PT828759E - Processo de producao de albumina de elevada pureza - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Processo de produção de albumina de elevada pureza" O presente invento refere-se à purificação da proteína albumina de soro humano (HSA) extraída de soro ou albumina humana recombinante (rHA) produzida através da transformação de um microorganismo com uma sequência de codificação nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da albumina de soro humano. Neste fascículo, o termo "albumina” refere-se genericamente a HSA e/ou rHA. A albumina é utilizada para tratar doentes com queimaduras graves, em choque ou com perda de sangue. É também utilizada para suplementar meios utilizados para crescer células eucarióticas superiores e como excipiente na formulação de proteínas terapêuticas. Actualmente, a procura do produto é satisfeita através de albumina extraída de sangue humano. Exemplos de técnicas de extracção e separação incluem as divulgadas em: JP 03/258 728 sobre a utilização de um permutador catiónico; EP 428 758 sobre a utilização de permuta aniónica seguida por permuta catiónica; e EP 452 753 sobre a utilização de aquecimento, adição de sal e diafiltração. A produção de rHA em microorganismos foi divulgada na EP 330 451 e EP 361 991. As técnicas de purificação para rHA foram divulgadas em: WO 92/04367, remoção de corante derivado da matriz; EP 464 590, remoção de corantes derivados de leveduras; e EP 319 067, precipitação alcalina e aplicação subsequente da rHA a uma fase lipófila possuindo afinidade específica para a albumina. 0 presente invento proporciona albumina altamente purificada.

Um aspecto do presente invento proporciona um processo para purificar albumina, compreendendo o processo os passos de aplicação de uma solução de albumina relativamente impura a um material cromatográfico para o qual a albumina não tem qualquer afinidade específica de forma a que a albumina se ligue ao material, e eluição da albumina ligada do material aplicando uma solução de um composto possuindo uma afinidade específica para a albumina. De preferência, o rnalerial crumaluyiáficu é um permutador catiónico, tal como

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 2 SP-Sepharose FF, SP-Spherosil, etc., tal como abaixo apresentado no Exemplo 2. O composto com afinidade específica para a albumina pode ser octanoato (p.ex. octanoato da sódio), outros ácidos gordos de cadeia longa (Ce a C22), salicilato, octilsuccinato, N-acetiltriptofano ou uma mistura de dois ou mais destes.

Um segundo aspecto do invento proporciona um processo para purificar albumina, compreendendo o processo os passos de sujeição de uma solução de albumina a cromatografia de permuta catiónica na qual a albumina é ligada a um material de permuta catiónica e depois a cromatografia de permuta aniónica na qual a albumina é ligada a um material de permuta aniónica, desde que se cumpra uma das seguintes duas condições.

Primeiro, a albumina que é eluída do material de permuta catiónica é subsequentemente tratada por uma ou mais de entre cromatografia de afinidade, ultrafiltração e permeação em gel antes de ser sujeita à referida cromatografia de permuta aniónica. Por este motivo, numa concretização preferida, o processo compreende os passos de: (a) passagem de uma solução de albumina através de uma matriz de permuta catiónica sob condições tais que a albumina se ligará à matriz; (b) eluição, da referida matriz, de um eluato de permuta catiónica contendo albumina; (c) passagem do referido eluato através de uma matriz de afinidade compreendendo um composto de ligação à albumina; (d) eluição, da referida matriz, de um eluato da matriz de afinidade contendo albumina; (e) passagem do referido eluato, opcionalmente após ultrafiltração, através de uma matriz de permeação em gel para obter uma fracção enriquecida em albumina; (f) passagem da referida fracção enriquecida em albumina através de uma matriz de permuta aniónica sob condições tais que a albumina se ligará à matriz; e (g) eluição, da referida matriz de permuta aniónica, de um produto contendo albumina purificada.

Alternativamente, a albumina que é eluída do material de permuta catiónica pode ser aplicada ao referido material de permuta aniónica sem

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 3 qualquer tratamento interveniente (sem ser diluição). Por este motivo, uma segunda concretização preferida proporciona um processo para purificar albumina, compreendendo os passos de: (a) passagem de uma solução de albumina através de uma matriz de permuta catiónica sob condições tais que a albumina se ligará à matriz; (b) eluição, da matriz, de um eluato de permuta catiónica contendo albumina; (c) passagem do eluato de permuta catiónica através de uma matriz de permuta aniónica sob condições tais que a albumina se ligará à matriz; (d) eluição, da matriz de permuta aniónica, de um eluato de permuta aniónica contendo albumina; (e) passagem do eluato de permuta aniónica através de uma matriz de afinidade compreendendo um composto de ligação à albumina; (f) eluição, da matriz de afinidade, de um eluato de matriz de afinidade contendo albumina; (g) passagem do eluato de matriz de afinidade através de uma matriz de permeação em gel para obter uma fracção enriquecida em albumina.

De preferência, antes do passo de permuta catiónica, a solução de albumina é condicionada adicionando-lhe octanoato e/ou outro estabilizante de albumina (p.ex. acetiltriptofanato de sódio) até uma concentração final de cerca de 1-10 mM e ajustando o pH para cerca de 4,0-5,0.

Vantajosamente, a albumina retida no passo de permuta catiónica é lavada com uma solução de elevado teor salino (p.ex. NaCI 0,5-2,0 M tamponado a pH 4,0 com acetato de sódio 10-100 mM, de preferência 20-40 mM, por exemplo 27 mM) antes de ser eluída.

De preferência, em processos nos quais o eluato de permuta catiónica é passado directamente para o permutador aniónico, a albumina é eluída no passo de permuta catiónica utilizando um tampão contendo um composto possuindo uma afinidade específica para a albumina, especialmente um ácido ou sal deste, por exemplo octanoato ou qualquer outro ácido gordo de cadeia longa (C6-C22), salicilato, octilsuccinato ou N-acetiltriptofano.

Adequadamente, a albumina é eluída do permutador aniónico com um tampão contendo um nível elevado (p.ex. pelo menos 50 mM, de preferência 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 4

50-200 mM, por exemplo 80-150 mM) de um sal de ácido bórico, por exemplo tetraborato de sódio ou de potássio. A albumina purificada de acordo com o invento pode então, com ou sem passos de processo intervenientes, ser sujeita a cromatografia ou a uma resina contendo um composto imobilizado o qual se ligará selectivamente a glicoconjugados e sacáridos, tais como o ácido aminofenilborónico (PBA).

Em qualquer processo do invento que envolva cromatografia de afinidade, a cromatografia de afinidade utiliza de preferência uma resina compreendendo um corante imobilizado específico para a albumina, tal como um corante do tipo Azul de Cibaron, de preferência imobilizado na resina através de espaçador tal como 1,4-diaminobutano ou outro espaçador de C,.8, de preferência C,.6, p.ex. C,.5, sendo mais preferível um comprimento de C4, possuindo de preferência uma substituição α,ω-diamino. Surpreendentemente, verificámos que tais corantes têm de facto uma maior afinidade para um fragmento de albumina de 45 kD que pode ser produzido em culturas de microorganismos que segregam HA, que para a molécula de albumina de comprimento completo. O fragmento de 45 kD consiste tipicamente na região 1-403 a 1-409 e está divulgado em Sleep et al. (1990) Bio/Technology 8, 42-46 e em WO 95/23857. A solução de albumina purificada preparada através do processo do invento pode ser ainda processada de acordo com a sua utilidade pretendida. Por exemplo, esta pode ser ultrafiltrada através de uma membrana de ultrafiltração para obter um retentado de ultrafiltração possuindo uma concentração de albumina de pelo menos cerca de 80 g de albumina por litro, sendo o retentado de ultrafiltração diafiltrado contra pelo menos 5 equivalentes ao retentado de água. Pode ser vantajoso incluir iões amónio em certos passos cromatográficos, por exemplo no passo que envolve aminofenilboronato imobilizado. Surpreendentemente, verificámos que tais iões amónio se ligam de forma relativamente forte à albumina. É preferível que tais iões amónio sejam removidos da albumina e verificámos que isto pode ser alcançado através da utilização de um contra-ião. 0 desejo de expor a albumina a um contra-ião não terá ocorrido às pessoas nesta arte uma vez que os processos anteriores não envolviam iões amónio e não havia qualquer razão para supor que os iões amónio se ligariam à albumina. /g

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De acordo com isto, um outro aspecto do invento proporciona um método para purificar uma solução de albumina compreendendo a exposição da solução a uma solução de um contra-ião de tal forma que os iões amónio sejam deslocados da albumina e possam ser removidos da solução. 0 contra-ião (de preferência um ião metálico tal como iões de sódio) pode ser adicionado à solução de albumina e os iões amónio removidos por diálise, ou o ião amónio pode ser diafiltrado para fora através de uma membrana semi-permeável que separe a albumina da solução do contra-ião, ou estes podem ser removidos por cromatografia de permeação em gel. É geralmente adequada diafiltração contra pelo menos cinco volumes de retentado de cloreto de sódio 50 mM.

Verificou-se que a albumina obtida tinha níveis extremamente baixos, ou era essencialmente isenta, de corantes, lactato, citrato, metais, proteínas humanas tais como imunoglobulinas, activador de pré-calicreína, transferrina, glicoproteína α,-ácida, hemoglobina e factores de coagulação do sangue, proteínas procarióticas, fragmentos de albumina, agregados ou polímeros de albumina, endotoxina, bilirrubina, heme, proteínas de levedura e vírus. "Essencialmente isento" significa abaixo de níveis detectáveis. O termo "corante” tal como aqui utilizado significa qualquer composto que core a albumina. Por exemplo, um pigmento é um corante que tem origem no organismo, especialmente levedura, o qual é utilizado para preparar albumina recombinante, enquanto que um corante é um corante que tem origem em passos cromatográficos para purificar a albumina. Pelo menos 99%, de preferência pelo menos 99,9%, em peso da proteína nas preparações de albumina purificadas pelo processo do invento é albumina. É pouco provável que tal albumina altamente pura cause efeitos secundários adversos.

Verificou-se que a albumina produzida através do processo do invento é pelo menos 99,5% monomérica, de preferência substancialmente 100% monomérica através de SDS-PAGE redutora, e é caracterizada por uma ou mais das seguintes características. Tem um teor de iões de alumínio de menos de 150 ng, de preferência menos de 100 ng; um teor de iões de ferro de menos de 3000 ng, de preferência menos de 1000 ng; um nível de iões de cobre de menos de 10000 ng, de preferência menos de 5000 ng; um nível de iões de magnésiu de menus de 3000 ng, de preferência menos de 1500 ng; um nível de

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 6 iões de zinco de menos de 5000 ng, de preferência menos de 3000 ng, um nível de iões de manganésio de menos de 50 ng, todos baseados num grama de albumina; um nível de glicação de menos de 0,6, de preferência menos de 0,15 (sendo preferível menos de 0,05) moles de hexose/mol de proteína; um nível de contaminantes de baixo peso molecular abaixo de 20 V.s, de preferência menos de 10 V.s, medido tal como no Exemplo 9 adiante; um único pico num electroforetograma de zona capilar; terminal C e terminal N intactos, i.e. homogéneos; um teor de tiol livre de pelo menos 0,85 moles de SH/mol de proteína; e não mais que 0,3 moles/mol de ácidos gordos C10 a C20 e substancialmente isenta de ácidos gordos C18 ou C20· O material de partida pode ser um meio de fermentação contendo albumina, ou a solução de albumina impura pode ser uma solução obtida a partir de soro através de qualquer uma das muitas técnicas de extracção e purificação desenvolvidas ao longo dos últimos 50 anos, por exemplo as divulgadas em Stoltz et al. (1991) Pharmaceut. Tech. Int. Junho de 1991, 60-65 e More & Harvey (1991) em "Blood Separation and Plasma Fractionation" Ed. Harris, Wiley-Liss, 261-306.

Especialmente quando a albumina é rHA produzida em leveduras ou outros organismos deficientes em proteases, o processo não compreende normalmente um passo de tratamento com calor como parte do processo de purificação (em contraste com EP 428 758 e EP 658 569). De forma semelhante, se esta é preparada a partir de microorganismos (em vez de a partir de humanos) não requer normalmente um passo final de pasteurização (tipicamente 60°C durante uma hora). O produto final pode ser formulado para lhe dar maior estabilidade. De preferência, o produto de albumina altamente pura do invento contém pelo menos 100 g, sendo preferível 1 kg ou 10 kg de albumina, a qual pode ser dividida por vários frascos.

Embora o processo do presente invento possa ser utilizado para obter albumina mais purificada a partir de uma solução de albumina impura de várias fontes, tais como soro, é particularmente aplicável na purificação de albumina humana recombinante (rHA). A albumina produzida de acordo com o invento pode ser qualquer albumina de mamífero, tal como albumina de rato, bovina ou

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 7 ovina, mas é de preferência albumina humana. O ADN que codifica a albumina pode ser expresso num hospedeiro adequado para produzir albumina. Assim, o ADN pode ser utilizado de acordo com técnicas conhecidas para construir um vector de expressão, o qual é então utilizado para transformar uma célula hospedeira apropriada para a expressão e produção de albumina. Tais técnicas incluem as divulgadas em EP-A-73 646, EP-A-88 632, EP-A-201 239 e EP-A-387 319.

Conhecem-se muitos sistemas de expressão, incluindo bactérias (por exemplo E. coli e Bacillus subtilis), leveduras (por exemplo Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Kluyveromyces lactis), fungos filamentosos (por exemplo Aspergil/us), células vegetais, células animais e células de insecto. O microorganismo preferido é a levedura Saccharomyces cerevisiae.

Exemplos de géneros de leveduras contemplados como sendo úteis na prática do presente invento são Pichia {Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobo/us, Endomycopsis e semelhantes. Os géneros preferidos são os seleccionados a partir do grupo que consiste em Pichia (Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia e Hansenula. Exemplos de Saccharomyces sps. são S. cerevisiae, S. ita/icus e S. rouxii. Exemplos de Kluyveromyces sps. são K. fragilis e K. lactis. Exemplos de Pichia (Hansenula) são P. angusta (anteriormente H. po/ymorpha), P. anómala, P. pastoris e P. capsulata. Y. lipolytica é um exemplo de uma espécie adequada de Yarrowia. É vantajoso utilizar uma estirpe de levedura que seja deficiente numa ou mais proteases. Tais estirpes incluem os bem conhecidos mutantes pep4-3 e estirpes com mutações nos genes PRA1 e PRB1, tal como em Woolford et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 8990-8998, Cabézon et al. (1984) P.N.A.S. 81, 6594-6598, EP-A-327 797 e Jones et al. (1982) Genetics 102, 665-677. Alternativamente, as proteases no meio de fermentação podem ser inactivadas por aquecimento. A existência de proteases reduz o rendimento da albumina durante todo o processo.

