JP2008037867A - 高純度アルブミンの製造 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ポジティブモード陽イオン交換と、その後でポジティブモード陰イオン交換クロマトグラフィーにアルブミンを通す。他のステップ、例えば限外ロ過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アルブミンを結合させるアフィニティクロマトグラフィーと、混入物質を結合させるアフィニティクロマトグラフィーも用いてよい。アルブミンに特異的親和性を有しない材料から、アルブミンに親和性を有する化合物によるアルブミンの溶出も、カウンターイオンの使用によりアンモニウムイオンが除去される。
【選択図】なし
Description
(a)アルブミンがマトリックスと結合するような条件下で、アルブミン溶液を陽イオン交換マトリックスに通す;
(b)アルブミン含有陽イオン交換溶出液を上記マトリックスから溶離させる;
(c)アルブミン結合性化合物を含んでなるアフィニティマトリックスに上記溶出液を通す;
(d)上記マトリックスからアルブミン含有アフィニティマトリックス溶出液を溶離させる;
(e)場合により限外ロ過後に、上記溶出液をゲル浸透マトリックスに通してアルブミンに富むフラクションを得る;
(f)アルブミンがマトリックスと結合するような条件下で、上記のアルブミンに富むフラクションを陰イオン交換マトリックスに通す;および
(g)上記陰イオン交換マトリックスから、精製されたアルブミン含有産物を溶離させる、
ステップを含む。
(a)アルブミンがマトリックスと結合するような条件下で、アルブミン溶液を陽イオン交換マトリックスに通す;
(b)アルブミン含有陽イオン交換溶出液をそのマトリックスから溶離させる;
(c)アルブミンがマトリックスと結合するような条件下で、陽イオン交換溶出液を陰イオン交換マトリックスに通す;
(d)陰イオン交換マトリックスからアルブミン含有陰イオン交換溶出液を溶離させる;
(e)アルブミン結合性化合物を含んでなるアフィニティマトリックスに陰イオン交換溶出液を通す;
(f)そのアフィニティマトリックスからアルブミン含有アフィニティマトリックス溶出液を溶離させる;
(g)そのアフィニティマトリックス溶出液をゲル浸透マトリックスに通してアルブミンに富むフラクションを得る、
ステップを含む、アルブミンを精製するための方法を提供する。
次いで、本発明により精製されたアルブミンは、中間プロセスステップと共にまたはそれなしで、複合糖質および糖類、例えばアミノフェニルボロン酸(aminophenylboronic acid)(PBA)と選択的に結合する固定された化合物を含有する樹脂でクロマトグラフィーに付される。
細菌(例えば、E.coliおよびBacillus subtilis)、酵母(例えば、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris およびKluyveromyces lactis)、糸状菌(例えば、Aspergillus)、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含めた多くの発現系が知られている。好ましい微生物は酵母Saccharomyces cerevisiaeである。
図1はrHAを生産するために用いられる発酵槽を概略図で示している;
図2はC18PTH逆相HPLCカラム(Applied Biosystems Inc.)によるUVトレースであり、本発明のアルブミン中で低レベルの低分子量混入物質を示している;
図3は図2と同様であるが、従来技術のアルブミン中の低分子量混入物質を示している;
図4は市販アルブミンの脂肪酸含量を示したガスクロマトグラムである;
図5は図4に相当するが、本発明のアルブミンを示している;および
図6aおよび6bは、本発明のアルブミンと従来のアルブミンの各々に関するエレクトロスプレー質量スペクトル分析を示している。
アルブミン生産微生物の構築に関するクローニング戦略は、EP431880に開示されたとおりであった。プラスミドpAYE316をHinnen et al (1978) P.N.A.S.75,1929に記載された方法で(MATa、leu2、pep4‐3、〔cir゜〕)Saccharomyces cerevisiae株中に導入した。形質転換体はロイシンを欠く最小培地(酵母窒素ベース、Difco)上で選択した。形質転換体を複合(YEP、1%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)バクトペプトンおよび2%(w/v)スクロース)または規定(アミノ酸および硫酸アンモニウムのない0.15%(w/v)酵母窒素ベース、0.5%(w/v)硫酸アンモニウム、0.1Mクエン酸/Na2HPO4・12H2O pH6.5、2%(w/v)スクロース)液体培地の10mlを含有した50mlフラスコ中において30℃、200rpmで72時間増殖させたとき、rHAはSDS‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動および/またはロケットゲル免疫電気泳動により無細胞培養上澄において検出することができた。
このセクションはストック培養物から最終発酵に至るまでのrHAの生産に関するもので、特定の具体的装置または規模に限定されないrHA発酵プロセスの一般的規定である。
MW10培地
成分 バッチ培地 供給培地
塩
KH2PO4 2.74g/l 10.9g/l
MgSO4・7H2O 0.58g/l 2.3g/l
CaCl2・2H2O 0.06g/l 0.24g/l
H3PO4(85%w/w) 0.88ml/l 1.76ml/l
ビタミン
パントテン酸Ca 20mg/l 180mg/l
ニコチン酸 33.3mg/l 300mg/l
m‐イノシトール 20mg/l 180mg/l
d‐ビオチン 0.133mg/l 0.8mg/l
チアミン・HCl 16mg/l 32mg/l
微量元素ストック 10ml/l 20ml/l
スクロース 0* 500g/l
微量元素ストック成分
ZnSO4・7H2O 3g/l
FeSO4・7H2O 10g/l
MnSO4・4H2O 3.2g/l
CuSO4・5H2O 0.079g/l
H3BO3 1.5g/l
KI 0.2g/l
Na2MoO4・2H2O 0.5g/l
CoCl2・6H2O 0.56g/l
微量元素は、35ml/lの98%H2SO4で酸性化された脱塩水に加える。
供給速度(FR)=keμt
上記において、kは初期供給速度であり、μは指数増殖速度であり、tは時間である。k値は、エタノールおよび酢酸(acetate)の蓄積を最少にする増殖速度を達成させる上で必要な初期供給速度として経験的に決定される。この例では、kはMW10供給培地0.08ml/分/L培地の値を有するものとして決定された。μ値は、十分に呼吸性の生物の最大増殖速度、この例だと0.1/hである。
(例1に記載されたような)発酵からの遠心物または(血漿のような)いずれか他の供給源からの不純アルブミン溶液は、(オクタノエートを含有させることにより)重合化と、(ダメージを与えるレベルのプロテアーゼがないように酵母を選択するかまたは加熱することにより)プロテアーゼ活性からアルブミンをを保護しながら、陽イオン交換マトリックスでのクロマトグラフィー用に調製または条件設定する。好ましくは、オクタン酸ナトリウムを1〜10mM、例えば約5mMの最終濃度まで加えて(クロマトグラフィー溶液13(CS13)‐表2)、アルブミンを安定化させる。pHを酢酸(CS09)で4.3〜4.8、好ましくは4.50±0.1(最も好ましくは±0.05)に調整し、導電率は<5.5mS/cm となるようにチェックする。
すべての操作は環境温度(20±5℃)で行える。クロマトグラフィーカラム用のアルブミン担持量(load)(gアルブミン/Lマトリックス)は、SDS‐PAGE(SP‐FFカラムの場合)またはGP‐HPLC(他のすべてのカラムの場合)により、アルブミンの力価(g/l)から決める。各ステップの進行は、オンラインで、例えば254または280nmでUV吸光度を測定することによりモニターする。
10,000で用いられる公称分子量カットオフのセルロースタイプ膜を限外ロ過装置に用いて、プールされたリサイクルフラクションをアルブミン20〜120g/l、好ましくは80〜110g/lの保留液濃度まで濃縮させる。膜は中間限外ロ過下で上記のように使用後処理する。
この例では、適切な生成物、この場合には25%(w/v)アルブミンへの高度精製アルブミンの濃縮、ダイアフィルトレーションおよび処方(formulation)について説明している。この操作は2段階で、即ち最終限外ロ過(UF)および処方で行う。最終UFは最終UF供給容器への(リン酸でpH7.0±0.3に調整された)DEAE溶出液の移送から始めて、保留液と洗液がもしあれば処方容器に移された後で終える。アルブミン含有プロセス流は、セルロース膜または、更に好ましくは公称分子量カットオフ限界10,000のポリエーテルスルホン膜を装備した限外ロ過系で、一次濃縮、ダイアフィルトレーションおよび二次濃縮に連続的に付す。最初の濃縮ステップではアルブミン濃度を約100g/lまで増加させ、直ちに連続的なダイアフィルトレーション段階を続けて、アルブミンを保留液容量の少くとも5倍、好ましくは少なくとも7倍相当の注入用水に対してダイアフィルトレーションする。
例2のプロセスの変法として、ステップの順序を変えて、一部の変更をプロセス条件において行なった。このため、クロマトグラフィー溶液の別表を表3として示した。加えて、ゲル浸透ステップ以外のすべてのクロマトグラフィーカラムは半径流式である。
プロセスの別な変法において、例2または4のプロセスを下記のように変更して行う。陽イオン交換カラム(例えば、SP‐Sepharose FF、Pharmacia)へのアルブミンの担持後に、カラムをCS21(50mM酢酸ナトリウム、pH
3.9〜4.1、0.6〜0.8mS/cm)で洗浄してから、CS20での最終洗浄前に、酢酸ナトリウム緩衝液(例えば、10〜50mM酢酸ナトリウム、好ましくは約27mM、pH3.5〜4.5、好ましくはpH4.0)中に1〜3M NaCl、好ましくは2M NaClを含有した高塩緩衝液で更に洗浄した。この一層厳密な洗浄操作が低レベルの非アルブミンタンパク質を含有した溶出液にしており、アルブミンが酵母発酵からのrHAであるならば特に有用と思われる。アルブミンは例4に記載されたように溶出させた。高塩洗浄前にpHを低下させるとその洗浄中にカラムにアルブミンを留める上で役立ち、最終洗浄もアルブミン回収率を最大にする。どのステップも、回収されたアルブミンの純度に大きな影響を有しないと思われる。
この例では、例2または4のプロセス(例5の変更と共にまたはなしに)を下記のように変更した。陽イオン交換カラムからの溶出液を10mS/cm未満、好ましくは5mS/cm未満に希釈し、その後陰イオン交換マトリックス(例えば、DEAE Sepharose FF、Pharmacia )に担持させた。次いで陰イオン交換マトリックスは約9.2までpHを上げる効果を有する希テトラホウ酸緩衝液(例えば、15〜25mMテトラホウ酸カリウムまたはテトラホウ酸ナトリウム)で洗浄し、その後アルブミンを更に濃縮テトラホウ酸緩衝液(例えば、80〜150mMテトラホウ酸カリウム、好ましくは110mMテトラホウ酸カリウム)で溶出させた。例2および4では、アルブミンを20mMテトラホウ酸(borate)、100mM NaClで溶出させた;80〜150mMテトラホウ酸(例えば、33.6g/l)での溶出は、これらの条件下で陰イオン交換マトリックスに対するこれら種の親和性増加のために、炭水化物含有混入物質、例えば酵母糖タンパク質の含有率がより低い溶出液を生じる。テトラホウ酸カリウムは、室温でその高い溶解度のために、テトラホウ酸ナトリウムよりも優先して用いられる。陰イオン交換マトリックスからの溶出液は例2または4のように処理した。例えば、例4プロセスにおいて、それはアフィニティマトリックス、例えばDelta Blue Agarose(DBA)に直接担持させて、例4に記載されたように行った。
DBAマトリックスからの溶出液は、塩化ナトリウム(20〜2000mM、好ましくは約100mM)およびオクタノエート(1〜20mM、好ましくは約5mMオクタノエート、pH9.0〜9.5、好ましくは9.2)を含有した酢酸アンモニウム緩衝液(例えば10〜100mM、好ましくは約30mM)で平衡化されたゲル浸透媒体、例えばSephacryl S‐200(HR)(Pharmacia)に適用してもよい。この緩衝液は、以下で更に詳細に記された、最終クロマトグラフィーステップに適した溶液中にアルブミンを効果的に交換する。
それより先のUS特許第4,269,605号では、本発明で好ましい、アガロースのエピクロロヒドリン活性化を含めた様々なマトリックス活性化法について考えられている。市販マトリックスには、Amicon's PBA30およびSigma'sアクリルビーズ化アミノフェニルボロネートなどがある。
フェニルボロネートマトリックスは11.0±1.0cmの流路長を有しており、アンモニウムイオン(10〜50mM)、酢酸(10〜50mM)および1.0〜10.0mMオクタン酸(例えば、CS36‐後記表参照)を含有した緩衝液で平衡化させた。次いで、カラムを35±15g/LマトリックスのrHAで担持させた。PBAはネガティブステップとして行ない、したがって集められた産物は、担持とその後の平衡緩衝液での洗浄中におけるフロースルー(flow through)である。すべてのクロマトグラフィーステップは0.005〜0.3倍層容量/min範囲の流速で行える。好ましくは、カラムの平衡化および浄化はアルブミン溶液の担持および収集よりも高い流速、例えば0.19倍層容量/minで行い、好ましくは0.01〜0.05、好ましくは0.025倍層容量/minで行う。次いで、カラムはホウ酸緩衝液(CS37でのように)、塩(CS38)および苛性アルカリ(CS25)で浄化し、その後ホウ酸緩衝液(CS37)に貯蔵する。
溶 液 成 分 濃度(g/l) pH 導電率(mS/cm)
No. 名称
CS36 PBA CH3COONH4 2.31
平衡/洗液 NaOH(27%(w/w)) 2.55 9.0‐9.4 12.0‐15.0
NaCl 5.84
オクタン酸 0.721
CS37 ホウ酸浄化 K 2 B 4 O 7 ・4H 2 O 33.6 9.2‐9.5 15.0‐18.0
CS38 塩浄化 CH3COOH 1.62
NaOH(27%(w/w)) 1.19 3.9‐4.1 125.0‐165.0
NaCl 117.0
PBA緩衝液中におけるアンモニウムイオンの使用のために、上記例3に記されたような最終限外ロ過ステップでは塩を用いることが有利である。
(1)例1のような酵母発酵
(2)例2のような遠心物コンディショニング
(3)例5のような高塩洗浄での陽イオン交換(SP‐FF)と、例4のようなアルブミン特異性化合物での溶出
(4)例6のような、希釈と濃テトラホウ酸(tetraborate)溶出での陰イオン交換
(5)例4のようなアフィニティクロマトグラフィー(DBA)
(6)例7のような、中間限外ロ過、その後ゲル浸透(S‐200)、およびリサイクル限外ロ過
(7)例7のような固定ホウ酸(immobilised borate)上でのクロマトグラフィー
(8)例3のような最終限外ロ過および処方
例8:固定化フェニルボロネートの早期使用
固定フェニルボロネートを使うステップは、そのプロセスで、例えばステップの順序が陽イオン交換体‐陰イオン交換体‐アフィニティ物質‐限外ロ過/ダイアフィルトレーション‐固定フェニルボロネート‐ゲル浸透であるプロセスで早期に用いることができる。
この例では、本発明に従い精製されたアルブミンの純度を確認するために行われる分析について示している。他で指摘されないかぎり、すべてのアッセイは、最終産物を得るために例3に記載されたように処方されたアルブミンで行う。
グリケートされたタンパク質のマイクロアッセイでは、本発明により精製された(rHA)が非酵素グリコシル化(グリケーション)により修飾されていないことを示した。マイクロアッセイでは、過ヨウ素酸(periodate)によるAPのC‐1ヒドロキシル基の酸化により、安定なアマドリ産物(AP)形のグリケート化タンパク質を測定する。過ヨウ素酸酸化により放出されたホルムアルデヒドは、アンモニア中でアセチルアセトンとの反応による、発色団ジアセチルジヒドロルチジン(DDL)への変換により定量する。次いで、DDLは405nmで比色分析により検出する。
A 0.092
B 0.116
C 0.090
D 0.132
E 0.060
G 0.04
H 0.01
I 0.07
J 0.07
K 0.05
L 0.740
M 0.70
N 0.96
O 0.78
バッチA〜Kは例2により精製されたrHAであった。バッチL〜Oは異なる供給元からの市販ヒト血清アルブミンのサンプルであった。例7により精製されたrHAの8バッチは、HSA(0.387±0.012)と比較して、無視しうるグリケーションレベル(0.042±0.018モル/モル)であった。
原理‐このアッセイの目的は、酸性有機溶媒を用いてrHAおよびHSAから非共有結合低分子量混入物質(LMC)を除去することである。その後HPLC“指紋”クロマトグラムが、サンプルの比較のために生成されうる。
# 保持時間 面 積 高 さ
(min) (uV.sec) (uV)
1 0.800 3459686 219122
2 1.667 418606 33569
3 2.150 77883335 1963630
4 3.000 6293258 122295
5 20.433 297608 14424
6 22.900 205822 14601
7 27.567 150851 10835
8 31.117 2213883 170938
9 37.983 164710 15088
10 39.267 347946 29879
11 41.750 107515 8402
12 42.783 2303024 192911
13 43.217 139744 14141
14 43.457 254521 23979
15 50.467 152805 13226
16 50.950 162364 12577
17 56.533 5753796 83674
他方、市販HSAは更に多くのピークを有している(図3および表6参照)。
# 保持時間 面積 高さ
(min) (uV.sec) (uV)
1 0.350 244385 23957
2 0.633 607880 45310
3 0.783 3239730 243477
4 0.983 1072033 158146
5 2.233 76773569 2038028
6 2.933 6634089 182363
7 3.733 2812688 95459
8 12.483 818540 20185
9 12.650 218748 22750
10 14.150 5423715 98336
11 16.333 423403 17460
12 16.633 688525 24538
13 17.550 2301309 84781
14 18.033 1145045 47806
15 19.750 672721 21562
16 20.233 87799 9760
17 20.700 272171 13003
18 21.100 862146 55792
19 21.967 166471 8928
20 22.883 1381445 97660
21 23.583 1112632 89851
22 24.000 4740347 419780
23 24.417 352486 26374
24 24.917 171279 14625
25 25.133 99734 11473
26 25.267 133911 10515
27 25.667 223556 11854
28 25.967 257295 17351
29 26.600 93906 7657
30 26.817 223113 18326
31 27.250 303831 29461
32 27.533 124218 12710
33 27.783 5747091 561629
34 28.550 1383761 119772
35 29.033 390986 33455
36 29.417 182131 12713
37 29.833 181333 12584
38 30.183 478320 30155
39 30.583 1048945 58465
40 31.067 3454425 214489
41 31.983 168275 8663
42 32.717 651406 43161
43 33.150 1142221 102588
44 34.017 420756 23883
45 35.100 115704 10008
46 37.033 166588 9468
47 38.267 145731 8078
48 38.983 781209 54029
49 41.800 86967 8868
50 48.883 95416 8522
51 50.267 174159 16737
52 50.483 176115 15573
53 51.267 158727 13701
54 52.183 297278 25795
55 56.533 5846645 85710
非共有結合LMCに関する本発明のアルブミンの品質は、臨床用HSAの場合よりも明らかに優れている。数値で表すと、本発明のアルブミンについて10分と55分の間の全ピーク面積は約6.4V.secであり、市販物質について同じ2つの時間の間における全ピーク面積は約39.7V.secであった。
キャピラリー電気泳動(CE)は、本発明の精製rHAと市販HSAを定性的に比較するために、標準SDS‐PAGEの代わりとして用いる。CEは高分解能電気泳動技術であり、ほんの小さな差異がみられると、同様のタンパク質のサブ集団(sub-populations)を分離することができる。
20KeVおよび30℃で20mM PO4/B4O7緩衝液、pH=7.4により分離し、ABI270CEで電気泳動に付した。本発明のrHAは電気泳動図で単一ピークを与え、その均一性を示した。逆に、他のピークが市販HSAサンプルで観察された。これらのピークは、例えば遊離チオール基がブロックされたかまたはアミノ末端が分解したアルブミン分子の存在を示すと考えられる。
組換えタンパク質の質的コントロールの重要な面は、予備決定される一次構造の確立と安定性である。
トリプシン消化:HSA(市販源から‐1つのサンプルは−20℃で貯蔵し、1つは30℃で12週間貯蔵する)、本発明に従い精製されたrHA(4℃および30℃で6月間貯蔵する)およびDes‐Leu rHA(C末端ロイシンのないrHAの切欠形)(各1mg)を37℃で120分間かけて5mMジチオトレイトール(Calbiochem)により還元させ、その後0.5M Tris HCl pH8.0中6MグアニジンHCl中37℃で90分間かけて10mMヨードアセトアミド(Sigma)でアルキル化した。
高速原子衝突‐質量スペクトル分析:FAB‐MSをM‐Scan Limited,Ascot,UKによりVG Autospecで行った。
全長C末端トリプシン処理ペプチド(質量1012)は、合成マーカーペプチドを用いると、RP‐HPLCで37.5minで溶出することが示された。このピークを集め、HSAおよびrHAからN末端配列決定およびFAB‐MSにより同定した。
サンプル 配列
Des‐Leu rHA LVAASQAALG
AWAVAR
DLGEENFK
HSA標準 AWAVAR
DLGEENFK
+約5%LVAASQAALG
30℃で12週間のHSA AWAVAR
DLGEENFK
4℃で6月間のrHA AWAVAR
DLGEENFK
30℃で6月間のrHA AWAVAR
DLGEENFK
FAB‐MSによると、28.5分ピークに存在する主シグナル((M+H)+分子イオン)は表8に示されたとおりであった。
合成全長および切欠C末端 1013‐LVAASQAALGL
ペプチドの混合物 900‐LVAASQAALG
Des‐Leu rHA 673‐AWAVAR
900‐LVAASQAALG
951‐DLGEENFK
1028‐ ?
1140‐ ?
HSA標準 673‐AWAVAR
900‐LVAASQAALG
951‐DLGEENFK
1028‐ ?
1140‐ ?
30℃で6月間のrHA 673‐AWAVAR
900‐LVAASQAALG
1028‐ ?
1140‐ ?
951‐シグナルなし
1028および1140でのシグナルは断片イオンと思われる;それらは配列分析により検出できるペプチドではなかった。
Des‐Leu C末端トリプシン処理ペプチドは約5〜10%(定量ではない)で市販HSAに検出されたが、本発明のrHAでは30℃で6月間後であっても検出できなかった。Des‐Leuペプチドは30℃で12週目にHSAで検出できず、全長C末端ペプチドで37.5分のピーク(単離されないが)は他のサンプルと比較して非常に減少しており、おそらくこれがC末端分解を更に受けたことを示している。
序文‐エルマン試薬、5,5′‐ジチオビス(2‐ニトロベンゾエート)(DTNB)はCys‐SHのような遊離チオール基を検出する特異的な高感度手段である。その反応の後で412nmの吸光度をモニターでき、その値を用いてrHAの分子当たり1残基未満のレベルまで遊離Cys‐SHを計算することができる。下記の溶液、試薬をアッセイで利用する:
5,5′‐ジチオビス(2‐ニトロ安息香酸)DTNB,Sigma Product No D8130
TRIS PRE-SET pH結晶pH8.0,Sigma Product No T4753
EDTA・二ナトリウム,Sigma Product No ED2SS
リン酸二水素ナトリウム・二水和物,Analarグレード
リン酸水素二ナトリウム・二水和物,Analarグレード
緩衝液1:0.1M(12.1g)Tris‐HCl:0.01M(3.72g)EDTA Na2・2H2O,pH8.0。PRE-SET pH結晶。水500mlに溶解して、正確に1リットル容量に調整する。室温で1月間安定。
1)分光光度計セルホルダーサーモスタットを25℃にセットする。2)1つのキュベット中のサンプル1.25mlと、他の10mm減容量キュベット中の緩衝液の1.25mlとをサンプルおよびレファレンス位置に各々入れる。3)412nmで計器をゼロ調整する。吸光度を0.1AUフルスケールにセットする。4)DTNB試薬50μlをレファレンスキュベットに加え、きれいなプラスチックスターラーを用いてしばらく混合する。5)DTNB試薬50μlをサンプルキュベットに加え、上記のように混合する。6)直ちにデータ捕捉を始める (またはチャートレコーダーを始動させて、10分まで反応を追跡する)。7)値を同じく3回にわたり得るために、各サンプルについて繰り返す。8)安定した吸光度減衰からゼロ時間に逆外挿して、412nmで吸光度(δA412)を読み取る(図1)。9)モル吸光係数ε412=13.9cm2/mMを用いてスルフヒドリル含有量を計算する。
いくつかの市販HSAサンプルを遊離チオール含有量についてアッセイし、結果は以下にまとめた:
HSA 遊離チオール(モルSH/モルHSA)
1 0.29
2 0.22
3 0.35
4 0.05
5 0.08
6 0.46
7 0.36
これらの値は、0.85〜0.9モルSH/モルrHAでルーチンに分析された、上記例に従い作られたアルブミンの値よりも有意に低い。
標準およびサンプルをパイロコート(pyrocoat)されたグラファイト管から原子化する。サンプルの原子吸光は下記条件を用いて検出する:
金属イオン 波長nm 原子化温度℃
Zn 213.9 1800
Cu 327.4 2300
Fe 248.8 2400
Al 309.8 2500
Mn 279.8 2200
アルミニウムはPerkin Elmer M2100原子吸収スペクトル分析器、Perkin Elmer HGA‐700グラファイトファーネス、サンプルカップ付きPerkin Elmer AS‐70オートサンプラーおよびアルミニウム中空カソードランプを用いて測定した。試薬はARグレード硝酸マグネシウム、アルミニウム標準溶液(1000ppm)およびARグレード濃硝酸であった。1.00%w/v硝酸マグネシウム溶液はMilli-Q水で調製した。アルミニウム標準溶液15μlをピペットでオートサンプラーに入れ、0.20%硝酸溶液で1500μlまで希釈した。操作は、得られた溶液15μlと、その後に得られた溶液150μlで繰返して、10ppb(μg/l)アルミニウム溶液を得る。
本発明によるアルブミンと市販HSAの脂肪酸プロフィールは、C17:0内部標準を用いて、遊離脂肪酸の酸性溶媒抽出とガスクロマトグラフィーにより分析した。
試薬:水(Milli-Q);ジクロロメタン超純粋溶媒(Romil Chemicals,Loughborough,Leics.);酢酸ナトリウム・三水和物Analar(BDH Ltd.Poole);氷酢酸Analar(BDH Ltd.Poole);ヒト血清アルブミン溶液(ZenalbTM20,Bio Products Laboratory ,Elstree,Herts.);無水硫酸ナトリウム(分析試薬);Sigmaからの標準脂肪酸
溶液:
0.5M酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5;酢酸ナトリウム6.13gおよび酢酸3.30g/100ml
遊離脂肪酸標準混合物.各脂肪酸5mgを別々のガラスバイアル中に秤量する。各脂肪酸をジクロロメタン1mlに溶解し、短鎖(C6‐C14)、中鎖(C16‐C18)および長鎖(C20‐C22:1)脂肪酸について3つの12ml Pyrex培養管に各々移す。窒素流下で混合物を乾燥させ、ジクロロメタン1mlに溶解する。混合物を50μlずつ、ラベルしたガラスバイアルに移し、窒素下で乾燥させ、キャップを付して、−20℃で貯蔵する。
操作
1. 6つのラベルした40ml Pyrex管に内部標準溶液50μlを加える。
2. 5%rHAの場合にはサンプル5mlを加える。25%rHAの場合にはサンプル1mlおよび水4mlを用いる。ブランク(水5ml)および血清アルブミンサンプル(ZenalbTM20の1.25mlおよび水3.75ml)を含める。すべてのサンプルを二重に調製する。
3. 酢酸ナトリウム緩衝液2.5ml、その後ジクロロメタン10mlをすべての管に加える。
4. 室温で2時間にわたり機械ローラー上にキャップ付きの管をおく。
5. Sorvall RT6000B遠心機中、20℃、3000rpmで5分間にわたりすべての管を遠心する。
6. 上方の水相を除去し、その後管の底から作業して、ラベルした12ml Pyrex管中に下方のジクロロメタン相を慎重に移す。球状タンパク質はすべてのジクロロメタン相の除去を妨げることがある。これが生じるならば、1スパチュラ分の無水硫酸ナトリウムを加え、キャップを付して、振盪する。
7. 窒素流下でジクロロメタン相を乾燥させ、分析するまで窒素下−20℃で貯蔵する。
8. キャピラリーカラムを取り付けて、製造業者の説明に従いガスクロマトグラフを下記条件にセットする。
検出器:フレームイオン化;キャリアガス:窒素30ml/min;注入容量:0.5μl;カラム初期温度:70℃;保持:1.5min;勾配1:150℃まで20℃/min;勾配2:240℃まで4℃/min;保持:7min;検出器温度:280℃;Shimadzu GC9Aに特有のセッティングは:検出器レンジ(range):10゜;水素圧:0.5kg/cm2;空気圧:0.5kg/cm2;停止時間:50minである。
9. 製造業者の説明に従いガスクロマトグラフからデータを集めるために、インテグレーターを調整する。
10. オーブン温度を245℃に上げ、定常ベースラインに達するまでそのままにしておく。
11. オーブン温度を70℃に下げて、平衡化させる。
12. 長、中および短鎖脂肪酸標準のアリクウオットを解凍させる。長鎖脂肪酸をジクロロメタン1mlに溶解する。その溶液を中鎖脂肪酸に移して、溶解させる。短脂肪酸についても繰り返す。
13. 脂肪酸保持時間を調べるために標準混合物を注入する。得られたクロマトグラムは非常に小さなピークテーリングを有し、平坦でゆっくり立ち上がるベースラインを有して、正確な数のよく分割されたピークを持っているべきである。カプロン酸(C6:0)は約6minの保持時間で、エルカ酸(C22:1)は約33minの保持時間で溶出するはずだ。例の標準クロマトグラムと比較してすべてのピークを同定する。
14. サンプルを注入して、データを集める。
1. ブランクサンプルから内部標準ピークを同定する。これは保持時間約23.5minの主ピークである。
2. 下記式を用いて、すべてのサンプルで、すべての積分ピークについてピーク面積比を計算する。
ピーク面積比 = ピーク面積
内部標準ピーク面積
3. 標準との比較により、保持時間に基づきrHAおよびHSAサンプルで脂肪酸ピークを同定する。
4. 下記ファクターを用いて、rHAおよびHSA双方のサンプルについて、すべてのピーク面積比を大体の濃度(μg/gアルブミン)に変換する:
濃度(μg/g)=ピーク面積比×200
5. 脂肪酸として同定されたピークの場合には、脂肪酸の分子量と下記式を用いて、濃度をμg/gアルブミンからモル/モルアルブミンに変換する:
濃度(モル/モル) = 濃度(μg/g)×0.0665
脂肪酸分子量
表11.本発明の製造法に従い精製されたrHAと市販HSAとの脂肪酸組成の比較
脂肪酸含量( mol/mol タンパク質)
脂肪酸 rHA HSA
C10:0 0.100 0.005
C12:0 0.020 0.011
C14:0 0.005 0.017
C16:0 0.013 0.152
C16:1 0.064 0.023
C18:0 0.002 0.024
C18:1 0.012 0.145
C18:2 ND 0.089
C18:3 ND 0.006
C20:0 ND 0.001
C20:1 ND 0.001
C20:2 ND ND
C20:4 ND 0.006
合計 0.216 0.480
ND=検出されず
好ましくは、C18脂肪酸の全レベルはオクタノエートのレベルの1.0%(モル/モル)を超えず、好ましくはそのレベルの0.5%を超えない。更に、本発明のアルブミンにおいて、C18:2、C18:3およびC20脂肪酸のレベルは通常検出不能である。市販HSAの場合だと、典型的にはアルブミン1モル当たりC10〜C20脂肪酸約0.4モルである。本発明の生成物では、典型的にはC20脂肪酸について検出不能であり、アルブミン1モル当たりC18脂肪酸約0.01〜0.02モルにすぎない。
波長 平均吸光度(n=10バッチ)
(nm) (L・g-1・cm-1)
350 4.74×10−3
403 2.12×10−3
500 0.58×10−3
通常、本発明のアルブミンは上記3つの波長で6.0×10−3、
2.5×10−3および0.75×10−3の各吸光度を超えない。
サンプル A 350 A 403 A 500
1 9.95 4.10 0.8
2 9.25 5.36 1.1
3 7.40 3.26 0.6
4 7.20 3.60 0.6
5 8.68 4.08 0.8
6 11.45 6.26 1.2
7 7.20 3.70 0.8
8 6.82 4.78 1.8
SDS還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動‐このアッセイは、rHAが、還元剤(β‐メルカプトエタノール)で処理されたときに、SDS還元ポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)で単一バンド(モノマー)として移動する単一ポリペプチド鎖からなることを示すために行う。
本発明のプロセスの主態様(即ち、陰イオン交換ステップが限外ロ過および処方前の最終ステップである)における陰イオン交換マトリックスからの溶出液中でアルブミンの10mg/ml溶液25μlをShimadzu LC6A HPLCでTSK3000SWXLカラムに注入する。製品は少くとも99.9%モノマーであることがわかった。
本発明のプロセスにより得られたアルブミンのrHA2μgを、Millipore Investigatorシステムを用いて二次元電気泳動に付した。第一の次元での分離はpH3〜10等電点電気泳動ゲルであり、その後第二の次元で10%ポリアクリルアミド/SDSゲルを行った。Coomassie Blueによるゲルの染色では1つだけのスポットが見え、1つだけのタンパク質種の存在を示した。
電気スプレー質量スペクトル分析(ESMS)はVG Quattro電気スプレー質量スペクトル分析器を用いて行い、m/z範囲950〜1750Da/eでウマ心臓ミオグロビン(16951Da、Sigmaから入手)で較正した。市販HSAのサンプルおよび本発明に従い精製されたrHAのサンプルは、トリフルオロ酢酸を含有したアセトニトリル勾配を用いて、逆相HPLCによる分析前に脱塩させた。図6aおよびbは、本発明のアルブミンおよび従来技術のHSAに関するスペクトルを各々示している。後者はブロックされた遊離チオールおよびN末端分解を表したピークを示す。
2年以上、アルブミンの分解は電気泳動法で検出できず、このことはプロテアーゼ活性が存在しないことを示している。
Claims (15)
- アルブミンが特異的親和性を有していないクロマトグラフィー材料に比較的不純なアルブミン溶液を適用してアルブミンがその材料に結合し、アルブミンに特異的親和性を有する化合物の溶液を適用することによりその材料から結合アルブミンを溶出させるステップを含む、アルブミンを精製するための方法。
- クロマトグラフィー材料が陽イオン交換樹脂である、請求項1に記載の方法。
- 化合物が脂肪酸塩例えばオクタノエートである、請求項1または2に記載の方法。
- ボロン酸またはその塩を含んでなるクロマトグラフィー材料に比較的不純なアルブミン溶液を暴露し、アルブミン溶液からその材料を分離して精製アルブミンを得るステップを含む、アルブミンを精製するための方法。
- アルブミン溶液が複合糖質および/または糖類を含有している、請求項4に記載の方法。
- 複合糖質および/または糖類が酵母糖タンパク質を含む、請求項5に記載の方法。
- ボロン酸がアミノフェニルボロン酸またはその塩である、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
- アミノフェニルボロン酸がアガロースゲルに固定化されている、請求項7に記載の方法。
- アルブミン溶液が酢酸(acetate)イオン、塩化物イオン、オクタン酸(octanoate)イオンおよびアンモニウムイオンのうち1または2種以上で緩衝化されている、請求項4〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 溶液が10〜100mM酢酸イオン、10〜100mMアンモニウムイオン、20〜2000mM塩化物イオンおよび1〜20mMオクタン酸イオンを含有していて、9.0〜9.5のpHを有している、請求項9に記載の方法。
- 精製されたアルブミンがヒトへの静脈内投与用に更に精製および/または処方される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- アルブミン溶液を精製する方法であって、アルブミンに特異的親和性を有する固定化された色素に溶液を暴露して、アルブミンを、色素上に45kD断片を残留させながら溶出させることを特徴とする、一定のアルブミン分泌微生物により生産される約45kDアルブミン断片(1‐403〜1‐409)を含有するアルブミン溶液を精製する方法。
- 色素がCibacron Blue タイプの色素である、請求項12に記載の方法。
- 色素がスペーサーを介して樹脂に固定化されている、請求項13に記載の方法。
- スペーサーがα,ω‐ジアミノ‐(C1〜6直鎖アルキル)基である、請求項14に記載の方法。
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