BR112020012165A2

BR112020012165A2 - métodos para a remoção aumentada de impurezas durante a cromatografia de proteína a

Info

Publication number: BR112020012165A2
Application number: BR112020012165-7A
Authority: BR
Inventors: Carl A. BEIGIE
Original assignee: Genzyme Corporation
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-11-24
Also published as: TWI815838B; US11236126B2; WO2019126554A1; RU2020123917A3; JP2023145727A; IL275418A; AU2018392697A1; CY1125448T1; KR20200103740A; CN111712510A; JP2021506925A; IL275418B1; IL311002A; CA3086186A1; ZA202003440B; DK3728288T3; HUE057850T2; SG11202005809TA; US20220242902A1; EP3728288A1

Abstract

São proporcionados neste documento métodos relacionados à purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo) por meio de cromatografia de proteína A; métodos relacionados ao uso de uma solução de lavagem compreendendo um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico durante a cromatografia de proteína A; e métodos de ajustar uma coleta usando o benzoato de sódio antes da cromatografia de proteína A.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA A REMOÇÃO AUMENTADA DE IMPUREZAS DURANTE A CROMATOGRAFIA DE PROTEÍNA A".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório U.S. No. de Série 62/609.214, depositado em 21 de dezembro de 2017, e do Pedido Provisório U.S. No. de Série 62/694.387, depositado em 5 de julho de 2018, cujos conteúdos são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se aos métodos de purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo) por meio de cromatografia de proteína A.

ANTECEDENTES

[003] Os anticorpos e as outras proteínas contendo a região Fc (como as imunoadesinas) encontraram amplo uso em aplicações farmacêuticas/terapêuticas. O uso dessas moléculas (por exemplo, em pacientes humanos) requer a purificação cuidadosa de quaisquer contaminantes/impurezas que possam surgir durante a produção das proteínas. A purificação de proteínas terapêuticas é frequentemente atingida utilizando uma ou mais etapas de purificação cromatográfica; um tipo particularmente útil de purificação cromatográfica de proteínas que contêm uma região Fc de imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo) é a cromatografia de proteína A. No entanto, foi mostrado que as proteínas da célula hospedeira (HCPs) eluem juntamente com os anticorpos durante a cromatografia de proteínas no modo de captura convencional (incluindo a cromatografia de proteína A), o que pode ser problemática para aplicações a jusante desses anticorpos. Tipicamente, são empregadas uma ou mais etapas de lavagem após a ligação do produto (por exemplo, uma proteína contendo uma região Fc de imunoglobulina) à resina de cromatografia, antes da eluição. Infelizmente, as formulações atuais de lavagem compostas de sal e uma espécie de tamponamento podem não ser suficientes para interromper a interação das HCPs e de outras impurezas com os vários produtos de anticorpos monoclonais (mAb). Por conseguinte, há uma necessidade de métodos de purificação melhorados (por exemplo, a implementação de novas formulações de lavagem) que reduzam a concentração/número de impurezas (por exemplo, HCPs) que purificam juntamente com os anticorpos (por exemplo, durante a cromatografia por afinidade de proteína A).

[004] Todas as referências citadas neste documento, incluindo os pedidos de patentes, as publicações de patentes, a literatura que não seja de patente, e os números de Acesso de UniProtKB/Swiss-Prot são incorporados neste documento por referência em sua totalidade, como se cada referência individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

BREVE SUMÁRIO

[005] Para atender as necessidades acima e outras necessidades, são divulgados neste documento métodos melhorados de purificação de polipeptídeos contendo a região Fc de uma ou mais impurezas. Esses métodos compreendem a colocação em contato de uma matriz de cromatografia de Proteína A com uma amostra (por exemplo, um lisado celular) compreendendo (i) um polipeptídeo compreendendo uma região Fc e (ii) uma ou mais impurezas, e a lavagem da matriz com uma solução de lavagem tendo um pH de cerca de 4,0-10,0 e compreendendo um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico. A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na surpreendente descoberta que o uso de sal de benzoato (por exemplo, benzoato de sódio) e/ou álcool benzílico, em uma solução de lavagem a um pH de cerca de 4,0 a 10,0, durante a cromatografia de proteína A, proporciona uma separação superior de impurezas (por exemplo, impurezas de células hospedeiras) sobre as formulações de lavagem atualmente utilizadas (Ver a FIG. 1, Exemplo 1). A presente invenção também se baseia, pelo menos em parte, na constatação que a inclusão de um ou mais componentes adicionais selecionados a partir de benzenossulfonato (por exemplo, benzenossulfonato de sódio), ácido caprílico, hexileno glicol e/ou arginina, pode melhorar ainda mais a separação das impurezas quando incluídos na solução de lavagem (Ver as FIGS. 2 e 3, Exemplo 1).