De preferência, as leveduras têm um nível baixo (ou nulo) da prulease

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Yap3p e/ou da proteína de choque térmico hsp150, por exemplo como resultado de terem sofrido ruptura dos respectivos genes, tal como é ensinado nos nossos pedidos de patente publicados como WO 95/23R57 e WO 95/33833, respectivamente. A Yap3p pode causar a formação do fragmento de albumina de 45 kD referido adiante e a hsp150 co-purifica com a albumina nalguns passos de separação.

As leveduras podem ser transformadas com um plasmídeo de expressão baseado no plasmídeo de 2 pm de Saccharomyces cerevisiae. Na altura da transformação da levedura, o plasmídeo contém sequências de replicação e de selecção bacterianas, as quais podem ser excisadas, após a transformação, através de um evento de recombinação interna de acordo com o ensinamento da EP 286 424. O plasmídeo pode também conter uma cassete de expressão compreendendo: um promotor de levedura (tal como o promotor PRB1 de Saccharomyces cerevisiae), tal como ensinado na EP 431 880; uma sequência que codifique um comando de secreção, por exemplo um que compreenda a maior parte do comando de secreção de HSA natural mais uma pequena porção do comando de secreção do factor de conjugação α de 5. cerevisiae, tal como ensinado em WO 90/01063; a sequência de codificação de HSA, obtenível através de métodos conhecidos para isolamento de ADNc correspondente a genes humanos, e também divulgada, por exemplo, em EP 73 646 e EP 286 424; e um terminador da transcrição, por exemplo o terminador de Saccharomyces ADH1, tal como ensinado na EP 60 057.

Pensa-se que a escolha de vários elementos do plasmídeo acima descrito não seja directamente relevante para a pureza do produto de albumina obtido, embora os elementos possam contribuir para um melhor rendimento do produto.

Aspectos preferidos do invento serão agora descritos como exemplo e com referência aos desenhos anexos, nos quais: a Figura 1 mostra esquematicamente um fermentador utilizado para produzir rHA; a Figura 2 é um traçado de UV de uma coluna de HPLC de Fase Inversa C18 PTH (Applied Biosystems Inc), mostrando o baixo nível de contaminantes de baixo peso molecular na albumina do invento;

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 9 a Figura 3 é semelhante à Figura 2 mas mostra contaminantes de baixo peso molecular em albumina da arte anterior; a Figura 4 é um cromatograma de gás mostrando o teor de ácidos gordos da albumina comercialmente disponível; a Figura 5 corresponde à Figura 4 mas mostra a albumina do invento; e as Figuras 6a e 6b mostram espectrometria de massa por electropulverização para a albumina do invento e para a albumina da arte anterior, respectivamente.

Exemplo 1: Preparação de solução de albumina impura A estratégia de clonagem para construção do microorganismo produtor de albumina foi tal como divulgada na EP 431 880. O plasmídeo pAYE316 foi introduzido numa estirpe de Saccharomyces cerevisiae (MATa, Ieu2, pep4-3, [cir0]) através do método descrito por Hinnen et al. (1978) P.N.A.S. 75, 1929. Os transformantes foram seleccionados num meio mínimo sem leucina (Base de azoto para leveduras, Difco). Quando os transformantes cresceram durante 72 horas a 30°C, 200 rpm em frascos de 50 ml contendo 10 ml de meio líquido complexo (YEP, extracto de levedura a 1 % (p/v), bactopeptona a 2% (p/v) e sacarose a 2% (p/v), ou definido (base de azoto para leveduras a 0,15% (p/v) sem aminoácidos e sulfato de amónio, sulfato de amónio a 0,5% (p/v), ácido cítrico 0,1 M/Na2HP04.12H20 pH 6,5, sacarose a 2% (p/v), a rHA podia ser detectada no sobrenadante da cultura isento de células através de electroforese em gel de poliacrilamida-SDS e/ou através de imunoelectroforese foguete ("rocket") em gel.

Uma cultura celular principal de reserva em meio líquido definido (meio de sais Meio Mínimo Tamponado (BMM): Base de Azoto para Leveduras [sem aminoácidos e (NH4)2S04, Difco], 1,7 g/l; ácido cítrico mono-hidratado 6,09 g/l; Na2HP04 anidro, 20,16 g/l, pH 6,5±0,2, é adicionada sacarose até 20 g/l) é utilizada para preparar reservas para operação (banco de células de trabalho do fabricante) de leveduras do processo adequadas para a preparação de culturas em frascos de agitação, congelando alíquotas da cultura na presença de 20% (p/v) de trealose. 10 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ

Fermentação

Esta secção refere-se à produção de rHA a partir da cultura de reserva até à fermentação final e é uma definição geral de um processo de fermentação de rHA o qual não está limitado ao detalhe específico de determinados equipamento ou escala.

Cultura em Frasco de Agitação. A levedura [cir°, pAYE316] cresce como cultura axénica fisiologicamente adequada para inoculação do vaso semente. Se os tempos relativos ao vaso semente são para ser reprodutíveis, é necessário definir a fase de crescimento (excesso de hidratos de carbono primários) e a biomassa de inoculo (12±2 mg/l o que requer um inóculo de 100 ml por 10 litros de meio). É inoculado um frasco de reserva num frasco de agitação contendo 100 ml de BMM + 2% (p/v) de sacarose e o frasco é incubado a 30°C num agitador orbital (200 rpm rotações por minuto) até ser obtido um peso de células secas (pcs) de 0,6-1,2 g/l (avaliado por densidade óptica a 600 nm). Esta cultura é então utilizada para inocular um vaso de fermentação semente a um nível de 12±2 mg/l.

Fermentação semente. O inóculo para o fermentador de produção principal é proporcionado fazendo crescer o organismo de produção, de preferência 5. cerevisiae [cir°, pAYE316], num fermentador semente (neste exemplo, volume de trabalho de 20 I) até um peso de células secas (pcs) elevado de aprox. 100 g.l1. É seguido um regime de descontínuo com alimentação de forma a minimizar a acumulação de etanol e acetato e assim maximizar o rendimento celular. O todo de cada fermentação é monitorizado e controlado através de um sistema de controlo por computador, tal como o programa informático Multi-Fermenter Computer System (MFCS) disponível de B. Braun (Alemanha). O programa informático fornecido por B. Braun é um Pacote de Controlo de Supervisão e Aquisição de Dados; pacotes semelhantes estão disponíveis de outras companhias. Pretende-se que o algoritmo de controlo da alimentação controle a adição de sacarose de forma a que seja atingida a biomassa máxima evitando o efeito de "Crabtree", minimizando assim a produção de etanol e/ou acetato. O vaso de fermentação é sujeito a uma lavagem com NaOH quente e passado por água isenta de pirogénios (PFW). O vaso esterilizado por calor conterá aproxímadamente 10 I de meio MW10 estéril (Tabela 1), sais da carga inicial mais elementos vestigiários. O meio para produção de rHA pode ser

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 11 ultrafiltrado (exclusão de peso molecular de 10 000) para remover endotoxinas. TABELA 1 MEIO MW10

Constituintes Meio e Caraa Meio de inicial Alimentação Sais kh2po4 2,74 g/l 10,9 g/l MgS04.7H20 0,58 g/l 2,3 g/l CaCI2.2H20 0,06 g/l 0,24 g/l H3P04 (85% p/p) 0,88 ml/l 1,76 ml/l Vitaminas Pantotenato de Ca 20 mg/l 180 mg/l Ácido nicotínico 33,3 mg/l 300 mg/l m-lnositol 20 mg/l 180 mg/l d-Biotina 0,133 mg/l 0,8 mg/l Tiamina.HCI 16 mg/l 32 mg/l Elementos vestigiários da 10 ml/l 20 ml/l reserva Sacarose 01 500 g/l Constituintes da Reserva em Elementos Vestigiários ZnS04.7H20 3 g/l FeS04.7H20 10 g/l MnS04.4H20 3,2 g/l CuS04.5H20 0,079 g/l H3BO3 1,5 g/l Kl 0,2 g/l Na2Mo04.2H20 0,5 g/l CoCI2.6H20 0,56 g/l

Os elementos vestigiários são adicionados a água desmineralizada, acidificados com 35 ml/l de H2S04 a 98%. 1 São adicionados ao meio de carga inicial 20 g de sacarose/l no estádio de fermentador semente de 20 I. Qualquer método conveniente de esterilização 12 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ ο pode ser utilizado, tal como pode qualquer método de remoção de pirogénios, por exemplo ultrafiltração. As vitaminas são sempre esterilizadas por filtração.

Após o meio ter sido adicionado ao vaso, é estabelecida a temperatura operativa de 30°C, bem como a velocidade de agitação mínima, tipicamente 400-500 rpm. O pH inicial é ajustado com solução de amónia (gravidade específica de 0,901) utilizando um controlador de pH regulado para 5,7±0,2. É também utilizado H2S04 2 M como agente corrector de pH. São adicionados ao vaso, sacarose até 20 g.l1, vitaminas da carga inicial de MW10 e anti-espuma Breox FMT30 até 0,04 g.l1. É introduzido no vaso ar estéril filtrado a 0,5 v/v/m (i.e. 0,5 litros de ar não comprimido por litro de meio por minuto), o meio é inoculado a 12±2 mg de peso de células secas.I'1 a partir de uma cultura axénica em frasco de agitação e é iniciado o sistema de computador MFCS. Após a terminação da fase de crescimento em descontínuo (sinalizada por um aumento da tensão de oxigénio dissolvido >15% em 30 min), é iniciada a adição do meio de alimentação, sob controlo do sistema MFCS. A estratégia de controlo é efectivamente a mesma que a descrita abaixo para a fermentação de produção. Durante a fermentação o caudal de ar é aumentado em dois passos de forma a manter um caudal de aproximadamente 1 v/v/m. A tensão de oxigénio dissolvido (DOT) é controlada a 20% de saturação de ar alterando a velocidade de agitação. Quando a velocidade de agitação já não pode ser mais aumentada e o caudal de ar atingiu o seu valor máximo, o algoritmo de controlo da alimentação controla a taxa de alimentação para minimizar a formação de produtos de fermentação. No final da alimentação, a cultura é transferida para um vaso de produção.

Fermentação de Produção. Uma cultura axénica da levedura [cir°, pAYE316] é produzida por fermentação descontínua com alimentação até um pcs elevado (>80 g.l'1) para a produção de rHA extracelular. O fermentador de produção, neste exemplo um fermentador com um volume de trabalho de 8000 I, é inoculado com a cultura que cresceu no fermentador semente, cujo peso de células secas é de preferência >80 g.l1. A concentração inicial do peso de células secas no fermentador de produção aquando da transferência da cultura do fermentador semente é de preferência 0,25-1,00 g.l'1. Embora seja preferível iniciar a alimentação dentro de uma hora, esta pode ser atrasada se necessário. Devido aos valores muito baixos de OUH e CbH durante a parte inicial da fase

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 13 de alimentação e aos consequentes erros na sua medição, o controlo automático da taxa de alimentação utilizando RQ é inicialmente desligado. Pretende-se que o regime de alimentação minimize a acumulação de etanol e acetato, de forma a maximizar o rendimento celular e de produto.

A fermentação é efectuada num fermentador tal como o mostrado na Fig. 1, concebido para originar uma dissolução de gás e mistura do volume óptimas. O vaso, que é sujeito a uma lavagem com NaOH quente e passado por PFW, conterá aproximadamente 4000 I de MW10 estéril (Tabela 1), sais da carga inicial e elementos vestigiários. O meio pode ser esterilizado independentemente do vaso por esterilização por calor ou por filtração. Foi verificado de acordo com o presente invento que é vantajoso para o meio de fermentação, tal como MW10, ser isento de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) ou um seu sal, ou de outros agentes quelantes fortes de metais, uma vez que a sua presença resulta num grau significativamente mais elevado de contaminantes corados na albumina produzida. A temperatura operativa é estabelecida a 30°C e a velocidade de agitação regulada para ser suficiente para manter uma solução homogénea, tipicamente cerca de 50 rpm. 0 pH inicial é ajustado com solução de amónia (SG 0,901) (controlador regulado para 5,7+0,2). Pode ser utilizado H2S04 2 M como um segundo agente corrector de pH. As vitaminas da carga inicial de MW10 são adicionadas, tal como um anti-espuma adequado, conforme necessário (p.ex. Breox FMT30 para 0,125 g.l'1). É inicialmente adicionado ao vaso ar esterilizado por filtração a 0,5 v/v/m para maximizar a sensibilidade da análise do gás de exaustão e é iniciado o sistema de computador MFCS. 0 gás de exaustão é analisado, por exemplo utilizando um espectrómetro de massa contínuo (p.ex. um analisador de gás Fisons VG). O vaso é inoculado com a totalidade da cultura do vaso semente (mínimo 0,4% v/v). Alimentação com MW10 num volume igual ao volume de carga inicial. A alimentação é iniciada e o controlo de sobreposição RQ é desligado até que os valores OUR e CER sejam suficientemente elevados para tornar o controlo eficaz. A taxa de alimentação é ajustada manualmente durante o período sem controlo de RQ se RQ for consistentemente >1,2. A taxa de alimentação é aumentada, através de controlo por computador, de acordo com o seguinte algoritmo: 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ %/» 14

Taxa de alimentação (FR) = keMt onde k é a taxa de alimentação inicial, μ é a taxa de crescimento exponencial e t é o tempo. O valor k é determinado empiricamente como a taxa de alimentação inicial que é necessária para alcançar uma taxa de crescimento que minimize a acumulação de etanol e acetato. Para este exemplo, k foi determinado como possuindo um valor de 0,08 ml de meio de alimentação MW10 por minuto por litro de cultura. O valor μ refere-se à taxa de crescimento máximo de um organismo totalmente respiratório, neste exemplo 0,1 h'1. t é uma contra-variável que começa no 0 (zero) e depois aumenta 1 a cada minuto, a não ser que RQ>1,2 ou DOT<15%. Nestes casos, o valor de t reduz-se. O vaso pode ser colocado em sobre-pressão conforme necessário para aumentar a OTR. A cultura é mantida para posterior processamento no final da alimentação.

Este tempo de espera deve ser mantido num mínimo, mas pode estender-se até 48 horas e para além disso se necessário. Durante a fase de espera, a temperatura da cultura é reduzida ao mínimo possível, tipicamente entre 4 e 15°C, de preferência 4°C, e permite-se que o DOT caia para os 0%. A alimentação é parada, o arejamento desligado e a sobre-pressão reduzida. O controlo do pH, no entanto, é mantido. É mantida uma agitação suficiente para manter as células em suspensão e facilitar a homogeneidade do arrefecimento e do pH, de preferência cerca de 50 rpm.

