Bystricky, Preparation of synthetic polyoxazoline based carrier and Vibrio cholerae O-specific polysaccharidc conjugate vaccine, Eur J Med Chem. 45 (2010) 795-799.

[17] J. B. Robbins, J. Kijbler-Kielb, E. Vinogradov, C. Mocca, V. Pozsgay, J. Shiloach, R. Schneerson, Synthesis, characterization, and immunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific oligosaccharide-core-protcin eonjugates, Proc Natl Acad Sci USA. 106 (2009) 7974-7978.

[18] J. F. Vljegenthart, Carbohydrate based vaccines, FEBS Lett. 580 (2006) 2945-2950.

[19] M. Staniszewska, S. Jarosz, M. Jon, A. Gamian, Advanced glycation end-products prepared in solution under high pressure contain epitopes distinct from those formed in the dry reaction at high temperature, Arch. Immunol. Ther. Exp. 53 (2005) 71-78.

[20] S. Thorpe, J.W. Baynes, Maillard reaction products in tissue proteins: new products and new perspectives, Amino Acids 25 (2003) 275-281.

[21] P. Ulrich, A. Cerami, Protein glycation, diabetes, and aging, Recent Prog. Horm. Res. 56 (2001) 1-21.

[22] J. Pietkiewicz, A. Gamian, M. Staniszewska, R. Danielewicz, Inhibition of human muscle-specific enolase by methylglyoxal and irreversible formation of advanced glycation end products, J. Enyme Inhib. Med. Chem. 24 (2009) 356-364.

[23] J. Pietkiewicz, A. Bronowicka-Szydełko, K. Dzierzba. R. Danielewicz A. Gamian. Glycation of the muscle-specific enolase by reactive carbonyls: effect of temperature and the protection role of czarnosine, pirydoxamine and phosphatidylserine, Prot J. in press, (2011) DOI: 10.1007/s10930-011-9307-3.

[24] A.l. Ledesma-Osuna, G. Ramos-Clamont, L. Vάzquez-Moreno, Characterization of bovine serum albumin glycated with glucose, galactose and lactose, Acta Biochim. Pol. 55(2008) 491-497.

[25] U. Kańska. J. Boratyński, Thermal glycation of proteins by D-glucose and D-fructose, Arch. Immunol. Ther. Exp. 50 (2002) 61-66.

[26] J. Boratyński, R. Roy, High temperature conjugation of proteins with carbohydrates, Glycoconj. J. 15 (1998) 131-138.

[27] C. P. Quan, S. Wu, N. Dasovich, C. Hsu, T. Patapaff, E, Canova-Davis, Susceptibility of rhDNase to glycation in the dry-powder state, Anal. Chem. 71 (1999) 4445-4454.

[28] S. Fisher, J. Hoernschemeyer, H. C. Mahler, Glycation during storage and administration of monoclonal antibody formulations, Eur. J. Pharm. Biopharm. 70 (2008) 42-50.

[29] D. J. S. Hinton, J. M. Ames, Site specificity of glycation and carboxymethylation of bovine serum albumin by fructose, Amino Acids 30 (2006) 425-433.

[30] T. J. Wu, M. C. Tu, P. Zhung. P, Advanced glycation end product (AGE): characterization of the products from the reaction between D-glucose and serum albumin, J. (Clin. Lab. Anal. 10 (1996) 21-34.

[31] J. Rangsansarid, N. Cheetangdee, N. Kinoshita, K. Fukuda, Bovine serum albumin-sugar conjugates through the Maillard reaction: effects on interfacial behavior and emulsifying ability. J. Oleo Sci. 57 (2008) 539-547.

PL 221 899 B1

[32] F. K. Yeboah, Z. Alli, V. A. Yaylayan, Reactivities of D-glucose and D-fructose during glycation of bovine serum albumin, J. Agric. Food Chem. 47 (1999), 3164-3172.

[33] I. Bednarz-Misa, J. Pietkiewicz, T. Banaś. A. Gamian. Enolase from Klebsiella pneumoniae and human muscle cells. I. Purification and comparative molecular studies, Adv Clin Exp Med. 18 (2009) 71-78

[34] D. Witkowska, J. Pietkiewicz, B. Szostko, R. Danielewicz, L. Masłowski, A. Gamian, Antibodies against human muscle enolase recognize a 45-kDa bacterial cell wall outer membrane enolase-like protein, FEMS Immunol Med. Mierobiol. 42 (2005) 53-62.

[35] U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature (London) 227 (1970) 680-685.

[36] S. H. Jung, S. J. Choi, H. J. Kim T. W. Moon, Molecular characteristics of bovine serum albumin-dextran eonjugates, Biosci. Biotechnol. Biochem. 70 (2006) 2064-2070.

[37] T. Hushcha, A. Luik, Y. Naboka, Conformation changes of albumin in its interaction with physiologically active compounds as studied by quasi-elastic light scattering spectroscopy and ultrasonic method, Talanta, 53 (2000) 29-34.

[38] G. Navarra, A. Tinti, M. Leone, V. Militello, A. Torreggiani, Influence of metal ions on themial aggregation of bovine serum albumin: aggregation kinetics and structural changes, J Inorg Bioehem. 103 (2009) 1729-3178.

[39] M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers, F. Smith, Colorimetric method for determination of sugar and related substances, Anal. Chem. 28 (1956) 350-356.

Claims (6)

Zastrzeżenia patentowe

1. Czysta do analizy monomeryczna surowicza albumina wołowa, pozbawiona wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych, oznaczana elektroforetycznie w SDS/PAGE w 12% żelu rozdzielającym.

2. Czysta do analizy monomeryczna surowicza albumina wolowa według zastrz. 1, znamienna tym, że średnica cząstek BSA wynosi zasadniczo 7 nm.

3. Sposób otrzymywania monomerycznej surowiczej albuminy, znamienny tym, że obejmuje:

a) przygotowanie próbki preparatu BSA,

b) oczyszczanie chromatograficzne otrzymanej próbki z etapu a) na żywicy HW-55, zrównoważonej buforem, korzystnie 0,1 M buforem octanowym o pH 5,65 zawierającym 1% n-butanolu, za pomocą buforu równoważącego.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że etap a) zawiera usunięcie ligandów hydrofobowych, korzystnie poprzez przepuszczanie próbki przez charakoal.

5. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że oczyszczanie w etapie b) zachodzi w temperaturze pokojowej z szybkością 1,2 ml/10 min.

6. Sposób identyfikacji próbki zawierającej czystą do analizy monomeryczną surowiczą albuminę wołową, pozbawioną wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych, polegający na tym, że przeprowadza się pomiar średnicy cząstek surowiczej albuminy wołowej w próbce za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, znamienny tym, że przeprowadza się dodatkowo analizę elektroforetyczną w SDS/PAGE oraz analizę zanieczyszczeń cukrowych, przy czym średnica cząstek wynosząca około 7 nm wskazuje, że próbka zawiera czystą do analizy monomeryczną surowiczą albuminę wołową, pozbawioną wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych.