ES2857582T3

ES2857582T3 - Métodos para la purificación de proteínas mediante el uso de ácido caprílico

Info

Publication number: ES2857582T3
Application number: ES15722478T
Authority: ES
Inventors: Ole Elvang Jensen; Per Kaersgaard
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2021-09-29
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: EP4147761A1; JP2020114879A; JP7094322B2; CN106459142A; US20170044210A1; WO2015166072A1; EP3137186A1; DE22197320T1; CN106459142B; US20220324906A1; EP3842108A1; JP2017514826A; ES2975172T1; EP3137186B1; JP6700197B2; JP7414874B2; JP2022069571A

Abstract

Un método para la purificación de una proteína diana de una muestra que comprende las etapas de i. cargar una muestra que contiene proteína en una fase estacionaria, para unir la proteína diana a dicha fase estacionaria; ii. someter la proteína diana unida a una solución de ácido caprílico; en donde la solución de ácido caprílico comprende ácido caprílico libre de 1 a 50 mM; y iii. eluir la proteína diana, en donde dicha purificación de una proteína diana comprende la inactivación del virus en dicha muestra mediante dicho tratamiento con ácido caprílico, en donde el pH de la solución de ácido caprílico está en el intervalo de 2 a 7, en donde dicha proteína diana es un anticuerpo o un fragmento del mismo, y en donde dicha fase estacionaria es una columna de cromatografía.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la purificación de proteínas mediante el uso de ácido caprílico

Campo técnico

La purificación de proteínas con inactivación o eliminación de virus se realiza mediante el uso de ácido caprílico. Antecedentes de la invención

Los productos biofarmacéuticos o el uso de composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína terapéutica para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones es un elemento estratégico para varias compañías farmacéuticas y biotecnológicas. Muchas proteínas usadas en una composición biofarmacéutica se obtienen a través de la producción recombinante mediante el uso de una línea celular de mamífero o mediante la purificación a partir de un fluido biológico. Sin embargo, una proteína terapéutica fabricada mediante tales métodos puede estar contaminada con un virus, aparentemente con un virus patógeno contagioso, el cual puede ser perjudicial para la salud de un individuo. Es necesario procesar un medio que comprende una proteína terapéutica con el objetivo de eliminar cualquier posible actividad viral contaminante.

La inactivación de virus patógenos contagiosos puede realizarse mediante inactivación por calor, inactivación con solvente/detergente (S/D), inactivación por pH, inactivación química y/o inactivación con irradiación, siendo la inactivación con S/D quizás el método verídico más ampliamente aceptable.

La mayoría de los patógenos humanos son virus envueltos. Estos son susceptibles a la rotura de la membrana mediante solventes y detergentes. Los métodos de inactivación mediante el uso de calor, pH ácido, productos químicos e irradiación son problemáticos ya que estos agentes son agresivos y/o invasivos y tienden a desnaturalizar o inactivar de cualquier otra manera la proteína terapéutica que se purifica.

Para la inactivación de virus, como parte del aclaramiento del virus durante la purificación de un producto farmacéutico, el virus envuelto generalmente se inactiva mediante un detergente o una etapa de tratamiento con pH bajo en la cual se agrega detergente a una solución del producto farmacéutico o se ajusta a un pH alrededor de 3,7 (3,5 - 3,9) por hasta 6 horas o más. Sin embargo, los detergentes no siempre son efectivos contra todo tipo de virus envueltos, pueden tener problemas ambientales o, para una inactivación de pH bajo, la ventana de operación es muy estrecha porque a un pH superior a 3,8, el efecto de la inactivación desaparece. Por el contrario, a valores de pH más abajo de 3,5, el riesgo de formación de agregados o desnaturalización aumenta drásticamente para muchas proteínas.

El documento EP 0374625 demuestra que el ácido caprílico es efectivo contra la mayoría de los virus envueltos en poco tiempo. El documento de EE.UU 4,939,176 informa sobre un proceso para inactivar virus en soluciones de proteínas biológicamente activas al poner en contacto las soluciones con ácido caprílico. Las condiciones preferentes indicadas para el proceso fueron pH 4 a pH 8 y 0,07 (% p/p) a 0,001 (% p/p) de la forma no ionizada de ácido caprílico.

Se conocen otros métodos de inactivación viral a través del uso de agentes químicos. El documento de EE.UU 4,540,573 enseña el uso de di- o tri-alquilo fosfatos como agentes antivirales. El documento de EE.UU 4,534,972 describe un método para convertir soluciones de proteínas terapéutica o inmunológicamente activas sustancialmente libres de agentes infecciosos. En el documento de EE.UU 4,534,972, una solución de proteína se pone en contacto con un complejo de metal de transición, por ejemplo, fenantrolina de cobre, y un agente reductor para efectuar la inactivación de virus sin afectar sustancialmente la actividad de la proteína.

El documento de EE.UU 5,164,487 se refiere al uso de ácido caprílico para la fabricación de una preparación de IgG libre de agregados, sustancias vasoactivas y enzimas proteolíticas. El método incluye poner en contacto el material de partida que contiene IgG con 0,4 % a 1,5 % de ácido caprílico antes de la purificación por cromatografía con una matriz hidrófoba o de intercambio iónico.

Steinbuch y otros mostraron el uso de ácido caprílico para precipitar la mayoría de las proteínas y lipoproteínas (distintas de las inmunoglobulinas) presentes en la Fracción III de etanol de Cohn. (Steinbuch y otros, 1973). Se ha descrito una purificación en dos etapas de inmunoglobulinas de sueros de mamíferos y de fuido ascítico (McKinney y otros, 1987). Primero se precipitó la albúmina y otras proteínas que no eran IgG mediante el uso de ácido caprílico, y luego se añadió sulfato de amonio al sobrenadante para precipitar la IgG.

Durante la preparación de la inmunoglobulina humana, el ácido caprílico se reconoce generalmente como un agente de precipitación efectivo para la mayoría de las proteínas plasmáticas a pH 4,8, siempre que se optimicen parámetros tales como la temperatura y la fuerza iónica. Steinbuch y otros (1969) han descrito la precipitación de la mayor parte de las proteínas plasmáticas con ácido caprílico sin afectar la IgG, la ceruloplasmina y la IgA. Steinbuch y otros aislaron IgG de sueros de mamíferos mediante el uso de ácido caprílico e informaron que la precipitación extensa sin inmunoglobulina se obtenía mejor a pH ligeramente ácido, pero no más abajo de pH 4,5. El plasma se diluyó 2:1 con tampón acetato 0,06 M, pH 4,8, y luego se trató con caprilato al 2,5 % en peso para iniciar la precipitación.

Newcombe y otros se refirieron a la purificación de anticuerpos policlonales de suero ovino mediante el uso del adsorbente MAbsorbent A2P y describieron el uso del caprilato de sodio en un tampón de lavado de la columna de cromatografía con el objetivo de eliminar la albúmina (Newcombe y otros J. Chromatography B, 814 (2005) 209-215). Resumen

La presente invención proporciona un método para la purificación de una proteína diana de una muestra que comprende las etapas de

i. cargar una muestra que contiene proteína en una fase estacionaria, para unir la proteína diana a dicha fase estacionaria;

ii. someter la fase sólida con la proteína diana unida a una solución de ácido caprílico; en donde la solución de ácido caprílico tiene un pH para formar un ácido caprílico libre, y en donde la solución de ácido caprílico es un tampón de ácido caprílico a una concentración de 1 a 50 mM, medido en términos de ácido caprílico libre; y

iii. eluir la proteína diana

La presente invención finalmente ha logrado incorporar el tratamiento con ácido caprílico como parte de la etapa de cromatografía para realizar la inactivación viral sin un proceso discontinuo y sin necesidad de atención por el personal, particularmente cuando el ajuste del pH del eluato se realiza automáticamente mediante la elución en tampón.