Os rendimentos esperados de acordo com o procedimento acima são: biomassa >80 g de peso de células secas/l de cultura; rHA >1,5 g de monómero/l de cultura (determinada por SDS-PAGE, em relação à cultura completa).

De forma a preparar uma solução de albumina impura para tratamento de purificação de acordo com o presente invento quando a albumina é rHA, as células do microorganismo são removidas do meio de cultura de fermentação. Embora seja preferido que as células sejam removidas antes do início do

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 15 processo de purificação tal como descrito, isto pode ser efectuado simultaneamente com o primeiro passo sob certas condições, p.ex. quando o primeiro passo de purificação é efectuado num leito fluidizado. A cultura de fermentação, que foi arrefecida no fermentador durante a fase de espera para menos de 1 5°C sem arejamento, é transferida para um tanque onde é diluída para dar uma concentração de biomassa de 180-210 g/kg e é ainda arrefecida se necessário. A cultura diluída deve ser mantida durante um período de tempo tão curto quanto possível sem arejamento a uma temperatura reduzida com suficiente agitação para prevenir deposição das células de levedura.

As células e o sobrenadante são sujeitos a um primeiro passo de separação, por exemplo microfiltração ou centrifugação em qualquer centrífuga apropriada tal como uma Alfa Lavai BTUX510 em funcionamento com tubo de descarga contínua a 5700 rpm. O centrado assim produzido pode ser filtrado em linha, por exemplo utilizando um filtro de profundidade (tamanho de poro de 1 pm), fornecido por Cuno, para remover células inteiras e rebentadas residuais e outras partículas. Pelo menos 75% da rHA presente na cultura diluída é recuperada numa única passagem na operação de centrifugação. Opcionalmente, a lama de células desta operação pode ser ressuspensa em água ou tampão e novamente centrifugada para proporcionar um segundo centrado, aumentando assim a recuperação de produto. A solução resultante é então tratada pelo processo do invento para purificar a albumina nela contida, mostrado como no Exemplo 2.

Exemplo 2: Purificação de albumina de acordo com o invento O centrado de uma fermentação (tal como descrito no Exemplo 1) ou uma solução de albumina impura de qualquer outra fonte (tal como plasma), é preparado, ou condicionado, para cromatografia numa matriz de permuta catiónica ao mesmo tempo que se protege a albumina contra polimerização (incluindo octanoato) e actividade proteásica (aquecendo ou escolhendo leveduras sem níveis prejudiciais de proteases). De preferência, é adicionado octanoato de sódio (Solução para Cromatografia 13 (SC13) - Tabela 2) até uma concentração final de 1-10 mM, por exemplo aproximadamente 5 mM, para estabilizar a albumina. O pH é ajustado com ácido acético (SC09) para 4,3-4,8, de preferência 4,50±0,1 (sendo preferível ±0,05) e verifica-se que a condutividade é <5,5 mS.cm1.

85390 ΕΡ 0 828 759/ΡΤ 16 Ο sobrenadante de cultura de algumas estirpes ou espécies hospedeiras contém proteases que podem degradar a rHA durante o subsequente processamento. Em tais casos, esta actividade proteásica pode ser destruída através do tratamento pelo calor do sobrenadante da cultura contendo a rHA. Tipicamente 1-10 mM de octanoato de sódio são suficientes para proteger a rHA da desnaturação pelo calor e 30 segundos até 10 minutos a temperaturas de 60-80°C são adequados para inactivar as proteases. Subsequentemente o sobrenadante pode ainda ser condicionado tal como previamente descrito. Se não for encontrada degradação por proteases, então o tratamento pelo calor é de preferência omitido.

Cromatoarafia

Todas as operações podem ser efectuadas à temperatura ambiente (20±5°C). As cargas de albumina (g de albumina/l de matriz) para as colunas de cromatografia são determinadas a partir dos títulos de albumina (g/l) por SDS-PAGE (no caso da coluna SP-FF) ou GP-HPLC (para todas as outras colunas). O progresso de cada passo é monitorizado medindo a absorvância de UV em linha, por exemplo a 254 ou 280 nm. A sequência de passos cromatográficos tal como aqui descrita é nova e detentora de passo inventivo em vários aspectos. A utilização de uma matriz catiónica para o primeiro passo de purificação permite que a maioria de espécies pigmentadas de baixo peso molecular derivadas da fermentação de leveduras passe directamente através da coluna, enquanto que as que se ligam à matriz estão fracamente ligadas e podem ser removidas por uma limpeza com um sal de elevada força iónica tal como NaCI 1 M. Assim, a matriz catiónica, ao contrário de uma matriz aniónica que adsorve irreversivelmente estes tipos de moléculas, pode ser regenerada e utilizada para múltiplos ciclos de cromatografia como o primeiro passo na purificação. Por este motivo, este passo forma a base de um robusto processo comercial de cromatografia. A utilização de uma coluna do tipo Azul de Cibacron como segundo passo neste exemplo é nova no sentido em que é utilizada especificamente para remover um fragmento de 45 kDa de albumina o qual é muito difícil de remover da albumina porque as suas propriedades físico-químicas, p.ex. tamanho e pl, são semelhantes à molécula intacta. Surpreendentemente, o fragmento liga-se mais fortemente ao corante que a albumina completa, permitindo assim a sua separação.

As soluções de cromatografia utilizadas durante a purificação da albumina estão detalhadas na Tabela 2. Devido ao fabrico em muito grande escala da albumina, e ao custo relativamente baixo do produto, estes sais tampão são os mais adequados para o processo porque estão disponíveis numa forma altamente pura à escala industrial e têm um custo baixo em comparação com outros tampões vulgarmente utilizados tais como Tris, HEPES ou MOPS. Podem ser utilizados tampões alternativos no lugar dos utilizados na Tabela 2, por exemplo tampões com um pKa semelhante (p.ex. maleato por acetato), mas na maioria dos casos o custo e a disponibilidade em grande escala excluem a sua utilização. Podem ser utilizadas formas salinas alternativas desde que sejam solúveis, estejam disponíveis à escala industrial e tenham um custo baixo. No entanto, a inclusão de iões tetraborato em SC06 e SC10 é particularmente vantajosa uma vez que estes desempenham um papel específico na complexação com porções hidrato de carbono em macromoléculas e na ligação forte destas aos grupos aniónicos na matriz. Isto resulta numa pureza mais elevada da albumina no eluato. A cromatografia pode ser efectuada utilizando colunas de fluxo axial, tais como as disponíveis de Pharmacia, ou utilizando colunas de fluxo radial, tais como as disponíveis de Sepragen. Neste exemplo, as colunas são todas axiais.

As soluções tampão podem ser preparadas nas concentrações descritas abaixo ou podem ser preparadas soluções-mãe concentradas e misturadas ou diluídas em linha para utilização imediata. 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 18

TABELA 2: SOLUÇÕES DE CROMATOGRAFIA PARA A PURIFICAÇÃO DE ALBUMINA NO EXEMPLO 2 Solução Constituinte Concentração PH Condutividade (g.n (mS.cm'1) SC01 Para Equilíbrio CH3C00Na.3H20 3,69 5,45-5,65 1,9-2,2 de SP-FF CH3COOH (glaciar) 0,220 SC02 Eluente de CH3C00Na.3H20 13,6 5,45-4,65 6,5-7,5 SP-FF CH3COOH (glaciar) 0,750 SC03 Eluente de NaCI 117 9,0-9,4 125-165 DBA CH3COONH4 3,84 NaOH 0,680 SC04 NaOH 0,5 M NaOH 20,0 >12 80-120 SC05 Permeação em CH3COONa.3H20 4,94 5,4-5,6 2,9-3,3 Gel CH3COOH (glaciar) 0,380 Ácido Octanóico 0,721 NaOH 0,190 SC06 Eluente de Na2B407.10H20 7,62 8,9-9,3 11,7-13,5 DE-FF NaCI 5,84 SC07 NaOH 20 mM NaOH 0,800 >12 3,5-5,5 SC08 Para Equilíbrio CH3C00Na.3H20 4,94 5,4-5,6 2,9-3,3 de DE-FF CH3COOH (glaciar) 0,380 Ácido Octanóico 0,721 NaOH 0,190 SC09 Ácido Acético CH3COOH Glaciar - - SC10 Lavagem de DE-FF Na2B407.10H20 7,62 9,0-9,4 2,3-2,9 SC11 Para Pré- CH3C00Na.3H20 61,8 5,5-5,7 24-28 equilíbrio de DE-FF CH3COOH (glaciar) 2,98 SC12 Para NaCI 11,7 8,8-9,2 18-22 Equilíbrio/ CH3COONH4 0,960 Lavagem de DBA NaOH 0,150 SC 13 Octanoato de Ácido Octanóico 288 7,7-8,2 - Sódio 2 M NaOH 76,0 SC14 Ácido Fosfórico 1,73 M H3P04 (85% (p/p)) 200 <1,2 SC15 Amónia 2 M NH4OH (30% de NH3 (p/p)) 113 ml ' Todas as pesagens são ±2%, para este exemplo específico. 19 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ

ί I

Cromatoarafia de Permuta Catiónica. A albumina é concentrada e purificada em relação a pelo menos proteínas de levedura (se a albumina for rHA a partir de uma fermentação de leveduras) e outros antigénios, contaminantes de baixo peso molecular e compostos pigmentados através de cromatografia de permuta catiónica. 0 método utiliza uma matriz de permuta catiónica comercial tal como SP-Sepharose FF, SP-Spherosil, CM-Sepharose FF, CM-Celulose, SE-Celulose ou 5- Spherodex. De preferência a matriz é SP-Sepharose FF (Pharmacia) numa altura de leito de 5 a 25 cm, de preferência 10 a 15 cm e neste exemplo 12,5 cm, com uma carga de coluna de 10 a 50 g de albumina/l, de preferência 40±10 g de albumina/l de matriz. A matriz é equilibrada com um tampão para remover a solução alcalina de armazenamento; de preferência o tampão deve ser suficientemente forte para reduzir o pH para aproximadamente pH 6,0. Um tampão tal como SC01 é utilizado para remover a solução de armazenamento SC07 da coluna; no entanto, qualquer tampão com um pH <6,0 pode ser utilizado. O equilíbrio é considerado como completo quando o pH do efluente da coluna é aproximadamente pH 6,0. 0 centrado condicionado é então carregado na coluna a um caudal de, por exemplo 1,0-8,0 cm/min, de preferência 4,0-7,0 cm/min, neste exemplo, 6,36 cm/min, e a coluna é depois lavada com uma solução para remover contaminantes residuais. Esta solução de lavagem deve ter um pH <6,0 e uma condutividade de menos de 5 mS.cm1, de preferência menos de 3 mS.cnrf1, para impedir a eluição da albumina. Uma solução adequada é SC01. Os passos anteriores são todos efectuados a 6,36 cm/min; para a eluição e todos os passos subsequentes o caudal é reduzido para 0,5-5,0 cm/min, de preferência 2,0-4,0 cm/min, neste exemplo 3,18 cm/min, de forma a reduzir o volume de eluato. A eluição da albumina é efectuada aumentando a força iónica; é utilizada uma solução com uma condutividade na gama de 5-10 mS.cm'1, de preferência 6- 8 mS.cm'1, por exemplo SC02. A recolha de albumina começa quando o sinal de UV sobe acima de 1,0 A280/cm e a recolha continua até o sinal de UV descer abaixo de 0,6 A280/cm ou ter sido recolhido um volume máximo de 6,5 volumes da coluna. A coluna é então lavada utilizando SC03 e 04 e depois armazenada em SC07.

Cromatografia de Afinidade. Este passo purifica mais a albumina em relação a um fragmento de albumina de 45 kDa N-terminal, antigénios de levedura (se a albumina for rHA de uma fermentação de leveduras) e pigmentos. A matriz de 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 20

afinidade pode compreender qualquer corante do tipo Azul de Cibacron que se ligue a albumina, por exemplo Azul Reactivo 2, Azul de Procion HB, Sepharose Azul, Trisacril Azul e outros compostos do tipo antraquinona. De preferência, a matriz é a matriz de "Agarose Azul Delta" abaixo descrita. Verificou-se que esta reduzia os níveis de lixiviados Azuis gerados pela matriz e aumentava a estabilidade alcalina da matriz para facilitar a limpeza e remoção de pirogénios. Uma outra melhoria da matriz comparada com matrizes comercialmente disponíveis é a incorporação de um espaçador, 1,4-diaminobutano, entre o corante (Azul Reactivo 2) e a matriz. Verificou-se que este era o espaçador de comprimento óptimo em relação à pureza da albumina do eluato. O Azul Reactivo 2 tem a estrutura química representada abaixo.

Pode ser utilizado o isómero orto, meta ou para, ou qualquer mistura destes. O isómero preferido é a forma orto-S03 mas, como é difícil produzi-lo com a pureza desejada, pode ser utilizado o isómero meta. O aminobutil-Azul Reactivo 2 é preparado para uma pureza mínima de 98% da área total do pico tal como determinado por HPLC analítica. Isto pode ser alcançado utilizando um corante bruto comercialmente disponível, o qual necessitará de purificação do corante derivado de aminobutilo, ou utilizando um corante sintetizado puro. Neste último método, o material corante de partida deve ser no mínimo 98% puro através de HPLC analítica a 280 nm. Tal material está disponível de ACL, Isle of Man. 0 Azul Reactivo 2 é posto a reagir com 1,4-diaminobutano em água aquecendo a mistura a 60°C, após o que o corante derivatizado é purificado a partir da mistura, por exemplo por precipitação. O aminobutil-Azul Reactivo 2 é então conjugado com a matriz, por exemplo com Sepharose CL-6B activada por epicloridrina. (Pharmacia, Suécia). Ver Porath et al. (1971) J. Chtonwtuy. 00.,

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 21 167-177. Ο teor de corante de tal matriz de Agarose Azul Delta (DBA) deve, de preferência, ser 50±5 mmol/g de peso seco.

Utilização da Matriz Azul. O método utiliza DBA numa altura de leito de 10-30 cm, de preferência 20-30 cm (neste exemplo 25 cm), com uma carga de coluna de 7-14 g de rHA/l de matriz, de preferência 8-12 g/l (neste exemplo 10±1 g de albumina/l de matriz); todos os passos são efectuados a um caudal de 0,3-2,0 cm/min, de preferência 1,0-2,0 cm/min, neste exemplo 1,53 cm/min. A DBA é equilibrada em SC01 a partir de SC07; o equilíbrio está completo quando o pH do efluente da coluna é aproximadamente pH 9,5. Antes da cromatografia, o eluato de SP-FF é ajustado para aproximadamente pH 8,5-9,5, de preferência pH 9,0, com amónia, e depois carregado na coluna. Quando a carga está completa, a coluna é lavada para remover contaminantes com 1 -5 volumes de tampão 10-30 mS.cm1, de preferência 15-25 mS.cm'1, por exemplo SC12, de preferência 5 volumes de coluna. A albumina é eluída utilizando um tampão de elevada força iónica de >100 mS.cm1, de preferência 125-165 mS.cm'1, por exemplo SC03. A recolha de eluato começa quando o sinal de UV (A280/cm) sobe acima de 0,4 e pára quando o sinal desce novamente abaixo de 0,4. A coluna é então limpa utilizando SC04 e armazenada em SC07.

Ultrafiltracão Intermédia. Este passo concentra a albumina para cromatografia de permeação em gel. Uma membrana do tipo celulósico (exclusão nominal de pesos moleculares inferior ou equivalente a 30 000, por exemplo 10 000) num aparelho de ultrafiltracão é utilizada para concentrar o eluato de DBA até uma concentração de retentado de 20-120 g/l de albumina, de preferência 80-110 g/l. As membranas são tratadas, após a utilização, removendo a proteína residual por lavagem com água, ou SC03 ou SC05 da Tabela 3, e limpando com hidróxido de sódio 0,1 M. As membranas podem então ser armazenadas em hidróxido de sódio 20 mM.

Cromatografia de Permeação em Gel. Este passo purifica a albumina em relação a antigénios de levedura (se a albumina for rHA de uma fermentação de leveduras), pigmentos e albumina dimerizada e efectua um passo de troca de tampão. O método utiliza uma matriz de permeação em gel comercial tal como Sephadex G100, G150, G250, Sephacryl S-100, S-200 ou S-300, Toyopearl HW50S ou Superose 6 ou 12. De preferência, a matriz é Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) numa altura de leito superior a 60 cm, de preferência ±90 cm 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 22

(3x30 cm). A coluna é equilibrada em SC05 e corre a 0,1-1,5 cm/min, de preferência 0,5-1,0 cm/min, neste exemplo 0,75 cm/min; a coluna é então carregada com a albumina do passo de UF intermédia quando é alcançado um pH 9,5. O volume de carga é equivalente a aproximadamente 2-9% do volume da coluna, de preferência 5-8%, por exemplo 7,5% do volume da coluna. A fracção de albumina é recolhida em três partes: uma pequena quantidade inicial de dímero de albumina vai para o lixo até que a A28o/crn atinja uma deflecção da escala inteira de 10% (FSD) na subida; nesta altura começa a recolha de uma fracção de reciclagem e continua até FSD ser 90% e a albumina é depois recolhida como a fracção primária de produto. Isto continua até que a A280 caia até 5% de FSD, após o que a corrente de efluente é direccionada novamente para o lixo. As fracções de produto principal e de reciclagem são recolhidas separadamente. Este passo é repetido até que todo o material tenha sido carregado na coluna.

Ultrafiltracão de Reciclagem em S-200 HR. Uma membrana do tipo celulósico, exclusão nominal de pesos moleculares igual ou inferior a 30 000 ou, tal como utilizado neste exemplo 10 000, num aparelho de ultrafiltracão, é utilizada para concentrar a fracção de reciclagem reunida até uma concentração de retentado de 20-120 g/l de albumina, de preferência 80-110 g/l. As membranas são tratadas, após a utilização, tal como acima descrito em Ultrafiltracão Intermédia.

Alternativamente, tal como em todos os passos de ultrafiltracão neste processo, podem ser utilizadas membranas de poliétersulfona ou PVDF com uma exclusão de <30 000 em vez das membranas do tipo celulósico. Tais membranas estão disponíveis de Amicon e Millipore. É preferível utilizar membranas que sejam compatíveis com NaOH, utilizado para armazenamento e limpeza das membranas.

Purificação do Retentado da Ultrafiltracão de Reciclagem em S-200 HR. O retentado da ultrafiltracão de reciclagem é carregado na mesma coluna que foi utilizada para a purificação primária em S-200 e é recolhida de cada pico a fracção de produto, as quais são depois misturadas com os lotes de fracções primárias de produto recolhidas anteriormente. Este passo é repetido até todo o material ter sido carregado na coluna. 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 23

Cromatoqrafia de Permuta Aniónica. O objectivo deste passo é o de purificar a albumina em relação pelo menos a antigénios de levedura (se a albumina for rHA de uma fermentação de leveduras) e albumina pigmentada. O método utiliza uma matriz de permuta aniónica tal como QMA-Spherosil, DEAE-Spherodex, Q-Hyper D, DEAE-celulose, QAE-celulose, ou TMAE, DMAE ou DEAE Fractogel. De preferência, a matriz é a matriz de permuta aniónica comercial DEAE Sepharose-FF (Pharmacia) a qualquer altura de leito conveniente na gama de 5-25 cm, de preferência 10-15 cm, por exemplo 12,5 cm, com uma carga de coluna de 10-60 g de albumina por litro de matriz, de preferência 35±15 g/l de matriz. A coluna é primeiro equilibrada num tampão forte para baixar rapidamente o pH para a gama de trabalho, p.ex. acetato de sódio pH 4,5-6,0, de preferência aproximadamente pH 5,5, por exemplo SC11. Após o tampão concentrado, é utilizada uma solução de baixa condutividade, nomeadamente na gama 1-4 mS.cmΛ de preferência 2,5-3,5 mS.cm'1, por exemplo SC08, para equilibrar a coluna antes de carregar a coluna com o eluato de S200. Pode ser utilizada um caudal linear de 1,0-8,0 cm/min, de preferência 3,0-7,0 cm/min, neste exemplo 4,4 cm.min1. Quando o carregamento está completo, a coluna é lavada com uma solução de tetraborato de sódio na gama de 5-30 mM, de preferência 15-25 mM, por exemplo SC10. Isto faz com que quaisquer contaminantes contendo hidratos de carbono adiram à coluna de forma mais forte antes da eluição da fracção de albumina. A eluição pode ser efectuada por qualquer solução de elevada força iónica na gama de 10-20 mS.cm'1, de preferência com SC06. O eluato é recolhido quando a A280/cm atinge 0,4 e continua até que o pico chegue a 0,8.

Assim, neste exemplo, a sequência de passos de purificação é: permuta catiónica, cromatografia de afinidade, ultrafiltração, permeação em gel (com ultrafiltração da fracção de reciclagem) e permuta aniónica.

Verificou-se que o eluato da coluna DE-FF possuía menos de 0,1% (p/p) de dímero de albumina e um nível não detectável de polímeros ou agregados de albumina tal como analisado por GP HPLC utilizando uma coluna TSK SW3000XL, carregada com 25,0 μΙ de eluato contendo 10,0 mg/ml de albumina.

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Exemplo 3: Formulação da albumina purificada num produto final

Este Exemplo ilustra a concentração, diafiltração e formulação da albumina altamente purificada num produto adequado, neste caso albumina a 25% (p/v). Este procedimento é efectuado em duas etapas, nomeadamente ultrafiltração final (UF) e formulação. A UF Final começa com a transferência do eluato de DEAE (ajustado para pH 7,0±0,3 com ácido fosfórico) para o vaso de alimentação da UF Final e termina após o retentado e as lavagens, se as houver, serem transferidos para o vaso de formulação. A corrente do processo contendo albumina é sequencialmente sujeita a concentração primária, diafiltração e concentração secundária num sistema de ultrafiltração equipado com membranas celulósicas ou, de maior preferência, de poliétersulfona com um limite de exclusão nominal de peso molecular de 10 000. O passo inicial de concentração aumenta a concentração de albumina para aproximadamente 100 g.l'1 e é imediatamente seguido pela fase de diafiltração contínua onde a albumina é diafiltrada contra pelo menos 5, de preferência 7, equivalentes de volume de concentrado de água para injecção.

Nalguns processos de purificação do invento, por exemplo o passo exposto no Exemplo 7 utilizando aminofenilboronato imobilizado, podem estar presentes nesta fase iões amónio. Surpreendentemente, verificámos que estes iões amónio se ligam de forma relativamente forte à albumina e não podem ser completamente removidos por diafiltração contra água. Verificámos que a diafiltração contra uma solução salina é eficaz. Pode ser utilizada uma razão de 0,5 a 10% p/p de cloreto de sódio para albumina, por exemplo 1,0 a 5,0% ou cerca de 3%. O sal pode ser adicionado ao retentado de albumina ou, mais vulgarmente, será adicionado à água de diafiltração. Para uma formulação final de 5% (p/v), uma solução de aprox. 100 g/l pode ser recuperada directamente do passo de diafiltração. Para uma formulação final de 25% (p/v), é obtida uma solução de aprox. 275-325 g/l após um passo de concentração (UF) adicional. Finalmente, a solução é transferida para o vaso de formulação do produto principal. O passo de formulação produz albumina num ambiente químico apropriado e numa concentração apropriada, adequada para esterilização por filtração do produto principal (polivinilideno-difluoreto hidrófilo de 0,22 pm) e enchimento. A solução transferida é analisada para determinar as concentrações 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 25 /

de albumina, sódio e octanoato. Estas quantidades são tidas em conta e são adicionadas quantidades adicionais necessárias de soluções-mãe de excipientes de cloreto de sódio e octanoato de sódio e água de grau apropriado para atingir a especificação da formulação principal. A concentração final de albumina pode ser 235-265 g.l·1 (i.e. cerca de 25%), com uma concentração de sódio de 130-160 mM. Pode ser no entanto feita qualquer outra concentração praticável de albumina com, por exemplo, uma concentração mínima de pelo menos 4% (p/v), de preferencia 4-2b% (p/v). A formulação está completa a seguir à adição de excipientes convencionais farmaceuticamente aceitáveis apropriados, tais como os especificados nas Farmacopeias dos E.U.A. ou Europeia, para albumina humana e diluindo em água.

Uma concentração final de 0,08 mmol de octanoato de sódio por grama de albumina pode ser desejável. O produto é estéril e não é pirogénico. Pode existir cerca de 1 % (p/p) de albumina dimérica mas não são detectáveis quaisquer polímeros ou agregados maiores tal como analisado por GP HPLC utilizando uma coluna TSK SW3000XL.

Exemplo 4: Permuta catiónica seguida directamente por permuta aniónica

Numa variação do processo do Exemplo 2, a ordem dos passos foi alterada e algumas alterações foram feitas nas condições do processo. É por isso proporcionada uma outra tabela de soluções cromatográficas como Tabela 3. Adicionalmente, todas as colunas cromatográficas excepto o passo de permeação em gel são de fluxo radial. (Segue Tabela) 85399

ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 26 TABELA 3: SOLUÇÕES CROMATOGRÁFICAS PARA O EXEMPLO 4

Todas as tolerâncias de peso a ±0,5%.

Solução Constituinte Concentração (g.l·1) PH (mS.cm'1) N° Nome SC20 Para Equilíbrio de SP-FF /Lavagem/ Para Equilíbrio de DE-FF CH3COOH 1,85 5,45-5,65 1,9-2,2 NaOI I (27% (p/p>) 4,00 SC23 Eluente de SP-FF / Para Pré-Equilíbrio de DE-FF CH3COOH 5,13 5,4-5,6 5,0-6,0 NaOH (27% (p/p)) 11,5 Ácido Octanóico 0,721 SC24 Limpeza Salina de SP-FF/DE-FF NaCI 58,4 5-9 75-95 Tween 80 5,00 SC25 NaOH 0,5 M (limpeza da membrana de UF) NaOH (27% (p/p)) 74,1 >12 80-120 SC26 NaOH 20 mM NaOH (27% (p/p)) 2,96 >12 3,5-5,5 SC27 Lavagem de DE-FF K2B407.4H20 4,80 9,0-9,4 2,5-3,5 SC29 Para Equilíbrio de DBA/ Lavagem CH3C00NH4 19,3 8,7-9,1 18-22 NaOH (27% (p/p)) 5,93 SC30 Eluente de DBA NaCI 117 6,7-7,1 125-165 NaOH (27% (p/p)) 14,1 H3P04 (85% (p/p)) 5,79 SC32 NaOH 0,1 M (armazen. da membrana de UF) NaOH (27% (p/p)) 14,8 >12 16-24 SC33 Octanoato de Sódio 2 M NaOH (27% (p/p)) 281 7,8-8,4 ' Ácido Octanóico 288 SC34 Ácido Acético CH3COOH 1045 - - SC35 Ácido Fosfórico 0,5 M H3P04 (85% (p/p)) 59,0 <1 ' O passo inicial de permuta catiónica foi essencialmente o mesmo que no Exemplo 2, mas com as seguintes variações. 0 A extensão do caminho do fluxo no leito era 11,0±1,0 cm. A cromatografia foi então efectuada tal como se segue.

Uma coluna SP-FF (Pharmacia) foi equilibrada em quatro volumes de 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 27

acetato 10-100 mM, de preferência 20-40 mM, por exemplo 30 mM tal como em SC20, e a solução de albumina foi carregada a um caudal de 0,07 a 1,75 volumes de leito por min, de preferência 0,3-0,6, neste exemplo 0,5 volumes de leito por minuto. A coluna foi lavada com oito volumes de acetato 10-100 mM, de preferência 30-70, por exemplo acetato 50 mM (SC21) e depois dez volumes de SC20 e a albumina foi eluída com, e recolhida em, um tampão de acetato/octanoato (por exemplo acetato 40-120, de preferência 60-100, p.ex. 85 mM, e octanoato 2-50, de preferência 2-20, p.ex. 5 mM, tal como em SC23) utilizando uma A254/cm de 0,6 e 0,36 para marcar o início e o fim da recolha. A coluna é limpa com sal 0,25-3,0 M e detergente a 0,05-2% (SC24) e depois com cáustica 0,1-1,0 M (SC25) e armazenada em cáustica diluída (10-50 mM) (SC26). Neste exemplo, o caudal para os passos de equilíbrio, carregamento e lavagem é de 0,5 volumes de leito por minuto. Para a eluição da albumina, é utilizada um caudal de 0,04-0,6 vol. de leito/min, de preferência 0,15-0,35, neste exemplo 0,25 vol. de leito/min. A recuperação antecipada de monómero de rHA está entre 46 e 66%. A albumina foi assim eluída da coluna de permuta catiónica com uma solução de octanoato, alcançando uma nova eluição bioespecífica de rHA a partir de um permutador catiónico. 0 pH está próximo do pl da albumina de forma a que a ligação do octanoato cause uma diferença de carga global significativa; por exemplo, o pH é de pelo menos 4,5, de preferência à volta de pH 5,5. 0 eluato do permutador catiónico é então carregado directamente (i.e. em vez de após a cromatografia de afinidade e de permeação em gel tal como no Exemplo 2, mas de preferência após diluição) na resina de permuta aniónica a um pH de 4,5-6,5, de preferência cerca de 5,5, e a uma condutividade de preferência na gama de 1,5 a 5,0 mS.cm'1, por exemplo 2,5±0,5 mS.cm'1. Verificou-se que isto tinha como resultado que qualquer albumina dimérica que era formada durante a cromatografia de permuta catiónica era convertida de novo em albumina monomérica sob as condições da cromatografia de permuta aniónica. Foi atingido um rendimento de aproximadamente 110% para o monómero de albumina após este passo.

