PL221899B1 - Czysta albumina oraz sposób jej otrzymywania i detekcji - Google Patents
Czysta albumina oraz sposób jej otrzymywania i detekcjiInfo
- Publication number
- PL221899B1 PL221899B1 PL394784A PL39478411A PL221899B1 PL 221899 B1 PL221899 B1 PL 221899B1 PL 394784 A PL394784 A PL 394784A PL 39478411 A PL39478411 A PL 39478411A PL 221899 B1 PL221899 B1 PL 221899B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bsa
- serum albumin
- sample
- bovine serum
- protein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 title description 11
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 title description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims abstract description 71
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 15
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 13
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 11
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 3
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 16
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 16
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 15
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 11
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010058936 Cohn fraction V Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 alditol acetates Chemical class 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000540 fraction c Anatomy 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101100350744 Arabidopsis thaliana PAGR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101000878457 Macrocallista nimbosa FMRFamide Proteins 0.000 description 1
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001312 aldohexoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 150000001728 carbonyl compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002019 doping agent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
- Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
- Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest czysta monomeryczna surowicza albumina wołowa, sposób jej otrzymywania charakteryzujący się zastosowaniem chromatografii kolumnowej wypełnionej żywicą oraz sposób identyfikacji wykorzystujący metodę dynamicznego rozpraszania światła.
Description
Opis wynalazku
Albumina surowicza wołowa (BSA) jest jednym z najtańszych handlowo dostępnych białek. Ma szerokie zastosowanie, jako modelowe białko w badaniach podstawowych [1-4] i szeregu praktycznych aplikacjach [5-18]. Mieszanina wolnych aminokwasów uzyskana w wyniku hydrolizy BSA jest powszechnie stosowana jako standard do określania zawartości aminokwasów w badanych białkach. Komercyjna BSA używana do tego celu jest dostatecznie czysta, pomimo możliwej zawartości zanieczyszczeń cukrowych. W wyniku hydrolizy substancje domieszkowe podlegają degradacji i nie przeszkadzają w analizie aminokwasów. Albumina jest transporterem kwasów tłuszczowych i innych substancji hydrofobowych w krążeniu. Przed aplikacją BSA do badań celowe jest zatem usuwanie hydrofobowych zanieczyszczeń za pomocą charkoalu. BSA jest wykorzystywane w detekcji białka GFP (Green fluorescent protein) pozwalając na ultraczułe fluorescencyjne obrazowanie badanych komórek [6]. Modyfikowaną BSA koniugowaną na powierzchni kropek kwantowych zastosowano w analitycznej detekcji jonów metali [7]. Ponieważ białko to okazało się efektywnym nośnikiem fotouczulaczy użytecznych w terapii fotodynamicznej, można je wykorzystywać jako transporter aktywnych czynników w terapii chorób zapalnych i nowotworowych [9-12]. Ponadto, jako nośnik małych cząsteczek. BSA wzmaga immunogenność przyłączonych związków, co pozwala uzyskać wysokoczułe i specyficzne przeciwciała potrzebne do detekcji małocząsteczkowych substancji w testach ELISA [13,14]. BSA jest także wykorzystywana w konstruowaniu koniugowanych szczepionek. Po związaniu z białkiem antygenów polisacharydowych można otrzymać skuteczne i bezpieczne szczepionki przeciwko patogenom. W podobnym systemie BSA jest również wykorzystywana w terapii nowotworów [15-18]. W takich zastosowaniach powinna być używana BSA o wysokim stopniu czystości, szczególnie pozbawiona zanieczyszczeń węglowodanami. Wcześniejsze doniesienia wskazują na obecność w komercyjnych preparatach BSA wysokocząsteczkowych pochodnych [19]. Wysokospolimeryzowane agregaty mogą być tworzone w wyniku reakcji białka z reaktywnymi związkami karbonylowymi w procesie glikacji [20-23]. Ryzyko pojawienia się takich agregatów jako zanieczyszczeń jest możliwe. jeśli w środowisku białka obecne są cukry redukcyjne. Szereg doniesień wskazuje, że białka są glikowane przez fruktozę, glukozę, galaktozę, laktozę i dekstran podczas modyfikacji termicznej w warunkach suchych oraz w formulacjach w postaci suchego pudru [24-27]. Fischer i