Un aspecto de la invención está dirigido a un método para la purificación de una proteína diana de una muestra que comprende las etapas de:

i. cargar una muestra que contiene la proteína en una fase estacionaria, para unir la proteína diana a dicha fase sólida;

ii. someter la fase sólida a una solución de ácido caprílico; y

iii. eluir la proteína diana.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para la inactivación de un virus en una mezcla que contiene proteínas que comprende las etapas de i. cargar la muestra en una fase estacionaria, para unir la proteína diana a dicha fase sólida; ii. someter la fase sólida a una solución de ácido caprílico para inactivar y eliminar el virus; y iii. eluir la proteína diana.

Otro aspecto de la invención está dirigido a un método para la preparación de una solución de proteína libre de virus que comprende las etapas de i. cargar una muestra en una fase estacionaria, para unir la proteína diana a dicha fase sólida; ii. someter la fase sólida a un lavado con solución de ácido caprílico para inactivar y eliminar el virus; y iii. eluir la proteína diana.

Un aspecto alternativo de la invención está dirigido a un método de inactivación viral en donde una muestra que comprende a) una proteína diana y b) uno o más tipos de virus, se carga en una fase estacionaria y se lava con una solución de ácido caprílico.

Un método para inactivar un virus que contiene un recubrimiento lipídico, el método comprende las etapas de: i. cargar una muestra en una fase estacionaria, para unir la proteína diana a dicha fase sólida; ii. someter la fase sólida a un lavado con solución de ácido caprílico para inactivar y eliminar el virus; y iii. eluir la proteína diana.

La invención se dirige además a una muestra de proteína esencialmente libre de un virus que contiene un recubrimiento lipídico obtenida de un método que comprende las etapas de: i. cargar una muestra en una fase estacionaria, para unir la proteína diana a dicha fase sólida; ii. someter la fase sólida a un lavado con solución de ácido caprílico para inactivar y eliminar el virus; y iii. eluir la proteína diana.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para la inactivación de micoplasmas en una mezcla que contiene proteínas que comprende las etapas i. cargar la muestra en una fase estacionaria, para unir la proteína diana a dicha fase sólida; ii. someter la fase sólida a una solución de ácido caprílico para inactivar y eliminar el micoplasma; y iii. eluir la proteína diana.

La invención puede también resolver problemas adicionales que resultarán evidentes a partir de la descripción de las modalidades ilustrativas.

Descripción

Un aspecto de la invención está dirigido a la inactivación viral y a la purificación de proteínas concomitantes durante una etapa de cromatografía. Mediante el método de la invención se elimina la necesidad de la participación de un técnico para una etapa de inactivación y para separar la carga en una columna. La etapa singular de inactivación y captura puede realizarse sin la participación de un técnico.

Típicamente, la purificación de una proteína diana comprende la inactivación del virus potencial en dicha muestra. En consecuencia, un aspecto de la invención está dirigido a la preparación de una solución de proteína libre de virus y a una solución de proteína libre de virus preparada de acuerdo con el método de la presente invención. El método de la invención implica la inactivación del virus mediante el lavado de una membrana o columna de cromatografía con un solvente de lavado que contiene ácido caprílico después de la carga de la solución que contiene la proteína y antes de la elución de la proteína. El método de la invención también inactiva micoplasmas y resulta una mayor reducción de la Proteína de la Célula Huésped (HCP).

Para la purificación de proteínas y la inactivación del virus de la invención, la solución de ácido caprílico debe comprender el ácido caprílico en su ácido libre o no ionizado; es decir sustancialmente como ácido caprílico libre o ácido caprílico no ionizado. Los términos "ácido caprílico libre" y "ácido caprílico no ionizado" pretenden significar ácido caprílico en su forma no disociada; es decir como en su forma protonada; es decir como ^cH3(CH2)6CO2H. La invención está dirigida a la separación o purificación de una o más proteínas diana, típicamente una proteína diana, de cualquier medio o muestra que comprenda la proteína la cual puede comprender además, potencialmente comprender o comprender un virus o vira. La muestra puede ser un medio crudo o uno que haya sido parcialmente lavado, filtrado, diafiltrado o parcialmente purificado de cualquier manera. Adecuadamente, la muestra se selecciona del grupo que consiste en un caldo de fermentación, un cultivo celular, medio de línea celular, fluido de ascitis, medio de cultivo de tejidos, medio de células transgénicas, sangre humana o animal, plasma humano o animal que incluye fracciones de plasma. Típicamente, la muestra se selecciona de un medio de línea celular, tal como un medio de células transgénicas y plasma humano o animal.

La muestra o mezcla que contiene proteínas es un fluido que comprende una proteína, típicamente una proteína que tiene una actividad biológica o terapéutica. Un fluido puede ser cualquier fluido que tenga la posibilidad de estar contaminado por un virus. Los ejemplos no limitantes de un fluido incluyen extracto de cultivo celular y de tejido como un lisado celular, un sobrenadante celular, extractos placentarios o un fluido ascítico; un fluido biológico como sangre, plasma, suero, leche, saliva, semen; o cualquier otro fluido que incluya una proteína que tenga una actividad, o cualquier líquido purificado, parcialmente purificado de la misma, o líquido crudo o coloide que incluya una elución de una etapa de purificación previa.

Como se ha indicado, la muestra usada en la invención tiene como fuente un medio de línea celular, tal como un medio de células transgénicas y plasma sanguíneo humano o animal.

Una muestra de la invención que comprende la proteína de la invención puede obtenerse de un organismo que expresa naturalmente la proteína, de un organismo transgénico modificado genéticamente para expresar la proteína, o de una línea celular que produce la proteína de forma recombinante. Los ejemplos no limitantes de organismos transgénicos incluyen organismos descritos en la presente descripción que han sido modificados genéticamente para expresar una proteína de interés. Una muestra de la invención que comprende la proteína puede ser de un organismo u organismo transgénico puede obtenerse de un fluido biológico, extracto de tejido u órgano, u otra fuente de un organismo mediante el uso de métodos rutinarios conocidos en la técnica. Además, varios sistemas de expresión procariotas y/o eucariotas también pueden ser una fuente de la muestra de la invención, tal como para expresar recombinantemente una proteína descrita en la presente descripción. Los sistemas de expresión como fuente de la proteína de la invención pueden incluir, sin limitación, expresión inducible, expresión no inducible, expresión constitutiva, expresión específica de tejido, expresión específica de célula, expresión mediada por virus, expresión integrada de manera estable y expresión transitoria.

Una proteína de la invención puede ser codificada por un polinucleótido clonado en un vector de expresión. Los vectores de expresión procariotas, los vectores de expresión eucariotas, los vectores de levadura, los vectores de insectos, los vectores de mamíferos y otros vectores de expresión adecuados son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente.

Después de la recolección inicial de un organismo, organismo transgénico o sistema de cultivo celular, una muestra que comprende la proteína de la invención puede someterse a un proceso de purificación o filtración, incluyendo un proceso de diafiltración. Esta purificación inicial o preliminar de la muestra puede incluir una o más concentraciones de la proteína en la muestra, etapas de purificación intermedios para eliminar impurezas y pulido para eliminar impurezas adicionales y variantes de proteínas.

Un objeto de la invención es la inactivación de virus en una muestra que contiene proteínas. La frase "inactivación viral" pretende significar una disminución en el número de partículas virales en una muestra particular ("reducción") y/o una disminución en la actividad, tal como, pero no limitado a, la infectividad y/o la capacidad de replicarse, de partículas virales en una muestra particular. El término "inactivación viral" significa que un virión, normalmente capaz de replicarse, se vuelve incapaz de replicarse. El término abarca además la eliminación, al menos en parte, o la disminución o reducción del número del virus de la muestra. El término abarca la realización del método donde se desconoce la presencia o ausencia de virus. Por ejemplo, el proceso puede aplicarse a proteínas de sangre completa o plasma sanguíneo o sobrenadante celular en las que no se caracteriza la presencia o ausencia de virus y no hay garantía de que las proteínas del plasma y el sobrenadante celular sean seguras para su administración a un individuo. Las modalidades de la presente invención resultan, pero no se limitan a, reducciones de más de seis log10 de la carga viral. Es decir, el método produce una reducción en la replicación viral, comparado con el control, de 1 000000, en base a los límites de detección actuales.

Dichas disminuciones en el número y/o actividad de las partículas virales pueden ser del orden de aproximadamente 1 % a aproximadamente 100 %, preferentemente de aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 %, con mayor preferencia de aproximadamente 30 % a aproximadamente 100 %, con mayor preferencia de aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 %, aún con mayor preferencia de aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, aún con mayor preferencia de aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 %, aún con mayor preferencia de aproximadamente al menos aproximadamente 70 %, tal como al menos aproximadamente 80 %, más típicamente al menos aproximadamente 90 %, tal como de aproximadamente 95 % a 100 %, preferentemente de aproximadamente 95 % a aproximadamente 100 %, típicamente de aproximadamente 99 a aproximadamente 100 %.

En ciertas modalidades no limitantes, la cantidad total de virus, si existe, en el producto del anticuerpo purificado es menor que el ID50 (la cantidad de virus que infectará al 50 por ciento de una población diana) o PFU (unidades formadoras de placa) para ese virus, preferentemente al menos 100 veces menos que el ID50/PFU para ese virus, con mayor preferencia al menos 10000 veces menos que el ID50/PFU para ese virus, y aún más preferentemente al menos 1000000 de veces menos que el ID50/PFU para ese virus.

Como se reconocerá por el experto en la técnica, el método de la invención puede inactivar los virus en la muestra que luego pueden eliminarse de la muestra o el método puede tanto inactivar y eliminar los virus de la muestra.

Los aspectos de la presente especificación describen, en parte, un virus que contiene un recubrimiento lipídico. Una partícula de virus completa, conocida como virión, que consiste de ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, rodeado por un recubrimiento protector de proteína llamado cápside. Los virus pueden agruparse en virus envueltos y no envueltos. Como se usa en la presente, el término "virus que contiene un recubrimiento lipídico" se refiere a cualquier virus que comprende una membrana o envoltura que incluye lípidos, tal como, por ejemplo, un virus envuelto. Los virus envueltos tienen su cápside encerrada por una membrana lipoproteica, o envoltura. Esta envoltura se deriva de la célula huésped a medida que el virus "brota" de su superficie y se compone principalmente de lípidos no codificados por el genoma viral. Los virus envueltos tienen intervalos de tamaño de aproximadamente 45-55 nm a aproximadamente 120-200 nm. Los virus que contienen un recubrimiento lipídico los cuales pueden infectar células de mamíferos incluyen virus de ADN como un virus herpesviridae, un virus poxviridae o un virus hepadnaviridae; virus de ARN como un virus flaviviridae, un virus togaviridae, un virus coronaviridae, un virus deltavirus, un virus orthomyxoviridae, un virus paramyxoviridae, un virus rhabdoviridae, un virus bunyaviridae o un virus filoviridae; y virus de transcripción inversa como un virus retroviridae o un virus hepadnaviridae. Los ejemplos no limitantes de virus que contienen un recubrimiento lipídico incluyen un virus de inmunodeficiencia humana, un virus sindbis, un virus del herpes simple, un virus de la pseudorrabia, un virus sendai, un virus de la estomatitis vesicular, un virus del Nilo Occidental, un virus de la diarrea viral bovina, un coronavirus, un virus de la artritis equina, un virus del síndrome respiratorio agudo grave, un virus de la leucemia murina (MuLV), un virus de la rinotraqueitis infecciosa bovina (IBRV) o un virus vaccinia.

Un virus sin envoltura se refiere a un virus cuya cápside carece de una membrana de lipoproteína, o envoltura. En un virus sin envoltura, la cápside media la unión y la penetración a las células huésped. Las cápsides son generalmente helicoidales o icosaédricas. Los virus no envueltos tienen intervalos de tamaño de aproximadamente 18-26 nm a aproximadamente 70-90 nm. Los virus no envueltos que pueden infectar células de mamíferos incluyen, por ejemplo, un virus parvoviridae, un virus adenoviridae, un virus birnaviridae, un virus papillomaviridae, un virus poliomaviridae, un virus picornaviridae, un virus reoviridae y un virus calciviridae.

El virus puede ser, sin limitación, MuLV, IBRV, VIH, hepatitis B, hepatitis C, Ébola, Nilo Occidental y hantavirus, y tienen el potencial de contaminar el suministro de sangre y los productos derivados de la sangre. Es difícil eliminar o inactivar los agentes virales potencialmente presentes en los productos sanguíneos sin comprometer gravemente la calidad y/o la funcionalidad de las proteínas. Ejemplos no limitativos de virus de relevancia industrial son: parvoviridae, paramyoxyiridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae, rhabdoviridae, reoviridae, togaviridae, caliciviridae, Reoviridae y picornaviridae.

El virus incluye, pero no se limita a, un virus ADN de una sola hebra, un virus ADN de doble hebra, un virus ARN de doble hebra y un virus ARN de una sola hebra. En aspectos adicionales, el virus es un virus envuelto. Los virus envueltos incluyen, pero no se limitan a, un retrovirus, un virus del herpes o un hepadnavirus. En cualquier variación de la invención, puede seleccionarse un virus del grupo que consiste en un adenovirus, virus de la línea de la peste porcina africana, arenavirus, arterivirus, astrovirus, baculovirus, badnavirus, barnavirus, birnavirus, bromovirus, bunyavirus, calicivirus, capillovirus, carlavirus, caulimovirus, circovirus, closterovirus, comovirus, coronavirus, cotricovirus, cystovirus, deltavirus, dianthovirus, enamovirus, filovirus, flavivirus, furovirus, fusellovirus, geminivirus, hepadnavirus, herpesvirus, hordeivirus, hypovirus, ideaovirus, inovirus, iridovirus, levivirus, lipothrixvirus, luteovirus, machlomovirus, marafivovirus, microvirus, myovirus, necrovirus, nodavirus, orthomyxovirus, papovavirus, paramyxovirus, partitivirus, parvovirus, phycodnavirus, picornavirus, plamavirus, podovirus, polydnavirus, potexvirus, potyvirus, poxvirus, reovirus, retrovirus, rhabdovirus, rhizidiovirus, sequevirus, siphovirus, sobemovirus, tectivirus, tenuivirus, tetravirus, tobamavirus, tobravirus, togavirus, tombusvirus, totivirus, trichovirus, tymovirus, y umbravirus. En algunos aspectos, los virus incluyen, pero no se limitan a, virus de la enfermedad hemorrágica epizoótica (EHDV), virus del minuto del ratón (MMV), parvovirus-1 del ratón (MPV), virus del valle del caché, Vesivirus 2117, circovirus porcino (PCV 1), circovirus porcino 2 (PCV 2), parvovirus canino (CPV), parvovirus bovino (BPV) o virus de la lengua azul (BTV).