Com maior detalhe, uma coluna de DEAE-Sepharose Fast Flow com uma extensão de caminho do fluxo no leito de 11,0±1,0 cm (Pharmacia) é

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 28 pré-equilibrada com ο tampão de eluição de permuta catiónica (SC23) e depois é equilibrada com um tampão acetato (por exemplo SC20) antes de ser carregada com 30,0±10,0 g de albumina monomérica por litro de matriz. A coluna é então lavada com uma solução de borato tal como no Exemplo 2 (SC27), eluída tal como no Exemplo 2 (SC06) e limpa com sal/detergente (SC24), cáustica (SC25) e armazenada em cáustica diluída (SC26), todas tal como para a coluna de permuta catiónica. O caudal para todos os passos é de 0,07 a 0,75 vol. de leito/min, de preferência 0,3-0,6, neste exemplo 0,5 volumes de leito por minuto. O eluato da resina de permuta aniónica (p.ex. DE-FF) contém ainda impurezas e é depois aplicado directamente na matriz de afinidade (p.ex. Agarose Azul Delta, tal como descrito no Exemplo 2). A altura do leito foi reduzida de 25 cm no Exemplo 2 para 11,0+1,0 cm o que permite um caudal mais elevado dentro da pressão operativa normal. Por isso, foi preferida uma altura de leito de 11,0 cm e não afecta de forma adversa a recuperação de albumina ou a pureza da albumina. A coluna foi equilibrada em acetato de amónio (100-300 mM, de preferência 200-275, por exemplo 250 mM tal como SC29) e a albumina foi aplicada a 7,0-14,0 g/l, de preferência 8,0-12,0 g/l, neste exemplo 10,0±1,0 g por litro de matriz. Os passos de equilíbrio, carregamento e lavagem foram efectuados a caudais de 0,05-0,30 vol. de leito/min, de preferência 0,15-0,27, neste exemplo 0,25 vol. de leito/min. Todos os outros passos foram efectuados a 0,04-0,30, de preferência 0,ΙΟ,25, e neste exemplo, 0,20 vol. de leito/min. 0 caudal aumentado, facilitado pela reduzida altura do leito, melhorou o débito por um factor de quatro o que é vantajoso para o projecto de uma instalação em grande escala e estava próximo da capacidade operativa máxima da DBA. Uma vez que este caudal aumentado não pareceu afectar de forma adversa a recuperação da albumina ou a pureza da albumina, é preferível utilizar um tal caudal mais elevado. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna do tampão acetato de amónio (SC29) e a albumina foi eluída com uma solução fortemente salina e de fosfato (NaCI 1,0-3,0 M, por exemplo NaCI 1,5-2,5 M ou 2,0 M e fosfato 5-100 mM, p.ex. 50 mM, tal como SC30). O pH do eluenie nesta variante do processo foi alterado para pH 7,0 a

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ partir de ρΗ 9,2. Ο tampão foi mudado de forma concordante de acetato de amónio 50 mM para fosfato de sódio 50 mM o qual foi preferido devido ao seu efeito tampão a pH 7,0 e ao seu custo relativo. O eluente de pH baixo foi responsável por um aumento na recuperação de monómero de albumina no eluato de DBA. Um pH inferior a 7,0 aumentou os níveis de fragmento e acima de pH 7,0 a recuperação de monómero de albumina foi reduzida. O pH, que pode estar na gama de 5,5-9,0, é por isso de preferência pH 7,0. A coluna foi limpa e armazenada em cáustica (SC25, SC26) tal como acima. 0 eluato de DBA (opcionalmente após ultrafiltração com uma membrana do tipo celulósico (exclusão nominal de PM 30 000) para dar 80-110 g/l de albumina) foi então aplicado à resina de permeação em gel, por exemplo S-200 (HR). O tampão de operação de S-200 foi mudado para fosfato de sódio 40 mM, pH 7,0. O octanoato de sódio foi omitido deste tampão por razões de custo e em vez disso foi adicionado à solução antes da diafiltração (adicionado até uma concentração de 1-20 mM, de preferência 5 mM). O fosfato conferiu uma condutividade mais alta ao tampão de operação o que melhorou a pureza. Pode ser utilizada uma concentração salina elevada para aumentar a condutividade mas mesmo assim é preferível tamponar a solução. O pH 7,0 foi preferível uma vez que este era o pH desejado para a formulação.

Assim, neste exemplo, a sequência de passos de purificação é: permuta catiónica (eluindo com uma molécula que se liga especificamente à albumina), permuta aniónica, cromatografia de afinidade e permeação em gel. O passo de diafiltração antes da formulação pode ser favorecido começando com a albumina a pH 7,0. A albumina estava mais concentrada no eluato final que no processo do Exemplo 2, favorecendo o passo final de ultrafiltração antes da formulação (Exemplo 3).

Exemplo 5: Lavagem altamente salina no permutador catiónico

Numa outra variação do processo, foi seguido o processo do Exemplo 2 ou 4 excepto o que se segue. Após carregamento da albumina na coluna de permuta catiónica (por exemplo SP-Sepharose FF, Pharmacia), a coluna foi lavada com SC21 (acetato de sódio 50 mM, pH 3,9-4,1, 0,6-0,8 mS.cm1), sendo depois lavada ainda com um tampão altamente salino contendo NaCI 1- 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 30

3 Μ, de preferência NaCI 2 Μ, em tampão acetato de sódio (por exemplo acetato de sódio 10-50 mM, de preferência cerca de 27 mM, pH 3,5-4,5, de preferência pH 4,0) antes da lavagem final em SC20. Este procedimento de lavagem mais rigoroso resulta num eluato contendo um nível mais baixo de proteínas que não albumina e pode ser especialmente útil se a albumina for rHA de uma fermentação de leveduras. A albumina foi eluída tal como descrito no Exemplo 4. A diminuição do pH antes da lavagem altamente salina ajuda a manter a albumina na coluna durante essa lavagem e a lavagem final também maximiza a recuperação de albumina. É provável que nenhum dos passos tenha um efeito substancial na pureza da albumina recuperada.

Exemplo 6: Eluicão com borato concentrado do permutador aniónico

Neste exemplo, o processo do Exemplo 2 ou 4 ( com ou sem a variação do Exemplo 5) foi variado como se segue. O eluato da coluna de permuta catiónica foi diluído para menos de 10 mS.cm'1, de preferência menos de 5 mS.cm1, e depois carregado numa matriz de permuta aniónica (por exemplo, DEAE Sepharose FF, Pharmacia). A matriz de permuta aniónica foi então lavada com tampão tetraborato diluído (por exemplo, tetraborato de potássio ou tetraborato de sódio 15-25 mM), o qual tem o efeito de aumentar o pH para aproximadamente 9,2, e a albumina foi depois eluída com um tampão tetraborato mais concentrado (por exemplo tetraborato de potássio 80-1 50 mM, de preferência tetraborato de potássio 110 mM). Nos Exemplos 2 e 4, a albumina foi eluída com tetraborato 20 mM, NaCI 100 mM; a eluição com tetraborato 80-150 mM (p.ex. 33,6 g/l) resulta num eluato com um teor mais baixo de contaminantes contendo hidratos de carbono, por exemplo glicoproteínas de levedura, devido a uma afinidade aumentada destas espécies para a matriz de permuta aniónica, nestas condições. É utilizado de preferência tetraborato de potássio em relação a tetraborato de sódio devido à sua maior solubilidade à temperatura ambiente. Lidou-se com o eluato da matriz de permuta aniónica tal como no Exemplo 2 ou 4. Por exemplo, no processo do Exemplo 4, este foi carregado directamente numa matriz de afinidade, p.ex. Agarose Azul Delta (DBA), a qual foi operada tal como descrito no Exemplo 4.

Um passo de permeação em gel é então efectuado tal como no Exemplo 2 ou 4.

80399 ΕΡ 0 828 759/ΡΤ 31

Exemplo 7: Aminofenilboronato imobilizado O eluato da matriz de DBA pode ser aplicado a um meio de permeação em gel, por exemplo Sephacryl S-200 (HR), equilibrado num tampão acetato de amónio (por exemplo 10-100 mM, de preferência cerca de 30 mM), contendo cloreto de sódio (20-2000 mM, de preferência cerca de 100 mM) e octanoato (octanoato 1-20 mM, de preferência cerca de 5 mM a pH 9,0-9,5, de preferência 9,2). Este tampão permuta eficazmente a albumina para uma solução adequada para o último passo cromatográfico, exposto abaixo em maior detalhe. O passo de S-200 é efectuado tal como se segue. A S-200 é operada a uma altura de leito mínima de 90,0±3 cm (p.ex. 3x30 cm em série), (a) O retentado da ultrafiltração intermédia é carregado na coluna. As fracções de reciclagem e de produto são recolhidas. Este passo é repetido até todo o material ter sido carregado na coluna, (b) As fracções de reciclagem reunidas são concentradas para 80-110 g de rHA/l por ultrafiltração tal como acima, (c) 0 retentado da ultrafiltração de reciclagem é carregado na mesma coluna e é recolhida de cada pico uma fracção de produto. Este passo é repetido até todo o material ter sido carregado na coluna, (d) As fracções de produto dos passos primário e secundário de cromatografia de permeação em gel ((a) e (c)) são reunidas como o eluato de S-200. 0 passo final consiste num passo de afinidade para remover glicoconjugados, tais como glicoproteínas e glicolípidos, e poli-, oligo- e monossacáridos. Este passo utiliza o ácido aminofenilborónico (PBA) imobilizado como ligando. A Patente dos EUA N° 4 562 251 (aqui incorporada por referência) descreve métodos adequados para fazer diborotriazina-agarose ou monoborotriazina-agarose: (1) A triazina é primeiro ligada em O à agarose e depois ligada ao ácido 3-aminofenilborónico (APBA) numa segunda reacção. Se ο X na triazina for substituído por cloro é então produzida a resina bissubstituída. (2) A triazina reage primeiro com APBA para produzir mono- ou diborotriazina. Estas são depois ligadas em 0 através do cloro livre na triazina à agarose activada por -ONa para produzir agarose mono- ou bissubstituída. Todos os exemplos e descrições nesta patente utilizam agarose activada por -ONa o que resulta em ligações em 0. 32 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ

Uma patente anterior dos EUA 4 269 605 contempla uma variedade de métodos de activação de matrizes, incluindo a activação por epicloridrina da agarose, aqui preferida. Matrizes rnmercialmente disponíveis incluem a PBA30 de Amicon e a de aminofenilboronato em contas acrílicas de Sigma. A albumina recolhida da coluna S-200 foi cromatografada através da matriz de PBA, tendo sido pré-equilibrada em tampão de operação de S-200 (ver acima); nestas condições, a albumina não se liga grandemente à matriz, enquanto que os contaminantes baseados em hidratos de carbono são suficientemente retardados para os separar da albumina à medida que esta passa através da coluna. A cromatografia é por isso o modo negativo no que respeita à albumina. Outros detalhes são como se segue: A matriz de fenilboronato tinha uma extensão de caminho do fluxo no leito de 11,0+1,0 cm e foi equilibrada com um tampão contendo iões amónio (10-50 mM), acetato (10-50 mM) e octanoato 1,0-10,0 mM (p.ex. SC36 - ver tabela abaixo). A coluna foi então carregada a 35+15 g de rHA/l de matriz. O PBA é operado como um passo negativo e por isso o produto recolhido é o fluxo que atravessa a coluna durante o carregamento e a lavagem subsequente com o tampão de equilíbrio. Todos os passos cromatográficos podem ser efectuados a caudais na gama de 0,005-0,3 vol. de leito/min. De preferência o equilíbrio e a limpeza da coluna são efectuados a um caudal mais alto, p.ex. 0,19 vol. de leito/min, que o carregamento e a recolha da solução de albumina, os quais são efectuados de preferência a um caudal de 0,01-0,05, de preferência 0,025 vol. de leito/min. A coluna é então lavada com um tampão borato (tal como SC37), sal (SC38) e cáustica (SC25) e depois armazenada no tampão borato (SC37). 0 pH do fluxo que atravessa a coluna e do fluxo de lavagem recolhidos foi ajustado para 7,0+0,1 com solução de ácido fosfórico (SC35).

Os tampões utilizados são os seguintes: 33 85300 ΕΡ 0 828 759/ΡΤ

Tabela 4: Soluções de cromatoqrafia para o Exemplo 7

Solução Constituinte Concentração (g.r1 2 3 4 5 6 7 8) pH Conduti- vidade (mS.crn1) N° Nome SC36 Equilíbrio de ch3coonh4 2,31 PBA/ lavagem NaOH (27% p/p) 2,55 9,0-9,4 12,0-15,0 NaCI 5,04 Ácido octanóico 0,721 SC37 Limpeza com K2B407.4H20 33,6 9,2-9,5 15,0-18,0 borato SC38 Limpeza salina CH3COOH 1,62 NaOH (27% p/p) 1,19 3,9-4,1 125,0-165,0 NaCI 117,0

Devido à utilização de iões amónio no tampão de PBA, é vantajoso utilizar sal no último passo de ultrafiltração, tal como explicado acima no Exemplo 3.

Num processo particularmente preferido, a sequência de passos é como se segue: 1

Fermentação de leveduras tal como no Exemplo 1. 2

Condicionamento do centrado tal como no Exemplo 2. 3

Permuta catiónica (SP-FF) com lavagem altamente salina, tal como no Exemplo 5, e eluição com um composto específico para a albumina, tal como no Exemplo 4. 4

Diluição e permuta aniónica com eluição com tetraborato concentrado tal como no Exemplo 6. 5

Cromatografia de afinidade (DBA) tal como no Exemplo 4. 6

Ultrafiltração intermédia e depois permeação em gel (S-200), com ultrafiltração de reciclagem, tal como no Exemplo 7. 7

Cromatografia em borato imobilizado tal como no Exemplo 7. 8

Ultrafiltração final e formulação tal como no Exemplo 3.

Exemplo 8: Utilização anterior de fenilboronato imobilizado O passo que envolve fenilboronato imobilizado pode ser utilizado mais cedo no processo, por exemplo num processo no qual os passos estão 86398 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 34 α

ordenados - permutador catiónico - permutador aniónico - material de afinidade -ultrafiltração/diafiltração - fenilboronato imobilizado - permeação em gel.

As condições para cada passo são como nos Exemplos 4 a 7, excepto como se segue. O eluato de DBA é concentrado para 80-110 g/l de albumina e o pH é ajustado para 9,2 diafiltrando (5 volumes) contra um acetato de amónio do tipo utilizado no Exemplo 7. O eluato de DBA concentrado é então cromatografado em PBA e o fluxo que atravessa é recolhido e aplicado directamente na coluna de permeação em gel (p.ex. S200). Como o passo de permeação em gel é agora o último passo, este pode ser efectuado num tampão que seja adequado para o passo de formulação, por exemplo NaCI 20-130 mM (de preferência 50-100 mM), a pH 7,0.

Exemplo 9: Caracterização da albumina produzida de acordo com o invento

Este exemplo ilustra a análise que é efectuada para estabelecer a pureza da albumina purificada de acordo com o presente invento. A menos que referido em contrário, todos os ensaios são efectuados em albumina que foi formulada tal como descrito no Exemplo 3 para produzir o produto final.

Glicacão de rHA

Um microensaio para proteínas glicadas mostrou que a (rHA) purificada de acordo com o invento não é modificada por glicosilação não enzimática (glicacão). 0 microensaio mede a forma de produto Amadori estável (AP) da proteína glicada por oxidação dos grupos hidroxilo C-1 de AP com periodato. O formaldeído libertado pela oxidação com periodato é quantificado por conversão num cromóforo, diacetildi-hidrolutidina (DDL), através de reacção com acetilacetona em amónia. A DDL é então detectada colorimetricamente a 405 nm.

ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ

Lote de albumina Moles de hexose/moles de proteína A 0,092 B 0,116 C 0,090 D 0,132 E 0,060 G 0,04 H 0,01 I 0,07 J 0,07 K 0,05 L 0,740 M 0,70 N 0,96 0 0,78

Os lotes Α-Κ eram rHA purificada de acordo com o Exemplo 2. Os lotes L-0 eram amostras de albumina de soro humano comercialmente disponíveis de diferentes fontes. Oito lotes de rHA purificada de acordo com o Exemplo 7 tinham um nível desprezável de glicação (0,042±0,018 moles/mole) em comparação com a HSA (0,387+0,012).

Ensaio de Contaminantes de Baixo Peso Molecular

Racional - O objectivo deste ensaio é o de remover contaminantes de baixo peso molecular não ligados covalentemente (LMC) de rHA e HSA utilizando solventes orgânicos ácidos. Um cromatograma do tipo "impressão digital" de HPLC pode então ser produzido para comparação das amostras. Método - Para 100 μΙ de produto final (20 mg; rHA ou HSA) são adicionados sequencialmente 50 μΙ de ácido fórmico (98% v/v), 100 μΙ de clorofórmio e 50 μΙ de etanol com agitação em vórtex após cada adição. As amostras são mantidas à temperatura ambiente durante 5 min com mistura regular. A proteína é então precipitada pela adição de 1 ml de acetona (30 min, -20°C). As amostras proteicas são compactadas em pelete por centrifugação, os sobrenadantes são removidos por decantação e seca-se por evaporação

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 36 rotativa sob vácuo. As amostras secas são ressuspensas em acetonitrilo a 25%/ácido trifluoroacético a 0,1%. Os LMC são então separados numa coluna de fase inversa ABI PTH C18 (220 * 2,1 mm) utilizando um gradiente linear de acetonitrilo a 10%-90% em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal = 300 μΙ/min). As amostras foram monitorizadas a 214 nm utilizando um monitor de UV Shimadzu.

Resultados - Foi feita uma comparação entre um lote comercialmente disponível de albumina de soro humano e um lote de rHA purificada de acordo com o invento. Observam-se dois picos principais significativos a A214nm na amostra do invento (R, = 31,1 e 42,8 min respectivamente - ver Fig. 2 e Tabela 9). Pensa-se que o pico a 2,15 min deve-se a material insolúvel ou parcialmente solúvel que passa através da coluna e o pico grande a 56,5 min também está presente no traçado de um branco de água e é por isso visto como um artefacto.

Tabela 5: Resultados dos Picos tt Tempo de Ret (min) Área (uV.s) Altura (uV) 1 0,800 3459686 219122 2 1,667 418606 33569 3 2,150 77883335 1963630 4 3,000 6293258 122295 5 20,433 297608 14424 6 22,900 205822 14601 7 27,567 150851 10835 8 31,117 2213883 170938 9 37,983 164710 15088 10 39,267 347946 29879 11 41,750 107515 8402 12 42,783 2303024 192911 13 43,217 139744 14141 14 43,457 254521 23979 15 50,467 152805 13226 16 50,950 162364 12577 17 56,533 5753796 83674

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 37 A HSA comercialmente disponível, por outro lado, possui muito mais picos (ver Fig. 3 e Tabela 6).

Tabela 6: Resultados dos Picos # Tempo de Ret. Área Altura (min) (uV.s) (uV) 1 0,350 244385 23957 2 0,633 607880 45310 3 0,783 3239730 243477 4 0,983 1072033 158146 5 2,233 76773569 2038028 6 2,933 6634089 182363 7 3,733 2812688 95459 8 12,483 818540 20185 9 12,650 218748 22750 10 14,150 5423715 98336 11 16,333 423403 17460 12 16,633 688525 24538 13 17,550 2301309 84781 14 18,033 1145045 47806 15 19,750 672721 21562 16 20,233 87799 9760 17 20,700 272171 13003 18 21,100 862146 55792 19 21,967 166471 8928 20 22,883 1381445 97660 21 23,583 1112632 89851 22 24,000 4740347 419780 23 24,417 352486 26374 24 24,917 171279 14625 25 25,133 99734 11473 26 25,267 133911 10515 27 25,667 223556 11854 28 25,967 257295 17351 38 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 29 26,600 93906 7957 30 26,817 223113 18326 31 27,250 303831 29461 32 27,533 124218 12710 33 27,783 5747091 561629 34 28,550 1383761 119772 35 29,033 390986 33455 36 29,417 182131 12713 37 29,833 181333 12584 38 30,183 478320 30155 39 30,583 1048945 58465 40 31,067 3454425 214489 41 31,983 168275 8663 42 32,717 651406 43161 43 33,150 1142221 102588 44 34,017 420756 23883 45 35,100 115704 10008 46 37,033 166588 9468 47 38,267 145731 8078 48 38,983 781209 54029 49 41,800 86967 8868 50 48,883 95416 8522 51 50,267 174159 16737 52 50,483 176115 15573 53 51,267 158727 13701 54 52,183 297278 25795 55 56,533 5846645 85710 A qualidade da albumina do invento em termos de LMC não ligados covalentemente é claramente superior à da HSA clínica. Expressa numericamente, a área total de picos entre 10 min e 55 min para a albumina do invento foi de cerca de 6,4 V.s enquanto que a área total de picos entre os mesmos dois tempos para o material comercialmente disponível foi de cerca de 39,7 V.s.

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Uma análise semelhante foi efectuada com detecção a 280 nm, caso em que a área de picos para a albumina purificada de acordo com o invento foi de 0,56 V.s, enquanto que para a HSA foi de 14,9 V.s. A análise dos contaminantes de baixo peso molecular fluorescentes (excitação a 280 nm, detecção a 350 nm) revelou novamente uma área total de picos para a albumina purificada pelo processo do invento de menos de 10% da área para a HSA.

Electroforese de Zona Capilar para rHA e HSA A electroforese capilar (CE) é utilizada como uma alternativa a SDS-PAGE Standard de forma a comparar qualitativamente a rHA purificada do invento com a HSA comercialmente disponível. A CE é uma técnica electroforética de alta resolução e é capaz de separar sub-populações da mesma proteína quando se quer encontrar apenas pequenas diferenças. Método - Amostras de HSA (Armour) e rHA purificada de acordo com o invento foram separadas em tampão P04/B407 20 mM, pH = 7,4 a 20 KeV e 30°C e foram sujeitas a electroforese numa CE ABI 270. A rHA do invento originou um único pico num electroforetograma indicativo da sua homogeneidade. Em contraste, foram observados outros picos nas amostras de HSA comercialmente disponível. Acredita-se que estes picos sejam indicativos da presença de moléculas de albumina com, por exemplo, grupos tiol livres bloqueados ou degradação amino-terminal.

Análise do terminal C

Um aspecto importante do controlo de qualidade de proteínas recombinantes é a confirmação e estabilidade da estrutura primária predeterminada.

Materiais e Métodos

Digestão Tríptica: HSA (de uma fonte comercial - uma amostra armazenada a -20°C e outra armazenada a 30°C durante 12 semanas), rHA purificada de acordo com o invento (armazenada a 4°C e 30°C durante 6 meses)

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 40 e uma rHA Des-Leu (uma forma truncada de rHA sem a leucina C-terminal) (1 mg de cada) foram reduzidas com ditiotreitol 5 mM (Calbiochem) durante 120 min a 37°C, depois alquiladas com iodoacetamida 10 mM (Sigma) durante 90 min a 37°C em guanidina-HCI 6 M em Tris-HCI 0,5 M pH 8,0.

As amostras foram então diluídas 1 para 3 com HzO e digeridas com tripsina durante 48 horas a 37°C (tripsina tratada TPCK de Sigma, 3 x alíquotas de 10 μΙ de 1 mg/ml de solução adicionadas ao longo de 48 horas).

Mapeamento de Péptidos: As digestões trípticas foram mapeadas em HPLC de fase inversa (RP) num sistema de HPLC Gilson utilizando uma coluna SuperPac Pep-S de Pharmacia de 25 cm (5 μιτι C2/C18). Os eluentes utilizados foram A, TFA a 0,1% (v/v) (ABI) em água; B, TFA a 0,09% (v/v) em acetonitrilo a 70% (v/v) (Fisons Scientific) - gradiente linear durante 60 min, 0,5 ml/min. Detecção por UV a 214 nm e 280 nm.

Sequenciação N-terminal: Efectuada num sequenciador de proteínas ABI 477A.

Bombardeamento Atómico Rápido - Espectrometria de Massa: O FAB-MS foi efectuado num VG Autospec de M-Scan Limited, Ascot, RU. Síntese Peptídica: O péptido tríptico C-terminal de comprimento completo LVAASQAALGL (massa 1012) foi sintetizado por ABI, Warrington, RU; e a versão truncada LVAASQAALG (massa 899) foi sintetizado pelo Departamento de Bioquímica, Universidade de Nottingham, Nottingham, RU.

Resultados

Foi mostrado, utilizando o péptido marcador sintético, que o péptido tríptico C-terminal de comprimento completo (massa 1012) eluía a 37,5 minutos em RP-HPLC. Este pico foi recolhido e identificado por Sequenciação N-terminal e FAB-MS a partir de HSA e rHA. A remoção da leucina C-terminal resulta num péptido C-terminal truncado (massa 899) o qual se mostrou que eluía a 28,5 minutos, confirmado utilizando o péptido marcador sintético. Este pico foi isolado a partir da digestão tríptica 41 863ΘΘ ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ de rHA Des-Leu e identificado por Sequenciação N-terminal e FAB-MS. Mostrou-se que estavam presentes dois outros péptidos neste pico a 28,5 minutos, AWAVAR (massa 673) e DLGEENFK (massa 950). 0 pico a 28,5 minutos foi recolhido de RP-HPLC a partir das digestões trípticas de HSA, HSA armazenada a 30°C durante 12 semanas, rHA Des-Leu, rHA do invento armazenada a 4°C durante 6 meses e rHA do invento armazenada a 30°C durante 6 meses. 0 pico de cada digestão foi subsequentemente analisado por Sequenciação N-terminal e FAB-MS juntamente com os péptidos marcadores sintéticos.

Tabela 7: Péptidos presentes no pico a 28.5 minutos através de Sequenciação IM-terminal

AMOSTRA SEQUÊNCIA rHA Des-Leu LVAASQAALG AWAVAR DLGEENFK HSA padrão AWAVAR DLGEENFK + cerca de 5% de LVAASQAALG HSA 30°C, 12 semanas AWAVAR DLGEENFK rHA 4°C, 6 meses AWAVAR DLGEENFK rHA 30°C, 6 meses AWAVAR DLGEENFK

Através de FAB-MS, os sinais principais (iões moleculares (M-fH)+) presentes no pico a 28,5 minutos foram tal como mostrado na Tabela 8.

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Tabela 8: Ides (Μ + Η)* no Pico a 28.5 min

Mistura de Péptidos C-terminais Sintético Inteiro e Truncado 101 3- LVAASQAALGL 900- LVAASQAALG rHA Des-Leu 673- AWAVAR 900- LVAASQAALG 951- DLGEENFK 1028- ? 1140- ? HSA padrão 673- AWAVAR 900- LVAASQAALG 951- DLGEENFK 1028- ? 1140- ? rHA 30°C, 6 meses 673- AWAVAR 900- LVAASQAALG 1028- ? 1140- ? 951- Sem sinal

Os sinais a 1028 e 1140 podem ser iões fragmento; estes não eram péptidos que pudessem ser detectados por análise de sequência.

Conclusão O péptido tríptico C-terminal Des-Leu foi detectado em HSA comercial a aproximadamente 5-10% (não quantitativo), mas não pôde ser detectado na rHA do invento, mesmo após 6 meses a 30°C. O péptido Des-Leu não pôde ser detectado na HSA de 12 semanas a 30°C e o pico para o péptido C-terminal de comprimento completo a 37,5 minutos (embora não isolado) era muito diminuto em comparação com as outras amostras, indicando que este talvez tenha sofrido degradação C-terminal adicional.

Estes resultados indicam que a rHA, purificada de acordo com o invento, tem um terminal carboxi estável e de comprimento completo, enquanto que a HSA previamente disponível de fontes comerciais parece ser heterogénea por comparação. 43 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ

Ensaio Colorimétrico para Tióis Livres em Albumina Humana Purificada

Introdução - O Reagente de Ellmann, 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoato) (DTNB), é um meio específico e sensível para detectar grupos tiol livres tais como Cys-SH. A reacção pode ser seguida monitorizando a absorvância a 412 nnrt, valor esse que pode ser utilizado para calcular Cys-SH livre, para níveis de menos de um resíduo por molécula de rHA. Os seguintes reagentes em solução são utilizados no ensaio: 5,5'-Ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico) DTNB, Produto Sigma N° D8130.