współprac, analizował produkty glikacji różnych terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych podczas ich przechowywania w formulacjach zawierających bufor ze składnikami cukrowymi oraz po krótkotrwałej inkubacji tych białek w workach infuzyjnych z dekstrozą, pospolicie używanych w praktyce klinicznej do podawania białek terapeutycznych [28]. Zaobserwowano naturalną glikację komercyjnej BSA [19]. Albumina ławo ulega glikacji in vivo jako najbardziej pospolite białko osocza [29,30]. Proces agregacji obserwowano także podczas reakcji BSA z aldoheksozami w syntezie wysokotemperaturowej w warunkach suchych [31]. Produkty zaawansowanej glikacji wykryto po inkubacji BSA z glukozą i fruktozą [25,29,31,32]. Analiza GLC-MS zanieczyszczonych cukrami komercyjnych preparatów BSA wykazała obecność octanów alditolu, ujawniając obecność mannozy, glukozy i galaktozy w molowych proporcjach 1:1.6:1. odpowiednio. Występowanie galaktozy w BSA po jej inkubacji z laktozą opisano we wcześniejszym doniesieniu [26]. Znane są różnorodne metody izolowania białek, wykorzystujące różnice w wielkości cząsteczek białkowych [19], w ich ładunku powierzchniowym [33], w powinowactwie do określonego nośnika [34]. W literaturze przedmiotu nie są znane sposoby wydzielania z komercyjnych BSA czystej monomerycznej albuminy. Pomimo podawanej w charakterystyce odczynnika około 98% czystości określanej w analizie elektroforetycznej w żelu agarozowym, wykrywane są w preparatach komercyjnych w warunkach elektroforezy denaturującej w żelu poliakrylamidowym (SDS/PAGE) [35] pochodne białkowe o wyższych ciężarach cząsteczkowych. Korzystne jest zatem określanie czystości preparatu BSA metodą elektroforezy SDS/PAGE. Znane jest występowanie wysokocząsteczkowych produktów białkowych w preparacie handlowym - frakcji V Cohna (Sigma, A7888, Polska) [19], Opisano oddzielenie monomeru BSA od takich wyżej cząsteczkowych agregatów białkowych metodą frakcjonowania w kolumnie wypełnionej żelem dekstranowym Sephadex G-200 (Pharmacia, Szwecja), zrównoważonym PBS (phosphate-buffered saline) pH 7,5 zawierającym 0,02% NaN3 w temperaturze pokojowej
[19], Wykazano jednak obecność w uzyskanym produkcie 0,25% zanieczyszczeń cukrowych [19]. Niekorzystne jest zatem stosowanie żelu Sephadex G-200 jako sita molekularnego, ponieważ zanieczyszczenie cukrami izolowanego białka wzrasta wskutek możliwego udziału cząsteczek dekstranu pochodzących z żelu, w modyfikacji białka i innych reakcjach. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, BSA może ulegać modyfikacji przez dekstran w reakcji Maillarda i tworzyć koniugaty BSA-dekstran
PL 221 899 B1 o różnych ciężarach cząsteczkowych [36]. Obecność cukrowych zanieczyszczeń i wysokocząsteczkowych pochodnych w dostępnych komercyjnych preparatach BSA wyklucza wykorzystywanie takich reagentów w badaniach podstawowych w obszarze biologii molekularnej. W tym celu niezbędne jest opracowanie prostej metody otrzymywania albuminy BSA z preparatów handlowych monomerycznej pozbawionej domieszek cukrowych. Nieoczekiwanie przedstawiony problem rozwiązał prezentowany wynalazek.
Pierwszym przedmiotem wynalazku jest czysta do analizy monomeryczna surowicza albumina wołowa, pozbawiona wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych, oznaczana elektroforetycznie w SDS/PAGR w 12% żelu rozdzielającym. W korzystnej realizacji wynalazku średnica cząstek BSA wynosi zasadniczo 7 nm.
Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania monomerycznej surowiczej albuminy charakteryzujący się tym że obejmuje: a) przygotowanie próbki preparatu BSA: b) oczyszczanie chromatograficzne otrzymanej próbki z etapu a) na żywicy HW-55, zrównoważonej buforem, korzystnie 0,1 M buforem octanowym o pH 5,65 zawierającym 1% n-butanolu. za pomocą buforu równoważącego. W korzystnej realizacji wynalazku etap a) zawiera usunięcie ligandów hydrofobowych, korzystnie poprzez przepuszczanie próbki przez charakoal. W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku oczyszczanie w etapie b) zachodzi w temperaturze pokojowej z szybkością 1,2 ml/10 min.
Trzecim przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji próbki zawierającej czystą do analizy monomeryczną surowiczą albuminę wołową, pozbawioną wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych, polegający na tym, że przeprowadza się pomiar średnicy cząstek surowiczej albuminy wołowej w próbce za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, charakteryzujący się tym, że przeprowadza się dodatkowo analizę elektroforetyczną w SDS/PAGE oraz analizę zanieczyszczeń cukrowych, przy czym średnica cząstek wynosząca około 7 nm wskazuje, że próbka zawiera czystą do analizy monomeryczną surowiczą albuminę wołową, pozbawioną wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych.
Główną zaletą monomerycznej frakcji BSA otrzymanej według wynalazku jest homogenność uzyskanego białka i brak zanieczyszczeń cukrowych. Jednorodność otrzymanego białka określaną konwencjonalną metodą elektroforezy denaturującej potwierdzono dodatkowo, wyznaczając w uzyskanych z kolumny HW-55S frakcjach białkowych średnice ich cząsteczek metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) [37]. Wartości rozmiarów cząsteczek potwierdzały obecność monomerycznej BSA i odpowiadały wcześniejszym doniesieniom literaturowym [38]. Korzystna jest identyfikacja otrzymanego monomeru BSA metodą DLS ze względu na możliwość określania tą metodą również stopnia jednorodności (%) uzyskanych frakcji albuminy. Istotną zaletą jest mniejsza czasochłonność metody w porównaniu z analizą czystości w elektroforezie SDS/PAGE. Korzystne jest użycie metody fenolowej w warunkach kwaśnych [39], do określania całkowitej zawartości cukrów w uzyskanej frakcji monomeru BSA. Brak zanieczyszczeń cukrowych w otrzymanym preparacie stanowi o przewadze metody będącej przedmiotem wynalazku, nad dwoma innymi sposobami wydzielania monomeru albuminy wołowej, opisanymi w przykładach jako niekorzystne. Dodatkową zaletą wydzielania monomeru BSA z preparatów komercyjnych wg wynalazku jest prosta metodyka i niski koszt realizacji.
Przykłady realizacji wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia profile elucji BSA komercyjnej (Sigma-Aldrich A3294): A) po chromatografii na HW-55S; B) po filtracji żelowej na Sephadex G-200; C) chromatografii anionowymiennej na DEAE-Sephadex A-50, fig. 2 przedstawia analizę SDS/PAGE w 12% żelu rozdzielającym próbki BSA, gdzie: ścieżka 1) standardy białkowe ciężarów cząsteczkowych: 2) 6 pg komercyjnej próbki BSA (Sigma-Aldrich A3294): ścieżki 3) i 4), odpowiednio: po 3 pg frakcji A i B uzyskanych po HW-55S chromatografii: ścieżka 5) 6 pg frakcji C eluowanej z kolumny HW-55S; ścieżka 6) i 7) odpowiednio, po 2 pg frakcji A and B po kolumnie Sephadex G-200; ścieżka 8) 3 pg frakcji C uzyskanej po frakcjonowaniu w Sephadex G-200; ścieżki 9), 10) and 11) odpowiednio, po 2 pg frakcji 90-100, 115-123 and 124-150 po oczyszczaniu na DEAE-Sephadex A-50, fig. 3 przedstawia badania metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) rozmiarów cząsteczek białkowych i stopnia oczyszczania albuminy wołowej w uzyskanych w chromatograficznym oczyszczaniu na HW-55S frakcjach. A) Średnice cząsteczek białka eluowanego z kolumny: linią ciągłą z czarnymi trójkątami przedstawiono absorbancję A280 jako miarę ilości białka we frakcji, linia ciągła z czarnymi kwadratami ilustruje średnice cząsteczek, linią przerywaną zaznaczono średnicę 7 nm jako referencyjną albuminy wołowej. B) Określanie stopnia czystości (w %) frakcji białkowych - szare słupki frakcji 58-60 przedstawiają białko o średnicy referencyjnej albuminy wołowej (7 nm) i o 100% czystości, a fig. 4 przedstawia elektroforezę w 12% SDS/PAGE produktów
PL 221 899 B1 modyfikacji BSA oligosacharydem rdzeniowym (modyfikacja białka 200-krotnym molowym nadmiarem oligosacharydu przez 16 godzin w 37°C): ścieżka 1 - standardy białkowe ciężaru cząsteczkowego: 2 - komercyjna BSA inkubowana z oligosacharydem; na ścieżkach 3 - i 4 - kontrolne próbki, odpowiednio, komercyjnej i monomerycznej BSA (uzyskana po oczyszczaniu w kolumnie HW 55-S) inkubowane w tych samych warunkach bez oligosacharydu, ścieżka 5 - monomer BSA modyfikowany oligosacharydem.
Przedmiot wynalazku przedstawiono w przykładach wydzielania monomeru BSA z preparatu handlowego Sigma-Aldrich (frakcja V Cohna, A3294 o ponad 98% czystości określonej przez producenta metodą elektroforezy agarozowej). Przed frakcjonowaniem chromatograficznym próbki komercyjnej BSA przepuszczano przez charkoal w celu usunięcia potencjalnych ligandów hydrofobowych, głównie kwasów tłuszczowych. Poziom cukrów określonych metodą fenolową w komercyjnej BSA wynosił 0,7% (Tab. 1).
P r z y k ł a d 1.
Sposób wydzielania monomeru BSA z próbki komercyjnego preparatu w kolumnie z żywicą
HW-55S
Na szczyt kolumny (1,6x100 cm) wypełnionej żywicą HW-55S (Toyopearl, Tosh Bioscience) zrównoważonej 0,1 M buforem octanowym pH 5,65 zawierającym 1% n-butanol naniesiono 60 mg BSA komercyjnej. Potwierdzono w analizie 12% SDS/PAGE polidyspersyjność prepartu handlowego: oprócz monomerycznej albuminy o ciężarze cząsteczkowym 69 kDa obserwowano obecność agregatów o Mw ponad 200 kDa oraz niżejcząsteczkowe pochodne (fig. 2, ścieżka 2). Białko eluowano z kolumny buforem równoważącym, w temperaturze pokojowej, z szybkością 1,2 ml/10 min. We frakcjach wypływających z kolumny w szczycie D (fig. 1A) występowało homogenne białko o ruchliwości elektroforetycznej odpowiadającej albuminie (ciężar cząsteczkowy 69 kDa), co wykazano w analizie elektroforetycznej w 12% SDS/PAGE (fig. 2, ścieżka 5). Wydzielone białko identyfikowano jako albuminę nową metodą, określając średnicę cząsteczek białkowych metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) w analizatorze Zeta-seizer NanoZS (Malvern, GB). Średnica cząsteczek obserwowanych we frakcjach 53-58 zebranych z kolumny HW-55S wynosiła 7 nm (fig. 3, linia ciągła z czarnymi kwadratami), co odpowiada danym literaturowym dla monomerycznej BSA [39].