Una proteína de la invención es típicamente una proteína que tiene un actividad; preferentemente una actividad biológica. La proteína puede ser cualquier proteína de interés en la cual se desea la eliminación de cualquier actividad viral contaminante.

El método de la invención es aplicable a todas las proteínas, sin limitación. Como conoce el experto, la proteína en la muestra que contiene proteína es típicamente un determinante en la selección de la fase estacionaria y de esta manera no es un factor limitante en el método de la invención. El término proteína pretende significar un oligopéptido o cadena polipeptídica que tiene una estructura secundaria y opcionalmente terciaria. El término proteína incluye oligopéptidos, polipéptidos y proteínas que están glicosiladas, incluidas las glicoproteínas, o unidas a secuencias de ácidos nucleicos. Las proteínas pueden comprender cualquier modificación posterior a la traducción conocida por el experto en la técnica. Las proteínas pueden comprender elementos, enlaces o modificaciones no proteínicos. Particularmente en relación con, pero sin limitarse a, las proteínas de células transgénicas, las proteínas del método de la invención pueden comprender uno o varios aminoácidos no naturales y/o isómeros no naturales.

El método de la invención es aplicable a proteínas de todas las fuentes, sin limitación. La proteína en la muestra que contiene proteína puede seleccionarse de una proteína de la sangre, una proteína láctea, una proteína de extracto celular o celular. La proteína en la que contiene proteína es típicamente una proteína de la sangre o una proteína de un extracto celular, o una hormona. Más típicamente un anticuerpo, o un fragmento del mismo, tal como un Fab o un anticuerpo monocatenario.

Los términos "polipéptido" y "proteína" pueden usarse indistintamente para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no-aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como también otras modificaciones conocidas en la técnica.

El término "anticuerpo" o "anticuerpos" se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre, por ejemplo, anticuerpos monoclonales simples (incluidos anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos policlonales, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), inmunoadhesinas, y fragmentos de anticuerpos siempre que muestren la actividad biológica o inmunológica conveniente. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa de manera intercambiable con anticuerpo en la presente descripción.

El término "fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión al antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; moléculas de anticuerpos monocatenarios; diacuerpos; anticuerpos lineales; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales en la presente descripción incluyen anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es(son) idéntica(s) u homóloga(s) a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también los fragmentos de tales anticuerpos, siempre que muestren actividad biológica.

Como se indicó, la adaptación precisa de la purificación se basa en la consideración de la proteína a purificar. En determinadas modalidades, las etapas de separación de la presente invención separan un anticuerpo de uno o más HCP. Los anticuerpos que pueden purificarse con éxito mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos humanos IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM. En determinadas modalidades, las estrategias de purificación de la presente invención excluyen el uso de cromatografía de afinidad de proteína A, por ejemplo, purificación de anticuerpos IgG3, ya que los anticuerpos IgG3 se unen a la proteína A ineficientemente. Otros factores que permiten la adaptación específica de un esquema de purificación incluyen, pero no se limitan a: la presencia o ausencia de una región Fc (por ejemplo, en el contexto de un anticuerpo de longitud completa en comparación con un fragmento Fab del mismo) porque la proteína A se une a la región Fc; las secuencias de línea germinal particulares empleadas para generar el anticuerpo de interés; y la composición de aminoácidos del anticuerpo (por ejemplo, la secuencia primaria del anticuerpo, así como también la carga/hidrofobicidad general de la molécula). Los anticuerpos que comparten una o más características se pueden purificarse mediante el uso de estrategias de purificación adaptadas para aprovechar esa característica.

La presente invención es adecuada para aislar y purificar anticuerpos de una muestra. Típicamente, la muestra comprende una cosecha de línea celular en donde la línea celular se emplea para producir proteínas específicas, tales como anticuerpos específicos de la presente invención.

Los ejemplos 2 y 3, tomados en conjunto, demuestran que el método de la invención permite la purificación de proteínas de diferentes tipos de proteínas en las que se logró el aclaramiento completo de un virus, tal como el eMuLV, con la purificación concomitante de dos tipos de proteínas diferentes, específicamente, un anticuerpo humano recombinante (IgG1) en un caso y un Fab en otro caso. Además, los Ejemplos demuestran la purificación concomitante de un anticuerpo con inactivación viral.

En una modalidad preferida, la muestra comprende una proteína seleccionada de un anticuerpo, o un fragmento del mismo, un factor de coagulación y una hormona. El anticuerpo se selecciona preferentemente del grupo que consiste en un anticuerpo anti-TNF, un anticuerpo anti-IL-6, anticuerpo anti-IL-8, anticuerpo anti-IL-12, anticuerpo anti-IL-16, anti-IL-20, anticuerpo anti-IL-21, anticuerpo anti-IL-23, un anticuerpo anti-DR3, anticuerpo anti-CD27, un anticuerpo anti-C5aR-215, anticuerpo anti-CD30, anticuerpo anti-TREM-1, anticuerpo anti-TREM -2, anticuerpo anti uPA, anticuerpo anti-uPAR, anticuerpo anti-OX40, anticuerpo anti-BTLA, anticuerpo anti-GLP-1, anticuerpo anti-LAIR1, anticuerpo anti-LAIR2, anticuerpo anti-LILRA1, anticuerpo anti-Ly9, anticuerpo anti-PD1, anticuerpo anti-Siglec-9, anticuerpo anti-MMP2, anticuerpo anti-MMP6, anticuerpo anti-MMP8, anticuerpo anti-MMP9 y anticuerpo anti-TIM3.

En una modalidad típica, una columna empaquetada con una resina se carga con caldo de cultivo clarificado que contiene la proteína diana. La columna se carga típicamente con aproximadamente 1 a 50 g de proteína/L de resina, tal como 5-50 g de proteína/L de resina, típicamente de 5 a 25 g de proteína/L de resina, más típicamente de 10-20 g de proteína/L de resina. La columna se lava con un solvente acuoso que contiene aproximadamente 20-40 mmol/kg de caprilato de sodio, a un pH entre aproximadamente 5 y 6 durante aproximadamente 30 minutos después de que el pH se haya estabilizado. Opcionalmente, la columna se lava además con diferentes solventes para eliminar las impurezas antes de que la proteína se eluya con un solvente que contenga ácido fórmico.

La carga de una muestra en una fase estacionaria puede comprender uno o más de los siguientes procedimientos cromatográficos: cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de modo mixto y cromatografía de interacción hidrófoba.