Cristais de pH TRIS PRE-SET pH 8,0, Produto Sigma N° T4753. EDTA, dissódico, Produto Sigma N° ED2SS.

Di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado, grau Analar.

Hidrogenofosfato dissódico di-hidratado, grau Analar.

Tampão 1: Tris-HCI 0,1 M (12,1 g); EDTA Na2.2H20 0,01 M (3,72 g), pH 8,0. Cristais de pH PRE-SET. Dissolver em 500 ml de água e perfazer 1 litro de volume exacto. Estável durante um mês à temperatura ambiente.

Tampão 2: Fosfato de sódio 0,05 M pH 7,0, Na2HP04.2H20 (5,45 g), 3,04 g de NaH2P04.2H20. Dissolver em 500 ml de água e perfazer 1 litro de volume exacto. Estável durante 1 mês à temperatura ambiente.

Reagente: DTNB 0,01 M (39,4 g) em tampão fosfato. Dissolver em 10 ml de tampão 2. Preparar fresco todos os dias.

Amostra: Diluir a albumina para cerca de 10,3 μΜ em tampão 1 (0,66 mg/ml). Procedimento 1) Regular o termostato do suporte de células do espectrofotómetro para 25°C. 2) Colocar 1,25 ml de amostra numa cuvete e 1,25 ml de tampão 1 numa outra cuvete de 10 mm de volume reduzido nas posições de amostra e referência, respectivamente. 3) Calibrar o instrumento para zero a 412 nm. Regular a absorvância para Escala Total 0,1 UA. 4) Adicionar 50 μΙ de reagente DTNB à cuvete de referência e misturar brevemente utilizando um agitador de plástico limpo. 5) Adicionar 50 μΙ de reagente DTNB à cuvete de amostra e

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 44 misturar tal como acima. 6) Começar imediatamente a registar dados (ou iniciar o registador gráfico e seguir a reacção até aos 10 min). 7) Repetir para cada amostra, para obter valores em triplicado. 8) Extrapolar a partir do decaimento estacionário de absorvância para o tempo zero e ler a absorvância a 412 nm (δΑ412) (Fig. 1). 9) Calcular o teor de sulfidrilo utilizando o coeficiente de extinção molar e412 = 13,9 cm2mM1.

Resultados Várias amostras de HSA comercial foram ensaiadas quanto ao teor de tiol livre, estando os resultados resumidos abaixo: HSA Tiol Livre (moles de SH/mole de HSA) 1 0,29 2 0,22 3 0,35 4 0,05 5 0,08 6 0,46 7 0,36

Estes valores são significativamente mais baixos que o valor para a albumina preparada de acordo com o exemplo acima a qual é rotineiramente ensaiada a 0,85-0,9 moles de SH/mole de rHA. A determinação de contaminação com iões metálicos em albumina humana por espectroscopia em fornalha de grafite

Os padrões e as amostras são atomizados a partir de um tubo de grafite pirorrevestido. A absorção atómica da amostra é detectada utilizando as seguintes condições:

ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 45 Ião metálico Comprimento de onda nm Temperatura de atomização °C Zn 213,9 1800 Cu 327,4 2300 Fe 248,8 2400 AI 309,8 2500 Mn 279,8 2200 Ο alumínio foi medido utilizando um espectrofotómetro de absorção atómica Perkin Elmer M2100, uma fornalha de grafite Perkin Elmer HGA-700, um Amostrador Automático Perkin Elmer AS-70 com copos de amostra e uma lâmpada catódica oca de alumínio. Os reagentes foram nitrato de magnésio de grau AR, uma solução padrão de alumínio (1000 ppm) e ácido nítrico concentrado de grau AR. Foi feita uma solução de nitrato de magnésio a 1,00% p/v com água Milli-Q. Foram pipetados 15 μΙ de solução padrão de alumínio para o amostrador automático e diluídos para 1500 μΙ com solução de ácido nítrico a 0,20%. O procedimento é repetido com 15 μΙ da solução obtida e depois com 150 μΙ da solução subsequentemente obtida, para dar uma solução de alumínio de 10 ppb (pg/l).

Uma amostra de albumina é diluída com solução de ácido nítrico a 0,20% para dar uma concentração de alumínio dentro dos limites do gráfico de calibração. Uma diluição de 1:2 é normalmente suficiente. O magnésio é medido de forma semelhante, utilizando um amostrador automático de chama Perkin Elmer AS-51 e uma lâmpada catódica oca de magnésio. Uma solução Padrão de Magnésio de 1000 ppm é diluída com água Milli-Q para dar soluções padrão de 0,1, 0,2, 0,5 e 1,0 ppm. A absorção atómica da amostra é detectada a 285,2 nm. O cobre, ferro, manganês e zinco são medidos da mesma forma que o alumínio excepto que, para o zinco, é utilizada uma solução padrão de 1,0 ppb (pg/l) em vez de uma solução de 10 ppb. A concentração de iões metálicos foi determinada em ng/l e depois relacionada com a concentração de albumina (ng de ião metálico/g de albumina). Estes dados são apresentados na Tabela 9. 85300 ΕΡ 0 828 759/ΡΤ 46

Tabela 9: Perfis de Contaminação da Albumina produzida de acordo com o invento

Concentração em ng/g de albumina

Químico Lote A Lote B Lote C Alumínio - 85 - Cobre 3720 9080 1780 Ferro 460 810 440 Magnésio 1200 850 800 Zinco 4510 1490 1790 Manganês 20 191 16 Químico Lote D Lote E Lote F Lote G Alumínio - - - - Cobre 660 2690 440 530 Ferro 930 380 2720 1880 Magnésio - - - - Zinco 1580 680 3520 2130 Manganês 42 14 58 27 Químico Lote H Lote 1 Lote J Lote K Alumínio 9 22 86 96 Cobre 520 590 9920 8820 Ferro 1010 670 1030 100 Magnésio 600 <400 2000 2000 Zinco 1740 1040 4280 3520 Manganês 35 20 46 60

Todos os resultados são expressos como concentração total do ião metálico. A Tabela 10 mostra os níveis correspondentes de iões metálicos na HSA comercial.

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Tabela 10: Concentrações em ηα de metal/q de albumina

Químico Fonte A Fonte B Fonte C Fonte D (RU) (RU) (Japão) (Japão) Alumínio 790 970 915 420 Cobre 2020 4510 23840 580 Ferro 41220 15200 23550 15240 Magnésio 4500 500 15000 54000 Zinco 7230 1650 930 4580 Manganês 940 190 135 240 Químico Fonte E Fonte F Fonte G (RU) (EUA) (França) Alumínio 350 3190 155 Cobre 4830 1180 7910 Ferro 7910 25920 1850 Magnésio 1500 500 500 Zinco 1520 3940 2130 Manganês 160 65 80

Pode-se observar que o nível médio de alumínio no produto do invento era de cerca de 60 ng/g enquanto que as fontes comerciais tinham 155-3190 ng/g. De forma semelhante, o produto do invento tinha uma média de cerca de 948 ng/g de ferro (em comparação com 1850-41200 ng/g em material da arte anterior), uma média de 2990 ng/g de cobre (em comparação com 580-23840 ng/g em material da arte anterior), uma média de 1120 ng/g de magnésio (em comparação com 500-54000 ng/g em material da arte anterior), uma média de 2390 ng/g de zinco (em comparação com 930-7230 ng/g em material da arte anterior) e uma média de 48 ng/g de manganês (em comparação com 65 a 940 ng/g em material da arte anterior).

Análise de ácidos gordos de cadeia média e longa

Os perfis de ácidos gordos da albumina de acordo com o invento e da HSA comercialmente disponível foram analisados por extracção com solvente ácido e cromatografia gasosa dos ácidos gordos livres utilizando um padrão interno C17:0. 85309 ΕΡ 0 828 759/ΡΤ 48

Equipamento: Cromatógrafo de gás (p.ex. Shimadzu GC 9A) com detector de ionização por chama; Autoinjector (p.ex. Shimadzu AOC 14); Integrador/lmpressora (p.ex. Shimadzu CR4A); coluna de fase HP-FFA 30 χ 0,53 mm, 1,0 pm (Hewlett Packard Ltd); estojo de Instalação Megabore (J & W Scientific 220-11 50 para GC 9A) com separador de injecção directa.

Reagentes: Água (Milli-Q); Solvente Diclorometano de Super-Pureza (Romil Chemicals, Loughborough, Leics.); Acetato de Sódio Tri-hidratado Analar (BDH Ltd, Poole); Ácido Acético Glaciar Analar (BDH Ltd, Poole); Solução de Albumina de Soro Humano (Zenalb™20, Bio Products Laboratory, Elstree, Herts.); Sulfato de Sódio Anidro (Reagente Analítico); ácidos gordos padrão de Sigma.

Soluções:

Tampão Acetato de Sódio 0,5 M pH 4,5: Acetato de Sódio 6,13 g e Ácido Acético 3,30 g por 100 ml.

Misturas padrão de Ácidos Gordos Livres. Pesar 5 mg de cada ácido gordo em frascos de vidro separados. Dissolver cada ácido gordo em 1 ml de Diclorometano e transferir para três tubos de cultura de Pyrex de 12 ml respectivamente para ácidos gordos de cadeia curta (C6-C14), de cadeia média (C16-C18) e de cadeia longa (C20-C22:1). Secar a mistura sob uma corrente de azoto e dissolver em 1 ml de Diclorometano. Transferir alíquotas de 50 μΙ da mistura para frascos de vidro marcados, secar sob azoto, tapar e armazenar a -20°C.

Solução Padrão Interno de Ácido Heptadecanóico a 1 mg/ml (25,0 mg de Ácido Heptadecanóico/25 ml de Diclorometano).

Procedimento 1. Adicionar 50 μΙ de Solução Padrão Interno a 6 tubos de Pyrex de 40 ml marcados. 2. Para rHA a 5% adicionar 5 ml de amostra. Para rHA a 25% utilizar 1 ml de amostra e 4 ml de água. Incluir um branco (5 ml de água) e uma

86399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 49 amostra de albumina de soro (1,25 ml de Zenalb™20 e 3,75 ml de água). Preparar todas as amostras em duplicado. 3. Adicionar 2,5 ml de Tampão Acetato de Sódio e depois 10 ml de Diclorometano a todos os tubos. 4. Colocar os tubos tapados num agitador mecânico por rotação durante 2 horas à temperatura ambiente. 5. Centrifugar todos os tubos durante 5 min a 3000 rpm numa centrífuga Sorvall RT6000B a 20°C. 6. Remover a fase aquosa superior e depois, trabalhando a partir do fundo do tubo, transferir cuidadosamente a fase de Diclorometano inferior para um tubo de Pyrex de 12 ml marcado. Glóbulos proteicos podem impedir a remoção de toda a fase de Diclorometano. Se isto ocorrer, adicionar uma espátula cheia de Sulfato de Sódio Anidro, tapar e agitar. 7. Secar a fase de Diclorometano sob uma corrente de azoto e armazenar sob azoto a -20°C até à análise. 8. Instalar a coluna capilar e regular o cromatógrafo de gás para as seguintes condições de acordo com as instruções do fabricante:

Detector: Ionização por chama; Gás Transportador: Azoto a 30 ml.min'1; Volume de Injecção: 0,5 μΙ; Temperatura inicial da coluna: 70°C; Espera: 1,5 min; Gradiente 1: 20°C min'1 até 150°C; Gradiente 2: 4°C min1 até 240°C; Espera: 7 min; Temperatura do Detector: 280°C; Os Parâmetros Específicos para Shimadzu GC9A são: Alcance do Detector: 10°; Pressão de Hidrogénio: 0,5 kg/cm2; Pressão do Ar: 0,5 kg/cm2; Tempo de Paragem: 50 min. 9. Regular o integrador para recolher dados do cromatógrafo de gás de acordo com as instruções do fabricante. 10. Aumentar a temperatura do forno para 245°C e deixar até se atingir uma linha de base estacionária.

8Ε39Θ ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 50 11. Baixar a temperatura do forno para 70°C e deixar equilibrar. 12. Descongelar uma alíquota dos padrões de Ácidos Gordos de Cadeia Longa, Média e Curta. Dissolver os Ácidos Gordos de Cadeia Longa em 1 ml de Diclorometano. Transferir a solução para os Ácidos Gordos de Cadeia Média e dissolver. Repetir para os Ácidos Gordos Curtos. 13. Injectar a mistura padrão para determinar os tempos de retenção dos ácidos gordos. O cromatograma produzido deve ter picos com muito pouca cauda e ter uma linha de base lisa e lentamente ascendente com o número correcto de picos bem resolvidos. O Ácido Capróico (C6:0) deve eluir com um tempo de retenção de aprox. 6 min e o Ácido Erúcico (C22:1) com um tempo de retenção de aprox. 33 min. Identificar todos os picos por comparação com o cromatograma padrão do exemplo. 14. Injectar as amostras e recolher dados. Cálculos 1. Identificar o pico padrão interno das amostras de branco. Este será o pico principal com um tempo de retenção de aproximadamente 23,5 min. 2. Calcular as Razões de Área de Pico para todos os picos integrados em todas as amostras utilizando a seguinte fórmula:

Razão de Área de Pico = _Área do Pico_ Área do Pico Padrão Interno 3. Identificar picos de ácidos gordos em amostras de rHA e HSA com base no tempo de retenção por comparação com os padrões. 4. Converter todas as Razões de Área de Pico em concentrações aproximadas (pg/g de albumina) para ambas as amostras de rHA e HSA utilizando o seguinte factor:

Concentração (pg/g) = Razão de Área de Pico x 200

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 51 5. Para os picos identificados como ácidos gordos, converter a Concentração de pg/g de albumina em moles/mole de albumina utilizando o peso molecular do ácido gordo e a seguinte fórmula:

Concentração (moles/mole) = Concentração (iiq/g) x 0,0665

Peso Molecular do Ácido Gordo O3 resultados do Exemplo são apresentados para um lote de albumina preparada de acordo com o Exemplo 2 (Fig. 4) e HSA comercial (Fig. 5). Não foram detectados quaisquer ácidos gordos anormais na primeira através deste método embora os perfis para as duas proteínas mostrassem diferenças significativas. Tal como esperado, ambas mostraram grandes quantidades do estabilizante adicionado, octanoato (C8:0). À parte disto, a HSA comercial foi caracterizada predominantemente por C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 e C18:2 enquanto que a albumina do invento continha principalmente C10:1, C12:0, C16:1 e ocasionalmente C14:0. Experiências posteriores mostraram que os níveis de C10.O e C12:0 no produto final de rHA se correlacionavam com os níveis destes contaminantes no octanoato utilizado nas últimas fases do processo de purificação.