Wykonana metodą fenolową analiza całkowitej zawartości cukrów w otrzymanych frakcjach wykazała brak zanieczyszczeń cukrowych (Tab. 1).
P r z y k ł a d 2.
Sposób wydzielania monomeru BSA z próbki komercyjnego preparatu metodą sączenia molekularnego w żelu polidekstranowym Sephadex G-200 (Amersham Pharmacia).
Próbkę 50 mg komercyjnej BSA nanoszono na szczyt kolumny Sephadex G-200 zrównoważonym PBS (phosphate-buffered saline) pH 7,5 zawierającym 0,02% NaN3. Elucję białka wykonywano buforem równoważącym w temperaturze pokojowej, z prędkością 1,2 ml/15 min. Na niejednorodność komercyjnej BSA wskazuje profil elucji białka z kolumny - frakcje albuminy wypływały w trzech szczytach białkowych (fig. 1B). Analiza SDS/PAGE wykazała, że monomer BSA znajdował się w szczycie C (fig. 2, ścieżka 8). Stanowił on 60% masy nanoszonego preparatu komercyjnego. Wykryta metodą analizy fenolowej zawartość ok. 1% domieszki cukrowej w otrzymanym białku monomerycznym była nieco wyższa, niż w próbce komercyjnej (Tab. 1), co sugeruje, że jest tak wskutek pojawienia się zanieczyszczeń dekstranem. Wskazuje to na nieprzydatność metody sączenia molekularnego w żelu Sephadex G-200 do uzyskiwania czystego monomeru BSA.
P r z y k ł a d 3.
Sposób wydzielania monomeru BSA z próbki komercyjnego preparatu metodą chromatografii jonowymiennej na anionicie DEAE-Sephadex A-50 (Amersham Pharmacia).
Kolumnę (3x25 cm) wypełnioną anionitem DEAE-Sephadex A-50 zrównoważono 0,02 M buforem fosforanowym pH 8,0 i naniesiono 600 mg BSA komercyjnej rozpuszczonej w 1 ml buforu równoważącego. Związaną z wymieniaczem albuminę wymywano w gradiencie stężeń 0,02-0,03 M fosforanu pH 8,0. Białko wypływające z szybkością 1 ml/20 min, przy niższym zakresie stężeń buforu elucyjnego, w szczycie A (Rys. 1C) było jednorodne elektroforetycznie (fig. 2, ścieżka 9). W analizie w 12% SDS/PAGE wykazano, że wysokocząsteczkowe agregaty białkowe handlowej próbki eluowano przy większym gradiencie stężeń fosforanu, w szczycie C (fig. 2, ścieżka 11). Prawdopodobnie, w wyniku nieenzymatycznej modyfikacji białek przez węglowodany w procesie glikacji, powstające pochodne białkowe mają bardziej ujemny ładunek (dostępne reszty aminokwasów zasadowych zostały zablokowane przez czynnik glikujący) i zostają silniej związane z anionitem.
PL 221 899 B1
Całkowita zawartość cukrów w frakcjach zebranych w szczycie A, określona metodą fenolową wynosiła 0,9% (Tab. 1) Z tego względu użycie wymieniacza anionowego typu DEAE-Sephadex jest nieprzydatne w otrzymywaniu czystego monomeru BSA.
P r z y k ł a d 4.
Znaczenie wynalazku objaśnione jest na przykładzie wykorzystania monomeru BSA w tworzeniu glikokoniugatów z oligosacharydem rdzeniowym lipopolisacharydu bakterii Shigella sonnei PhII.
Próbkę komercyjnej BSA i monomerycznej albuminy (otrzymanej po frakcjonowaniu na HW-55S) inkubowano z oligosacharydem bakteryjnym (relacja molowa białka do oligosacharydu 1:200) w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Warunki modyfikacji dobrano na podstawie wcześniejszych doniesień [22.23] i produkty reakcji analizowano elektroforetycznie w SDS/PAGE w 12% żelu rozdzielającym. W próbce monomeru BSA inkubowanej z oligosacharydem obserwuje się glikokoniugaty, podczas gdy inkubacja kontrolnej próby bez oligosacharydu nie generuje takich produktów (fig. 4, ścieżka 5 i 4 odpowiednio). W wyniku modyfikacji handlowego preparatu BSA otrzymano glikokoniugaty o Mw w zakresie 130-530 kDa, widoczne na ścieżce 2 w Rys. 4. Podobny skład pochodnych, chociaż o nieco niższej intensywności, obserwowano w kontrolnej próbie komercyjnej nie traktowanej oligosacharydem (fig 4, ścieżka 3). Zatem stosowanie komercyjnej BSA jako białka modelowego w badaniach modyfikacji białek powinno być wykluczone ze względu na duże zafałszowanie wyników. Tylko oczyszczony monomer BSA pozwała uzyskać prawidłowe rezultaty: z tego względu wskazane jest wykorzystywanie żywicy HW-55S do jego izolowania z preparatu handlowego.
T a b e l a 1
Zawartość całkowita cukrów w próbkach BSA
| próbka | zawartość cukrów (%) |
| Komercyjna BSA (Sigma-Aldrich A3294) | 0,7 |
| BSA monomeryczna po Sephadex G-200 | 1,0 |
| BSA monomeryczna po DEAE Sephadex | 0,9 |
| BSA monomeryczna po HW-55S | 0 |
REFERENCJE:
[1] T. Chakraborty, I. Chakraborty, S.P. Moulik. S. Ghosh, Physicochemical and conformational studies on BSA-surfactant interaction in aqueous medium, Langmuir 25 (2009) 3062-3074.
[2] H. Yoneyama, M. Yamashita, S. Kasai. K. Kawase. R. Ueno, H. Ito, T. Ouchi. Terahertz spectroscopy of native-conformational and thermally denatured bovine serum albumin (BSA), Phys. Med. Biol. 53 (2008) 3543-3549.
[3] L. Jin, Y.X. Yu, G. H. Gao, A molecular-thermodynamic model for the interactions between globular proteins in aqueous solutions: applications to bovine serum albumin (BSA), lysozyme, alpha-chymotrypsin. and immune-gamma-globulins (IgG) solutions. J. Colloid Interface Sci. 304 (2006) 77-83.
[4] A.E. Ategria, P. Sanchez-Cruz, A. Kumar. C. Garcia, F. A. Gonzalez, A. Orellano, B. Zayas,
M. Gordializa, Thiols oxidation and covalent binding of BSA by cyclolignanic quinones are enhanced by the magnesium cation, Free Radical Res. 42 (2008) 70-81.
[5] J. R. Brown, Albumin structure, function and uses (Rosenover, V. M., Oratz, M., Rothschild, M. A. Eds.), Pergamon Press. (1977) Oxford, UK.
[6] Q. Pan, M. Zhao, S. Liu, Combination of on-chip field amplification and bovine serum albumin sweeping for ultrasensitive detection of green fluorescent protein, Anal. Chem. 81 (2009) 5333 -5341.
[7] J. H. Wang. H. Q. Wang, H. L. Zhang, X. Q. Li., X. F. Hua, Y. C. Cao, Z. L. Huang, Y. D.
Zhao, Purification of denatured bovine serum albumin coated CdTe quantum dots for sensitive detection of silver(l) ions, Anal. Bioanal. Chem. 388 (2007) 969-974.
[8] E. Alarcón, A. M. Edwards. A. M. Garcia. M. Muńoz, A. Aspee, C. D. Borsarelli, F. A. Lissi, Photophysics and photochemistry of zinc phthalocyanine/bovine serum albumin adducts, Photochem. Photobiol. Sci. 8 (2009) 255-263.
[9] J. Kang, O. Lambert, M. Ausborn, S. P. Schwenderman. Stability ofproteins encapsulated in injectable and biodegradable poly(lactide-co-glycolide)-glucose millicylinders, Int. J. Pharm. 357 (2008) 235-243.
PL 221 899 B1
[10] J. Li, P. Yao, Self-assembly of ibuprofen and bovine serum albumin-dextran conjugates leading to effective loading of the drug, Langmuir 25 (2009) 6385-6391.
[11] N. Seedher, S. Bhatia, Complexation of cox-2 inhibitors with bovine serum albumin: interaction mechanism, Pharm. Dev. Technol 14 (2009) 343-349.
[12] L. Yang, F. Cui, D. Cun, A. Tao, K. Shi, W. Lin, Preparation, characterization and biodistribution of the lactone form of 10-hydroxycamptothecin (HCPT)-loaded bovine serum albumin (BSA) nanoparticles, Int. J. Pharm. 340 (2007) 163-172.
[13] P. Branaa, J. Naar, M. Chinain, S. Pauillac, Preparation and characterization of domoic acid-protein conjugates using small amount of toxin in a reversed micellar medium: application in a competitive enzyme-linked immunosorbent assay, Bioconjug. Chem. 10 (1999), 1137-1142.
[14] J. Das Sarma, C. Duttagupta, E. Ali, T. K. Dhar, T. K. Antibody to folic acid: increased specificity and sensitivity In ELISA by using ε-aminocaproic acid modified BSA as the carrier protein,
J. Immunol. Methods 184 (1995) 1-6.
[15] Paulovicovά, J. Korcovά, P. Farkas, S. Bystricky. Immunological efficacy of glycoconjugates derived from Vibrio cholerae Ol serotypc Ogawa detoxified LPS in mice, J Med Microbiol. 59 (2010), 1440-1448.
[16] P. Farkas, J. Korcovά, J. Kronek, S. Bystricky, Preparation of synthetic polyoxazoline based carrier and Vibrio cholerae O-specific polysaccharidc conjugate vaccine, Eur J Med Chem. 45 (2010) 795-799.
[17] J. B. Robbins, J. Kijbler-Kielb, E. Vinogradov, C. Mocca, V. Pozsgay, J. Shiloach, R. Schneerson, Synthesis, characterization, and immunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific oligosaccharide-core-protcin eonjugates, Proc Natl Acad Sci USA. 106 (2009) 7974-7978.
[18] J. F. Vljegenthart, Carbohydrate based vaccines, FEBS Lett. 580 (2006) 2945-2950.
[19] M. Staniszewska, S. Jarosz, M. Jon, A. Gamian, Advanced glycation end-products prepared in solution under high pressure contain epitopes distinct from those formed in the dry reaction at high temperature, Arch. Immunol. Ther. Exp. 53 (2005) 71-78.
[20] S. Thorpe, J.W. Baynes, Maillard reaction products in tissue proteins: new products and new perspectives, Amino Acids 25 (2003) 275-281.
[21] P. Ulrich, A. Cerami, Protein glycation, diabetes, and aging, Recent Prog. Horm. Res. 56 (2001) 1-21.
[22] J. Pietkiewicz, A. Gamian, M. Staniszewska, R. Danielewicz, Inhibition of human muscle-specific enolase by methylglyoxal and irreversible formation of advanced glycation end products, J. Enyme Inhib. Med. Chem. 24 (2009) 356-364.
[23] J. Pietkiewicz, A. Bronowicka-Szydełko, K. Dzierzba. R. Danielewicz A. Gamian. Glycation of the muscle-specific enolase by reactive carbonyls: effect of temperature and the protection role of czarnosine, pirydoxamine and phosphatidylserine, Prot J. in press, (2011) DOI: 10.1007/s10930-011-9307-3.
[24] A.l. Ledesma-Osuna, G. Ramos-Clamont, L. Vάzquez-Moreno, Characterization of bovine serum albumin glycated with glucose, galactose and lactose, Acta Biochim. Pol. 55(2008) 491-497.
[25] U. Kańska. J. Boratyński, Thermal glycation of proteins by D-glucose and D-fructose, Arch. Immunol. Ther. Exp. 50 (2002) 61-66.
[26] J. Boratyński, R. Roy, High temperature conjugation of proteins with carbohydrates, Glycoconj. J. 15 (1998) 131-138.
[27] C. P. Quan, S. Wu, N. Dasovich, C. Hsu, T. Patapaff, E, Canova-Davis, Susceptibility of rhDNase to glycation in the dry-powder state, Anal. Chem. 71 (1999) 4445-4454.
[28] S. Fisher, J. Hoernschemeyer, H. C. Mahler, Glycation during storage and administration of monoclonal antibody formulations, Eur. J. Pharm. Biopharm. 70 (2008) 42-50.
[29] D. J. S. Hinton, J. M. Ames, Site specificity of glycation and carboxymethylation of bovine serum albumin by fructose, Amino Acids 30 (2006) 425-433.
[30] T. J. Wu, M. C. Tu, P. Zhung. P, Advanced glycation end product (AGE): characterization of the products from the reaction between D-glucose and serum albumin, J. (Clin. Lab. Anal. 10 (1996) 21-34.
[31] J. Rangsansarid, N. Cheetangdee, N. Kinoshita, K. Fukuda, Bovine serum albumin-sugar conjugates through the Maillard reaction: effects on interfacial behavior and emulsifying ability. J. Oleo Sci. 57 (2008) 539-547.
PL 221 899 B1
[32] F. K. Yeboah, Z. Alli, V. A. Yaylayan, Reactivities of D-glucose and D-fructose during glycation of bovine serum albumin, J. Agric. Food Chem. 47 (1999), 3164-3172.
[33] I. Bednarz-Misa, J. Pietkiewicz, T. Banaś. A. Gamian. Enolase from Klebsiella pneumoniae and human muscle cells. I. Purification and comparative molecular studies, Adv Clin Exp Med. 18 (2009) 71-78
[34] D. Witkowska, J. Pietkiewicz, B. Szostko, R. Danielewicz, L. Masłowski, A. Gamian, Antibodies against human muscle enolase recognize a 45-kDa bacterial cell wall outer membrane enolase-like protein, FEMS Immunol Med. Mierobiol. 42 (2005) 53-62.
[35] U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature (London) 227 (1970) 680-685.
[36] S. H. Jung, S. J. Choi, H. J. Kim T. W. Moon, Molecular characteristics of bovine serum albumin-dextran eonjugates, Biosci. Biotechnol. Biochem. 70 (2006) 2064-2070.
[37] T. Hushcha, A. Luik, Y. Naboka, Conformation changes of albumin in its interaction with physiologically active compounds as studied by quasi-elastic light scattering spectroscopy and ultrasonic method, Talanta, 53 (2000) 29-34.
[38] G. Navarra, A. Tinti, M. Leone, V. Militello, A. Torreggiani, Influence of metal ions on themial aggregation of bovine serum albumin: aggregation kinetics and structural changes, J Inorg Bioehem. 103 (2009) 1729-3178.
[39] M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers, F. Smith, Colorimetric method for determination of sugar and related substances, Anal. Chem. 28 (1956) 350-356.
Claims (6)
1. Czysta do analizy monomeryczna surowicza albumina wołowa, pozbawiona wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych, oznaczana elektroforetycznie w SDS/PAGE w 12% żelu rozdzielającym.
2. Czysta do analizy monomeryczna surowicza albumina wolowa według zastrz. 1, znamienna tym, że średnica cząstek BSA wynosi zasadniczo 7 nm.
3. Sposób otrzymywania monomerycznej surowiczej albuminy, znamienny tym, że obejmuje:
a) przygotowanie próbki preparatu BSA,
b) oczyszczanie chromatograficzne otrzymanej próbki z etapu a) na żywicy HW-55, zrównoważonej buforem, korzystnie 0,1 M buforem octanowym o pH 5,65 zawierającym 1% n-butanolu, za pomocą buforu równoważącego.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że etap a) zawiera usunięcie ligandów hydrofobowych, korzystnie poprzez przepuszczanie próbki przez charakoal.
5. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że oczyszczanie w etapie b) zachodzi w temperaturze pokojowej z szybkością 1,2 ml/10 min.
6. Sposób identyfikacji próbki zawierającej czystą do analizy monomeryczną surowiczą albuminę wołową, pozbawioną wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych, polegający na tym, że przeprowadza się pomiar średnicy cząstek surowiczej albuminy wołowej w próbce za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, znamienny tym, że przeprowadza się dodatkowo analizę elektroforetyczną w SDS/PAGE oraz analizę zanieczyszczeń cukrowych, przy czym średnica cząstek wynosząca około 7 nm wskazuje, że próbka zawiera czystą do analizy monomeryczną surowiczą albuminę wołową, pozbawioną wysokocząsteczkowych agregatów białkowych oraz zanieczyszczeń cukrowych.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL394784A PL221899B1 (pl) | 2011-05-06 | 2011-05-06 | Czysta albumina oraz sposób jej otrzymywania i detekcji |
| US14/116,680 US9074017B2 (en) | 2011-05-06 | 2012-05-06 | Pure albumin and its method of preparation and detection |
| JP2014508883A JP2014514343A (ja) | 2011-05-06 | 2012-05-06 | 純粋なアルブミン及びその製造及び検出方法 |
| CA2835074A CA2835074A1 (en) | 2011-05-06 | 2012-05-06 | Pure albumin and a method of producing and detecting it |
| CN201280022116.4A CN103608351A (zh) | 2011-05-06 | 2012-05-06 | 纯白蛋白及其制备和检测方法 |
| EP12730029.1A EP2705048B1 (en) | 2011-05-06 | 2012-05-06 | Pure albumin and its method of preparation and detection |
| PCT/IB2012/000887 WO2013050830A1 (en) | 2011-05-06 | 2012-05-06 | Pure albumin and its method of preparation and detection |
| AU2012320205A AU2012320205A1 (en) | 2011-05-06 | 2012-05-06 | Pure albumin and its method of preparation and detection |
| IL229219A IL229219A0 (en) | 2011-05-06 | 2013-11-03 | Pure albumin, a method for its production and identification |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL394784A PL221899B1 (pl) | 2011-05-06 | 2011-05-06 | Czysta albumina oraz sposób jej otrzymywania i detekcji |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL394784A1 PL394784A1 (pl) | 2012-11-19 |
| PL221899B1 true PL221899B1 (pl) | 2016-06-30 |
Family
ID=46384421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL394784A PL221899B1 (pl) | 2011-05-06 | 2011-05-06 | Czysta albumina oraz sposób jej otrzymywania i detekcji |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9074017B2 (pl) |
| EP (1) | EP2705048B1 (pl) |
| JP (1) | JP2014514343A (pl) |
| CN (1) | CN103608351A (pl) |
| AU (1) | AU2012320205A1 (pl) |
| CA (1) | CA2835074A1 (pl) |
| IL (1) | IL229219A0 (pl) |
| PL (1) | PL221899B1 (pl) |
| WO (1) | WO2013050830A1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107228910B (zh) * | 2017-01-24 | 2018-08-24 | 浙江海隆生物科技有限公司 | 一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5728553A (en) | 1992-09-23 | 1998-03-17 | Delta Biotechnology Limited | High purity albumin and method of producing |
| IL139609A (en) | 1998-06-01 | 2006-06-11 | Genentech Inc | Separation of polypeptides monomers |
| JP4783727B2 (ja) * | 2003-04-04 | 2011-09-28 | パソゲン リムーバル アンド ダイアグノスティック テクノロジーズ インコーポレーテッド | プリオンタンパク質結合物質と使用法 |
-
2011
- 2011-05-06 PL PL394784A patent/PL221899B1/pl unknown
-
2012
- 2012-05-06 CA CA2835074A patent/CA2835074A1/en not_active Abandoned
- 2012-05-06 CN CN201280022116.4A patent/CN103608351A/zh active Pending
- 2012-05-06 JP JP2014508883A patent/JP2014514343A/ja active Pending
- 2012-05-06 EP EP12730029.1A patent/EP2705048B1/en active Active
- 2012-05-06 WO PCT/IB2012/000887 patent/WO2013050830A1/en not_active Ceased
- 2012-05-06 AU AU2012320205A patent/AU2012320205A1/en not_active Abandoned
- 2012-05-06 US US14/116,680 patent/US9074017B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-11-03 IL IL229219A patent/IL229219A0/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20140205839A1 (en) | 2014-07-24 |
| PL394784A1 (pl) | 2012-11-19 |
| CA2835074A1 (en) | 2013-04-11 |
| EP2705048B1 (en) | 2019-07-17 |
| WO2013050830A1 (en) | 2013-04-11 |
| CN103608351A (zh) | 2014-02-26 |
| EP2705048A1 (en) | 2014-03-12 |
| US9074017B2 (en) | 2015-07-07 |
| JP2014514343A (ja) | 2014-06-19 |
| AU2012320205A1 (en) | 2013-11-21 |
| IL229219A0 (en) | 2014-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yoshimura et al. | Antioxidative effect of Maillard reaction products using glucose− glycine model system | |
| Luz Sanz et al. | Characterization and in vitro digestibility of bovine β-lactoglobulin glycated with galactooligosaccharides | |
| Jöbstl et al. | Molecular model for astringency produced by polyphenol/protein interactions | |
| Seo et al. | Characterization of glycated lysozyme with galactose, galactooligosaccharides and galactan: Effect of glycation on structural and functional properties of conjugates | |
| Chen et al. | Effects of malondialdehyde modification on the in vitro digestibility of soy protein isolate | |
| Zhong et al. | Antigenicity and conformational changes of β-lactoglobulin by dynamic high pressure microfluidization combining with glycation treatment | |
| Fraker et al. | Isolation and characterization of a bacteriochlorophyll-containing protein from Rhodopseudomonas spheroides | |
| Bu et al. | Insight into the mechanism of d-allose in reducing the allergenicity and digestibility of ultrasound-pretreated α-lactalbumin by high-resolution mass spectrometry | |
| Nagai et al. | Antibody-based detection of advanced glycation end-products: promises vs. limitations | |
| Chen et al. | Effect of fructose and glucose on glycation of β-lactoglobulin in an intermediate-moisture food model system: Analysis by liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) and data-independent acquisition LC–MS (LC–MSE) | |
| Shin et al. | Recombinant human intelectin binds bovine lactoferrin and its peptides | |
| Chen et al. | The reduction in the IgE-binding ability of β-lactoglobulin by dynamic high-pressure microfluidization coupled with glycation treatment revealed by high-resolution mass spectrometry | |
| Shao et al. | Mechanism of reduction in allergenicity and altered human intestinal microbiota of digested β-lactoglobulin modified by ultrasonic pretreatment combined with glycation | |
| CN115109817B (zh) | 一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽及其制备方法和用途 | |
| CN104198731B (zh) | 一种c反应蛋白半定量检测试剂及应用该试剂的试纸 | |
| Hernandez-Hernandez et al. | In vitro fermentation by human gut bacteria of proteolytically digested caseinomacropeptide nonenzymatically glycosylated with prebiotic carbohydrates | |
| Andrews et al. | Properties of aseptically-packed UHT milk: casein modification during storage and studies with model systems | |
| Petrelli et al. | Efficient Conjugation of Oligosaccharides to Polymer Particles through Furan/Maleimide Diels–Alder Reaction: Application to the Capture of Carbohydrate‐Binding Proteins | |
| CN104407157B (zh) | 一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的检测瘦素的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
| CN104459105B (zh) | 一种检测lp的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法 | |
| Kazem-Farzandi et al. | β-lactoglobulin mutation Ala86Gln improves its ligand binding and reduces its immunoreactivity | |
| Sitar et al. | Asymmetric dimethylarginine (ADMA) in human blood: effects of extended haemodialysis in the critically ill patient with acute kidney injury, protein binding to human serum albumin and proteolysis by thermolysin | |
| Carbonaro et al. | Disulfide reactivity and in vitro protein digestibility of different thermal-treated milk samples and whey proteins | |
| US9074017B2 (en) | Pure albumin and its method of preparation and detection | |
| CN104391120B (zh) | 一种利用表面官能团的检测瘦素的胶乳增强免疫比浊试剂盒 |