En consecuencia, la fase estacionaria puede comprender cualquier medio cromatográfico conocido en la técnica, incluida una matriz inerte fijada con un ligando de unión a proteínas, una proteína, un intercambiador de aniones, un intercambiador de cationes. Preferentemente, la fase estacionaria es un medio para cromatografía de afinidad. La purificación de la proteína a partir de su contenido viral o inactivación viral es un objeto de la invención. A partir del Ejemplo 1, se muestra que la etapa de cromatografía en una columna con medio Capto L y con lavado con ácido caprílico lava completamente el contenido viral, determinado mediante el aclaramiento del eMuLV enriquecido. El aclaramiento completo del eMuLV que se vio en el Ejemplo 1 también se ve en el Ejemplo 2 en una columna con medio de Proteína A. Por lo tanto, la purificación de la proteína a partir de su contenido viral o la inactivación viral determinada mediante el aclaramiento de la carga viral no depende del medio en la columna.

Cuando se usan técnicas recombinantes, la proteína puede producirse intracelularmente, en el espacio periplasmático o secretarse directamente en el medio de muestra. En un aspecto, tal como si la proteína se produce intracelularmente, antes de cargar la muestra en la fase sólida, los restos de partículas, ya sean células huésped o células lisadas (por ejemplo, resultantes de la homogeneización), pueden eliminarse opcionalmente, por ejemplo, mediante centrifugación. o ultrafiltración. Sin embargo, una ventaja del método es que tal etapa preliminar no es esencial. Donde el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión pueden concentrarse primero mediante el uso de un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente.

Cuando la proteína se secreta en el medio, las células hospedadoras recombinantes también pueden separarse del medio de cultivo celular, por ejemplo, mediante filtración de flujo tangencial. La proteína de la invención se puede purificar del medio de cultivo mediante el uso del método de la invención.

En una modalidad, la etapa de cromatografía de afinidad comprende someter la muestra a una columna que comprende un soporte cromatográfico de afinidad adecuado. Los ejemplos no limitantes de tales soportes cromatográficos incluyen, pero no se limitan a, resina de proteína A, resina de proteína L, resina de proteína G, soportes de afinidad que comprenden el antígeno contra el cual se generó el anticuerpo de interés y soportes de afinidad que comprenden una proteína de unión a Fc. La resina de proteína A es útil para la purificación por afinidad y el aislamiento de anticuerpos tales como IgG.

Después de la carga de la columna, la columna puede lavarse una o varias veces mediante el uso, por ejemplo, de un tampón equilibrante. Pueden usarse otros lavados, incluidos lavados que emplean diferentes tampones, antes de eluir la columna. El eluato puede controlarse mediante el uso de técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica.

Una columna de intercambio catiónico adecuada es una columna cuya fase estacionaria comprende grupos aniónicos. Un ejemplo de tal columna es una columna SP Sepharose (TM).

Una columna de modo mixto adecuada es una columna cuya fase estacionaria comprende grupos de modo mixto. Un ejemplo de tal columna es una columna Capto MMC (TM).

En otra modalidad, la muestra se somete a cromatografía interactiva hidrófoba ("HIC"). Una columna adecuada es aquella cuya fase estacionaria comprende grupos hidrófobos. Un ejemplo de tal columna es una columna de fenil Sepharose (TM). Es posible que los anticuerpos hayan formado agregados durante el proceso de aislamiento/purificación. Esta etapa de cromatografía hidrófoba facilita la eliminación de estas agregaciones. También ayuda a eliminar las impurezas.

De acuerdo con el método de la invención, la muestra que contiene proteína, tal como medio de línea celular o plasma sanguíneo, se carga en una fase estacionaria, para unir la proteína diana a dicha fase estacionaria. El método de la invención no se limita a ninguna fase estacionaria. Los ejemplos demuestran que pueden usarse diferentes fases estacionarias en el método de la invención. Las etapas de cromatografía pueden incluir uno o más de los siguientes procedimientos cromatográficos: cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y cromatografía de interacción hidrófoba. La fase estacionaria es típicamente parte de una columna de cromatografía. La fase estacionaria es típicamente un medio para cromatografía de afinidad. La fase estacionaria puede seleccionarse de una columna de cromatografía de intercambio iónico, una cromatografía líquida de proteínas rápida y una columna de cromatografía de adsorción en lecho expandido (EBA), preferentemente una columna de cromatografía de intercambio iónico.

En una modalidad, la fase estacionaria comprende una matriz de agarosa fijada con un ligando de proteína de unión a inmunoglobulina, tal como una proteína recombinante o cualquier proteína que tenga una fuerte afinidad por la región variable de las cadenas ligeras kappa del anticuerpo. Un ejemplo de tal fase estacionaria es una columna empaquetada con medio Capto L (GE-Healthcare). En consecuencia, en una modalidad, la fase estacionaria comprende Proteína L típicamente fijada a una resina. En una modalidad adicional, la fase estacionaria comprende un medio de afinidad derivado de la proteína A. Un ejemplo de tal fase estacionaria es una columna empaquetada con medio Mab Select SuRe. En una modalidad adicional, la fase estacionaria comprende una matriz de agarosa con intercambiadores de cationes fuertes y/o aniones fuertes. Ejemplos de tales fases estacionarias incluyen Capto SP ImpRes y Capto Q ImpRes.

La duración de la exposición de la muestra a la solución de ácido caprílico puede variar con varios factores, incluidos, pero sin limitarse a, la concentración de ácido caprílico libre, el pH, el tipo de virus y la temperatura. La Tabla A indica el pH requerido a diversas concentraciones de caprilato para obtener los tiempos de exposición preferibles de las muestras a la solución de ácido caprílico. Para el propósito más práctico, la etapa ii. someter la fase sólida a una solución de ácido caprílico, o someter la muestra a una solución de ácido caprílico tiene lugar durante menos de 2 horas, típicamente menos de 1 hora, tal como de 0,05 minutos a 50 minutos, más típicamente de 0,10 minutos a 30 minutos, preferentemente de 0,25 minutos a 15 minutos.

Como puede verse en las Tablas 6 y 7, la activación viral a menudo se logra en menos de 5 minutos. Sin embargo, en dependencia de las condiciones (tal como concentración de ácido caprílico libre, pH, tipo de virus y temperatura), se requiere hasta 1 hora, tal como hasta 45 minutos, tal como 30 minutos, para fines prácticos.

En una modalidad de la invención típica, una columna empaquetada con una resina y cargada con la proteína diana se lava con un solvente acuoso que contiene ácido caprílico durante aproximadamente 30 minutos. Opcionalmente, la columna se lava además con diferentes solventes para eliminar las impurezas antes de que la proteína se eluya con un solvente que elimine la proteína diana.

La solución de ácido caprílico tiene un pH para inactivar el virus y no desnaturalizar la proteína diana. La solución de ácido caprílico tiene un pH para formar un ácido caprílico libre o no iónico. En consecuencia, el pH de la solución de ácido caprílico es típicamente ácido.

En consecuencia, la solución de ácido caprílico tiene un pH de 7,0 o menos, tal como un pH entre 2 y 7, tal como menos de 6,5, tal como menos de 6,1, tal como un pH de 2-6, tal como un pH de 2<pH< 6, preferentemente 3<pH< 6, con mayor preferencia 4<pH< 6, tal como 4,5<pH< 6, con la máxima preferencia 2<pH<6, preferentemente 3<pH< 6, más preferentemente 4<pH< 6, tal como 4,5<pH<6, tal como 4,6 < pH<6, tal como aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4.8, aproximadamente 4,9, aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,1, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,3, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7, aproximadamente 5,8 y aproximadamente 5,9, tal como 4,9<pH<6.

Como puede verse en el Ejemplo 2, las concentraciones bajas de ácido caprílico libre son efectivos para la inactivación completa de un virus tal como el eMuLV. En una modalidad preferida de la presente invención, el propio ácido caprílico es el tampón (pKa = 4,9). Típicamente, la solución de ácido caprílico es un tampón de ácido caprílico a una concentración de 1 a 100 mM, típicamente de 1 a 50 mM, que incluye de 10 a 80 mM, tal como de 30 a 70 mM o de 30 a 50 mM. Preferentemente, la concentración de ácido caprílico no ionizado es de 1 a 10 mM, tal como de 2 a 10 mM, tal como de 2 a 8 mM, tal como de 2 a 6 mM. En una modalidad típica, el tampón usado se prepara mediante la combinación de 35 mmol/kg de caprilato de sodio con 4,1 mmol/kg de HCl, lo que da como resultado un pH de aproximadamente 5,6-6,7. La concentración de ácido caprílico no ionizado puede determinarse mediante la ecuación de Henderson-Hasselbach: pH = pKa log ([caprilato]/[ácido caprílico]).

Tabla A: Concentración de ácido caprílico libre a diversas concentraciones y pH del tampón de caprilato

La Tabla A muestra el pH requerido a diversas concentraciones de caprilato, o viceversa, la concentración requerida a varios niveles de pH, para lograr la concentración mínima requerida de 1 mM de ácido caprílico libre para la purificación de proteínas de la presente invención. El área sombreada delimita modalidades en donde la concentración de ácido caprílico libre es demasiado baja para fines prácticos, ya que la inactivación viral requeriría un tiempo de exposición demasiado largo para inactivar una cantidad aceptable de virus de acuerdo con la presente invención.

La solución de ácido caprílico es típicamente un tampón de ácido caprílico a una concentración de 1 a 500 mM, típicamente 1 a 50 mM, que incluye 1 a 20 mM, tal como 2 a 20 mM o 1 a 10 mM, con mayor preferencia 2 a 10 mM como de 2 a 8 mM, tal como de 2 a 6 mM, medido en términos de ácido caprílico libre.

La solución de ácido caprílico típicamente comprende una combinación i) una sal de caprilato y ii) un ácido orgánico o inorgánico en proporciones para proporcionar una solución de pH menor a 7,0, tal como 6,5 o menos, tal como de pH 1 a 6,2, y en una concentración de ácido caprílico a una concentración de al menos 1 mM, tal como al menos 2 mM, tal como de 2 a 100 mM, tal como de 2,5 a 100 mM, medida en términos de ácido caprílico libre.

La carga de la muestra que contiene proteína y/o el lavado con el tampón de ácido caprílico puede realizarse a una diversidad de temperaturas, típicamente de 1 a 40 oC, tal como de 1 a 30 oC, tal como de 2 a 25 oC. La baja temperatura usada en el ejemplo 4, en comparación con la temperatura usada en el ejemplo 3, muestra que la etapa de inactivación viral se logra tanto a temperaturas bajas (2 a 8oC) y a temperaturas más altas (15 a 25 oC)

La elución de la proteína puede realizarse mediante técnicas convencionales tal como un tampón de elución, tal como un tampón de elución ácido, típicamente mediante el uso de un ácido orgánico. En una modalidad preferida, el tampón de elución es ácido fórmico. En una modalidad adecuada, el tampón de elución se prepara mediante la combinación de ácido fórmico 10 mmol/kg más NaOH 3,4 mmol/kg, lo que resulta en un pH de aproximadamente 3,5). La etapa de elución también puede realizarse mediante un tampón con alto contenido de sal.

En una modalidad de la invención típica, una columna empaquetada con una resina se carga con caldo de cultivo clarificado que contiene la proteína diana; la columna se carga típicamente con aproximadamente 10-40 g de proteína/L de resina, tal como 20-40 g de proteína/L de resina, y la columna se lava con un solvente acuoso que contiene aproximadamente 20-40 mmol/kg de caprilato de sodio, de 2 a 25 °C, a un pH entre aproximadamente 5 y 6 durante aproximadamente 30 minutos después de que el pH se haya estabilizado. Opcionalmente, la columna se lava además con diferentes solventes para eliminar las impurezas antes de que la proteína se eluya con un solvente que contenga ácido fórmico.

La invención se dirige además a una proteína, en forma sólida o en solución, obtenida mediante el método de la invención. En otra modalidad más, la invención se dirige a una o más composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína, tal como un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de unión a antígeno del mismo obtenida mediante el método de la invención y un portador aceptable.

Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan con fines ilustrativos únicamente, con el fin de facilitar una comprensión más completa de las modalidades representativas contempladas ahora. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de ninguna de las modalidades descritas en la presente memoria descriptiva, incluidas las que pertenecen a los métodos de inactivación de un virus que contiene un recubrimiento lipídico descrito en la presente descripción y productos procesados mediante el uso de estos métodos.

Sin limitación, las siguientes modalidades son modos preferentes de la invención.

En una modalidad, la invención proporciona un método para la purificación de una proteína diana de una muestra que comprende las etapas de

ii. someter la proteína diana unida a una solución de ácido caprílico; en donde la solución de ácido caprílico comprende ácido caprílico libre de 1 a 50 mM; y

iii. eluir la proteína diana,

en donde dicha purificación de una proteína diana comprende la inactivación del virus en dicha muestra mediante dicho tratamiento con ácido caprílico,

en donde el pH de la solución de ácido caprílico está en el intervalo de 2 a 7,

en donde dicha proteína diana es un anticuerpo o un fragmento del mismo, y

en donde dicha fase estacionaria es una columna de cromatografía.

En una de tales modalidades, la presente invención proporciona un método en donde la solución de ácido caprílico comprende una combinación i) una sal de caprilato y ii) un ácido orgánico o inorgánico en proporciones para proporcionar una solución ácida y una concentración de ácido caprílico superior a 1 mM, tal como al menos 2 mM, tal como al menos 2,2 mM, típicamente al menos 2,5 mM, medido en términos de ácido caprílico libre.

En otra de tales modalidades, la invención proporciona un método en donde la solución de ácido caprílico comprende una combinación de i) una sal de caprilato y ii) un ácido inorgánico u orgánico en proporciones para proporcionar una solución de pH menor que 7,0, tal como 6,5 o menos, y en una concentración de ácido caprílico a una concentración de al menos 1 mM, tal como al menos 2 mM, tal como de 2 a 10 mM, medida en términos de. ácido caprílico libre.

En otra de tales modalidades de la presente invención, la proteína es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En otra de tales modalidades, la muestra se selecciona del grupo que consiste en un caldo de fermentación, un cultivo celular, medio de línea celular, fluido de ascitis, medio de cultivo de tejidos, medio de células transgénicas, plasma humano o animal que incluye fracciones de plasma.

En una modalidad, la fase estacionaria se selecciona de una columna de cromatografía de intercambio iónico, una cromatografía de afinidad, una cromatografía de modo mixto, una cromatografía líquida de proteínas rápida y una columna de cromatografía de adsorción en lecho expandido (EBA).

En una de tales modalidades, la solución de ácido caprílico tiene un pH para inactivar el virus y no desnaturalizar la proteína diana.

En una modalidad, la solución de ácido caprílico tiene un pH de 6,1 o menos, tal como 2-6, tal como a un pH de 2<pH< 6, preferentemente 3<pH< 6, con mayor preferencia 4<pH< 6, tal como 4,5<pH< 6, tal como 4,6<pH<6, tal como aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4,8, aproximadamente 4,9, aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,1, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,3, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7, aproximadamente 5,8 y aproximadamente 5,9, tal como 4,9<pH<6.

En una modalidad, la solución de ácido caprílico es un tampón de ácido caprílico a una concentración de 1 a 20 mm, tal como de 2 a 20 mm o de 1 a 10 mm, con mayor preferencia de 2 a 10 mm tal como de 2 a 8 mm, tal como de 2 a 6 mm, medido en términos de ácido caprílico libre.

En una modalidad, la muestra comprende virus envueltos, virus no envueltos o tanto virus envueltos como no envueltos.

En una modalidad, el método está automatizado o es parte de un proceso de purificación de proteínas automatizado. En una modalidad, el método inactiva además el micoplasma.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para la purificación de un anticuerpo o un Fab del mismo que comprende las etapas de

i. cargar una muestra que comprende una o más de dichas proteínas en una fase estacionaria para cromatografía de afinidad;

ii. someter a la fase sólida de 2 a 10 mM, tal como de 2 a 8 mM, tal como de 2 a 6 mM, de solución de ácido caprílico, medido en términos de ácido caprílico libre a un pH de 4,9<pH<6,2, para inactivar y eliminar virus;

iii. eluir la proteína diana.

Una ventaja adicional del método de la invención es que proporciona una muestra inactivada de virus, o una muestra libre de virus y además una muestra en donde los micoplasmas están inactivados. Además, el método de la invención proporciona muestras con una cantidad reducida de impurezas tal como la proteína de la célula huésped (HCP).

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Se filtró un medio de línea celular que contenía un fragmento Fab humano recombinante a través de 0,22 pm y luego se enriqueció con el virus eMuLV. El medio enriquecido se aplicó a una columna empaquetada con medio Capto L (GE-Healthcare). Después de la carga, la columna se lavó primero con tampón de equilibrio (fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) y luego con un tampón de ácido caprílico 35 mM a pH 5,5 (ácido caprílico libre 5,8 mM). Después de lavar con el tampón de ácido caprílico durante 30 minutos, el fragmento Fab se eluyó de la columna con ácido fórmico 20 mM a pH 3,5. La temperatura del proceso fue 15-25 oC. El rendimiento del fragmento Fab fue de 97 % y no se detectó el eMuLV en la fracción eluida que contenía el fragmento Fab (Tabla 1).

Tabla 1

Esto muestra que la etapa de cromatografía en una columna con medio Capto L y con lavado con ácido caprílico, limpia completamente el eMuLV enriquecido con un LRV de más de 6,0 log10.

Ejemplo 2

Un medio de línea celular que contiene un anticuerpo humano recombinante (IgG1) se filtró a través de un filtro de 0,22 pm y se enriqueció con el virus eMuLV. El medio enriquecido se cargó en una columna empaquetada con Proteína A (Mab Select SuRe, Ge Healthcare). Después de la carga, la columna se lavó primero con tampón de equilibrio (50 mmol/kg de fosfato, 300 mmol/kg de NaCl, pH 7,0) y luego con un tampón de caprilato 32 mmol/kg, pH 5,8 (2,9 mM de ácido caprílico libre). Se usó una baja concentración de caprilato y un pH alto para mostrar la efectividad de esta etapa en las peores condiciones (baja concentración de ácido caprílico). Después que el pH se estabilizó, el lavado continuó durante 30 min. Después de otros 3 lavados (tampón de equilibrio, 50 mmol/kg de fosfato, 1 mol/kg de NaCl y luego tampón de equilibrio), el mAb se eluyó de la columna con un tampón de formato, pH 3,5. El rendimiento del mAb fue del 100 % y no se detectó el eMuLV en la fracción eluida que contenía el mAb (Tabla 2). La temperatura del proceso fue de 15-25 °C.

Tabla 2

El aclaramiento completo del eMuLV que se vio en el ejemplo 1, también se ve en una columna con medio de Proteína A. Por lo tanto, el aclaramiento de la carga enriquecida no depende del medio de la columna. También, las concentraciones bajas de ácido caprílico libre son efectivas para el aclaramiento completo del eMuLV.

Ejemplo 3

Un medio de línea celular que contiene un anticuerpo humano recombinante (IgG4) se filtró a través de un filtro de 0,22 pm y se enriqueció con el virus eMuLV. El medio enriquecido se cargó en una columna empaquetada con Proteína A (Mab Select SuRe, Ge Healthcare). Después de la carga, la columna se lavó primero con tampón de equilibrio (50 mmol/kg de fosfato, 300 mmol/kg de NaCl, pH 7,0) y luego con un tampón de caprilato 32 mmol/kg, pH 5,8 (2,9 mM de ácido caprílico libre). Después de que el pH se estabilizó, el lavado continuó durante 30 min. Después de otros 3 lavados (tampón de equilibrio, 50 mmol/kg de fosfato, 1 mol/kg de NaCl) y luego tampón de equilibrio), el mAb se eluyó de la columna con un tampón de formato, pH 3,5. El rendimiento del mAb fue de 90 % y no se detectó el eMuLV en la fracción eluida que contenía el mAb (Tabla 3). La temperatura del proceso fue de 15 25 °C.

Tabla 3

Este ejemplo con otro anticuerpo humano como en el ejemplo 2 muestra que el aclaramiento completo del eMuLV es independiente del anticuerpo monoclonal en el medio de la línea celular.

Ejemplo 4

Un medio de línea celular que contiene un anticuerpo humano recombinante (IgG1) se filtró a través de un filtro de 0,22 pm y se enriqueció con el virus eMuLV. El medio enriquecido se cargó en una columna empaquetada con Proteína A (Mab Select SuRe, Ge Healthcare). Después de la carga, la columna se lavó primero con tampón de equilibrio (50 mmol/kg de fosfato, 300 mmol/kg de NaCl, pH 7,0) y luego con un tampón de caprilato 35 mmol/kg, pH 5,7 (3,9 mM de ácido caprílico libre). Después que el pH se estabilizó, el lavado continuó durante 30 min. Después de otros 3 lavados (tampón de equilibrio, 50 mmol/kg de fosfato, 1 mol/kg de NaCl y luego tampón de equilibrio), el mAb se eluyó de la columna con un tampón de formato, pH 3,5.

El rendimiento del mAb fue de 90 % y no se detectó el eMuLV en la fracción eluida que contenía el mAb (Tabla 4). La temperatura del proceso fue de 2-8 °C.

Tabla 4

La baja temperatura usada en este ejemplo, en comparación con la temperatura usada en el ejemplo 3, muestra que se logra un aclaramiento total del eMuLV tanto a temperaturas bajas (2 - 8 oC) y a temperaturas más altas.

Ejemplo 5

170 litros de un medio de línea celular que contiene un anticuerpo humano recombinante (IgG1) se dividió en dos partes iguales en la planta piloto y luego se pasó por separado a través de una columna con Proteína A (Mab Select SuRe, Ge Healthcare) en un sistema de cromatografía automático (piloto ÁKTA, GE Healthcare).

Una parte se cargó en una columna de Proteína A (7,1 litros de Mab Select SuRe, Ge Healthcare), donde después la columna se lavó con 3 tampones (tampón de equilibrio, (50 mmol/kg de fosfato, 1 mol/kg de NaCl) y luego el tampón de equilibrio). El mAb se eluyó de la columna con un tampón de formato, pH 3,5. El eluato se trató manualmente a pH bajo (3,7) durante 60 minutos.

La otra parte se manipuló como en el ejemplo 4 con una etapa de lavado programada con ácido caprílico durante la cromatografía de Proteína A (7,1 litros de Mab Select SuRe, Ge Healthcare) y sin tratamiento del eluato a pH bajo. A continuación, los eluatos se cargaron por separado en una columna de intercambio catiónico (2,2 litros de Poros 50 HS, Life Technologies). Después de lavar las columnas con tampón de equilibrio (tampón de ácido acético 37,4 mM, pH 5), las columnas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 300 mM en tampón de ácido acético, pH 5).

El nivel de HMWP fue aproximadamente de 2 % en ambos eluatos, pero aumentó a 3 % después del tratamiento con pH bajo (ver tabla). Después del intercambio catiónico, el nivel de HMWP fue de aproximadamente 2 % en ambos, la parte que se trató con pH bajo y la parte que se trató con un lavado con ácido caprílico durante la cromatografía de proteína A. El nivel de CHO-HCP fue sólo aproximadamente la mitad del nivel en el eluato de la columna de Proteína A que se lavó con ácido caprílico, en comparación con el nivel en el eluato que se trató con pH bajo (ver tabla). Después del intercambio catiónico, el nivel de CHO-HCP en la parte que se trató con un lavado con ácido caprílico durante la cromatografía de proteína A era todavía la mitad de la cantidad de CHO-HCP en la parte que se trató con el pH bajo.

El proceso con lavado con ácido caprílico durante la cromatografía de proteína A fue aproximadamente 45 minutos más rápido que el proceso con tratamiento de pH bajo del eluato de la proteína A. El rendimiento de anticuerpo monoclonal fue casi el mismo en las dos partes después del intercambio catiónico (Tabla 5).

Tabla 5

El ejemplo muestra que se logra una concentración más baja de CHO-HCP mediante el uso de una etapa de lavado con ácido caprílico durante la cromatografía en una columna con Proteína A. La cantidad más baja de CHO-HCP todavía se observa después de la siguiente etapa de cromatografía (intercambio catiónico). Además, se evita el aumento de HMWP después de la etapa de pH bajo. Se ahorraron 45 minutos en el tiempo del proceso al usar el proceso con un lavado con ácido caprílico en comparación con el proceso con una etapa de pH bajo.

Ejemplo 6

Se investigó la inactivación del MuLV a diferentes concentraciones de caprílico y a diferentes pH (Tabla 6). En el intervalo de pH de 5,0 a 6,0 se logró la inactivación completa del MuLV después de 5 minutos si se elevaban las concentraciones de ácido caprílico mientras se aumentaba el pH, de modo que la concentración de ácido caprílico libre se mantenía al menos alrededor de 4 mM. Los tiempos de reacción se incrementaron a concentraciones de ácido caprílico de aproximadamente 2 mM, con inactivación parcial con estos virus más difíciles después de 30 minutos. Más abajo de 1 mM, no se observó inactivación.

Tabla 6: Título del virus MuLV después de la inactivación con ácido caprílico a diferentes concentraciones y pH

La concentración de ácido caprílico depende del pH, y es solo el ácido caprílico libre el que inactiva los virus envueltos. Por tanto, la eficiencia de ácido caprílico 60 mM se investigó además en el intervalo de pH de 5,9 a 6,3. A lo largo de este intervalo de pH, hubo una inactivación completa de más de 5,4 log 10 de MuLV en 5 minutos (Tabla 7). A pH 6,3, la concentración de ácido caprílico es 2,2 mM, y esta concentración también es efectiva en esta prueba.

Con una concentración total de ácido caprílico a 60 mM, la inactivación del MuLV fue muy efectiva a un pH con un intervalo entre 5,9 a 6,2. Los mejores resultados se obtuvieron cuando el pH se mantuvo a 6,1 o menos con caprílico 60 mM.

Tabla 7: Título de MuLV después de inactivar el MuLV con ácido caprílico 60 mM a diferentes niveles de pH

Para ser efectivo, se muestra que la concentración de ácido caprílico libre debe ser al menos 1 mM, preferentemente al menos aproximadamente 2 mM, tal como aproximadamente 2,2 mM, tal como al menos aproximadamente 2,5 mM o al menos 2,8 mM.

Como reconocerá fácilmente el experto en la técnica, una alta concentración de otras sales, tal como CaCl2 o NaCl, es probable que reduzca la solubilidad de ácido caprílico. Como reconocerá fácilmente el experto en la técnica, deben evitarse concentraciones de sales distintas de caprilato de más de 500 mM, tal como más de 100 mM o más de 50 mM, ya que esto puede afectar la capacidad de ácido caprílico libre para ser generado. Sin embargo, el experto en la técnica reconocerá fácilmente que la concentración de ácido caprílico no debería ser superior a su solubilidad.

Se ha demostrado que un proceso de purificación de proteínas que comprende inactivación viral mediante el uso de ácido caprílico es muy efectivo y rápido en la inactivación de virus envueltos en general, incluido el virus MuLV, a concentraciones de ácido caprílico libre superiores a 1 mM.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la purificación de una proteína diana de una muestra que comprende las etapas de

iii. eluir la proteína diana,

en donde dicha proteína diana es un anticuerpo o un fragmento del mismo, y

en donde dicha fase estacionaria es una columna de cromatografía.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en un caldo de fermentación, un cultivo celular, medio de línea celular, fluido de ascitis, medio de cultivo de tejidos, plasma humano o animal que incluye fracciones de plasma.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la muestra se carga en una columna de cromatografía seleccionada de una columna de cromatografía de intercambio iónico, una cromatografía de afinidad, una cromatografía de modo mixto, una cromatografía líquida de proteínas rápida y una columna de cromatografía de adsorción en lecho expandido (EBA).

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de ácido caprílico tiene un pH de 6,1 o menos, tal como 2-6, tal como a un pH de 2<pH< 6, preferentemente 3<pH< 6, con mayor preferencia 4<pH< 6, tal como 4,5<pH< 6, tal como 4,6 <pH<6, tal como aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4,8, aproximadamente 4,9, aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,1, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,3, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7, aproximadamente 5,8 y aproximadamente 5,9, tal como 4,9<pH<6.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de ácido caprílico es un tampón de ácido caprílico a una concentración de 1 a 20 mM, tal como de 2 a 20 mM o 1 a 10 mM, con mayor preferencia de 2 a 10 mM tal como de 2 a 8 mM, tal como de 2 a 6 mM, medido en términos de ácido caprílico libre.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra comprende virus envueltos, virus no envueltos o tanto virus envueltos como no envueltos.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está automatizado o es parte de un proceso automatizado de purificación de proteínas.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tiempo de reacción de la etapa (ii) es 0,05 minutos a menos de 2 horas.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tiempo de reacción de la etapa (ii) es 0,05 minutos a 50 minutos.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tiempo de reacción de la etapa (ii) es 0,1 minutos a 30 minutos.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tiempo de reacción de la etapa (ii) es 0,25 minutos a 15 minutos.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el tiempo de reacción de la etapa (ii) es 15 minutos a 50 minutos, tal como 15 a 30 minutos.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el isotipo del anticuerpo es IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el isotipo del anticuerpo es IgG2, IgG3 o IgG4.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que inactiva el micoplasma.