DE69632353T2

DE69632353T2 - Hochreines Albumin, durch ein mehrstufiges Verfahren hergestellt

Info

Publication number: DE69632353T2
Application number: DE69632353T
Authority: DE
Inventors: Andrew Robert Goodey; Darrell Sleep; Hendrik Van Urk; Stephen Berezenko; John Rodney Woodrow; Richard Alan West Bridgford Johnson; Patricia Carol Wood; Stephen James Burton; Alan Victor Costock Quirk
Original assignee: Delta Biotechnology Ltd
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 1995-05-25
Filing date: 1996-02-29
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2016-03-01
Also published as: JP2006342169A; US6638740B1; ES2156991T3; JP4372813B2; KR100566606B1; PT1031578E; CA2220923A1; KR19990021994A; CN100455597C; CN1550504A; AU4838096A; ES2219257T3; EP1031578A3; PT828759E; CN100584857C; MX9709108A; DE69611445D1; CN1198844C; CA2220923C; HK1072436A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Reinigen des Proteins humanes Serumalbumin (HSA), das aus Serum extrahiert wird, oder rekombinantes humanes Albumin (rHA), das durch Transformieren eines Mikroorganismus mit einer Nukleotidcodiersequenz erzeugt wird, die die Aminosäurensequenz von humanem Serumalbumin codiert, erzeugt wird. In dieser Beschreibung bezieht sich der Begriff "Albumin" ganz allgemein auf HSA und/oder rHA.
Albumin wird verwendet, um Patienten mit ernsten Verbrennungen, Schock oder Blutverlust zu behandeln. Es wird auch verwendet, um Medien zu anzureichern, die zum Heranziehen von höheren eukaryotischen Zellen verwendet werden, und als Füllstoff bei der Formulierung von therapeutischen Proteinen. Derzeit wird die Nachfrage für dieses Produkt durch Albumin befriedigt, das aus menschlichem Blut extrahiert wird. Beispiele für Extraktions- und Separationstechniken umfassen jene, die offenbart sind in: der JP 03/258 728, betreffend die Verwendung eines Kationentauschers, der EP 428 758 , betreffend die Anwendung eines Anionenaustausches gefolgt von einem Kationenaustausch, und der EP 452 753 betreffend das Anwenden von Erhitzen, Salz Hinzufügen und Diafiltrieren.
Die Herstellung von rHA in Mikroorganismen ist offenbart worden in der EP 330 451 und der EP 361 991 . Reinigungstechniken für rHA sind offenbart worden in der WO 92/04367, Entfernung von Farbstoffen, die von der Matrix herrühren, der EP 464 590 , Entfernung von Verfärbungen, die von Hefe herrühren, und der EP 319 067 , alkalische Präzipitation und nachfolgendes Aufbringen des rHA auf eine lipophile Phase, die eine spezifische Affinität für Albumin aufweist. Die EP 570 916 und die EP 612 761 offenbaren gereinigtes rHA.
Die vorliegende Erfindung stellt hochgereinigtes Albumin bereit, das ein Glykationsniveau von weniger als 0,6 mol Hexose/mol Protein aufweist und einen einzigen Peak bei einem Kapillarzonenelektrophoretogramm aufweist.
Das Albumin kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das die Schritte aufweist des Aufbringens einer relativ unreinen Albuminlösung auf ein chromatographisches Material, für das das Albumin keine spezifische Affinität aufweist, so dass das Albumin an das Material anbindet, und des Eluierens des gebundenen Albumins von dem Material durch Aufbringen einer Lösung einer Verbindung mit einer spezifischen Affinität für das Albumin. Vorzugsweise ist das chromatographische Material ein Kationentauscher, wie beispielsweise SP-Sepharose FF, SP-Spherosil usw., wie sie unten im Beispiel 2 aufgelistet sind. Die Verbindung mit der spezifischen Affinität für Albumin kann/können Octanoat (z. B. Natriumoctanoat), andere langkettige (C₆ bis C₂₂) Fettsäuren, Salicylat, Octylsuccinat, N-Acetyltryptophan oder eine Mischung von zwei oder mehr von diesen sein.
Das Verfahren zum Reinigen des Albumins kann die Schritte aufweist des Unterwerfens einer Albuminlösung unter eine Kationenaustauschchromatographie, in der das Albumin an ein Kationenaustauschmaterial gebunden wird, und dann unter eine Anionenaustauschchromatographie, in der das Albumin an ein Anionenaustauschmaterial gebunden wird.
Das Albumin, das von dem Kationenaustauschmaterial eluiert wird, kann nachfolgend durch eine oder mehrere der Maßnahmen Affinitätschromatographie, Ultrafiltration und Gelpermeation behandelt werden, bevor es der Anionenaustauschchromatographie unterworfen wird. So weist das Verfahren in einer bevorzugten Ausführungsform die Schritt auf:

(a) Durchführen einer Albuminlösung durch einen Kationenaustauschmatrix unter solchen Bedingungen, dass das Albumin an die Matrix anbindet;
(b) Eluieren eines Albumin-haltigen Kationenaustauscheluats von der Matrix;
(c) Hindurchführen des Eluats durch eine Affinitätsmatrix, die eine Albumin-bindende Verbindung aufweist;
(d) Eluieren eines Albumin-haltigen Affinitätsmatrixeluats von der Matrix;
(e) Hindurchführen des Eluats, optional nach Ultrafiltration, durch eine Gelpermeationsmatrix, um eine an Albumin angereicherte Fraktion zu erhalten;
(f) Hindurchführen der Albumin-angereicherten Fraktion durch eine Anionenaustauschmatrix unter solchen Bedingungen, dass das Albumin an die Matrix anbindet; und
(g) Eluieren eines gereinigten Albumin-haltigen Produkts von der Anionenaustauschmatrix.

Alternativ kann das Albumin, das von dem Kationenaustauschmaterial eluiert wird, ohne jegliche Zwischenbehandlung (andere als Verdünnung) auf das Anionenaustauschmaterial aufgebracht werden. So stellt eine zweite bevorzugte Ausführungsform ein Verfahren zum Reinigen von Albumin bereit, das die Schritte aufweist:

(a) Hindurchführen einer Albuminlösung durch eine Kationenaustauschmatrix unter solchen Bedingungen, dass das Albumin an die Matrix anbindet,
(b) Eluieren eines Albumin-haltigen Kationenaustauscheluats von der Matrix,
(c) Hindurchführen des Kationenaustauscheluats durch eine Anionenaustauschmatrix unter solchen Bedingungen, dass das Albumin an die Matrix anbindet;
(d) Eluieren eines Albumin-haltigen Anionenaustauscheluats von der Anionenaustauschmatrix,
(e) Hindurchführen des Anionenaustauscheluats durch eine Affinitätsmatrix, die eine Albumin-bindende Verbindung aufweist,
(f) Eluieren eines Albumin-haltigen Affinitätsmatrixeluats von der Affinitätsmatrix,
(g) Hindurchführen des Affinitätsmatrixeluats durch eine Gelpermeationsmatrix, um eine an Albumin angereicherte Fraktion zu erhalten.

Vorzugsweise wird die Albuminlösung vor dem Kationenaustauschschritt durch Hinzufügen von Octanoat und/oder anderen Albuminstabilisatoren (z. B. Natriumacetyltryptophanat) bis auf eine Endkonzentration von etwa 1–10 mM und Einstellen des pH-Werts auf etwa 4,0–5,0 konditioniert.
Vorteilhafterweise wird das Albumin, das in dem Kationenaustauschschritt zurückgehalten wird, mit einer konzentrierten Salzlösung (z. B. 0,5–2,0 M NaCl, gepuffert bei pH 4,0 mit 10–100 mM, vorzugsweise 20–40 mM, beispielsweise 27 mM Natriumacetat) gewaschen, bevor es eluiert wird.
Vorzugsweise wird das Albumin in Verfahren, in denen das Kationenaustauscheluat direkt auf den Anionentauscher überführt wird, in dem Kationenaustauschschritt unter Verwendung eines Puffers eluiert, der eine Verbindung mit einer spezifischen Affinität für Albumin aufweist, vorzugsweise eine Säure oder ein Salz derselben, beispielsweise Octaonat, oder jede andere langkettige (C₆ bis C₂₂) Fettsäure, Salicylat, Octylsuccinat oder N-Acetyltryptophan.
Geeigneter Weise wird das Albumin von dem Anionentauscher mit einem Puffer eluiert, der eine hohe Konzentration (z. B. mindestens 50 mM, vorzugsweise 50–200 mM, beispielsweise 80–150 mM) eines Borsäuresalzes, wie z. B. Natrium- oder Kaliumtetraborat, enthält.
Das Albumin kann dann, mit oder ohne Verfahrenszwischenschritte, einer Chromatographie auf einem Harz unterworfen werden, das eine immobilisierte Verbindung enthält, welche selektiv Glykokonjugate und Saccharide, so wie Aminophenylborsäure (PBS) bindet.
Das Verfahren zum Reinigen des Albumins kann den Schritt aufweisen des Aussetzens einer relativ unreinen Albuminlösung gegenüber einem chromatographischen Material, das eine Borsäure oder ein Salz davon aufweist, und des Trennens des Materials von der Albuminlösung, um gereinigtes Albumin zu erhalten. Geeigneter Weise enthält die Lösung Glykokonjugate und/oder Saccharide. Vorzugsweise weisen die Glykokonjugate und/oder Saccharide Hefeglykoproteine auf.
Vorzugsweise ist die Borsäure, Aminophenylborsäure oder ein Salz davon. Vorzugsweise ist die Aminophenylborsäure auf einem Agarosegel immobilisiert.
In einer Ausführungsform ist die Albuminlösung mit einem oder mehreren Acetationen, Chloridionen, Oktanoationen und/oder Ammoniumionen gepuffert. Vorzugsweise enthält die Lösung 10 bis 100 mM Acetationen, 10 bis 100 mM Ammoniumionen, 200 bis 2000 mM Chloridionen und 1 bis 20 mM Oktanoationen und weist einen pH-Wert von 9,0 bis 9,5 auf.
In jeglichem solchen Verfahren, das Affinitätschromatographie einschließt, verwendet die Affinitäschromatographie vorzugsweise ein Harz, das einen immobilisierten Albumin-spezifischen Farbstoff enthält, so wie einen Farbstoff vom Cibacron Blue Typ, vorzugsweise an dem Harz immobilisiert durch einen Mittler (Spacer), so wie 1,4-Diaminbutan oder einen anderen Mittler von C_1-8, vorzugsweise C_1-6, beispielsweise C_1-5 und am meisten bevorzugt C₄ Länge, vorzugsweise mit einer α, ω-Diaminsubstitution. In einer Ausführungsform ist der Mittler eine α, ω-Diamin-(geradkettige C_1-6 Alkyl)-Gruppe.
In Überraschenderweise haben wir herausgefunden, dass solche Farbstoffe tatsächlich eine größere Affinität für ein 45 kD Albuminfragment, das in Kulturen von HA-sekretierenden Mikroorganismen produziert werden kann, aufweisen als für das Albuminmolekül voller Länge. Das 45 kD-Fragment besteht typischerweise aus dem 1–403 bis 1–409 Bereich und ist in Sleep et al (1990) Bio/Technology 8, 42–46 und in der WO 95/23857 offenbart.
Dementsprechend stellt dieses Vorgehen ein Verfahren zum Reinigen einer Albuminlösung bereit, die das ungefähr 45 kD Albuminfragment (1–403 bis 1–409) enthält, welches von bestimmten Albumin sekretierenden Mikroorganismen erzeugt wird, wobei das Verfahren das Aussetzen der Albuminlösung gegenüber einem immobilisierten Farbstoff mit einer spezifischen Affinität für Albumin und das Eluieren des Albumins aufweist, während das 45 kD Fragment an dem Farbstoff zurückgelassen wird.
Die gereinigte Albuminlösung, die durch das Verfahren der Erfindung präpariert wurde, kann entsprechend ihrer vorgesehenen Verwendung weiter verarbeitet werden. Zum Beispiel kann sie durch eine Ultrafiltrationsmembran ultrafiltriert werden, um ein Ultrafiltrationsretentat mit einer Albuminkonzentration von mindestens etwa 80 g Albumin pro Liter zu erhalten, wobei das Ultrafiltrationsretentat gegen mindestens fünf Retentatäquivalente Wasser diafiltriert wird. Es kann vorteilhaft sein, Ammoniumionen in bestimmten chromatographischen Schritten vorzusehen, z. B. in dem Schritt, der das immobilisierte Aminphenylboronat betrifft. Überraschenderweise haben wir herausgefunden, dass solche Ammoniumionen relativ fest an das Albumin angebunden werden. Es ist bevorzugt, dass solche Ammoniumionen von dem Albumin entfernt werden, und wir haben herausgefunden, dass dies durch die Verwendung eines Gegenions erreicht werden kann. Der Wunsch, das Albumin einem Gegenion auszusetzen, wäre dem Fachmann nicht gekommen, weil bisherige Verfahren keine Ammoniumionen eingesetzt haben und es keinen Grund gab, anzunehmen, dass Ammoniumionen von dem Albumin gebunden würden.
Entsprechend stellt ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Reinigen einer Albuminlösung bereit, das das die Lösung einem Gegenion Aussetzen aufweist, so dass die Ammoniumionen von dem Albumin abgelöst werden und aus der Lösung entfernt werden können.
Das Gegenion (vorzugsweise ein Metallion, so wie Natriumionen) kann zu der Albuminlösung hinzugegeben werden, und die Ammoniumionen können durch Dialyse entfernt werden, oder die Ammoniumionen können über eine semipermeable Membran, die das Albumin von der Lösung des Gegenions trennt, hinweg abdiafiltriert werden, oder sie können durch Gelpermeationschromatographie entfernt werden. Diafiltration gegen mindestens fünf Retentatvolumen von 50 mM Natriumchlorid ist im Allgemeinen geeignet.
So kann man ein Verfahren zum Reinigen einer Albuminlösung verwenden, das das Aussetzen der Lösung gegenüber einem chromatographischen Material in einem Ammoniumionen enthaltenden Puffer und das nachfolgende Entfernen der Ammoniumionen durch ein oben beschriebenes Verfahren aufweist, um ein gereinigtes Albuminprodukt zu erhalten, optional nach weiteren Reinigungs- und Formulierungsschritten. Vorzugsweise weist das chromatographische Material immobilisierte Borationen auf.
In einer Ausführungsform wird die gereinigte Albuminlösung für die intravenöse Verabreichung an einem Menschen weiter gereinigt und formuliert.
Von dem erhaltenen Albumin ist herausgefunden worden, dass es sehr niedrige Niveaus aufweist an bzw. im wesentlichen frei ist von Farbstoffen, Lactat, Citrat, Metallen, menschlichen Proteinen, sowie Immunglobulinen, pre-Kallikreinaktivator, Transferrin, α₁-Säureglykoprotein, Haemoglobin und Blutgerinnungsfaktoren, prokaryotische Proteinen, Fragmenten von Albumin, Albuminaggregaten oder -polymeren, Endotoxin, Billirubin, Haem, Hefeproteinen und Viren. Mit "im wesentlichen frei" ist unterhalb nachweisbarer Niveaus gemeint. Der Begriff "Farbstoff", wie er hier verwendet wird, meint jede Verbindung, die Albumin färbt. Zum Beispiel ist ein Pigment ein Farbstoff, der von dem Organismus, insbesondere Hefe, herrührt, der verwendet wird, um rekombinantes Albumin zu präparieren, während eine Farbe ein Farbstoff ist, die von chromatographischen Schritten zum Reinigen des Albumins herrührt. Mindestens 99 Gewichts-%, vorzugsweise mindestens 99,9 Gewichts%, des Proteins in der Albuminpräparation, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gereinigt wurde, ist Albumin. Solch hochreines Albumin verursacht mit geringerer Wahrscheinlichkeit negative Nebenwirkungen.
Von dem durch diese Verfahren hergestellten Albumin wurde durch eine reduzierende SDS-PAGE herausgefunden, dass es zu mindestens 99,5% monomer, vorzugsweise im wesentlichen zu 100% monomer ist und dass es durch eines oder mehrere der folgenden Merkmale charakterisiert ist. Es hat einen Aluminiumionengehalt von weniger als 150 ng, vorzugsweise von weniger als 100 ng; einen Eisenionengehalt von weniger als 3.000 ng, vorzugsweise von weniger als 1.000 ng; einen Kupferionenniveau von weniger als 10.000 ng, vorzugsweise weniger als 5.000 ng; ein Magnesiumionenniveau von weniger als 3.000 ng, vorzugsweise weniger als 1.500 ng; ein Zinkionenniveau von weniger als 5.000 ng, vorzugsweise weniger als 3.000 ng; ein Manganionenniveau von weniger als 50 ng, jeweils bezogen auf 1 g Albumin; ein Glykationenniveau von weniger als 0,6, vorzugsweise von weniger als 0,15 (noch mehr bevorzugt von weniger als 0,05) mol Hexose/mol Protein; ein Niveau an niedrigmolekulargewichtigen Verunreinigungen unterhalb 20 Vsek, vorzugsweise weniger als 10 Vsek, gemessen wie in Beispiel 9, unten; einen einzigen Peak auf einem Kapillarzonenelektrophoretogramm; intakte, d. h. homogene C- und N-Termini; einen Gehalt von freiem Thiol von mindestens 0,85 mol SH/mol Protein; und nicht mehr als 0,3 mol/mol von C₁₀ bis C₂₀ Fettsäuren und im wesentlichen keine C₁₈ oder C₂₀ Fettsäuren.
Das Ausgangsmaterial kann ein Albumin-haltiges Fermentationsmedium sein, oder die unreine Albuminlösung kann eine Lösung sein, die aus Serum durch jede aus der Vielzahl von Extraktions- und Reinigungstechniken erhalten wurde, welche innerhalb der letzten 50 Jahre entwickelt wurden, beispielsweise jene, die offenbart sind in Stoltz et al (1991) Pharmaceut. Tech. Int. Juni 1991, 60–65 und More & Harvey (1991) in "Blood Separation and Plasma Fractionation" Hrs. Harris, Wiley-Liss, 261–306.
Insbesondere, wenn das Albumin rHA ist, das in Proteasedefizienten Hefen oder anderen Organismen produziert wurde, umfaßt das Verfahren normalerweise keinen Hitzebehandlungsschritt als Teil des Reinigungsverfahren (im Gegensatz zur EP 428 758 und EP 658 569 ). Entsprechend erfordert es, falls es von Mikroorganismen (im Gegensatz zu humanen Quellen) präpariert wurde, normalerweise keinen abschließenden Pasteurisierungsschritt (typischerweise 60°C für eine Stunde).
Das Endprodukt kann formuliert werden, um ihm zusätzliche Stabilität zu geben. Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße hochreine Albuminprodukt mindestens 100 g, noch bevorzugter 1 kg oder 10 kg Albumin, das auf eine Mehrzahl von Phiolen aufgeteilt sein kann.
Obwohl solche Verfahren verwendet werden können, um stärker gereinigtes Albumin aus einer unreinen Albuminlösung aus einer Anzahl von Quellen, so wie Serum, zu erhalten, sind sie insbesondere zum Reinigen von rekombinantem humanem Albumin (rHA) anwendbar. Das Albumin, das erfindungsgemäß hergestellt wurde, kann jedes Säugetieralbumin sein, so wie Ratten-, bovines oder ovines Albumin, vorzugsweise ist es aber humanes Albumin. Albumin codierende DNA kann in einem geeigneten Wirt expressiviert werden, um Albumin zu erzeugen. So kann DNA gemäß bekannten Techniken verwendet werden, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann verwendet wird, um eine geeignete Wirtszelle für die Expression und die Produktion von Albumin zu transformieren. Solche Techniken umfassen jene, die in der EP-A-73 646, der EP-A-88 632, der EP-A-201 239 und der EP-A-387 319 offenbart sind.
Viele Expressionssysteme sind bekannt, einschließlich Bakterien (z. B. E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (z. B. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris und Kluyveromyces lactis), filamentöse Pilze (z. B. Aspergillus), Planzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen. Der bevorzugte Mikroorganismus ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die anfängliche Albuminlösung ein Hefekulturmedium, das durch Kultivieren von Hefe in einem Fermentationsmedium erhalten wird, die mit einer Albumin enthaltenden Nukleotidsequenz transformiert ist, wodurch die Hefe Albumin expressiviert und sekretiert.
Beispielhafte Arten von Hefe, die als nützlich in der Praxis der vorliegenden Erfindung angesehen werden, sind Pichia (Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, und dgl. Bevorzugte Arten sind jene, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Pichia (Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia und Hansenula ausgewählt sind. Beispiele für Saccharomyces Spezies sind S. cerevisiae, S. italicus und S. rouxii. Beispiele für Kluyveromyces-Spezies sind K. fragilis und K. lactis. Beispiele für Pichia (Hansenula) sind P. angusta (früher H. polymorpha), P. anomala, P. pastoris und P. capsulara. Y. lipolyrica ist ein Beispiel einer geeigneten Yarrowia-Spezies.
Es ist vorteilhaft, einen Hefestamm zu verwenden, dem es an einer oder mehreren Proteasen mangelt. Solche Stämme umfassen die wohlbekannten pep 4-3-Mutanten mit Mutationen in den PRA1- und/oder PRB1-Genen, wie bei Woolford et al (1993) J. Biol. Chem. 268. 8990–8998, Cabezón et al (1984) P. N. A. S. 81, 6594–6598, der EP-A-327 797 und Jones et al (1982) Genetics 102, 665-677. Alternativ können die Proteasen in dem Fermentationsmedium durch Erhitzen inaktiviert werden. Die Existenz von Proteasen reduziert die Ausbeute an Albumin während des gesamten Verfahrens.
Vorzugsweise hat die Hefe ein niedriges (oder null-) Niveau an Yap3p-Protease und/oder an hsp150-Hitzeschockprotein, beispielsweise weil die entsprechenden Gene unterbrochen sind, wie in unseren als WO 95/23857 und WO 95/33833 publizierten Patentanmeldungen gelehrt wird. Yap3p kann die Bildung des 45 kD Albuminfragments verursachen, auf das unten Bezug genommen wird, und hsp150 wird in bestimmten Separationsschritten gemeinsam mit Albumin aufgereinigt.
Hefe kann mit einem Expressionsplasmid transformiert werden, das auf dem Saccharomyces cerevisiae-2 μm Plasmid basiert. Zum Zeitpunkt des Transformierens der Hefe, enthält das Plasmid bakterielle Replikations- und Selektionssequenzen, die nach Transformation durch ein internes Rekombinationsereignis gemäß der Lehre der EP 286 424 ausgelöscht werden können. Das Plasmid kann außerdem eine Expressionskassette aufweisen: einen Hefepromotor (so wie den Saccharomyces-cerevisiae-PR81- Promoter), wie in der EP 431 880 gelehrt; eine Sequenz, die einen Sekretionsleader codiert, beispielsweise einen, der das meiste des natürlichen HSA-Sekretionsleaders aufweist, plus einen kleinen Bereich des S. cerevisiae-α-Matingfaktorsekretionsleaders, wie in der WO 90/01063 gelehrt; die HSA-codierende Sequenz, die durch bekannte Verfahren zum Isolieren von humanen Genen entsprechender cDNA erhaltbar ist und beispielsweise auch in der EP 73 646 und der EP 286 424 offenbart ist; und einen Transkriptionsterminator, beispielsweise den Teminator von Saccharomyces ADHI, wie in der EP 60 057 gelehrt.
Die Auswahl der verschiedenen Elemente des oben beschriebenen Plasmids wird für die Reinheit des erhaltenen Albuminprodukts als nicht direkt relevant angesehen, obwohl die Elemente zu einer verbesserten Ausbeute des Produkts beitragen können.
Bevorzugte Aspekte der Erfindung werden jetzt im Wege von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben werden, in denen:
1 schematisch einen Fermentationsbehälter zeigt, der zum Produzieren von rHA verwendet wird;
2 ein UV-Spektrum von einer C18 PTH-Umkehrphasen-HPLC-Säule (Applied Biosystems Inc) ist, das das niedrige Niveau an niedrigmolekularen Verunreinigungen in dem erfindungsgemäßen Albumin zeigt;
3 2 ähnlich ist, aber die niedrigmolekulargewichtigen Verunreinigungen von Albumin gemäß dem Stand der Technik zeigt;
4 ein Gaschromatogramm ist, das den Fettsäurengehalt von kommerziell verfügbarem Albumin zeigt;
5 4 entspricht, aber das erfindungsgemäße Albumin zeigt; und
6a und 6b Elektronensprühmassenspektrometrien für erfindungsgemäßes Albumin und Albumin nach dem Stand der Technik zeigen.
Beispiel 1: Präparation von einer unreinen Albuminlösung
Die Clonierstrategie für die Ausbildung von Albumin-produzierenden Mikroorganismen war wie in der EP 431 880 beschrieben. Das Plasmid pAYE316 wurde in einen (MATa, leu2, pep4-3, [cir°]) Saccharomyces cerevisiae-Stamm durch die Methode eingeführt, die von Hinnen et al, (1978) P. N. A. S. 75, 1929 beschrieben wurde. Transformanten wurden auf einem Minimalmedium, dem es an Leucin fehlte, (Hefestickstoffbasis, Difco) selektiert. Nachdem die Transformanten für 72 Stunden bei 30°C, 200 U/min in 50 ml Kolben, die entweder 10 ml von komplexem (HEP, 1% (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 2% (Gew./Vol.) Bactopepton und 2% (Gew./Vol.) Sukrose), oder definierter (0,15% (Gew./Vol.) Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und Ammoniumsulphat, 0,5% (Gew./Vol.) Ammoniumsulphat, 0,1 M Zitronensäure/Na₂HPO₄12·H₂O pH 6,5, 2% (Gew./Vol.) Sukrose) Flüssigmedium gezogen worden waren, konnte rHA in dem zellenfreien Kulturüberstand durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und/oder durch Rocketgelimmunoelektrophorese nachgewiesen werden.
Eine Stammzellkulturmutter in definiertem Flüssigmedium (gepuffertes Minimalmedium-(Buffered Minimal Medium = BMM)-Salzmedium: Hefestickstoffbasis [ohne Aminosäuren und (NH₄)₂SO₄, Difco] 1,7 g/L; Zironensäuremonohydrat 6,09 g/L; wasserfreies Na₂HPO₄ 20,16 g/L, pH 6,5 ± 0,2, Sukrose ist bis auf 20 g/L zugesetzt) wird verwendet, um laufende Bestände (arbeitende Zellbank des Herstellers) an Prozesshefe zu präparieren, die für die Präparation von Schüttelkolbenkulturen durch Einfrieren von Aliquots der Kultur in der Gegenwart von 20% (Gew./Vol.) Trehalose geeignet ist.
Fermentation
Dieser Abschnitt bezieht sich auf die Herstellung von rHA aus Stammkulturen durch die abschließende Fermentation und ist eine allgemeine Definition eines rHA-Fermentationsverfahrens, das nicht auf das spezielle Detail der konkreten Ausrüstung oder der Skalierung beschränkt ist.
Schüttelkolbenkultur
Die Hefe (cir°, pAYE316] wird als eine axenische Kultur gezogen, die physiologisch für die Beimpfung des Keimbehälters geeignet ist. Wenn der Zeitablauf im Keimbehälter reproduzierbar sein soll, ist es notwendig, die Phase des Wachstums (primärer Kohlenhydratüberschuß) und die Impfbiomasse (12 ± 2 mg/L, was 100 ml Impflösung pro 10 L Medium erfordert) zu definieren. Eine Stammphiole wird in einen Schüttelkolben eingeimpft, der 100 ml BMM +2% (Gew./Vol.) Sukrose enthält, und der Kolben wird bei 30°C auf einem Orbitalschüttler (200 Umdrehungen/min) inkubiert, bis ein Zelltrockengewicht (Cell Dry Weight = cdw) von 0,6–1,2 g/L (erfaßt über die optische Dichte bei 600 nm) erreicht ist. Diese Kultur wird dann verwendet, um einen Fermentationskeimbehälter auf ein Niveau von 12 ± 2 mg/L zu beimpfen.
Keimfermentation. Das Impflösung für den Hauptproduktionsfermentationsbehälter wird bereitgestellt durch Ziehen der Produktionsorganismen, vorzugsweise S. cerevisiae [cir°, pAYE316] in einem Keimfermentationsbehälter (in diesem Beispiel mit 20 L Arbeitsvolumen) bis auf ein hohes Zelltrockengewicht (cdw) von ungefähr 100 g/L. Es wird ein chargenweises Zugaberegime geführt, um die Akkumulation von Ethanol und Acetat zu minimieren und so die Zellausbeute zu maximieren. Jede Fermentation wird vollständig überwacht und gesteuert über ein Computersteuersystem, so wie die Multi-Fermenter Computer System-(MFCS)-Software, erhältlich von B. Braun (Deutschland). Die von B. Braun gelieferte Software ist ein Überwachungssteuerungs- und Datenaquisitionspaket, entsprechende Pakete sind von anderen Firmen erhältlich. Der Fütterungssteueralgorithmus ist vorgesehen, um die Zugabe von Sukrose so zu steuern, dass durch Vermeiden des Crabtree-Effekts eine maximale Biomasse erreicht wird, wodurch die Produktion von Ethanol und/oder Acetat minimiert wird. Der Fermentationsbehälter wird einer heißen NaOH-Waschung und einer Spülung mit pyrogenfreiem Wasser (PFW) unterworfen. Der hitzesterilisierte Behälter wird ungefähr 10 L steriles MW10 Medium (Tabelle 1), Chargensalze puls -spurenelemente enthalten. Das Medium für die rHA-Produktion kann ultrafiltriert werden (Molgewichttrenngrenze von 10.000), um Endotoxine zu entfernen. TABELLE 1 MW10 MEDIUM
Die Spurenelemente werden zu entmineralisiertem Wasser hinzugefügt, das mit 35 ml/L 98% H₂SO₄ angesäuert war.
*20 g Sukrose/L werden zu dem Chargenmedium in der 20 L Keimfermentationsbehälterstufe hinzugefügt. Jede geeignete Methode der Sterilisation kann verwendet werden, ebenso wie jede Entpyrogenisierungsmethode, wie beispielsweise Ultrafiltration. Die Vitamine sind immer filtersterilisiert.
Nachdem das Medium in den Behälter gegeben wurde, wird die Betriebstemperatur von 30°C eingestellt, ebenso wie die minimale Rührergeschwindigkeit, typischerweise 400–500 U/min. Der anfängliche pH-Wert wird mit Ammoniaklösung (spezifische Wichte 0,901) unter Verwendung eines pH-Steuersets auf 5,7 ± 0,2 eingestellt. 2 M H₂SO₄ wird auch als pH-Korrekturmittel verwendet. In den Behälter werden Sukrose zu 20 g/L, MWW10-Chargenvitamine und Breox-FMT30-Antischaum zu 0,04 g/L hinzu gegeben.
Sterile gefilterte Luft wird in den Behälter mit 0,5 Vol./Vol./min eingeführt (d. h. 0,5 L unverdichtete Luft pro Liter Medium pro Minute), das Medium wird auf 12 ± 2 mg Zelltrockengewicht/L von einer axenischen Schüttelkolbenkultur beimpft, und das MFCS-Computersystem wird gestartet. Nach dem Abschluss der Chargenwachstumphase (signalisiert durch einen Anstieg der gelösten Sauerstoffbeladung von > 15% binnen 30 min.) wird die Zugabe des Fütterungsmediums unter Steuerung durch das MFCS-System eingeleitet. Die Steuerungsstrategie ist effektiv dieselbe, wie unten für die Produktionsfermentation beschrieben. Während der Fermentation wird der Luftstrom in zwei Schritten erhöht, um einen Strom von ungefähr 1/Vol./Vol./min aufrechtzuerhalten. Die gelöste Sauerstoffbeladung (Disolved Oxygen Tension = DOT) wird durch Ändern der Rührergeschwindigkeit zu 20% Luftsättigung geregelt. Wenn die Rührergeschwindigkeit nicht weiter gesteigert werden kann, und die Luftstromrate ihren Maximalwert erreicht hat, steuert der Fütterungssteueralgorythmus die Fütterungsrate, um die Ausbildung von Fermentationsprodukten zu minimieren. Am Ende der Fütterung wird die Kultur in einen Produktionsbehälter überführt.
Produktionsfermentation. Eine axenische Kultur der Hefe [cir°, pAYE16] für die Herstellung von extrazellulärem rHA wird durch fütterungschargenweise Fermentation bis auf ein hohes Zelltrockengewicht (> 80 g/L) erzeugt. Der Produktionsfermentationsbehälter, der in diesem Beispiel ein Fermentationsbehälter mit einem Arbeitsvolumen von 8.000 L ist, wird mit der Kultur beimpft, die in dem Keimfermentationsbehälter gezogen wurde, deren Zelltrockengewicht vorzugsweise > 80g/L ist. Die anfängliche Zelltrockengewichtkonzentration in dem Produktionsfermentationsbehälter nach der Überführung der Keimfermentationsbehälterkultur beträgt vorzugsweise 0,25–1,00 g/L. Obwohl es bevorzugt ist, die Fütterung binnen einer Stunde zu beginnen, kann sie falls nötig verzögert werden. Aufgrund der sehr geringen OUR- und CER-Werte während des anfänglichen Teils der Fütterungsphase und den entsprechenden Fehlern bei ihrer Messung, wird die automatische Steuerung der Fütterungsrate unter Verwendung des RQ anfänglich inaktiviert. Das Fütterungsregime ist vorgesehen, um die Akkumulation von Ethanol und Acetat zu minimieren, um so die Zell- und Produktausbeute zu maximieren.
Die Fermentation wird in einem Fermentationsbehälter durchgeführt, so wie er in 1 gezeigt ist und der ausgelegt ist, um eine optimale Gaslösung und Durchmischung zu ergeben. Der Behälter, der einer heißen NaOH-Waschung und einer PFW-Spülung unterworfen wurde, wird ungefähr 4000 L von sterilem MW10 (Tabelle 1), Chargensalzen und -spurenelementen enthalten. Dieses Medium kann unabhängig von dem Behälter entweder durch Hitze- oder Filtersterilisation sterilisiert werden. Es ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung herausgefunden worden, dass es vorteilhaft für das Fermentationsmedium, so wie MW10 ist, ist, frei von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder eines Salzes derselben oder anderer starker metallgelierenden Mittel zu sein, da deren Anwesenheit in ein signifikant höheres Maß an verfärbten Verunreinigungen in dem hergestellten Albumin resultiert.
Die Betriebstemperatur wird auf 30°C eingestellt, und die Rührergeschwindigkeit wird reguliert, um ausreichend zu sein, um eine homogene Lösung aufrechtzuerhalten, typischerweise auf 50 U/min. Der anfängliche pH-Wert wird mit Ammoniaklösung (SW 0,901) eingestellt (Steuerung eingestellt auf 5,7 ± 0,2). 2 M H₂SO₄ kann als zweites pH-korrigierendes Mittel verwendet werden. Die MW10-Chargenvitamine werden hinzugefügt, ebenso wie soweit notwendig ein geeignetes Antischaummittel (z. B. Breox FMT30 zu 0,125 g/L).
Sterile gefilterte Luft wird in den Behälter mit anfänglich 0,5 Vol./Vol./min eingebracht, um die Sensitivität der Abgasanalyse zu maximieren, und das MFCS Computersystem wird gestartet. Das Abgas wird analysiert, beispielsweise durch Verwendung eines kontinuierlichen Massenspektrometers (z. B. eines Fisons-VG-Gasanalysators). Der Behälter wird mit der gesamten Keimbehälterkultur (Minimum 0,4% Vol./Vol.) beimpft. Die MW10 wird in einem dem Chargenvolumen gleichen Volumen eingespeist. Die Fütterung wird gestartet und die RQ-Eingriffsteuerung deaktiviert, bis die OUR- und CER-Werte ausreichend hoch sind, um diese Steuerung effektiv zu machen. Die Fütterungsrate wird während dieses Zeitraums manuell ohne RQ-Steuerung eingestellt, falls RQ ständig > 1,2 ist. Die Fütterungsrate wird über die Computersteuerung gemäß dem folgenden Algorithmus erhöht: Fütterungsrate = keμt,wobei k die anfängliche Fütterungsrate ist, μ die exponentielle Wachstumsrate und t die Zeit. Der Wert k wird empirisch als die anfängliche Fütterungsrate bestimmt, die notwendig ist, um eine Wachstumsrate zu erreichen, die die Akkumulation von Ethanol und Acetat minimiert. Für dieses Beispiel ist k auf einen Wert von 0,08 mL MW10-Fütterungsmedium pro Minute pro Liter Kultur bestimmt worden. Der Wert μ bezieht sich auf die maximale Wachstumsrate eines vollständig durchatmeten Organismus, in diesem Beispiel 0,1 pro Stunde.
t ist eine Gegenvariable, die bei 0 (null) startet und dann um 1 jede Minute ansteigt, solange nicht RQ > 1,2 oder DOT < 15%. In diesen Fällen wird der Wert von t reduziert.
Der Behälter kann falls erforderlich unter Überdruck gesetzt werden, um die OTR zu fördern. Die Kultur wird am Ende der Fütterung für die Stromabverarbeitung gehalten.
Diese Haltezeit sollte auf ein Minimum beschränkt bleiben, sie kann aber bis zu 48 Stunden und darüber hinaus verlängert werden, falls dies nötig ist. Während der Haltephase wird die Temperatur der Kultur auf das mögliche Minimum reduziert, typischerweise zwischen 4 und 15°C, vorzugsweise 4°C, und der DOT wird es erlaubt, auf 0% abzufallen. Die Fütterung wird gestoppt, die Belüftung abgestellt und der Überdruck reduziert. Die pH-Steuerung wird jedoch fortgesetzt. Ausreichende Agitation mit vorzugsweise etwa 50 U/min wird aufrecht erhalten, um die Zellen in Suspension zu halten und um das Kühlen und die pH-Homogenität zu erleichtern.
Die erwarteten Ausbeuten gemäß dem obigen Verfahren sind: Biomasse > 80 g Zelltrockengewicht/L Kultur; rHA > 1,5 g Monomer/L Kultur (bestimmt durch SDS-PAGE, bezogen auf die gesamte Kultur).
Um eine unreine Albuminlösung für die Reinigungsbehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung zu präparieren, wenn das Albumin rHA ist, werden die Mikroorganismuszellen von dem Fermentationskulturmedium entfernt. Während es bevorzugt ist, dass die Zellen wie beschrieben vor dem Beginn des Reinigungsverfahrens entfernt werden, kann dies unter bestimmten Bedingungen, wenn z. B. der erste Reinigungsschritt in einem fluidisierten Bett durchgeführt wird, gleichzeitig mit dem ersten Schritt ausgeführt werden. Die Fermentations kultur, die in dem Fermentationsbehälter während der Haltephase auf weniger als 15°C ohne Belüftung abgekühlt worden ist, wird in einen Tank überführt, wo sie verdünnt wird, um eine Biomassenkonzentration von 180–210 g/kg zu ergeben, und wo sie falls nötig weiter gekühlt wird. Die verdünnte Kultur sollte für so kurze Zeit wie möglich ohne Belüftung und bei reduzierter Temperatur unter hinreichender Agitation gehalten werden, um Hefezellenablagerungen zu vermeiden.
Zellen und Überstand werden dann einem ersten Separationsschritt unterworfen, z. B. Mikrofiltration oder Zentrifugation in jeder geeigneten Zentrifuge, so wie einer Alfa Laval BTUX510-Düse, die kontinuierlich entlädt und bei 5.700 U/min läuft. Das so hergestellte Zentrat kann inline gefiltert werden, beispielsweise unter Verwendung eines Tiefenfilters (1 μm Porengröße), geliefert von Cuno, um zurückgebliebene ganze oder zerbrochene Hefezellen und andere Partikel zu entfernen. Mindestens 75% des rHA, das in der verdünnten Kultur vorliegt, wird in einem Durchgang der Zentrifugationsoperation geborgen. Optional kann der Zellschlamm von dieser Operation erneut in Wasser oder Puffer suspendiert und erneut zentrifugiert werden, um ein zweites Zentrat bereitzustellen, um so die Produktausbeute zu verbessern. Die resultierende Lösung wird dann durch das Verfahren der Erfindung behandelt, wie in Beispiel 2 gezeigt wird, um das darin enthaltene Albumin zu reinigen.
Beispiel 2: Erfindungsgemäße Reinigung von Albumin
Das Zentrat von einer Fermentation (so wie im Beispiel 1 beschrieben) oder eine unreine Albuminlösung aus irgendeiner anderen Quelle (so wie Plasma) wird für eine Chromatographie auf einer Kationenaustauschmatrix präpariert bzw. konditioniert, während das Albumin vor Polymerisation (durch Zugeben von Octanoat) und Proteasenaktivität (durch Erhitzen oder Auswählen von Hefe ohne schädliche Niveaus an Protease) geschützt wird. Vorzugsweise wird Natriumoctanoat (Chromatographielösung 13 (CS13) – Tabelle 2) bis auf eine Endkonzentration von 1–10 mM, beispielsweise von etwa 5 mM, hinzugefügt, um das Albumin zu stabilisieren. Der pH-Wert wird mit Essigsäure (CS09) auf 4,3–4,8, vorzugsweise 4,50 ± 0,1 (am meisten bevorzugt ±0,05) eingestellt, und die Leitfähigkeit wird darauf überprüft, dass sie < 5,5 mS/cm ist.
Der Kulturüberstand von einigen Wirtsstämmen bzw. -spezies enthält Proteasen, die rHA während der nachfolgenden Verarbeitung abbauen können. In solchen Fällen, kann die Proteasenaktivität durch Hitzebehandlung des rHA enthaltenden Kulturüberstands zerstört werden. Typischerweise sind 1–10 mM Natriumoctanoat ausreichend, um das rHA vor Hitzedenaturierung zu schützen, und 30 sec bis zu 10 min bei Temperaturen von 60–80°C sind adäquat, um die Proteasen zu inaktivieren. Nachfolgend kann der Überstand weiter konditioniert werden, wie zuvor beschrieben wurde. Falls der Abbau durch Proteasen nicht auftritt, wird die Hitzebehandlung vorzugsweise weggelassen.
Chromatographie
Alle Operationen können bei Raumtemperatur (20 ± 5°C) durchgeführt werden. Die Albuminbeladungen (g Albumin/L Matrix) für die Chromatographiesäulen werden aus Titern von Albumin (g/L) durch entweder SDS-PAGE (im Falle der SP-FF-Säule) oder GP-HPLC (für alle anderen Säulen) bestimmt. Der Fortschritt jedes Schritts wird durch Messen der UV-Absorption auf einer Linie, beispielsweise bei 254 oder 280 nm überwacht.
Die Abfolge der chromatographischen Schritte, wie sie hier beschrieben wird, ist unter einer Reihe von Gesichtspunkten neu und erfinderisch. Die Verwendung einer kationischen Matrix für den ersten Reinigungsschritt erlaubt es der Mehrzahl von niedrigmolekulargewichtigen pigemtierten Spezies, die von der Hefefermentation stammen, direkt durch die Säule hindurchzutreten, während jene, die an die Matrix anbinden, schwach gebunden sind und durch eine Salzspülung hoher ionischer Stärke, wie 1 M NaCl entfernt werden können. So kann die kationische Matrix, im Gegensatz zu einer anionischen Matrix, die diese Typen von Molekülen irreversibel adsorbiert, regeneriert und für mehrere Chromatographiezyklen als erster Schritt der Reinigung verwendet werden. So bildet dieser Schritt die Basis für ein robustes kommerzielles Chromatographieverfahren.
Die Verwendung einer Säule vom Cibacron Blue-Typ als der zweite Schritt in diesem Beispiel ist neu, indem er verwendet wird, um spezifisch ein 45 kDa-Fragment des Albumins zu entfernen, das sehr schwierig von Albumin zu entfernen ist, weil seine physikalischchemischen Eigenschaften, z. B. Größe und pI, dem intakten Molekül ähnlich sind. Überraschenderweise bindet dieses Fragment stärker an den Farbstoff an als dies Albumin voller Länge tut, so dass deren Separation ermöglicht wird.
Die Chromatographie-Lösungen, die während der Reinigung des Albumins verwendet werden, sind in Tabelle 2 detailliert aufgeführt. Wegen der Herstellung des Albumins in sehr großem Stil und der relativ geringen Kosten des Produkts sind diese Puffersalze für das Verfahren am besten geeignet, weil sie in hochreiner Form in industriellen Mengen verfügbar sind und verglichen mit anderen gemeinhin verwendeten Puffern, so wie Tris, HEPES oder MOPS, kostengünstig sind. Alternative Puffer könnten anstelle derjenigen verwendet werden, die in Tabelle 2 verwendet werden, beispielsweise Puffer von ähnlichem pK_a (z. B. Malat für Acetat), aber in den meisten Fällen verbieten die Kosten und die Verfügbarkeit im großen Umfang ihre Verwendung. Alternative Salzformen können verwendet werden, vorausgesetzt sie sind löslich, verfügbar in industriellen Mengen und kosten wenig. Die Aufnahme von Tetraborationen in CS06 und CS10 ist jedoch besonders vorteilhaft, da sie eine spezifische Rolle in der Komplexbildung mit Kohlenhydratanteilen in Makromolekülen spielen, und sie fest an die anionischen Gruppen an der Matrix binden. Dies resultiert in eine verbesserte Reinheit des Albumins in dem Eluat.
Die Chromatographie kann unter Verwendung entweder axial durchströmter Säulen, so wie solcher erhältlich von Pharmacia, oder unter Verwendung radial durchströmter Säulen, so wie solcher erhältlich von Sepragen, durchgeführt werden. In diesem Beispiel sind alle Säulen axial.
Die Pufferlösungen können bei den unten beschriebenen Konzentrationen präpariert werden, oder es können konzentrierte Stammlösungen präpariert und online für die sofortige Verwendung gemischt oder verdünnt werden.
Kationenaustauschchromatographie. Albumin wird durch Kationenaustauschchromatographie konzentriert und zumindest bezüglich Hefeproteinen (falls das Albumin rHA von einer Hefefermentation ist) und anderen Antigenen, niedrigmolekulargewichtigen Verunreinigungen und pigmentierten Verbindungen gereinigt. Die Methode verwendet eine kommerzielle Kationenaustauschmatrix, so wie SP-Sepharose FF, SP-Spherosil, CM-Sepharose FF, CM-Cellulose, SE-Cellulose oder S-Spherodex. Vorzugsweise ist die Matrix SP-Sepharose FF (Pharmacia) mit einer Betthöhe von 5–25 cm, vorzugsweise 10–15 cm und in diesem Beispiel von 12,5 cm, mit einer Säulenbeladung von 10–50 g Albumin/L, vorzugsweise 40 ± 10 g Albumin/L Matrix. Die Matrix wird mit einem Puffer equilibriert, um die alkalische Lagerlösung zu entfernen; vorzugsweise sollte der Puffer stark genug sein, um den pH-Wert auf ungefähr pH 6,0 zu reduzieren. Ein Puffer, so wie CS01, wird verwendet, um die Lagerlösung CS07 aus der Säule zu entfernen; es könnte jedoch jeder Puffer mit einem pH-Wert < 6,0 verwendet werden. Die Equilibrierung wird als abgeschlossen angesehen, wenn der ph-Wert des Ausflusses aus der Säule etwa pH 6,0 ist.
Das konditionierte Konzentrat wird dann mit einer Flußrate von beispielsweise 1,0–8,0 cm/min, vorzugsweise 4,0–7,0 cm/min, in diesem Beispiel 6,36 cm/min, auf die Säule geladen, und dann wird die Säule mit einer Lösung gewaschen, um zurückbleibende Verunreinigungen zu entfernen. Diese Waschlösung sollte einen pH-Wert < 6,0 und eine Leitfähigkeit von weniger als 5 mS/cm, vorzugsweise < 3 mS/cm haben, um die Elution des Albumins zu verhindern. Eine geeignete Lösung ist CS01. Die vorangehenden Schritte werden alle mit 6,36 cm/min ausgeführt; für die Elution und alle nachfolgenden Schritte wird die Flußrate auf 0,5–5,0 cm/min, vorzugsweise 2,0–4,0 cm/min in diesem Beispiel 3,18 cm/min reduziert, um das Volumen des Eluats zu reduzieren. Die Elution des Albumins wird durch Erhöhen der ionischen Stärke bewirkt; eine Lösung mit einer Leitfähigkeit in dem Bereich von 5–10 mS/cm, vorzugsweise 6–8 mS/cm, beispielsweise CS02, wird verwendet. Das Auffangen des Albumins startet, wenn das UV-Signal über 1,0 A₂₈₀/cm ansteigt, und das Auffangen wird fortgesetzt, bis das UV-Signal unter 0,6 A₂₈₀/cm abfällt oder ein maximales Volumen von 6,5 Säulenvolumen aufgefangen wurde. Die Säule wird dann unter Verwendung von CS03 und CS04 gereinigt und dann in CS07 gelagert.
Affinitätschromatographie. Dieser Schritt reinigt das Albumin weiter bezüglich eines N-terminalen 45 kDa-Albuminfragments, Hefeantigenen (falls das Albumin rHA aus einer Hefefermentation stammt) und Pigment. Die Affinitätsmatrix kann jeden Farbstoff vom Cibacron Blue-Typ aufweisen, der Albumin bindet, z. B. Reactive Blue 2, Procion Blue HB, Blue Sepharose, Blue Trisacryl und andere Verbindungen vom Anthraquinon-Typ.
Vorzugsweise ist die Matrix die unten beschriebene "Delta Blue Agarose"-Matrix. Von dieser wurde herausgefunden, dass sie das Niveau der Blauauslaugungen, die von der Matrix erzeugt werden, reduziert und dass sie die alkalische Stabilität der Matrix verbessert, um das Reinigen und Entpyrogenisieren zu erleichtern. Eine weitere Verbesserung der Matrix verglichen mit kommerziell verfügbaren Matrizen ist der Einbau eines Mittlers, 1,4-Diaminbutan, zwischen dem Farbstoff (Reactive Blue 2) und der Matrix. Dies wurde als optimale Länge des Mittlers bezüglich der Albumineluatreinheit ermittelt.
Reactive Blue 2 hat die unten dargestellte chemische Struktur.
Das Ortho-, Metha- oder Paraisomer oder jede Mischung derselben kann verwendet werden. Das bevorzugte Isomer ist die Ortho-SO₃-Form, aber weil diese schwierig mit der gewünschten Reinheit herzustellen ist, wird das Methaisomer verwendet. Das Aminobutyl-Reactive Blue 2 wird mit einer Mindestreinheit von 98% als totale, durch analytische HPLC bestimmte Peakfläche präpariert. Dies kann entweder durch Verwenden kommerziell verfügbaren Rohfarbstoffs, der die Aufreinigung des von Aminobutyl abgeleiteten Farbstoffs erfordert, oder durch Verwenden eines reinen synthetisierten Farbstoffs erreicht werden. Bei der letzteren Methode, sollte das Farbstoffausgangsmaterial bei analytischer HPLC bei 280 nm zu mindestens 98% rein sein. Solches Material ist verfügbar von ACL, Isle of Man. Reactive Blue 2 wird mit 1,4-Diaminbutan in Wasser durch Erhitzen der Mischung auf 60°C reagiert, wonach der erhaltene Farbstoff von der Mischung aufgereinigt wird, beispielsweise durch Präzipitation. Das Aminobutyl-Reactive Blue 2 wird dann an die Matrix angekoppelt, beispielsweise an Epichlorhydrin-aktivierte Sepharose CL-6B (Pharmacia, Schweden). Siehe Porath et al (1971) J. Chromatog. 60, 167–177. Der Farbstoffgehalt solch einer Delta Blue Agarose-(DBA)-Matrix sollte vorzugsweise 50 ± 5 mmol/g Trockengewicht sein.
Verwendung der Blue-Matrix. Die Methode verwendet DBA mit einer Betthöhe von 10–30 cm, vorzugsweise 20–30 cm (in diesem Beispiel 25 cm), mit einer Säulenbeladung von 7–14 g rHA/L Matrix, vorzugsweise 8–12 g/L (in diesem Beispiel 10 ± 1 g Albumin/L Matrix; alle Schritte laufen mit einer Flußrate von 0,3–2,0 cm/min, vorzugsweise 1,0–2,0 cm/min, in diesem Beispiel 1,53 cm/min. Die DBA wird in CS01 von CS07 equilibriert; die Equilibrierung ist abgeschlossen, wenn der pH-Wert des Ausflusses aus der Säule etwa pH 9,5 beträgt. Vor der Chromatographie wird das SP-FF-Eluat mit Ammoniak auf etwa pH 8,5–9,5, vorzugsweise pH 9,0 eingestellt, und dann auf die Säule geladen. Wenn die Beladung abgeschlossen ist, wird die Säule zum Entfernen von Verunreinigungen mit 1–5 Volumen Puffer von 10–30 mS/cm, vorzugsweise 15–25 mS/cm, beispielsweise CS12, vorzugsweise mit fünf Säulenvolumen, gewaschen. Das Albumin wird unter Verwendung eines Puffers hoher ionischer Stärke von > 100 mS/cm, vorzugsweise 125–165 mS/cm, z. B. CS03, eluiert. Das Auffangen des Eluats wird gestartet, wenn das UV-Signal (A₂₈₀/cm) über 0,4 ansteigt, und beendet, wenn das Signal wieder unter 0,4 abfällt. Die Säule wird dann unter Verwendung von CS04 gereinigt und in CS07 gelagert.
Zwischen-Ultrafiltration. Dieser Schritt konzentriert das Albumin für die Gelpermeationschromatographie. Eine Membran vom Cellulose-Typ (nominale Molekulargewichtstrenngrenze ≤ 30.000, beispielsweise 10.000) wird in einer Ultrafiltrationsvorrichtung verwendet, um das DBA-Eluat auf eine Retentatkonzentration von 20–120 g/L Albumin, vorzugsweise 80–110 g/L Albumin, zu konzentrieren. Die Membranen werden nach der Verwendung durch Ausspülen von Restprotein mit Wasser oder CS03 oder CS05 aus Tabelle 3 und Reinigen mit 0,1 M Natriumhydroxid behandelt. Die Membranen können dann in 20 mM Natriumhydroxid gelagert werden.
Gelpermeationschromatographie. Dieser Schritt reinigt das Albumin bezüglich Hefeantigenen (falls das Albumin rHA von einer Hefefermentation stammt), Pigment und dimerisiertm Albumin und bewirkt einen Pufferaustauschschritt. Die Methode verwendet eine kommerzielle Gelpermeationsmatrix, so wie Sephadex G100, G150, G250, Sephacryl S-100, S-200 oder S-300, Toyopearl HW50S oder Superose 6 oder 12. Vorzugsweise ist die Matrix Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) mit einer Betthöhe von größer als 60 cm, vorzugsweise 90 ± cm (3 × 30 cm). Die Säule wird in CS05 equilibriert und läuft mit 0,1–1,5 cm/min, vorzugsweise 0,5–1,0 cm/min, in diesem Beispiel 0,75 cm/min; die Säule wird dann mit Albumin aus dem Zwischen-UF-Schritt beladen, wenn pH 9,5 erreicht ist. Das Beladungsvolumen ist ungefähr gleich 2–9% des Säulenvolumens, vorzugsweise 5–8%, beispielsweise 7,5% des Säulenvolumens. Die Albuminfraktion wird in drei Teilen aufgefangen. Eine anfängliche kleine Menge Albumindimer wird verworfen, bis der A₂₈₀/cm-Wert 10% des Vollausschlags (Full Scale Deflection = FSD) auf seinem Weg nach oben erreicht; an diesem Punkt startet das Auffangen einer Rezyklusfraktion und wird bis 90% FSD fortgesetzt, und dann wird das Albumin als primäre Produktfraktion aufgefangen. Dies wird fortgesetzt bis der A₂₈₀/cm-Wert durch 5% FSD hindurchfällt, wonach der Ausflußstrom wieder verworfen wird. Die Rezyklus- und die primäre Produktfraktion werden separat aufgefangen. Dieser Schritt wird wiederholt, bis das gesamte Material auf die Säule geladen wurde.
S-200 HR Rezyklusultrafiltration. Eine Membran vom cellulosischen Typ mit einer nominalen Molekulargewichtstrenngrenze ≤ 30.000 bzw. wie in diesem Beispiel von 10.000 wird in einer Ultrafiltrationsvorrichtung verwendet, um die gesammelte Rezyklusfraktion auf eine Retentatkonzentration von 20–120 g/L Albumin, vorzugsweise 80–110 g/L zu konzentrieren. Die Membranen werden nach der Verwendung behandelt, wie oben im Abschnitt Zwischen-Ultrafiltration beschrieben wurde.
Alternativ können, wie bei jedem Ultrafiltrationsschritt in diesem Verfahren, Polyethersulfon- oder PVDF-Membranen mit einer Trenngrenze ≤ 30.000 anstelle der Membranen vom Cellulosetyp verwendet werden. Solche Membranen sind erhältlich von Amicon und Millipore. Es ist bevorzugt, Membranen zu verwenden, die mit NaOH kompatibel sind, das zum Lagern und Reinigen der Membranen verwendet wird.
Reinigung von S-200 HR-Rezyklusultrafiltrationsretentat. Das Retentat der Rezyklusultrafiltration wird auf dieselbe Säule geladen, wie sie für die primäre S-200 Reinigung verwendet wurde, und eine Produktfraktion wird von jedem Peak aufgefangen, die dann mit der Summe der primären Produktfraktionen, welche zuvor aufgefangen wurden, vermischt wird. Dieser Schritt wird wiederholt, bis das gesamte Material auf die Säule geladen wurde.
Anionenaustauschchromatographie. Das Ziel dieses Schrittes ist es, das Albumin zumindest bezüglich Hefeantigenen (falls das Albumin rHA von einer Hefefermentation ist) und pigmentiertem Albumin zu reinigen. Die Methode Verfahren verwendet eine Anionenaustauschmatrix, so wie QMA-Spherosil, DEAE-Spherodex, Q-Hyper D, DEAE-Cellulose, QAE-Cellulose oder TMAE-, DMAE- oder DEAE-Fractogel. Vorzugsweise ist die Matrix die kommerzielle Anionenaustauschmatrix DEAE-Sepharose-FF (Pharmacia) mit jeder geeigneten Betthöhe in dem Bereich von 5–25 cm, vorzugsweise 10–15 cm, beispielsweise 12,5 cm, mit einer Säulenbeladung von 10–60 g Albumin pro Liter Matrix, vorzugsweise 35 ± 15 g/L Matrix. Die Säule wird zuerst in einem starken Puffer equilibriert, um den pH-Wert schnell herunter in den Arbeitsbereich zu bringen, z. B. mit Natriumacetat pH 4,5–6,0, vorzugsweise etwa pH 5,5, beispielsweise CS11. Nach dem konzentrierten Puffer wird eine Lösung geringerer Leitfähigkeit, nämlich in dem Bereich von 1–4 mS/cm, vorzugsweise 2,5–3,5 mS/cm, beispielsweise CS08, verwendet, um die Säule vor der Beladung der Säule mit S200-Eluat zu equilibrieren. Eine lineare Flußrate von 1,0–8,0 cm/min, vorzugsweise 3,0–7,0 cm/min, in diesem Fall 4,4 cm/min, kann verwendet werden. Wenn die Beladung abgeschlossen ist, wird die Säule mit einer Lösung aus Natriumtetraborat in dem Bereich von 5–30 mM, vorzugsweise 15–25 mM, beispielsweise CS10 gewaschen. Dies führt dazu, dass jegliche kohlenhydrathaltigen Verunreinigungen vor der Elution der Albuminfraktion stärker an der Säule anhaften. Die Elution kann dann durch jede Lösung hoher ionischer Stärke in dem Bereich von 10–20 mS/cm, vorzugsweise mit CS06, bewirkt werden. Das Eluat wird aufgefangen, wenn der A₂₈₀/cm-Wert 0,4 erreicht, und wird fortgesetzt, bis der Peak durch 0,8 abfällt.
Somit ist in diesem Beispiel die Abfolge der Reinigungsschritte: Kationenaustausch, Affinitätschromatographie, Ultrafiltration, Gelpermeation (mit Ultrafiltration der Rezyklusfraktion) und Anionenaustausch.
Von dem Eluat der DE-FF-Säule ist herausgefunden worden, dass es weniger als 0,1% (Gew./Gew.) Albumindimer und ein nicht nachweisbares Niveau an Albuminpolymeren oder - aggregaten aufweist, wie durch GP HPLC unter Verwendung einer TSK SW3000XL-Säule analysiert wurde, die mit 25,0 μL des Eluats, welches 10,0 mg/ml Albumin enthielt, beladen wurde.
Beispiel 3: Formulierung von gereinigtem Albumin in ein Endprodukt
Dieses Beispiel illustriert die Konzentrierung, Diafiltrierung und Formulierung des hochgereinigten Albumins in ein geeignetes Produkt, in diesem Fall 25% (Gew./Vol.) Albumin. Diese Prozedur wird in zwei Stufen durchgeführt, nämlich End-Ultrafiltrierung (UF) und Formulierung. Die End-UF beginnt mit dem Transfer des DEAE-Eluats (mit Phosphorsäure eingestellt auf pH 7,0 ± 0,3) in den End-UF-Beschickungsbehälter und endet, nachdem das Retentat und etwaige Waschlösungen in den Formulierungsbehälter überführt sind. Der Albumin-haltige Prozeßstrom wird sequentiell einer primären Konzentrierung, einer Diafiltrierung und einer sekundären Konzentrierung in einem Ultrafiltrierungssystem unterworfen, das mit cellulosischen, oder, was mehr bevorzugt ist, mit Polyethersulfonmembranen mit einer nominalen Molekulargewichtstrenngrenze von 10.000 ausgestattet ist. Der anfängliche Konzentrierungsschritt erhöht die Albuminkonzentration auf etwa 20 g/L, und ihm wird unmittelbar von der kontinuierlichen Diafiltrierungsphase gefolgt, in der das Albumin gegen mindestens 5, vorzugsweise mindestens 7, Retentatvolumenäquivalente Wasser für die Injektion diafiltriert wird.
In einigen Reinigungsverfahren der Erfindung, beispielsweise dem in Beispiels 7 dargelegten Schritt, der immobilisiertes Aminphenylborat verwendet, können in dieser Stufe Ammoniumionen vorliegen. Überraschenderweise haben wir herausgefunden, dass diese Ammoniumionen relativ fest durch das Albumin gebunden werden und durch Diafiltrieren gegen Wasser nicht vollständig entfernt werden können. Wir haben herausgefunden, dass Diafiltrieren gegen eine Salzlösung wirksam ist. Ein Verhältnis von 0,5 bis 10% Gew./Gew. von Natriumchlorid zu Albumin, beispielsweise 1,0–5,0% oder etwa 3%, kann verwendet werden. Das Salz kann zu dem Albuminretentat hinzugefügt werden, oder es kann, was üblicher ist, dem Diafiltrierwasser zugesetzt werden. Für die letztendliche 5% (Gew./Vol.) Formulierung, kann eine Lösung von 100 g/L direkt von dem Diafiltrierungsschritt abgenommen werden. Für eine letztendliche 25% (Gew./Vol.) Formulierung wird eine Lösung von ungefähr 275–325 g/L nach einem weiteren Konzentrationsschritt (UF) erhalten. Am Ende wird die Lösung in den Masseproduktformulierungsbehälter überführt.
Der Formulierungsschritt erzeugt Albumin in einer angemessenen chemischen Umgebung und einer angemessenen Konzentration, die für eine Masseproduktsterilfiltration (0,22 μ hydrophiles Polyvenylidendifluorid) und Abfüllung geeignet ist. Die überführte Lösung wird analysiert, um die Konzentrationen an Albumin, Natrium und Octantoat zu bestimmen. Diese Mengen werden berücksichtigt, und jegliche weitere Mengen an Natriumchlorid- und Natriumoctanoatfüllerstammlösungen und geeignet eingestelltes Wasser werden hinzugefügt, um die Masseformulierungsspezifikationen zu erreichen. Die Endalbuminkonzentration kann 235–265 g/L sein (d. h. etwa 25%) mit einer Natriumkonzentration von 130–160 mM. Jegliche andere machbare Albuminkonzentration kann hergestellt werden, jedoch beispielsweise mit einer Minimalkonzentration von mindestens 4% (Gew./Vol.), vorzugsweise 4–25% (Gew./Vol.). Die Formulierung ist nach der Zugabe von geeigneten konventionellen, pharmazeutisch akzeptablen Füllstoffen, so wie jene, die in den US- oder den europäischen Arzneibüchern für humanes Albumin spezifiziert sind, und nach Verdünnen mit Wasser abgeschlossen.
Eine Endkonzentration von 0,08 mMol Natriumoctanoat pro Gramm Albumin kann wünschenswert sein. Das Produkt ist steril und nicht-pyrogen. Es kann etwa 1% (Gew./Gew.) dimeres Albumin vorliegen, aber es sind keine größeren Polymere oder Aggregate nachweisbar, wie durch GP HPLC unter Verwendung einer TSK SW3000XL Säule analysiert wurde.
Beispiel 4: Kationenaustausch direkt gefolgt von Anionenaustausch
In einer Variante des Verfahrens des Beispiels 2 wurde die Reihenfolge der Schritte geändert und es wurden einige Änderungen bei den Verfahrensbedingungen gemacht. Eine weitere Tabelle von chromatographischen Lösungen wird deshalb als Tabelle 3 vorgelegt. Zusätzlich werden alle chromatographischen Säulen außer in dem Gelpermeationsschritt radial durchströmt.
Der anfängliche Kationenaustauschschritt war im wesentlichen derselbe wie beim Beispiel 2, aber mit den folgenden Variationen. Die Bettflußweglänge war 11,0 ± 1,0 cm. Die Chromatographie wurde dann wie folgt durchgeführt:
Eine SP-FF (Pharmacia)-Säule wurde in vier Volumen 10–100 mM Acetat, vorzugsweise 20–40 mM, beispielsweise 30 mM wie in CS20, equilibriert, und die Albuminlösung wurde mit einer Flußrate von 0,07–0,75 Bettvolumen/min aufgeladen, vorzugsweise 0,3–0,6, in diesem Beispiels 0,5 Bettvolumen/min. Die Säule wurde mit 8 Volumen 10–100 mM, vorzugsweise 30–70, beispielsweise 50 mM, Acetat (CS21) und dann 10 Volumen CS20 gewaschen, und das Albumin wurde mit einem Acetat-/Octanoatpuffer (beispielsweise 40–120, vorzugsweise 60–100, z. B. 85 mM, Acetat und 2–50, vorzugsweise 2–20, z. B. 5 mM Octanoat wie bei CS23) unter Verwendung von A₂₅₄/cm-Werten von 0,6 und 0,36 zum Markieren des Start- und Endpunkts des Auffangens eluiert und in diesem Puffer aufgefangen. Die Säule wird mit 0,25–3,0 M Salz und 0,05–2% Detergens (CS24) und dann 0,1–1,0 M Ätzlösung (CS25) gereinigt und dann in verdünnter (10–50 mM) Ätzlösung (CS26) gelagert. In diesem Beispiel ist die Flußrate für die Equilibrierungs-, Beladungs- und Waschschritte 0,5 Bettvolumen/min. Für die Elution des Albumins wird eine Flußrate von 0,04–0,6 Bettvolumen/min, vorzugsweise 0,15–0,35, in diesem Beispiel 0,25 Bettvolumen/min angewendet. Die erwartete Ausbeute an rHA-Monomer beträgt zwischen 46 und 66%.
Das Albumin wurde somit von der Kationenaustauschsäule mit einer Lösung von Octanoat eluiert, wodurch eine neue biospezifische Elution von rHA von einem Kationentauscher verwirklicht wurde. Der pH-Wert ist nahe dem pI-Wert des Albumins, so dass die Bindung des Octanoats eine signifikante Gesamtladungsdifferenz verursacht; beispielsweise beträgt der pH-Wert mindestens 4,5, vorzugsweise etwa pH 5,5.
Das Eluat von dem Kationentauscher wird dann direkt (d. h. anstelle von nach einer Affinitäts- und Gelpermeationschromatographie wie im Beispiel 2, aber vorzugsweise nach Verdünnung) auf das Anionenaustauschharz bei einem pH-Wert von 4,5–6,5, vorzugsweise etwa 5,5, und einer Leitfähigkeit vorzugsweise in dem Bereich von 1,5–5,0 mS/cm, beispielsweise 2,5 ± 0,5 mS/cm geladen. Hiervon ist herausgefunden worden, dass es dazu führt, dass jegliches dimeres Albumin, das während der Kationenaustauschchromatographie ausgebildet wurde, unter den Bedingungen der Anionenaustauschchromatographie zurück in monomeres Albumin umgewandelt wurde. Eine Ausbeute von etwa 110% Albuminmonomer wurde durch diesen Schritt erreicht.
Im Einzelnen wurde eine Säule aus DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) mit einer Bettflußweglänge von 11,0 ± 1,0 cm mit dem Kationenaustauschelutionspuffer (CS23) vorequilibriert und dann mit einem Acetatpuffer (z. B. CS20) equilibriert, bevor sie mit 30,0 ± 10,0 g monomerem Albumin/L Matrix beladen wurde.
Die Säule wird dann mit einer Boratlösung wie in Beispiel 2 (CS27) gewaschen, wie in Beispiel 2 eluiert (CS06) und mit Salz/Detergens (CS24) und Ätzlösung (CS25) gewaschen und in verdünnter Ätzlösung (CS26) gelagert, alles wie bei der Kationenaustauschsäule. Die Flußrate für alle Schritte ist 0,07–0,75 Bettvolumen/min, vorzugsweise 0,3–0,6 Bettvolumen/min, in diesem Beispiel 0,5 Bettvolumen/min.
Das Eluat von dem Anionenaustauschharz (z. B. DE-FF) enthält immer noch Verunreinigungen und wird dann direkt auf die Affinitätsmatrix (z. B. Delta Blue Agarose, wie in Beispiel 2 beschrieben) aufgebracht. Die Betthöhe wurde von 25 cm in Beispiel 2 auf 11,0 ± 1,0 cm reduziert, was höhere Flußraten im Bereich normaler Betriebsdrücke erlaubte. Deshalb war eine Betthöhe von 11,0 cm bevorzugt, und sie beeinflußt das Gewinnen von Albumin oder die Albuminreinheit nicht negativ. Die Säule wurde in Ammoniumacetat (100–300 mM, vorzugsweise 200–275, z. B. 250 mM, wie bei CS29) equilibriert, und das Albumin wurde mit 7,0–14,0 g/L, vorzugsweise 8,0–12,0 g/L, in diesem Beispiel 10,0 ± 1,0 g/L, Matrix aufgebracht. Die Equilibrierungs-, Beladungs- und Waschschritte wurden mit Flußraten von 0,05–0,30 Bettvolumen/min, vorzugsweise 0,15–0,27, in diesem Beispiel 0,25 Bettvolumen/min, durchgeführt. Alle anderen Schritte wurden mit 0,04–0,30, vorzugsweise 0,1–0,25 und in diesem Beispiel 0,20 Bettvolumen/min, durchgeführt. Die erhöhte Flußrate, erleichtert durch die reduzierte Betthöhe, verbesserte den Durchsatz um einen Faktor vier, was vorteilhaft für die Auslegung großer Anlagen ist, und war nahe an der maximalen Betriebsmöglichkeit der DBA. Da diese erhöhte Flußrate anscheinend die Gewinnung von Albumin oder die Albuminreinheit nicht negativ beeinflußte, ist es bevorzugt, solch eine höhere Flußrate zu anzuwenden.
Die Säule wurde mit fünf Säulenvolumen des Ammoniumacetatpuffers (CS29) gewaschen, und das Albumin wurde mit einer starken Salz- und Phosphatlösung (1,0–3,0 M NaCl, beispielsweise 1,5–2,5 M, oder 2,0 M NaCl und 5–100 mM, beispielsweise 50 mM, Phosphat, wie bei CS30) eluiert.
Der pH-Wert des Eluants wurde in dieser Variante des Verfahrens von pH 9,2 auf pH 7,0 geändert. Der Puffer wurde entsprechend von 5 mM Ammoniumacetat in 50 mM Natrium phosphat geändert, das bevorzugt wurde, weil es bei pH 7,0 puffert und relativ kostengünstig ist. Das Eluant von niedrigerem pH-Wert war verantwortlich für einen Anstieg in der DBA-Eluatalbuminmonomerausbeute. Ein pH-Wert < als 7,0 erhöht die Fragmentniveaus, und über pH 7,0 wurde die Albuminmonomerausbeute reduziert. Der pH-Wert, der in dem Bereich von 5,5–9,0 liegen kann, ist deshalb vorzugsweise pH 7,0. Die Säule wurde wie oben in Ätzlösung (CS25, CS26) gereinigt und gelagert.
Das DBA-Eluat (optional nach Ultrafiltration mit einer Membran vom cellulosischen Typ (nominale Trenngrenze MW 30.000), um 80–110 g/L Albumin zu ergeben) wurde dann auf das Gelpermeationsharz, beispielsweise S-200 (HR), aufgebracht. Der S-200 Durchlaufpuffer wurde in 40 mM Natriumphosphat mit pH 7,0 geändert. Das Natriumoctanoat wurde bei diesem Puffer aus Kostengründen weggelassen und wurde statt dessen der Lösung vor der Diafiltration hinzugefügt (Zugabe bis auf eine Konzentration von 1–20 mM, vorzugsweise 5 mM). Das Phosphat ergab eine höhere Leitfähigkeit des Durchlaufpuffers, was die Reinheit verbesserte. Eine hohe Salzkonzentration kann verwendet werden, um die Leitfähigkeit zu steigern, aber es ist weiterhin bevorzugt, die Lösung zu Puffern. Der pH-Wert 7,0 war bevorzugt, weil dies der gewünschte pH-Wert für die Formulierung war.
So ist in diesem Beispiel die Abfolge der Reinigungsschritte: Kationenaustausch (Eluieren mit einem Molekül, das spezifisch von Albumin gebunden wird), Anionenaustausch, Affinitätschromatographie und Gelpermeation.
Der Diafiltrationsschritt vor der Formulierung kann unterstützt werden durch Starten mit Albumin bei pH 7,0. Das Albumin war in dem letztendlichen Eluat stärker konzentriert als bei dem Verfahren des Beispiels 2, was den End-Ultrafiltrationsschritt vor der Formulierung (Beispiel 3) unterstützte.
Beispiel 5: Starke Salzwaschlösung auf dem Kationentauscher
In einer weiteren Variation des Verfahrens wurde dem Verfahren des Beispiels 2 oder 4 gefolgt, außer in den folgenden Punkten. Nach dem Beladen der Kationenaustauschsäule (z. B. SP-Sepharose FF, Pharmacia) mit dem Albumin wurde die Säule mit CS21 (50 mM Natriumacetat, pH 3,9–4,1, 0,6–0,8 mS/cm) gewaschen und dann vor der Endwaschung in CS20 noch mit einem starken Salzpuffer gewaschen, der 1–3 M NaCl, vorzugsweise 2 M NaCL in Natriumacetatpuffer (z. B. 10–50 mM Natriumacetat, vorzugsweise etwa 27 mM, pH 3,5–4,5, vorzugsweise pH 4,0) gewaschen. Diese stringentere Waschprozedur resultierte in ein Eluat, das ein niedrigeres Niveau an Nichtalbuminproteinen enthielt und kann besonders sinnvoll sein, wenn das Albumin rHA von einer Hefefermentation ist. Das Albumin wurde wie in Beispiel 4 beschrieben eluiert. Das Absenken des pH-Werts vor dem Waschen mit starkem Salz hilft, das Albumin während dieser Waschung auf der Säule zu halten, und die Endwaschung maximiert auch die Albumingewinnung. Es ist wahrscheinlich, dass keiner dieser Schritte einen wesentlichen Effekt auf die Reinheit des gewonnenen Albumins hat.
Beispiel 6: Konzentrierte Boratelution von dem Anionentauscher
In diesem Beispiel wird das Verfahren des Beispiels 2 oder 4 (mit oder ohne die Variation beim Beispiel 5) wie fort variiert. Das Eluat von der Kationenaustauschsäule wurde auf unter 10 mS/cm, vorzugsweise weniger als 5 mS/cm, verdünnt und dann auf eine Anionenaustauschmatrix aufgeladen (z. B. DEAE Sepharose FF, Pharmacia). Die Anionenaustauschmatrix wurde dann mit verdünntem Tetraboratpuffer (z. B. 15–25 mM Kaliumtetraborat oder Natriumtetraborat) gewaschen, was den Effekt hatten, dass der pH-Wert auf ungefähr 9,2 angehoben wurde, und dann wurde das Albumin mit einem stärker konzentrierten Tetraboratpuffer (z. B. 80–150 mM Kaliumtetraborat, vorzugsweise 110 mM Kaliumtetraborat) eluiert. In dem Beispielen 2 und 4 wurde das Albumin mit 20 mM Tetraborat, 100 mM Natriumchlorid eluiert; die Elution mit 80–150 mM Tetraborat (z. B. 33,6 g/L) resultiert in ein Eluat mit niedrigerem Gehalt an kohlenhydrathaltigen Verunreinigungen, z. B. Hefeglykoproteinen, aufgrund einer erhöhten Affinität dieser Spezies für die Anionenaustauschmatrix unter diesen Bedingungen. Kaliumtetraborat wird gegenüber Natriumtetraborat wegen seiner höheren Löslichkeit bei Raumtemperatur bevorzugt verwendet. Das Eluat von der Anionenaustauschmatrix wurde wie in Beispiel 2 oder 3 behandelt. Zum Beispiel wurde es bei dem Beispiel 4-Verfahren dann direkt auf eine Affinitätsmatrix geladen, z. B. Delta Blue Agarose (DBA), die dann wie in Beispiel 4 beschrieben laufengelassen wurde.
Ein Gelpermeationsschritt wird dann wie in Beispiel 2 oder 4 durchgeführt.
Beispiel 7: Immobilisiertes Aminphenylboronat
Das Eluat von der DBA-Matrix kann auf ein Gelpermeationsmedium aufgebracht werden, zum Beispiel Sephacryl S-200 (HR) (Pharmacia), das in einem Ammonimumacetatpuffer (z. B. 10–100 mM, vorzugsweise etwa 30 mM) equilibriert ist, der Natriumchlorid (20–2000 mM, vorzugsweise etwa 100 mM) und Octanoat (1–20 mM, vorzugsweise etwa 5 mM Octanoat bei pH 9,0–9,5, vorzugsweise 9,2) enthält. Dieser Puffer tauscht das Albumin effektiv in eine für den letzten chromatographischen Schritt geeignete Lösung aus, der unten detaillierter dargestellt ist.
Der S-200 Schritt läuft wie folgt ab. Die S-200 wird mit einer minimalen Betthöhe von 90,0 ± 3 cm (z. B. 3 × 30 cm in Reihe) laufen gelassen. (a) Das Retentat von der Zwischen-Ultrafiltration wird auf die Säule geladen. Die Rezyklus- und Produktfrakionen werden aufgefangen. Dieser Schritt wird wiederholt, bis das gesamte Material auf die Säule geladen worden ist. (b) Die gesammelten Rezyklusfraktionen werden wie oben durch Ultrafiltration auf 80–110 g rHA/L aufkonzentriert. (c) Das Retentat von der Rezyklusultrafiltration wird auf dieselbe Säule geladen, und von jedem Peak wird eine Produktfraktion aufgefangen. Dieser Schritt wird wiederholt, bis das gesamte Material auf die Säule geladen worden ist. (d) Die Produktfraktionen von den primären und sekundären Gelpermeationschromatographieschritten ((a) und (c)) werden als das S-200-Eluat zusammengefaßt.
Der abschließende Schritt besteht aus einem Affinitätsschritt, um Glykokonjugate zu entfernen, so wie Glykoproteine und Glykolipide und Poly-, Oligo- und Monosaccharide. Dieser Schritt verwendet immobilisierte Aminophenylborsäure (PBA) als Ligand. Das US-Patent Nr. 4 562 251 (hier durch Bezugnahme einbezogen) beschreibt geeignete Verfahren zum Herstellen von Dibortriazinagarose oder Monobortriazinagarose: (1) Triazin wird zuerst mit Agarose O-verbunden und dann in einer zweiten Reaktion mit 3-Aminphenylborsäure (APBA). Wenn das X an dem Triazin durch ein Chloratom ersetzt ist, dann ist das substituierte Harz hergestellt. (2) Triazin wird zuerst mit APBA reagiert, um entweder Mono- oder Dibortriazin zu erzeugen. Diese werden dann über das freie Chloratom an dem Triazin an die -ONa aktivierte Agarose O-gebunden, um entweder mono- oder disubstituierte Agarose herzustellen. Alle diese Beispiele und Beschreibungen in diesem Patent verwenden -ONa aktivierte Agarose, was in O-Bindungen resultiert.
Ein früheres Patent US 4 269 605 erwägt eine Vielzahl von Matrixaktivierungsmethoden, einschließlich Epichlorhydrinaktivierung von Agarose, welche dort bevorzugt ist. Kommerziell verfügbare Matrizen umfassen Amicon's PBA30 und Sigma's geperltes akrylisches Aminphenylboronat.
Das von der S-200-Säule aufgefangene Albumin wurde durch die PBA-Matrix chromatographiert, die in S-200-Laufpuffer (s. o.) vorequilibriert worden war; unter diesen Bedingungen bindet das Albumin nicht vorsätzlich an die Matrix an, während die kohlenhydratbasierten Verunreinigungen hinreichend zurückgehalten werden, um sie von dem Albumin abzutrennen, während es durch die Säule hindurchtritt. Die Chromatographie ist so bezüglich des Albumins im negativen Modus. Weitere Details waren wie folgt:
Die Phenylboromatmatrix hatte eine Flußweglänge von 11,0 ± 1,0 cm und war mit einem Puffer equilibriert, der Ammoniumionen (10–50 mM), Acetat (10–50 mM) und 1,0–100,0 mM Octanoat enthielt (z. B. CS36, s. die Tabelle, unten). Die Säule wurde dann mit 35 ± 15 g rHA/L Matrix beladen. Die PBA wird als ein negativer Schritt laufen gelassen, und deshalb war das aufgefangene Produkt der Durchfluß während des Beladens und des nachfolgenden Waschens mit dem Equilibrierungspuffer. Alle chromatographischen Schritte können mit Flußraten in dem Bereich von 0,005–0,3 Bettvolumen/min durchgeführt werden. Vorzugsweise werden die Equilibrierung und Reinigung der Säule mit höherer Flußrate, beispielsweise 0,19 Bettvolumen/min, als die Beladung und das Auffangen der Albuminlösung durchgeführt, die vorzugsweise mit einer Flußrate von 0,01–0,05, vorzugsweise 0,25 Bettvolumen/min, durchgeführt werden. Die Säule wird dann mit einem Boratpuffer (wie in CS37), Salz (CS38) und Ätzlösung (CS25) gereinigt und dann in dem Boratpuffer (CS37) gelagert.
Der pH-Wert des aufgefangenen Durchflusses und des Waschflusses wird mit Phosphorsäurelösung (CS35) auf 7,0 ± 0,1 eingestellt.
Die verwendeten Puffer sind die folgenden:
Tabelle 4: Chromatographielösungen für Beispiel 7
Wegen der Verwendung von Ammoniumionen in dem PBA-Puffer ist es vorteilhaft, Salz in dem End-Ultrafiltrationsschritt zu verwenden, wie oben bei Beispiel 3 erklärt wurde.
In einem besonder bevorzugten Verfahren ist die Abfolge der Schritte wie folgt:

(1) Hefefermentation wie in Beispiel 1.
(2) Zentratkonditionierung wie in Beispiel 2.
(3) Kationenaustausch (SP-FF) mit starker Salzwaschung wie in Beispiel 5 und Elution mit einer Albumin-spezifischen Verbindung wie in Beispiel 4.
(4) Verdünnung und Anionenaustausch mit konzentrierter Tetraboratelution wie in Beispiel 6.
(5) Affinitätschromatographie (DBA) wie in Beispiel 4.
(6) Zwischen-Ultrafiltration und dann Gelpermeation (S-200) mit Rezyklusultrafiltration wie in Beispiel 7.
(7) Chromatographie an immobilisiertem Borat wie in Beispiel 7.
(8) End-Ultrafiltration und Formulierung wie in Beispiel 3.

Beispiel 8: Früherer Einsatz von immobilisiertem Phenylboronat
Der Schritt, der immobilisiertes Phenylboronat einbezieht, kann früher in dem Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise in einem Verfahren, in dem die Schritte geordnet sind: Kationentauscher – Anionentauscher – Affinitätsmaterial – Ultrafiltration/Diafiltration – immobilisiertes Phenylboronat – Gelpermeation.
Die Bedingungen für jeden Schritt sind wie in den Beispielen 4–7, außer den folgenden. Das DBA-Eluat wird auf 80–110 g/L Albumin aufkonzentriert, und der pH-Wert wird durch Diafiltrieren (5 Volumen) gegen ein Ammoniumacetat des in Beispiel 7 verwendeten Typs auf 9,2 eingestellt. Das konzentrierte DBA-Eluat wird dann auf DBA chromatographiert, und der Durchfluß wird aufgefangen und direkt auf die Gelpermeationssäule (z. B. S200) aufgebracht. Da der Gelpermeationsschritt nun der letzte Schritt ist, kann er in einem Puffer laufengelassen werden, der an den Formulierungsschritt angepaßt ist, beispielsweise 20–130 mM (vorzugsweise 50–100 mM) NaCl bei pH 7,0.
Beispiel 9: Charakterisierung des erfindungsgemäß hergestellten Albumins
Dieses Beispiel illustriert die Analyse, die durchgeführt wird, um die Reinheit des erfindungsgemäß gereinigten Albumins nachzuweisen. Soweit nicht anderes angegeben ist, sind alle Tests an Albumin durchgeführt worden, das wie in Beispiel 3 formuliert worden ist, um das Endprodukt zu ergeben.
Glykosilierung von rHA
Ein Mikroassay für glykosiliertes Protein hat gezeigt, dass erfindungsgemäß gereinigtes (rHA) nicht durch nicht-enzymatische Glykosilierung (Glykolierung) modifiziert ist. Der Mikroassay mißt die stabile Amadoriprodukt-(AP)-Form von glykosiliertem Protein durch Oxydation der C-1 Hydroxylgruppen des AP mit Periodat. Die Formaldehydfreisetzung durch die Periodatoxydation wird durch Umwandlung in ein Chromophor, Diacetyldihydrolutidin (DDL), durch Reaktion mit Acetylaceton in Ammoniak quantifiziert. DDL wird dann kolorimetrisch bei 405 nm detektiert.