Os dados para a rHA produzida de acordo com o Exemplo 7 são como os seguintes: (Segue Tabela) 52 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ

Tabela 11: Comparação da composição em ácidos gordos da rHA purificada de acordo com o processo do invento e da HSA comercial

Teor de ácidos gordos (moles/mole de proteína) Ácido gordo rHA HSA C10:0 0,100 0,005 C12:0 0,020 0,011 C14:0 0,005 0,017 C1 6:0 0,013 0,152 Cl 6:1 0,064 0,023 C18:0 0,002 0,024 Cl 8:1 0,012 0,145 C18:2 ND 0,089 C18:3 ND 0,006 C20:0 ND 0,001 C20:1 ND 0,001 C20:2 ND ND C20:4 ND 0,006 TOTAL 0,216 0,480 ND = Não detectado

De preferência, o nível total de ácidos gordos C18 não excede 1,0% (moles/mole) do nível de octanoato e de preferência não excede 0,5% desse nível. Para além disso, na albumina do invento, o nível de ácidos gordos C18:2, C18:3 e C20 não é geralmente detectável. Em HSA comercial, pode haver tipicamente cerca de 0,4 moles de ácidos gordos C10 a C20 por mole de albumina. No produto do invento, não existem tipicamente quaisquer ácidos gordos C20 detectáveis e existem apenas cerca de 0,01 a 0,02 moles de ácidos gordos C18 por mole de albumina.

Análise da Cor - A absorvância de uma solução a 5% (p/v) do produto final numa cuvete de 1 cm foi medida a 350 nm, 403 nm e 500 nm e calculada em termos de absorvâncias por grama de albumina/litro por cm de extensão do caminho (i.e. A l.g \cm ’). A albumina do invento tem os seguintes valores: 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ

Comprimento de onda (nm) 350 403 500 53

Absorvância média (n = 10 lotes) (l.g\cm1) 4,74 x IO3 2,12 x 103 0,58 x 10 3

Geralmente, a albumina do invento não excede as respectivas absorvâncias de 6,0x103, 2,5x10'3 e 0,75x103 nos três comprimentos de onda referidos.

Ensaios de várias preparações de HSA comercialmente disponíveis revelaram absorvâncias mais altas a èstes comprimentos de onda (ver Tabela 12).

Tabela 12: Absorvância (l.g^.cnT1) de preparações de HSA da arte anterior AMOSTRA A350 A403 A500 1 9,95 4,10 0.8 2 9,25 5,36 1.1 3 7,40 3,26 0,6 4 7,20 3,60 0,6 5 8,68 4,08 0,8 6 11,45 6,26 1,2 7 7,20 3,70 0,8 8 6,82 4,78 1,8

Electroforese em gel redutor de poliacrilamida-SDS - Este ensaio é efectuado para mostrar que a rHA consiste numa única cadeia polipeptídica a qual quando tratada com um agente redutor (β-mercaptoetanol) migra como uma única banda (monómero) em electroforese em gel redutor de poliacrilamida (PAGE) com SDS.

As amostras de albumina foram fervidas em tampão redutor com SDS (Tris-HCI 20 mM pH 8,0 contendo EDTA 2 mM, SDS a 5% (p/v) e β-mercaptoetanol a 10% (v/v) com a albumina a 1 mg/ml) e depois separadas em Phastgels (Pharmacia) homogéneos (12,5%) com SDS, utilizando um carregamento de 1 μΙ da solução. As bandas proteicas foram detectadas por

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 54 coloração com Azul de Coomassie R250, varridas num densitómetro Shimadzu CS9000. A separação da albumina mostrou uma única banda de coloração com Coomassie o que é indicativo de que a proporção de albumina presente como monómero é de pelo menos 99,9%.

Cromatoarafia líquida de alta pressão de permeacão em gel São injectados 25 μΙ de uma solução 10 mg/ml da albumina do eluato da matriz de permuta aniónica na concretização principal do processo do invento (i.e. quando o passo de permuta aniónica é o passo final antes da ultrafiltração e formulação) numa coluna TSK3000SWXL numa HPLC Shimadzu LC6A. Verificou-se que o produto era pelo menos 99,9% monomérico.

Foram ensaiados da mesma forma 25 μΙ de uma segunda solução 10 mg/ml de albumina purificada de acordo com o invento a qual foi formulada para 25% p/v e verificou-se que continha menos de 0,1% de albumina polimérica. Este resultado indica que a formulação tal como aqui descrita não tem qualquer efeito no teor de polímero/agregado da albumina purificada.

Electroforese em Gel Bidimensional

Submeteram-se 2 pg de rHA preparada pelo processo do invento a electroforese bidimensional utilizando um sistema Millípore Investigator. A separação na primeira dimensão foi um gel de focagem isoeléctrica pH 3-10 e foi seguida por um gel SDS-poliacrilamida a 10% na segunda dimensão. Após a coloração do gel com Azul de Coomassie, apenas um ponto era visível, indicando a presença de apenas uma espécie proteica.

Espectrometria de Massa de Electropulverizacão A espectrometria de massa de electropulverizacão (ESMS) foi efectuada utilizando um espectrómetro de massa de electropulverização VG Quattro, calibrado com mioglobina cardíaca de cavalo (16951 Da, obtida de Sigma) ao longo de uma gama de m/z de 950-1750 Da/e. Amostras de HSA comercialmente disponível e amostras de rHA purificada de acordo com o invento foram dessalinizadas antes da análise por HPLC de fase inversa utilizando um gradiente de acetonitrilo contendo ácido trifluoroacético. As 55 85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ

Figuras 6a e b mostram os espectros para a albumina do invento e para a HSA da arte anterior, respectivamente. O último mostra picos representando tiol livre bloqueado e degradação N-terminal. A albumina do invento pode ser vista como sendo substancialmente homogénea neste ensaio, por outras palavras, mostra um único pico definido, ocorrendo com uma massa de cerca de 66441 Da.

Estabilidade a longo prazo

Ao fim de dois anos, não é detectável qualquer degradação da albumina através de métodos electroforéticos, o que mostra que não está presente qualquer actividade proteásica.

Lisboa,

Por DELTA BIOTECHNOLOGY LIMITED

m.· ÂMTÓHIO JOÃO DÁ CUMHA FERREIRA Á§. Of. Pr. ind. 6se das Flores, 74 - 4.*

1SOQ LISBOA

Claims (39)

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES

1. Processo de purificação de albumina, compreendendo o processo os passos de aplicação de uma solução de albumina relativamente impura a um material cromatográfico para o qual a albumina não tem qualquer afinidade específica de tal forma que a albumina se ligue ao material, e eluição da albumina ligada do material através da aplicação de uma solução de um composto possuindo uma afinidade específica para a albumina.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que o material cromatográfico é uma resina de permuta catiónica.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que o composto é um sal de ácido gordo tal como octanoato.

4. Processo de purificação de albumina, compreendendo o processo os passos de sujeição de uma solução de albumina a cromatografia de permuta catiónica na qual a albumina é ligada a um material de permuta catiónica e depois a cromatografia de permuta aniónica na qual a albumina é ligada a um material de permuta aniónica, em que a albumina eluída do material de permuta catiónica é subsequentemente tratada por uma ou mais de entre cromatografia de afinidade, ultrafiltração e permeação em gel, antes de ser sujeita à referida cromatografia de permuta aniónica.

5. Processo de purificação de albumina, compreendendo o processo os passos de sujeição de uma solução de albumina a cromatografia de permuta catiónica na qual a albumina é ligada a um material de permuta catiónica e depois a cromatografia de permuta aniónica na qual a albumina é ligada a um material de permuta aniónica, em que a albumina eluída do material de permuta catiónica é aplicada ao referido material de permuta aniónica sem qualquer tratamento interposto excepto, opcionalmente, diluição.

6. Processo de purificação de albumina, compreendendo os passos de: (a) passagem de uma solução de albumina através de uma matriz de permuta catiónica sob condições tais que a albumina se ligue à matriz; (b) eluição da referida matriz de um eluato de permuta catiónica contendo albumina;

86399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ (c) passagem do referido eluato através de uma matriz de afinidade compreendendo um composto de ligação à albumina; (d) eluição da referida matriz de um eluato da matriz de afinidade contendo albumina; (e) passagem do referido eluato, opcionalmente após ultrafiltração, através de uma matriz de permeação em gel para obter uma fracção enriquecida em albumina; (f) passagem da referida fracção enriquecida em albumina através de uma matriz de permuta aniónica sob condições tais que a albumina se ligue à matriz; e (g) eluição da referida matriz de permuta aniónica de um produto purificado contendo albumina.

7. Processo para purificação de albumina, compreendendo os passos de: (a) passagem de uma solução de albumina através de uma matriz de permuta catiónica sob condições tais que a albumina se ligue à matriz; (b) eluição da matriz de um eluato de permuta catiónica contendo albumina; (c) passagem do eluato de permuta catiónica através de uma matriz de permuta aniónica sob condições tais que a albumina se ligue à matriz; (d) eluição da matriz de permuta aniónica de um eluato de permuta aniónica contendo albumina; (e) passagem do eluato de permuta aniónica através de uma matriz de afinidade compreendendo um composto de ligação à albumina; (f) eluição da matriz de afinidade de um eluato da matriz de afinidade contendo albumina; (g) passagem do eluato da matriz de afinidade através de uma matriz de permeação em gel para obter uma fracção enriquecida em albumina.

8. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 7 em que a albumina é eluída no passo de permuta catiónica utilizando um tampão contendo um composto que possui uma afinidade específica para a albumina.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8 em que o composto é um sal de octanoato.

IO. Processo de acordo com a reivindicação 8 ou 9 em que a albumina no

passo de permuta catiónica é lavada com uma solução altamente salina antes de ser eluída.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a albumina é eluída do permutador aniónico com um tampão contendo sal de ácido bórico 50-200 mM.

12. Processo de acordo com qualquer umas das reivindicações anteriores em que a albumina obtida deste modo é então, com ou sem passos processuais interpostos, sujeita a cromatografia numa resina contendo um composto imobilizado o qual se irá selectivamente ligar a glicoconjugados e sacáridos.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12 em que o composto é ácido aminofenilborónico (PBA).

14. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, reivindicação essa que especifique cromatografia de afinidade, em que a cromatografia de afinidade utiliza uma resina compreendendo um corante imobilizado específico para a albumina.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14 em que o corante é um corante do tipo Azul de Cibacron.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15 em que o corante é imobilizado na resina através de um espaçador.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16 em que o espaçador é um grupo a, a>-diamino-(C,.6-alquilo de cadeia linear).

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que, antes do passo de permuta catiónica, a solução de albumina é condicionada adicionando-lhe octanoato até uma concentração final de cerca de 1-10 mM e ajustando o pH a cerca de 4,0-5,0.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a solução final contendo albumina obtida deste modo é então ultrafiltrada através de uma membrana de ultrafiltração para obter um retentado

86399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 4/6 de ultrafiltração possuindo uma concentração de albumina de pelo menos cerca de 80 g de albumina por litro e o retentado de ultrafiltração é diafiltrado contra pelo menos 5 equivalentes ao retentado, de água.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a solução inicial de albumina é um meio de cultura de leveduras obtido através da cultura de leveduras transformadas com uma sequência nucleotídica que codifica albumina num meio de fermentação, pelo que a referida levedura expressa e segrega albumina.

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que o referido meio de fermentação é isento de um agente quelante de metais.

22. Processo de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que a levedura é separada do meio de fermentação antes do meio ser aplicado à matriz de permuta catiónica.

23. Processo para purificação de albumina, compreendendo o processo o passo de exposição de uma solução de albumina relativamente impura a um material cromatográfico compreendendo um ácido borónico ou um seu sal, e separação do material da solução de albumina para produzir albumina purificada.

24. Processo de acordo com a reivindicação 23 em que a solução de albumina contém glicoconjugados e/ou sacáridos.

25. Processo de acordo com a reivindicação 24 em que os glicoconjugados e/ou sacáridos compreendem glicoproteínas de leveduras.

26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 25 em que o ácido borónico é ácido aminofenilborónico ou um seu sal.

27. Processo de acordo com a reivindicação 26 em que o ácido aminofenilborónico é imobilizado num gel de agarose.

28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 27 em que a solução de albumina é tamponada com um ou mais de iões acetato, iões cloreto, iões octanoato e iões amónio.

85399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ

29. Processo de acordo com a reivindicação 28 em que a solução contém iões acetato 10-100 mM, iões amónio 10-100 mM, iões cloreto 20-2000 mM e iões octanoato 1-20 mM e tem um pH de 9,0-9,5.

30. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a albumina purificada é adicionalmente purificada e/ou formulada para administração intravenosa a um humano.

31. Método de purificação de uma solução de albumina compreendendo a exposição da solução a uma solução de um contra-ião de tal forma que os iões amónio são deslocados da albumina e podem ser removidos da solução.

32. Método de acordo com a reivindicação 31 em que a solução de contra-ião é adicionada à solução de albumina e os iões amónio são removidos por diálise.

33. Método de acordo com a reivindicação 31 em que a solução de contra-ião é separada da solução de albumina por uma membrana semi-permeável e os iões amónio são removidos por diafiltração.

34. Método de acordo com a reivindicação 31 em que os iões amónio são removidos da solução por cromatografia de permeação em gel.

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 31 a 34 em que a solução de contra-ião é uma solução compreendendo iões de sódio.

36. Método de purificação de uma solução de albumina, compreendendo o método a exposição da solução a um material cromatográfico num tampão contendo iões amónio, e subsequentemente a remoção dos iões amónio através de um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 32 a 36, para produzir um produto de albumina purificado, opcionalmente após passos adicionais de purificação ou de formulação.

37. Método de acordo com a reivindicação 36 em que o material cromatográfico compreende iões borato imobilizados. 86399 ΕΡ Ο 828 759/ΡΤ 6/6

38. Método de purificação de uma solução de albumina que contém o fragmento de albumina de aproximadamente 45 kD (1-403 a 1-409) produzido por certos microorganismos que segregam albumina, compreendendo o método a exposição da solução a um corante imobilizado possuindo afinidade específica para a albumina, e eluição da albumina enquanto o fragmento de 45 kD fica no corante.

39. Método de acordo com a reivindicação 38 em que o corante é tal como definido em qualquer uma das reivindicações 14-17. Lisboa, Por DELTA BIOTECHNOLOGY LIMITED - O AGENTE OFICIAL -

À§. 0{. Pr. lnd. Roo das Flores, 74 - 4.* -ISOO LISBOA |0$G.e ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRÀ