JP2014514343A - 純粋なアルブミン及びその製造及び検出方法 - Google Patents
純粋なアルブミン及びその製造及び検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014514343A JP2014514343A JP2014508883A JP2014508883A JP2014514343A JP 2014514343 A JP2014514343 A JP 2014514343A JP 2014508883 A JP2014508883 A JP 2014508883A JP 2014508883 A JP2014508883 A JP 2014508883A JP 2014514343 A JP2014514343 A JP 2014514343A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bsa
- protein
- monomer
- fraction
- commercial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
- Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
- Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本発明の主題は、純粋なウシ血清アルブミンモノマー、樹脂カラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とするその製造方法、及び動的光散乱(DLS)を用いるその同定方法に関する。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
ウシ血清アルブミン(BSA)は最も安価な市販のタンパク質の1つである。基礎研究[文献1-4]及び多くの実用的用途において、モデルタンパク質として広く用いられている。BSAの加水分解より得られる遊離アミノ酸混合物は、一般にタンパク質中のアミノ酸の組成を決定するのに用いられる。不純物として糖類が混じる可能性があるが、当該目的用の市販のBSAは十分に純粋である。加水分解の結果として不純物は分解されるので、アミノ酸解析を妨げることはない。アルブミンは循環系において脂肪酸及び他の疎水性の基質の輸送体である。よって、BSAを研究で使用する前には、活性炭を用いて疎水性の不純物を除去することが重要である。BSAは評価対象細胞の超高感度画像化を促進するGFP(Green Fluorescent Protein)の検出に用いられる[6]。量子ドットで表面が共役された修飾BSAは、金属イオンの分析的検出に用いられてきた[7]。当該タンパク質は、光線力学的治療において、光線感作物質の効果的な担体であることが判明したため、炎症及び悪性新生物の治療において活性成分の輸送体として用いられる[9-12]。さらに、小分子の担体として、BSAはELISA試験での小分子の検出のために高い抗体感受性及び特異性を獲得することを可能とする、付加化合物の免疫原性を増加させる[13-14]。BSAはまた、共役ワクチンの構築にも使用される。多糖類抗体と結合後、病原体に対する効果的且つ安全なワクチンが得られる。類似の系において、BSAはまた悪性新生物の治療に用いられる[15-18]。このような用途においては、BSAは高純度でなくてはならない。特に炭水化物の不純物をなくすべきである。先の報告は、BSAの製造において高分子量の誘導体が存在することを示している[19]。高重合度の凝集体は、タンパク質と、反応性のカルボニル化合物との糖化反応の結果のように形成されることができる[20-23]。これらの不純物の凝集形成のリスクは、タンパク質中に還元糖が存在することによる可能性がある。一連の報告は、乾燥条件下及び乾燥粉末形成における熱変形の間に、フルクトース、グルコース、ラクトース及びデキストランによりタンパク質が糖化されることについて開示している[24-27]。Fischerらは、一般に臨床診療で治療用タンパク質を投与するために用いられる輸液バッグ中で、当該タンパク質をデキストロースとともに短期間インキュベーションした後、緩衝液を含む糖類成分の処方の形態で貯蔵期間中の、種々の治療用モノクローナル抗体の糖化生成物を解析した[28]。市販BSAの天然の糖化が観察された[19]。アルブミンは大部分の一般的な血清タンパクと同様に、インビボで容易に糖化を受ける[29, 30]。乾燥高温条件下での合成でのアルドヘキソースとBSAの反応時にも、凝集が観察されている[31]。進行した糖化生成物は、BSAと、グルコース及びフルクトースとのインキュベーションに続いて検出された[25, 29, 31, 32]。サッカライドが混入された市販のBSA製造物のGLC-MS解析は、マンノース、グルコース及びガラクトースのモル比が各1:1.6:1の存在比で行われた場合、アルドチオール酢酸(aldothiol acetates)の存在を開示した。ラクトース存在下でのインキュベーション後、BSA中でガラクトースが産生することは先の報告で説明されている[26]。タンパク質の単離方法として、タンパク質の分子サイズ[19]、表面電荷[33]、及び与えられた担体に対する親和性[34]を利用する様々な方法が知られている。純粋なアルブミンモノマーを市販のアルブミン調製物から単離する方法は知られていない。アガロースゲル電気泳動により決定された試薬の物性で純度98%と表示されていても、SDS/PAGE変性電気泳動[35]は、より高い分子量を伴うタンパク質誘導体の存在を示す。市販調製物ではCohn fraction V (Sigma, A7888, Poland)が高分子量の形態として知られている[19]。BSAモノマーを高分子タンパク質凝集体から単離する方法としては、デキストランゲルのSephadex G-200(Pharmacia, Sweden)が封入されたカラムに、PBS(生理食塩水リン酸緩衝液、phosphate buffer saline )、0.02%NaN3含有、室温pH7.5に平衡化させたものにより分画する方法が説明されている[19]。しかし、0.25%のサッカライドの混入が確認された[19]。そのため、Sephadex G-200を分子ふるい(molecular sieve)として用いることは好ましくない。なぜなら、単離されたタンパク質における不純物としてのサッカライドの混入量は、ゲル由来のデキストラン分子の沈殿、タンパク質修飾及び他の反応により増加するためである。先の報告によれば、BSAはメイラード(Maillard)反応を経由してデキストランにより修飾されることができ、様々の分子量のBSA-デキストラン共役結合体を形成することができる[36]。市販のBSA調製物中にサッカライド共役体及び高分子量誘導体が存在することは、それらの分子生物学の基礎研究の使用を妨げる。この理由のため、市販の調製物から、単量体且つサッカライドを含まない状態のBSAを得る単純な方法を設計する必要がある。
驚くべきことに、本発明により前記の問題を解決することができた。
本発明の第1の主題は、分析上純粋なウシ血清アルブミンモノマーであって、12%分離ゲルでのSDS/PAGEを介する電気泳動で検出されるサッカライドの混入を含まないものである。分析上純粋であるとは、前記の方法で検出した場合に、サッカライドの混入が存在しないことを意味する。同様に好ましくは、本発明による純粋なウシ血清アルブミンモノマーは分子径が実質的に7nmであることを特徴とする。
本発明の第2の主題は、ウシ血清アルブミンモノマーの単離方法であって、以下:a) BSAサンプルの調製、b) 緩衝液、好ましくは1%ブタノールを含むpH5.65の0.1M酢酸緩衝液で平衡化した樹脂、好ましくはHW-55による、工程a)で得られたサンプルの、平衡化緩衝液を用いた精製クロマトグラフィー、を包含する。同様に好ましくは、本発明の方法は、工程a)において疎水性リガンドの除去、好適にはサンプルを炭素に通す工程を含むことを特徴とする。同様に好ましくは、工程b)における精製が室温で1.2ml/10分の速度で行われることを特徴とする。
本発明の第3の主題は、アルブミンの同定方法であって、本発明の方法を用いて得られたフラクション(分画)において動的光散乱を用いてタンパク分子径を決定することを含み、ここでフラクションが有するBSAモノマーの分子径が実質的に7nmであることを特徴とする。
本発明により得られたBSAモノマー分画の主な利点は、結果物のタンパク質が均一であり且つサッカライドの混入が無いことである。結果物のタンパク質の均一性は従来の変性電気泳動により決定され、さらにHW-55Sカラムより動的光散乱(DLS)を経て得られた画分中の、タンパク質の分子径を決定することにより確認された[37]。分子径の値は、BSAの存在を支持するものであり、先行文献のデータとも整合していた[38]。DLSを介した結果物のBSAモノマーの同定は、結果物のアルブミン画分の均一性(%)を同時に決定可能であるという点で好ましい。最大の利点は従来のSDS/PAGEを経る純度分析と比較して時間が短縮できることである。得られたBSAモノマー画分のサッカライド含有量の総量を決定するために、酸フェノール法[39]を用いることが好ましい。得られた調製物中にサッカライドの混入がないことは、本発明の目的の方法が、実施例に不利な方法として記載した他の2つのウシアルブミンモノマーの単離方法よりも、有利であることの証明となる。加えて、本発明の市販製品からBSAモノマーを単離する方法は、簡素な手順且つ低価格である点で有利である。
本発明の実施態様の例を以下に図示する。
本発明の主題は、BSAモノマーをSigma-Aldrich製(Cohn fraction V, A3294, 98%以上の純度、アガロースゲル電気泳動を用い製造元により決定)より単離する例に関する実施形態の例に示される。クロマトグラフィーによる分別の前に、可能性のある疎水性リガンド、例えば脂肪酸、を除去するために、市販BSAサンプルを炭素に通した。単糖類の値はBSA0.7%において酸フェノール法を用いて測定された(表1)。
実施例1.市販調製物サンプルより、HW-55レジンのカラムを用いた、BSAモノマーの単離方法
0.1M酢酸緩衝液(pH5.65, 1%n-ブタノール含有)で平衡化されたHW-55Sレジン(Toyopearl, Tosh Bioscience)が充填されたカラム(1.6x100cm)の頂部に、60mgの市販BSAをロードした。12%SDS/PAGE分析により市販製品の多分散性を決定した:分子量69kDaのアルブミンモノマーに加え、分子量(MW)が200kDa及びそれ以下の分子量の誘導体の凝集の存在を確認した(図2、レーン2)。室温、流速1.2ml/10分で、タンパク質はカラムより平衡化用の緩衝液とともに流出した。ピークD(図1A)におけるカラムからの流出画分において、電気泳動での移動度がアルブミン(分子量69kDa)に相当する相同性タンパク質の存在を確認し、解析は12%SDS/PAGEにおける電気泳動を用いて行った(図2、レーン)。単離したタンパク質は新しい方法、Zeta-seizer NanoZS analyzer (Malvern, GB)による動的光散乱(DLS)を用いてタンパク質の分子径を決定することにより、アルブミンと同定された。HW-55Sカラムで収集された画分53-58において、観察された分子径は7nmであり(図3、実線-黒塗四角形の折れ線グラフ)、これはBSAモノマーの文献データと一致した[39]。
実施例2.市販調製物サンプルより、Sephadex G200 ポリデキストランゲル(Amersham Pharmacia)分子ふるいを用いた、BSAモノマーの単離方法
PBS(リン酸緩衝液-生理食塩水、pH7.5, 0.02%アジ化ナトリウム含有)で平衡化されたSephadex G200が充填されたカラム頂部に、50mgの市販BSAをロードした。タンパク質の溶出は平衡化された緩衝液により室温、流速1.2ml/10分で行った。アルブミン画分が3つのタンパク質のピークより流出されたという事実より、市販BSAとの非相同性が証拠づけられた(図1B)。SDS/PAGE分析を行った結果、ピークCにおいてBSAを検出した(図2、レーン8)。ロードされた市販調製物の重量の60%を構成した。フェノール法を用いて検出されたサッカライド含有量は、モノマータンパク質中の場合サッカライドの約1%であり、市販サンプル中の場合よりも僅かに高く、デキストランの混入の結果であることを示している。このことは、Sephadex G-gelを通す濾過は純粋なBSAモノマーを得るためには不適切であることの証拠となる。
実施例3.市販調製物サンプルより、DEAE-Sephadex A-50アニオンゲル(Amersham Pharmacia)イオン交換クロマトグラフィーを用いた、BSAモノマーの単離方法
アニオン性ゲルDEAE-Sephadex A-50を充填され、0.02Mリン酸緩衝液pH8.0にて平衡化されたカラム(3 x 25 cm)に、600mgの市販BSAを、1mlの緩衝液に溶解させロードした。アルブミンをイオン交換体と混合させ濃度勾配0.02-0.3Mのリン酸pH8.0により溶出させた。タンパク質は1ml/20分の速度で溶出させ、溶出緩衝液が低濃度の範囲のピークA(図1C)は電気泳動上では均一であった(図2、レーン9)。12%SDS/PAGE分析は、市販タンパク質の高い分子量の凝集が、リン酸の高濃度勾配、ピークCにおいて溶出したことを示した(図2、レーン11)。恐らく炭化水素による非酵素的なタンパク質修飾(糖化)により、形成されたタンパク質誘導体は、より陰性の電荷(利用できる塩基性のアミノ酸残基が糖化試薬によりブロックされる)を有し、アニオン性ゲルに対しより強固に結合する。
ピークAの画分におけるサッカライドの総含有量はフェノール法を用いて0.9%と決定された(表1)。このため、DEAE-Sephadexのようなアニオン交換体の利用は、純粋なBSAモノマーを得るのに利用するのに優れているとはいえない。
ピークAの画分におけるサッカライドの総含有量はフェノール法を用いて0.9%と決定された(表1)。このため、DEAE-Sephadexのようなアニオン交換体の利用は、純粋なBSAモノマーを得るのに利用するのに優れているとはいえない。
実施例4.本発明の顕著な効果を示す、赤痢菌(Shigella sonnei PhII)のリポポリ多糖類のオリゴ糖中心との複合糖質形成における、BSAモノマーの使用例
市販BSAサンプル及びアルブミンモノマー(HW-55Sによる分離処理後に得られたもの)を細菌性オリゴ糖(オリゴ糖に対するタンパク質のモル比が1:200)の存在下37℃16時間インキュベートした。修飾条件は先の報告[22,23]に基づいて選択し、反応生成物は12%分離ゲル上のSDS/PAGEを用いた電気泳動により分析した。オリゴ糖存在下インキュベートしたBSAモノマーサンプルにおいて複合糖質が確認されたが、一方、オリゴ糖を含まない対照サンプルにおいてそのような生成物は生成しない(図4、各レーン5及び4)。市販BSA製造物の修飾結果のように、図4のレーン2に見られる、分子量の範囲が130-150kDaの範囲である複合糖質が得られた。類似の組成物が、強度がより弱いものの、未処理のオリゴ糖対照の市販サンプル中に確認された(図4、レーン3)。実際、市販のBSAをタンパク質修飾の評価におけるモデルタンパク質として使用すると、結果に大きくバイアスがかかるため除外するべきである。純粋なBSAのみでないと、適切な結果を得ることはない。このため、市販製品からの単離にはHW55-Sレジンを用いることが好ましい。
Claims (6)
12%分離ゲル中でのSDS/PAGE電気泳動による決定において、分析上純粋なウシ血清アルブミンモノマー。
BSA分子の直径が実質的に7nmであることを特徴とする、請求項1記載の分析上純粋なウシ血清アルブミンモノマー。
ウシ血清アルブミンモノマーを得る方法であって、
a)BSA調製物のサンプルの調製、
b)緩衝液、好ましくは1%n-ブタノールを含むpH5.65の0.1M酢酸緩衝液で平衡化した樹脂、好ましくはHW-55による、工程a)で得られたサンプルの、平衡化緩衝液を用いた精製クロマトグラフィー、
を包含する、方法。
a)BSA調製物のサンプルの調製、
b)緩衝液、好ましくは1%n-ブタノールを含むpH5.65の0.1M酢酸緩衝液で平衡化した樹脂、好ましくはHW-55による、工程a)で得られたサンプルの、平衡化緩衝液を用いた精製クロマトグラフィー、
を包含する、方法。
工程a)が疎水性リガンドの除去、好適にはサンプルを炭素に通す工程を含むことを特徴とする、請求項2記載の方法。
工程b)における精製が室温で1.2ml/10分の速度で行われることを特徴とする、請求項2又は3記載の方法。
アルブミンを同定する方法であって、請求項1の方法を用いて得られたフラクション(分画)において動的光散乱を用いてタンパク分子径を決定することを含み、ここで、フラクションが有するBSAモノマーの分子径が実質的に7nmである、
ことを特徴とする、請求項1の方法。
ことを特徴とする、請求項1の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PLPL394784 | 2011-05-06 | ||
PL394784A PL221899B1 (pl) | 2011-05-06 | 2011-05-06 | Czysta albumina oraz sposób jej otrzymywania i detekcji |
PCT/IB2012/000887 WO2013050830A1 (en) | 2011-05-06 | 2012-05-06 | Pure albumin and its method of preparation and detection |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014514343A true JP2014514343A (ja) | 2014-06-19 |
Family
ID=46384421
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014508883A Pending JP2014514343A (ja) | 2011-05-06 | 2012-05-06 | 純粋なアルブミン及びその製造及び検出方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9074017B2 (ja) |
EP (1) | EP2705048B1 (ja) |
JP (1) | JP2014514343A (ja) |
CN (1) | CN103608351A (ja) |
AU (1) | AU2012320205A1 (ja) |
CA (1) | CA2835074A1 (ja) |
IL (1) | IL229219A0 (ja) |
PL (1) | PL221899B1 (ja) |
WO (1) | WO2013050830A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107228910B (zh) * | 2017-01-24 | 2018-08-24 | 浙江海隆生物科技有限公司 | 一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法及其应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5728553A (en) | 1992-09-23 | 1998-03-17 | Delta Biotechnology Limited | High purity albumin and method of producing |
CA2333747C (en) | 1998-06-01 | 2008-02-19 | Genentech, Inc. | Separation of protein monomers by use of ion-exchange chromatography |
PL1615992T3 (pl) * | 2003-04-04 | 2014-03-31 | Pathogen Removal And Diagnostic Tech Inc | Materiały wiążące białko prionowe i sposoby ich zastosowania |
-
2011
- 2011-05-06 PL PL394784A patent/PL221899B1/pl unknown
-
2012
- 2012-05-06 AU AU2012320205A patent/AU2012320205A1/en not_active Abandoned
- 2012-05-06 WO PCT/IB2012/000887 patent/WO2013050830A1/en active Application Filing
- 2012-05-06 US US14/116,680 patent/US9074017B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-05-06 JP JP2014508883A patent/JP2014514343A/ja active Pending
- 2012-05-06 CA CA2835074A patent/CA2835074A1/en not_active Abandoned
- 2012-05-06 CN CN201280022116.4A patent/CN103608351A/zh active Pending
- 2012-05-06 EP EP12730029.1A patent/EP2705048B1/en active Active
-
2013
- 2013-11-03 IL IL229219A patent/IL229219A0/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103608351A (zh) | 2014-02-26 |
PL394784A1 (pl) | 2012-11-19 |
EP2705048A1 (en) | 2014-03-12 |
IL229219A0 (en) | 2014-01-30 |
US20140205839A1 (en) | 2014-07-24 |
US9074017B2 (en) | 2015-07-07 |
EP2705048B1 (en) | 2019-07-17 |
PL221899B1 (pl) | 2016-06-30 |
AU2012320205A1 (en) | 2013-11-21 |
WO2013050830A1 (en) | 2013-04-11 |
CA2835074A1 (en) | 2013-04-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Rice et al. | Chemical modification and hybridization of wheat germ agglutinins | |
JPH07501937A (ja) | 精製キチンデアセチラーゼ | |
AU661071B2 (en) | Oligoside derived from an antigen polyoside obtained from a pathogenic agent | |
Zukin et al. | Properties of the galactose binding protein of Salmonella typhimurium and Escherichia coli | |
Clark et al. | Association of Arginine-rich Histones with G· C-rich Regions of DNA in Chromatin | |
Andrews et al. | Properties of aseptically-packed UHT milk: casein modification during storage and studies with model systems | |
EP0247071A1 (en) | IMMUNE TREATMENT. | |
EP0278422A2 (en) | y-Globulin injectable solutions | |
Kornguth et al. | Isolation and partial characterization of a tubulin-like protein from human and swine synaptosomal membranes | |
Molnar et al. | The role of an α2-macroglobulin of rat serum in the phagocytosis of colloidal particles | |
Brown et al. | Isolation and characterization of rat α-lactalbumin: a glycoprotein | |
Marr et al. | Studies on the growth-promoting glycoprotein fraction of foetal calf serum | |
JP2014514343A (ja) | 純粋なアルブミン及びその製造及び検出方法 | |
US3409605A (en) | Concentration and purification of growth factor-placental origin (human) | |
US3579495A (en) | Isolation of orgotein from blood | |
Bengtsson et al. | The basis for the interaction between attenuated poliovirus and polyions | |
CN107412730B (zh) | 一种地黄蛋白纳米颗粒及其制备方法 | |
Scheider et al. | An effective method for defatting albumin using resin columns | |
Bakay et al. | Binding of thalidomide by macromolecules in the fetal and maternal rat | |
Bleumink et al. | Studies on the atopic allergen in ripe tomato fruits | |
JP5689064B2 (ja) | 精製方法 | |
JPH04346934A (ja) | γ−グロブリンの液状製剤 | |
Jackson et al. | Physicochemical properties of some glycopeptides released from human erythrocyte membranes by trypsin | |
JP2003532874A (ja) | 糖含有実体の分離 | |
Harbers | Radiation effects on nuclear ribonucleic acid of Ehrlich ascites tumor cells |