Albumincharge Mol hexose/Mol protein

A 0,092

B 0,116

C 0,090

D 0,132

E 0,060

G 0,04

H 0,01

I 0,07

J 0,07

K 0,05

L 0,740

M 0,70

N 0,96

O 0,78
Die Chargen A–K waren gemäß Beispiel 2 gereinigtes rHA. Die Chargen L–O waren Beispiele für kommerziell verfügbares humanes Serumalbumin aus verschiedenen Quellen. Acht Chargen von gemäß Beispiel 7 gereinigtem rHA hatten vernachlässigbare Niveaus an Glykosilierung (0,042 ± 0,018 Mol/Mol) verglichen mit HSA (0,387 ± 0,012).
Test auf niedrigmolekulargewichtige Verunreinigungen
Grundüberlegung – Das Ziel dieses Tests ist es, nicht-kovalent gebundene niedrigmolekulargewichtige Verunreinigungen (Low Molekular Weight Contaminants = LMC) von rHA und HSA unter Verwendung saurer organischer Lösungsmittel zu entfernen. Für den Vergleich der Proben kann dann ein HPLC-"Fingerabdruck"-Chromatogramm erzeugt werden.
Verfahren – Zu 100 μL des Endprodukts (20 mg; rHA oder HSA) werden nacheinander 50 μL Ameisensäure (98% Vol./Vol.), 100 μL Chloroform und 50 μL Ethanol unter Durchmischung nach jeder Zugabe hinzugefügt. Die Proben werden bei Raumtemperatur für 5 min unter regelmäßiger Durchmischung gehalten. Protein wird dann durch Zugabe von 1 mL Aceton (30 min, –20°C) präzipitiert. Die Proteinproben werden durch Zentrifugation pelletiert, und die Überstände werden dekantiert und durch Rotationsverdampfung unter Vakuum getrocknet. Die getrockneten Proben werden in 25%igem Acetonitril/0,1%iger Trifluoressigsäure resuspendiert. LMC werden dann auf einer ABI PTH C18-Umkehrphasensäule (220 × 2,1 mm) unter Verwendung eines linearen 10%–90% Acetonitrilgradienden in 0,1% Trifluoressigsäure (Flußrate = 300 μL/min) abgetrennt. Die Proben wurden bei 214 nm unter Verwendung eine Shimadzu UV-Monitors beobachtet.
Ergebnisse – Ein Vergleich wurde zwischen einer kommerziell verfügbaren Charge von humanem Serumalbumin und einer Charge von erfindungsgemäß gereinigtem rHA gemacht. Zwei hauptsächlich signifikante A₂₁₄nm-Peak sind bei den Proben der Erfindung gesehen worden (R_t = 31,1 bzw. 42,8 min – siehe 2 und Tabelle 9). Von dem Peak bei 2,15 min wird angenommen, dass er auf nicht-löslichem oder teilweise löslichem Material beruht, das durch die Säule hindurchtritt, und der Große Peak bei 46,5 min tritt auch in dem Spektrum einer Wasserleerspülung auf und wird deshalb als Artefakt betrachtet.
Tabelle 5: Peakergebnisse
Das kommerziell verfügbare HSA hatte andererseits viel mehr Peaks (siehe 3 und Tabelle 6).
Tabelle 6: Peakergebnisse
Die Qualität des Albumins der Erfindung im Sinne von nicht-kovalent gebundenen LMC ist derjenigen von klinischem HSA eindeutig überlegen. Numerische ausgedrückt ist die totale Peakfläche zwischen 10 min und 55 min für das Albumin der Erfindung etwa 6,4 Vsek während die totale Peakfläche zwischen den beiden selben Zeitpunkten für kommerziell verfügbares Material etwa 39,7 Vsek beträgt.
Eine entsprechende Analyse wurde mit Detektion bei 280 nm durchgeführt, wobei die Peakfläche für erfindungsgemäß gereinigtes Albumin 0,56 Vsek war, während sie für HSA 14,9 Vsek war.
Die Analyse von fluoreszenten niedrigmolekulargewichtigen Verunreinigungen (Anregung bei 280 nM, Detektion bei 350 nm) ergab wieder eine totale Peakfläche für durch das erfindungsgemäße Verfahren gereinigtes Albumin von weniger als 10% derjenigen für HSA.
Kapillarzonenelektrophorese von rHA und HSA
Kapillarelektrophorese (Capillary Electrophoresis = CE) wird als eine Alternative zur Standard-SDS-Page verwendet, um gereinigtes rHA der Erfindung und kommerziell verfügbares HSA qualitativ zu vergleichen. CE ist eine hochauflösende elektrophoretische Technik und ist in der Lage, Unterpopulatinen desselben Proteins zu trennen, auch wenn nur kleinere Unterschiede gefunden werden können.
Methode – Proben von HSA (Armour) und erfindungsgemäß gereinigtem rHA wurden getrennt in 2 mM PO₄/B₄O₇-Puffer, pH = 7,4 bei 20 KeV und 30°C auf einer ABI 270 CE elektrophoresiert. Das rHA der Erfindung ergab einen einzigen Peak auf dem Elektrophoretogramm, der seine Homogenität anzeigte. Im Gegensatz dazu wurden bei den kommerziell erhältlichen HSA-Proben anderen Peaks beobachtet. Von diesen Peaks wird angenommen, dass sie die Anwesenheit von Albuminmolekülen beispielsweise mit blockierten freien Thiolgruppen oder Aminendgruppenabbau anzeigen.
Analyse des C-Terminus
Ein wichtiger Aspekt der Qualitätskontrolle von rekombinanten Proteinen ist die Bestätigung und Stabilität der vorgegebenen primären Struktur.
Materialien und Methoden
Tryptischer Aufschluß: HSA (aus einer kommerziellen Quelle – eine Probe bei –20°C gelagert und eine für 12 Wochen bei 30°C gelagert), erfindungsgemäß gereinigtes rHA (für sechs Monate bei 4°C und 30°C gelagert) und ein Des-Leu rHA (eine Rumpfform von rHA minus dem C-terminalen Leucin) (jeweils 1 mg) wurden mit 5 mM Dithiotreitol (Calbiochem) für 120 min bei 37°C reduziert, dann mit 10 mM Iodacetamid (Sigma) für 90 min bei 37°C in 6 M Guanidin-HCl in 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 alkyliert.
Die Proben wurden dann 1 zu 3 mit H₂O verdünnt und mit Trypsin für 48 Stunden bei 37°C aufgeschlossen (TPCK-behandeltes Trypsin von Sigma, 3 × 10 μL Aliquots von 1 mg/mL Lösung zugegeben über 48 Stunden).
Peptidabbildung: Die tryptischen Aufschlüsse wurden auf Umkehrphasen-(Reverse Phase = RP)-HPLC auf einem Gilson HPLC-System unter Verwendung einer 25 cm Pharmacia SuperPac Pep-S-Säule (5 μm C₂/C₁₈) abgebildet. Die verwendeten Eluante waren A, 0,1% (Vol./Vol.) TFA (ABI) in Wasser; B, 0,09% (Vol./Vol.) TFA in 70% (Vol./Vol.) Acetonitril (Fisons Scientific) – linearer Gradient über 60 min, 0,5 mL/min, UV-Detektion bei 214 nm und 280 nm.
N-terminale Sequenzierung: Durchgeführt auf einem ABI 477A-Proteinsequenzierer.
Massenspektrometrie unter Bombardierung mit schnellen Atomen (Fast Atom Bombardment-Mass Spectrometry): FAB-MS wurde auf einem VG Autospec von M-Scan Limited, Ascot, UK durchgeführt.
Peptidsynthese: Das C-terminale tryptische Peptid voller Länge, LVAASQAALGL (Masse 1012), wurde von ABI, Warrington, UK synthetisiert; und die abgeschnittene Version, LVAASQAALG (Masse 899), wurde von dem Department of Biochemistry, Univerity of Nottingham, Nottingham, UK synthetisiert.
Ergebnisse
Von dem C-terminalen tryptischen Peptid voller Länge (Masse 1012) wurde unter Verwendung des synthetischen Markerpeptids gezeigt, dass es bei 37,5 min auf der RP-HPLC eluiert. Dieser Peak wurde aufgefangen und durch N-terminates Sequenzieren und FAB-MS von HSA und rHA identifiziert.
Die Entfernung des C-terminalen Leucins resultiert in ein abgeschnittenes C-terminales Peptid (Masse 899), von dem gezeigt wurde, dass es bei 28,5 min eluiert, was unter Verwendung des synthetischen Markerpeptids bestätigt wurde. Dieser Peak wurde von dem tryptischen Aufschluß von Des-Leu rHA isoliert und durch N-terminales Sequenzieren und FAB-MS identifiziert. Es wurde gezeigt, dass noch zwei andere Peptide in diesem 28.5 min Peak vorliegen, ABAVAR (Masse 673) und DLGEENFK (Masse 950).
Der 28,5 min Peak wurde von der RP-HPLC aus dem tryptischen Aufschluß von HSA, von für zwölf Wochen bei 30°C gelagertem HSA, von Des-Leu rHA, von für sechs Monate bei 4°C gelagertem rHA der Erfindung und von für sechs Monate bei 30°C gelagertem rHA der Erfindung aufgefangen.
Die Peaks von jedem Aufschluß wurden nachfolgend durch N-terminales Sequenzieren und FAB-MS zusammen mit den synthetischen Markerpeptiden analysiert.
Tabelle 7. Peptide, die in dem 28,5 min. Peak durch N-terminales Sequenzieren nachgewiesen wurden
Bei der FAB-MS waren die Hauptsignale ((M + H)⁺-Molekülionen), die in dem 28,5 min Peak vorliegen, so wie in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8. (M + H)⁺ Ionen im 28,5 min Peak
Die Signale bei 1028 und 1140 können Fragmentionen sein; es gab keine Peptide, die durch Sequenzanalyse detektiert werden konnten.
Schlußfolgerungen
Das tryptische C-terminale Des-Leu-Peptid wurde in kommerziellem HSA mit etwa 5–10 (nicht quantitativ) detektiert, es konnte aber nicht in dem rHA der Erfindung nachgewiesen werden, selbst nach 6 Monaten bei 30°C nicht. Das Des-Leu-Peptid konnte in dem 12 Wochen bei 30°C HSA nicht nachgewiesen werden, und der Peak für das C-terminale Peptid voller Länge bei 37,5 min (obwohl nicht isoliert) war stark reduziert verglichen mit den anderen Proben, was anzeigt, dass diese Probe vielleicht eine weitergehenden C-terminalen Zersetzung erlitten hatte.
Diese Resultate zeigen, dass erfindungsgemäß gereinigtes rHA einen stabilen Carboxyterminus voller Länge hat, während HSA, wie es bislang aus kommerziellen Quellen verfügbar ist, im Vergleich heterogen erscheint.
Kolorimetrischer Test auf freie Thiole in gereinigtem humanem Albumin
Einleitung – Ellmann's Reagenz, 5,5'-Dithiobis-(2-Nitrobenzoat) (DTNB), ist ein spezifisches und sensitives Mittel zum Nachweisen freier Thiolgruppen, so wie Cys-SH. Die Reaktion kann durch Beobachten der Absorption bei 412 nm verfolgt werden, wobei der Meßwert verwendet werden kann, um freies Cys-SH bis auf Niveaus von weniger als ein Rest pro Molekül rHA zu berechnen. Die folgenden Lösungsreagenzien wurden bei dem Test verwendet:
5,5-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure) DTNB, Sigma Product No D8130.
TRIS PRE-SET pH-Kristalle pH 8,0, Sigma Produkt Nr. T4753.
EDTA, Dinatrium, Sigma Product Nr. ED2SS.
Natriumdihydrogenphosphatdihydrat, Analar-Qualität.
Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat, Analar-Qualität.
Puffer 1: 0,1 M (12,1 g) Tris-HCl; 0,01 M (3,72 g) EDTA Na₂·2H₂O, pH 8,0. PRE-SET pH-Kristalle. Löse in 500 mL Wasser und fülle auf genau 1 L Volumen auf. Stabil für einen Monat bei Raumtemperatur.
Puffer 2: 0,05 M Natriumphosphat pH 7,0, Na₂HPO₄·2H₂O (5,45 g), 3,04 g NaH₂PO₄·2H₂O. Löse in 500 mL Wasser und fülle auf genau 1 L Volumen auf. Stabil für einen Monat bei Raumtemperatur.
Reagenz: 0,01 M (39,4 mg) DTNB in Phosphatpuffer. Löse in 10 ml Puffer 2. Präpariere jeden Tag frisch.
Probe: Verdünne Albumin auf etwa 10,3 μM in Puffer 1 (0,66 mg/mL).
Vorgehen
1) Setze den Spektrophotometerzellenhalterthermostat auf 25°C. 2) Gebe 1,25 ml der Probe in eine Küvette und 1,25 ml Puffer in eine andere 10 ml Küvette von reduziertem Volumen in der Probenposition bzw. in der Referenzposition. 3) Nulle das Instrument bei 412 nm. Setze die Absorption auf 0,1 AU Vollausschlag. 4) Gebe 50 μL DTNB Reagenz in die Referenzküvette und mische kurz unter Verwendung eines gereinigten Plastikrührers. 5) Gebe 50 μL DTNB-Reagenz in die Probenküvette und mische wie oben. 6) Starte sofort die Aufnahme von Daten (oder starte den Meßaufzeichner und folge der Reaktion für bis zu 10 min). 7) Wiederhole für jede Probe, um die Werte dreifach zu erhalten. 8) Extrapoliere von dem stetigen Absorptionsabfall zurück auf die Nullzeit und lese die Absorption bei 412 nm (δA₄₁₂) ab (1). 9) Berechne den Sulphydryl-Gehalt unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten ζ₄₁₂ = 13,9 cm²mM^–1.
Ergebnisse
Eine Anzahl von kommerziellen HSA-Proben wurden auf ihren freien Thiol-Gehalt getestet. Die Resultate sind unten zusammengefaßt:

HAS Freies Thiol (Mol SH/Mol HSA)

1 0,29

2 0,22

3 0,35

4 0,05

5 0,08

6 0,46

7 0,36
Diese Werte sind signifikant niedriger als die Werte für Albumin, das gemäß dem obigen Beispiel präpariert wurde, das regelmäßig zu 0,85–0,9 Mol SH/Mol rHA getestet wird.
Die Bestimmung von Metallionenkontamination in humanem Albumin durch Graphitofenspektroskopie
Standards und Proben werden aus einem pyrobeschichteten Graphitrohr atomisiert. Die Atomabsorption der Probe wird unter Verwendung der folgenden Bedingungen detektiert:
Aluminium wurde unter Verwendung eines Perkin Elmer M2100 Atomabsorptionsspektrophotometer, eines Perkin Elmer HGA-700 Graphitofens, eines Perkin Elmer AS-70 Autosamplers mit Probenschälchen und einer Aluminiumhohlkatodenlampe gemessen. Die Reagenzien waren Magnesiumnitrat von AR-Qualität, eine Aluminiumstandardlösung (1000 ppm) und konzentrierte Salpetersäure von AR-Qualität. Eine 1,0% Gew./Vol. Magnesiumnitratlösung wurde mit Milli-Q-Wasser hergestellt. 15 μL Aluminiumstandardlösung wurden in den Autosampler pipettiert und mit 0,20%iger Salpetersäurelösung auf 1500 μL verdünnt. Die Prozedur wurde mit 15 μL der erhaltenen Lösung und dann mit 150 μL der nachfolgend erhaltenen Lösung wiederholt, um eine 10 ppb (μg/L) Aluminiumlösung zu ergeben.
Eine Albuminprobe wird mit 0,20% Salpetersäurelösung verdünnt, um eine Aluminiumkonzentration innerhalb der Grenzen des Kalibrierungsgraphen zu ergeben. Eine 1 : 2-Verdünnung ist normalerweise ausreichend.
Magnesium wird ähnlich gemessen und zwar unter Verwendung eines Perkin Elmer AS-51 Flammenautosamplers und einer Magnesiumhohlkatodenlampe. Eine Magnesiumstandardlösung von 1000 ppm wird mit Milli-Q-Wasser verdünnt, um 0,1, 0,2, 0,5 und 1,0 ppm Standardlösungen zu ergeben. Die Atomabsorption der Probe wird bei 285,2 nm detektiert.
Kupfer, Eisen, Mangan und Zink werden auf dieselbe Weise wie Aluminium gemessen, außer dass für Zink eine 1,0 ppb (μg/L) Standardlösung verwendet wird, anstelle einer 10 ppb-Lösung. Die Konzentration der Metallionen wurde in ng/L bestimmt und dann auf die Konzentration des Albumins (ng Metallionen/g Albumin) bezogen. Diese Daten sind in Tabelle 9 wiedergegeben.
Tabelle 9: Verunreinigungsprofile von erfindungsgemäß hergestelltem Albumin Kuzentration in ng/g Albumin
Alle Ergebnisse sind als totale Metallionenkonzentration ausgedrückt.
Tabelle 10 zeigt die entsprechenden Niveaus von Metallionen in kommerziellem HSA.
Tabelle 10: Konzentrationen in ng Metall/g Albumin
Es ist zu sehen, dass das mittlere Niveau an Aluminium in dem Produkt der Erfindung etwa 60 ng/g war, während kommerzielle Quellen 155–3.190 ng/g hatten. In gleicher Weise hatte das Produkt der Erfindung ein Mittel von etwa 948 ng/g Eisen (verglichen mit 1.850–41.200 ng/g im Material nach dem Stand der Technik), ein Mittel von 2.990 ng/g Kupfer (verglichen mit 580–23.840 ng/g im Material nach dem Stand der Technik), ein Mittel von 1.120 ng/g Magnesium (verglichen mit 500–54.000 ng/g im Material nach dem Stand der Technik), ein Mittel von 2.390 ng/g Zink (verglichen mit 930–7.230 ng/g im Material nach dem Stand der Technik) und ein Mittel von 48 ng/g Mangan (verglichen mit 65–940 ng/g im Material nach dem Stand der Technik).
Analyse von mittel- und langkettigen Fettsäuren
Die Fettsäureprofile von erfindungsgemäßem Albumin und kommerziell verfügbarem HSA wurden durch saure Lösungsmittelextraktion und Gaschromatographie der freien Fettsäuren unter Verwendung eines internen C17:0-Standards analysiert.
Ausrüstung: Gaschromatograph (z. B. Shimadzu GC 9A) mit Flammenionisationsdetektor; Autoinjektor (z. B. Shimadzu AOC14); Integrator/Drucker (z. B. Shimadzu CR4A); HP-FFA 30 × 0,53 mm, 1,0 μm Phasensäule (Hewlett Packard Limited); Megabore Installation Kit (J & W Scientific 220–1.150 für GC 9A) mit Direktinjektionsauskleidung.
Reagenzien: Wasser (Milli-Q); Dichlormethan Superpurity Solvent (Romil Chemicals, Loughborough, Leics.; Natriumacetattrihydratanalar (DBH Limited, Poole); Eisessigsäureanalar (BDH Limited, Poole); humane Serumalbuminlösung (Zenalb^TM20, Bioproducts Laboratory, Elstree, Herts.); wasserfreies Natriumsulphat (analytisches Reagenz); Standardfettsäuren von Sigma.
Lösungen: 0,5 M Natriumacetatpuffer pH 4,5; Natriumacetat 6,13 g und Essigsäure 3,30 g/100 mL.
Freie Fettsäuren-Standardmischungen. Wiege 5 mg von jeder Fettsäure in separate Glasphiolen ein. Löse jede Fettsäure in 1 mL Dichlormethan und überführe in drei 12 mL Pyrexkulturröhrchen jeweils für kurzkettige (C6-C14), mittelkettige (C16-C18) und langkettige (C20-C22: 1) Fettsäuren. Trockne die Mischungen unter einem Strom von Stickstoff herunter und löse in 1 ml Dichlormethan auf. Überführe 50 μL Aliquots der Mischung in markierte Glasphiolen, trockne unter Stickstoff, verschließe und lagere bei –20°C.
Innere Standardlösung 1 mg/ml Heptadekansäure (25,0 mg Heptadekansäure/25 mL Dichlormethan).
Vorgehen

1. Gib 50 μl interne Standardlösung in 6 markierte 40 mL Pyrexröhrchen.
2. Für 5%iges rHA, gib 5 ml Probe hinzu. Für 25%iges rHA, verwende 1 ml Probe und 4 ml Wasser. Schließe eine Nullprobe (5 ml Wasser) und eine Serumalbuminprobe (1,25 ml Zenalb^TM20 und 3,75 ml Wasser) ein. Präpariere alle Proben doppelt.
3. Gib 2,5 ml Natriumacetatpuffer, dann 10 ml Dichlormethan in alle Röhrchen.
4. Gib die verschlossenen Röhrchen auf einen mechanischen Roller für zwei Stunden bei Raumtemperatur.
5. Zentrifugiere alle Röhrchen für 5 min bei 3.000 U/min in einer Sorvall RT6000B Zentrifuge bei 20°C.
6. Entferne die obere wässrige Phase, dann überführe vom Grund der Röhrchen arbeitend vorsichtig die untere Dichlormethanphase in markierte 12 ml Pyrexröhrchen. Proteinkügelchen können das vollständige Entfernen der Dichlormethanphase behindern. Falls dies auftritt, gib einen Spatel voll wasserfreies Natriumsulphat hinzu, verschließe und schüttle.
7. Trockne die Dichlormethanphase unter einem Strom von Stickstoff, und lagere unter Stickstoff bei –20°C bis zur Analyse.
8. Installiere die Kapillarsäule, und stelle den Gaschromatographen gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die folgenden Bedingungen ein: Detektor: Flammenionisation; Trägergas: Stickstoff mit 300 ml/min; Injektionsvolumen: 0,5 μl; Säulenanfangstemperatur: 70°C; Haltedauer: 1,5 min.; Gradient 1: 20°C/min bis 150°C; Gradient 2: 4°C/min bis 240°C; Haltezeit 7 min; Detektortemperatur 280°C; die Vorgaben spezifisch für den Shimadzu GC 9A sind: Detektorbereich: 10°: Wasserstoffdruck: 0,5 kg/cm²: Luftdruck: 0,5 kg/cm²; Stoppzeit: 50 min.
9. Stelle den Integrator gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Datenaufnahme von dem Gaschromatographen ein.
10. Erhöhe die Ofentemperatur auf 245°C und lasse sie dort bis eine stabile Basislinie erreicht ist.
11. Senke die Ofentemperatur auf 70°C und erlaube die Einstellung eines Gleichgewichts.
12. Taue ein Aliquot der lang-, mittel- und kurzkettigen Fettsäurestandards auf. Löse den langkettigen Fettsäurestandard in 1 ml Dichlormethan. Überführe die Lösung zu den mittelkettigen Fettsäuren und löse auf, wiederhole für die kurzen Fettsäuren.
13. Injiziere die Standardmischung, um die Fettsäureretentionszeiten zu bestimmen. Das erzeugte Chromatogramm sollte sehr wenig Peakschwanzbildung zeigen und eine glatte, langsam ansteigende Basislinie mit der korrekten Anzahl von gut aufgelösten Peaks aufweisen. Kaprylsäure (C6:0) sollte mit einer Retentionszeit von ungefähr 6 min eluieren und Erucasäure (C22:1) mit einer Retentionszeit von ungefähr 33 min. Identifiziere alle Peaks durch Vergleich mit dem Beispielsstandardchromatogramm.
14. Injiziere Proben und sammle Daten.

Berechnungen

1. Identifiziere den internen Standardpeak von der Nullprobe. Dies wird der Hauptpeak mit einer Retentionszeit von ungefähr 23,5 min sein.
2. Berechne die Peakflächenverhältnisse für alle integrierten Peaks in allen Proben unter Verwendung der folgenden Formel. Peakflächenverhältnis = Peakfläche/Peakfläche des internen Standards
3. Identifiziere die Fettsäurepeaks in den rHA- und HSA-Proben basierend auf der Retentionszeit im Vergleich mit den Standards.
4. Wandle alle Peakflächenverhältnisse in ungefähre Konzentrationen (μg/g Albumin) sowohl für die rHA-als auch für die HSA-Proben unter Verwendung des folgenden Faktors um: Konzentration (μg/g) = Peakflächenverhältnis × 200
5. Für Peaks, die als Fettsäuren identifiziert sind, wandle die Konzentration von μg/g Albumin in Mol/Mol Albumin unter Verwendung des Molekulargewichts der Fettsäure und der folgenden Formel um: Konzentration (Mol/Mol) = μg/g) × 0,0665/Fettsäuremolekulargewicht

Beispielsergebnisse werden für eine Charge von Albumin wiedergegeben, das gemäß Beispiel 2 präpariert wurde, (4) und kommerzielles HSA (5). Keine abnormalen Fettsäuren sind durch diese Methode in letzteren detektiert worden, obwohl die Profile für die beiden Proteine signifikante Unterschiede zeigten. Wie erwartet zeigten beide große Mengen an dem zugesetzten Stabilisator, Octanoat (C8:0). Hiervon abgesehen wurde das kommerzielle HSA vorwiegend durch C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 und C18:2 charakterisiert, während das Albumin der Erfindung vorwiegend C10:0, C12:0, C16:1 und manchmal C14:0 enthielt. Weitere Experimente zeigten, dass die Niveaus an C10:0 und C12:0 in dem rHA-Endprodukt mit den Niveaus dieser Verunreinigungen in dem Octanoat korreliert waren, welches für die späteren Stufen des Reinigungsverfahrens verwendet wurde.
Die Daten für das rHA, welches gemäß Beispiel 7 hergestellt wurde, sind wie folgt: Tabelle 11: Vergleich der Fettsäurenzusammensetzung von gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigtem rHA und kommerziellem HSA

ND: nicht detektiert

Vorzugsweise überschreitet das absolute Niveau an C18 Fettsäuren nicht 1,0% (Mol/Mol) des Niveaus des Octanoats und vorzugsweise überschreitet es nicht 0,5% dieses Niveaus. Darüberhinaus sind die Niveaus der C18:2-, C18:3- und C20-Fettsäuren bei dem Albumin der Erfindung im allgemeinen nicht nachweisbar. In kommerziellem HSA kann es typischerweise etwa 0,4 Mol C10- bis C12-Fettsäuren/Mol Albumin geben. In dem Produkt der Erfindung gibt es typischerweise keine nachweisbaren C20-Fettsäuren und ungefähr etwa 0,01–0,02 Mol C18-Fettsäuren/Mol Albumin.
Analyse der Farbe – Die Absorption einer 5%igen (Gew./Vol.) Lösung des Endprodukts in einer 1 cm Küvette wurde bei 350 nm, 403 nm und 500 nm gemessen und in Einheiten der Absorption pro Gramm Albumin/Liter pro cm Weglänge (d. h. A I g^–1·cm^–1) berechnet. Das Albumin der Erfindung hatte die folgenden Werte:

Wellenlänge mittlere Absorption (n = 10 Chargen)

(nm) (I g^–1·cm^–1)

350 4,75 × 10^–3

403 2,12 × 10^–3

500 0,58 × 10^–3
Im Allgemeinen überschreitet das Albumin der Erfindung nicht die jeweiligen Absorptionen von 6,0 × 10^–3 und 0,75 × 10^–3 bei den drei Wellenlängen.
Tests an einer Anzahl von kommerziell verfügbaren HSA-Präparationen ergaben höhere Absorptionen bei diesen Wellenlängen (s. Tabelle 12).
Tabelle 12: Absorption (L·g^–1·cm^–1) von HSA-Präparationen nach dem Stand der Technik
SDS-reduzierende Polyacrylamidgelelektrophorese – Dieser Test wird durchgeführt, um zu zeigen, dass rHA aus einer einzigen Polypeptidkette besteht, die, wenn sie mit einem reduzierenden Mittel (β-Merkaptoethanol) behandelt wird, als ein einziges Band (Monomer) bei einer SDS-reduzierenden Polyacrylamidgelektrophorese (PAGE) wandert.
Proben von Albumin in SDS-reduzierendem Puffer (20 mMol TRIS-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 5% (Gew./Vol.) (SDS) und 10% (Vol./Vol.) β-Merkaptoethanol enthaltend) mit dem Albumin zu 1 mg/ml wurden gekocht und dann auf SDS-homogenen (12,5%) Phastgelen (Pharmacia) unter Anwendung einer Beladung von 1 μL der Lösung aufgetrennt. Die Proteinbänder wurden durch Coomassie Blue R250-Einfärbung detektiert und auf einem Shimadzu CS9000 Densitometer eingescannt. Die Auftrennung des Albumins zeigte ein einziges Band von Coomassie-Färbungen, was anzeigt, dass der Anteil des Albumins, der als Monomer vorliegt, mindestens 99,9% ist.
Gelpermeationshochdruckflüssigchromatographie
25 μL einer 10 mg/ml Lösung des Albumins in dem Eluat von der Anionenaustauschmatrix bei der Hauptausführungsform des Verfahrens der Erfindung, d. h. bei der der Anionenaustauschschritt der letzte Schritt vor der Ultrafiltration und der Formulierung ist, wird auf eine TSK3000SWXL-Säule an einem Shimadzu LC6A HPLC injiziert. Es wurde gefunden, dass das Produkt zu mindestens 99,9% monomer ist.
25 μL einer zweiten 10 mg/ml Lösung von Albumin, das erfindungsgemäß gereinigt worden war und das zu 25% Gew./Vol. formuliert worden war, wurde in derselben Weise getestet, und es wurde herausgefunden, dass es weniger als 0,1% polymeres Albumin enthielt. Dieses Resultat zeigt an, dass die hier beschriebene Formulierung keinen Effekt auf den Polymer/Aggregatgehalt des gereinigten Albumins hat.
Zweidimensionale Gelelektrophorese
2 μg rHA Albumin, das durch das Verfahren der Erfindung präpariert worden war, wurde einer zweidimensionalen Elektrophorese unter Verwendung eines Millipore Investigator Systems unterworfen. Die Auftrennung in der ersten Dimension war ein isoelektrisch fokussierendes Gel von pH 3–10, und es wurde in der zweiten Dimension gefolgt von einem 10% Polyacrylamid/SDS-Gel. Nach Färbung des Gels mit Coomassie Blue war nur ein Punkt sichtbar, was das Vorliegen nur einer Proteinspezies anzeigt.
Elektronensprühmassenspektrometrie
Elektronensprühmassenspektrometrie (ESMS) wurde durchgeführt unter Verwendung eine VG Quattro Elektronensprühmassenspektrometers kalibriert mit Pferdeherzmyoglobin (16951 Da, erhalten von Sigma) über einen m/z-Bereich 950–1.750 Da/e. Proben von kommerziell verfügbarem HSA und Proben von erfindungsgemäß gereinigtem rHA wurden entsalzt vor der Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Acetonitrilgradienden, der Trifluoressigsäure enthielt. 6A und 6B zeigen die Spektren für Albumin der Erfindung bzw. HSA nach dem Stand der Technik. Das letztere zeigt Peaks, die blockiertes freies Thiol und N-terminalen Abbau wiedergeben.
Das Albumin der Erfindung kann bei diesem Test als homogen angesehen werden, mit anderen Worten zeigt es einen einzigen definierten Peak, der bei einer Masse von ungefähr 66441 Da auftritt.
Langzeitstabilität
Über zwei Jahre ist keine Zersetzung des Albumin durch elektrophoretische Methoden nachweisbar, was zeigt, dass keine Proteasenaktivität vorliegt.

Claims

Albuminpräparat, wobei das Albumin ein Glykationsniveau von weniger als 0,6 mol Hexose/mol Protein aufweist und wobei das Präparat einen einzigen Peak bei einem Kapillarzonenelektrophoretogramm aufweist.
Albuminpräparat nach Anspruch 1, wobei das Albumin eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) einen Aluminiumionengehalt von weniger als 150 ng; einen Eisenionengehalt von weniger als 3.000 ng; einen Kupferionengehalt von weniger als 10.000 ng; einen Magnesiumionengehalt von weniger als 3.000 ng; einen Zinkionengehalt von weniger als 5.000 ng oder einen Manganionengehalt von weniger als 50 ng (jeweils basierend auf einem Gramm Albumin); (b) mindestens 99,5% des Albumins sind monomer beim SDS-reduzierenden PAGE-Verfahren; (c) ein Niveau von niedrigmolekulargewichtigen Verunreinigungen von weniger als 20 Vsek; (d) ein intakter, d. h. homogener C-Terminus und N-Terminus; (e) ein Gehalt an freiem Thiol von mindestens 0,85 mol SH/mol Protein; (f) und nicht mehr als 0,3 mol/mol von C10 bis C20 Fettsäuren und im Wesentlichen keine C18 oder C20 Fettsäuren; oder (g) eine Absorption von nicht mehr als 6,0 × 10^–3, 2,5 × 10^–3, 0,75 × 10^–3 pro Gramm Albumin/Liter pro Zentimeter Weglänge (A I g^–1cm^–1) wenn bei 350 nm, 403 nm bzw. 500 nm gemessen wird.
Albuminpräparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Albumin eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) einen Aluminiumionengehalt von weniger als 100 ng; einen Eisenionengehalt von weniger als 1.000 ng; einen Kupferionengehalt von weniger als 500 ng; einen Magnesiumionengehalt von weniger als 1.500 ng; oder einen Zinkionengehalt von weniger als 3.000 ng (jeweils basierend auf einem Gramm Albumin; (b) ein Glykationsniveau von weniger als 0,15 mol Hexose/mol Protein; oder (c) ein Niveau von niedrigmolekulargewichtigen Verunreinigungen unterhalb von 10 Vsek.
Albuminpräparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Albumin ein Glykationsniveau von weniger als 0,05 mol Hexose/mol Protein aufweist.
Albuminpräparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei 99,9% des Proteins in dem Präparat Albumin sind.
Albuminpräparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Albumin ein rekombinantes Albumin ist.
Albuminpräparat nach Anspruch 6, wobei das Albumin durch Hefe hergestellt ist.
Albuminpräparat nach Anspruch 7, wobei die Hefe zu einem der folgenden Stämme gehört: Saccharomyces, Pichia oder Kluyveromyces.
Albuminpräparat nach Anspruch 8, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.
Vial, das eine 4 bis 25% Gewicht/Volumen Lösung eines Albuminpräparates gemäß einem der vorangehenden Ansprüche enthält, welches steril und nicht pyrogen ist und für die intravenöse Verabreichung formuliert ist.
Formulierung eines therapeutischen Proteins und eines Albuminpräparats nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Medium zum Ziehen höherer eukaryotischer Zellen, das ein Albuminpräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 9 aufweist.