[006] Por conseguinte, em um aspecto, é proporcionado neste documento um método de purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, o método compreendendo as etapas de: (a) colocar em contato uma matriz de cromatografia de Proteína A com uma amostra compreendendo (i) o polipeptídeo compreendendo a região Fc e (ii) uma ou mais impurezas, sob uma condição que o polipeptídeo compreendendo a região Fc se ligue à Proteína A; e (b) lavar a matriz com uma solução de lavagem, em que a solução de lavagem compreende um ou ambos de (i) um sal de benzoato em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M e (ii) álcool benzílico em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 4% volume/volume (v/v), e em que a solução de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende: (1) um sal de benzoato; (2) o álcool benzílico; ou (3) um sal benzoato e o álcool benzílico. Em algumas modalidades, o sal de benzoato está em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o sal de benzoato é um sal alcalino de benzoato. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o sal de benzoato é o benzoato de sódio. Em algumas modalidades, o benzoato de sódio está em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,3 M. Em algumas modalidades, o benzoato de sódio está em uma concentração de cerca de 0,3 M. Em algumas modalidades, o benzoato de sódio está em uma concentração de cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o álcool benzílico está em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 4% (v/v). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o álcool benzílico está em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 2% (v/v). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o álcool benzílico está em uma concentração de cerca de 2% (v/v). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o álcool benzílico está em uma concentração de cerca de 4% (v/v).

[007] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, a solução de lavagem compreende adicionalmente um agente de tamponamento. Em algumas modalidades, o agente de tamponamento é selecionado a partir de fosfato, tris, arginina, acetato e citrato. Em algumas modalidades, o agente de tamponamento está em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM ou cerca de 10 mM a cerca de 500 mM. Em algumas modalidades, o agente de tamponamento está em uma concentração de cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o agente de tamponamento está em uma concentração de cerca de 500 mM. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 10,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 9,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 5,0, cerca de 6,0, cerca de 7,0, cerca de 8,0, cerca de 9,0 ou cerca de 10,0.

[008] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, a solução de lavagem compreende adicionalmente o benzenossulfonato de sódio.

Em algumas modalidades, o benzenossulfonato de sódio está em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M.

Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, a solução de lavagem compreende adicionalmente o ácido caprílico.

Em algumas modalidades, o ácido caprílico está em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM.

Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, a solução de lavagem compreende adicionalmente o hexileno glicol.

Em algumas modalidades, o hexileno glicol está em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 10% (v/v). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, a solução de lavagem compreende adicionalmente a creatina.

Em algumas modalidades, a creatina está em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM.

Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, a solução de lavagem compreende adicionalmente a arginina.

Em algumas modalidades, a arginina está em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M.

Em algumas modalidades, a arginina está em uma concentração de cerca de 0,5 M.

Em algumas modalidades, a arginina é a arginina-HCl.

Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreendendo arginina tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 6,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreendendo arginina tem um pH de cerca de 8,0 a cerca de 10,0. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, a solução de lavagem compreende adicionalmente um ou mais sais que não são de tamponamento.

Em algumas modalidades, os um ou mais sais que não são de tamponamento são selecionados a partir de cloreto de sódio, brometo de sódio, cloreto de potássio, brometo de potássio, cloreto de magnésio, brometo de magnésio, cloreto de cálcio, brometo de cálcio e quaisquer combinações deles. Em algumas modalidades, os um ou mais sais que não são de tamponamento são o cloreto de sódio e/ou o cloreto de potássio. Em algumas modalidades, os um ou mais sais que não são de tamponamento estão em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M.

[009] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, a solução de lavagem é uma solução selecionada a partir de: (i) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e bicarbonato de sódio em uma concentração de cerca de 50 mM, tendo um pH de cerca de 10,0; (ii) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2%, arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M e fosfato de sódio em uma concentração de cerca de 50 mM, tendo um pH de cerca de 9,0; (iii) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v), tendo um pH de cerca de 7,0; (iv) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 7,0; (v) uma solução compreendendo hexileno glicol em uma concentração de cerca de 10% (v/v), benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v), tendo um pH de cerca de 7,0; (vi) uma solução compreendendo benzenossulfonato em uma concentração de cerca de 0,5 M, benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v), tendo um pH de cerca de 7,0;

(vii) uma solução compreendendo ácido caprílico em uma concentração de cerca de 50 mM, benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M e cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 7,0; (viii) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 6,0; (ix) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 5,0; (x) uma solução compreendendo álcool benzílico em uma concentração de cerca de 4% (v/v), tendo um pH de cerca de 5,0 a cerca de 10; (xi) uma solução compreendendo álcool benzílico em uma concentração de cerca de 4% (v/v), tendo um pH de cerca de 9,0; e (xii) uma solução compreendendo álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 5,0.

[0010] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o método compreende adicionalmente uma etapa de lavagem da matriz com uma primeira solução, antes de lavar a matriz com a solução de lavagem como descrita acima. Em algumas modalidades, a primeira solução compreende um tampão selecionado a partir de um tampão fosfato, um tampão tris, um tampão acetato, um tampão carbonato, um tampão citrato e quaisquer combinações deles. Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM ou cerca de 10 mM a cerca de 500 mM. Em algumas modalidades, a primeira solução é um tampão fosfato.

[0011] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o método compreende adicionalmente uma etapa de lavar a matriz com uma segunda solução, após lavar a matriz com a solução de lavagem como descrita acima. Em algumas modalidades, a segunda solução compreende um tampão selecionado a partir de um tampão fosfato, um tampão tris, um tampão acetato, um tampão carbonato, um tampão citrato e quaisquer combinações deles. Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM ou cerca de 10 mM a cerca de 500 mM. Em algumas modalidades, a segunda solução tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a segunda solução compreende substancialmente pouco sal ou nenhum sal.

[0012] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o método compreende adicionalmente uma etapa de colocar em contato a matriz de cromatografia de Proteína A com uma solução de eluição, após uma ou mais etapas de lavagem. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de coletar um eluato compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de filtrar o eluato por meio de filtração de profundidade. Em algumas modalidades, o eluato compreende menos que cerca de 500 partes por milhão (ppm) das uma ou mais impurezas.

[0013] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, a aplicação dos métodos descritos neste documento resulta no polipeptídeo compreendendo a região Fc sendo purificado das uma ou mais impurezas até um grau maior do que um método correspondente, sem a etapa de lavar a matriz com a solução de lavagem. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, as uma ou mais impurezas são proteínas da célula hospedeira (HCPs). Em algumas modalidades, as uma ou mais HCPs são selecionadas a partir de fosfolipases (por exemplo, Fosfolipase B-like 2 Putativa), clusterina, serina proteases, fatores de alongamento e quaisquer combinações deles. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de mamífero. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de ovário de hamster chinês (CHO).

[0014] Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc humana. Em algumas modalidades, a região Fc humana compreende uma região Fc humana de IgG1, IgG2 ou IgG4. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de camundongo. Em algumas modalidades, a região Fc de camundongo compreende uma região Fc de camundongo de IgG1, IgG2 ou IgG3. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o polipeptídeo compreendendo a região Fc é um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico ou um anticorpo triespecífico.

[0015] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos acima descritos compreende adicionalmente, antes de colocar em contato a matriz de cromatografia de Proteína A com uma amostra compreendendo (i) o polipeptídeo compreendendo a região Fc e (ii) uma ou mais impurezas, ajustar uma coleta compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc, para atingir uma concentração final de um sal de benzoato de entre cerca de 0,1 M e cerca de 0,5 M e um pH entre cerca de 7,0 e cerca de 9,0, por exemplo, para produzir a amostra compreendendo (i) o polipeptídeo compreendendo a região Fc e (ii) uma ou mais impurezas. Em algumas modalidades, o sal de benzoato é um sal alcalino de benzoato. Em algumas modalidades, o sal de benzoato é o benzoato de sódio. Em algumas modalidades, a concentração final do sal de benzoato na coleta é entre cerca de 0,4 M e cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, o pH da coleta após o ajuste é entre cerca de 7,0 e cerca de 8,0. Em algumas modalidades, o pH da coleta após o ajuste é entre cerca de 8,0 e cerca de 9,0. Em algumas modalidades, a coleta é gerada a partir de uma cultura compreendendo uma célula hospedeira manipulada para expressar o polipeptídeo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira eucariótica é uma célula do Ovário de Hamster Chinês (CHO). Em algumas modalidades, a coleta é purificada antes do ajuste. Em algumas modalidades, a coleta é purificada após o ajuste.

[0016] Em um aspecto relacionado, é proporcionado um método de purificar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, o método compreendendo as etapas de: (A) ajustar uma coleta compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc para atingir uma concentração final de um sal de benzoato de cerca de 0,1 M e cerca de 0,5 M e um pH entre cerca de 7,0 e cerca de 9,0, por exemplo, para produzir uma amostra compreendendo (i) o polipeptídeo compreendendo a região Fc e (ii) uma ou mais impurezas; e (B) colocar em contato a amostra com pelo menos uma matriz de cromatografia. Em algumas modalidades, a pelo menos uma matriz de cromatografia compreende uma matriz de cromatografia por afinidade. Em algumas modalidades, a matriz de cromatografia por afinidade é uma matriz de cromatografia de Proteína A ou uma matriz de cromatografia de Proteína G. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de colocar em contato a pelo menos uma matriz de cromatografia com pelo menos uma solução de lavagem. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de colocar em contato a pelo menos uma matriz de cromatografia com uma solução de eluição. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de coletar um eluato compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de filtrar o eluato por meio de filtração de profundidade. Em algumas modalidades, o eluato compreende menos que cerca de 500 partes por milhão (ppm) das uma ou mais impurezas.

[0017] Em algumas modalidades, o sal de benzoato é um sal alcalino de benzoato. Em algumas modalidades, o sal de benzoato é o benzoato de sódio. Em algumas modalidades, a concentração final do sal de benzoato na coleta é entre cerca de 0,4 M e cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, o pH da coleta após o ajuste é entre cerca de 7,0 e cerca de 8,0. Em algumas modalidades, o pH da coleta após o ajuste é entre cerca de 8,0 e cerca de 9,0. Em algumas modalidades, a coleta é gerada a partir de uma cultura compreendendo uma célula hospedeira manipulada para expressar o polipeptídeo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira eucariótica é uma célula do Ovário de Hamster Chinês (CHO). Em algumas modalidades, a coleta é purificada antes do ajuste. Em algumas modalidades, a coleta é purificada após o ajuste. Em algumas modalidades, o método resulta no polipeptídeo compreendendo a região Fc sendo purificado das uma ou mais impurezas até um grau maior do que um método correspondente, sem a etapa de ajustar a coleta compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc, para produzir a amostra. Em algumas modalidades, as uma ou mais impurezas são proteínas da célula hospedeira (HCPs). Em algumas modalidades, as uma ou mais HCPs são selecionadas a partir do grupo que consiste em fosfolipases, clusterina, serina proteases, fatores de alongamento e quaisquer combinações deles. Em algumas modalidades, a HCP é a Fosfolipase B-like 2 (PLBL2) Putativa. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc humana. Em algumas modalidades, a região Fc humana compreende uma região Fc humana de IgG1, IgG2 ou IgG4. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de camundongo. Em algumas modalidades, a região Fc de camundongo compreende uma região Fc de camundongo de IgG1, IgG2 ou IgG3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo a região Fc é um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico ou um anticorpo triespecífico.

[0018] Deve ser entendido que uma, algumas ou todas as propriedades das várias modalidades descritas acima e neste documento podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção. Estes e outros aspectos da presente invenção tornar-se-ão evidentes para um especialista na técnica. Estas e outras modalidades da presente invenção são ainda descritas pela descrição detalhada que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] A FIG. 1 mostra a concentração das impurezas de proteínas da célula hospedeira (HCP) do ovário de hamster chinês (CHO) nas amostras de anticorpos eluídas das colunas de proteína A, após serem lavadas com as soluções de lavagem de controle ou de teste indicadas.

[0020] As FIGS. 2A-B mostram as concentrações de uma HCP específica (HCP-A) nas amostras de anticorpos eluídas das colunas de proteína A. A FIG. 2A mostra a concentração de HCP-A nas amostras de anticorpos eluídas das colunas de proteína A, após serem lavadas com álcool benzílico a 2% ± benzoato de sódio 0,5 M e/ou arginina 0,5 M, em comparação com uma lavagem de controle, conforme avaliada por ELISA. A FIG. 2B mostra a concentração de HCP-A nas amostras de anticorpos eluídas das colunas de proteína A, após serem lavadas com várias soluções de lavagem em pH de 9,0 ou 10,0, em comparação com uma lavagem de controle, como avaliada por ELISA.

[0021] A FIG. 3 mostra a concentração de HCP-A nas amostras de anticorpos eluídas das colunas de proteína A, após serem lavadas com as soluções de lavagem indicadas contendo compostos de teste adicionais, conforme avaliada por ELISA.

[0022] As FIGS. 4A-B mostram as concentrações de HCP e PLBL2 genéricas nas amostras de anticorpos eluídas das colunas de proteína A. A FIG. 4A mostra a concentração da HCP genérica nas amostras de anticorpos eluídas das colunas de proteína A, após serem lavadas com Arginina 0,5 M, Benzoato de Sódio 0,5 M ou Álcool Benzílico a 4%, em comparação com uma lavagem de controle de processo, conforme avaliada por ELISA. A FIG. 4B mostra a concentração de PLBL2 genérica nas amostras de anticorpos eluídas das colunas de proteína A, após serem lavadas com Arginina 0,5 M, Benzoato de Sódio 0,5 M ou Álcool Benzílico a 4%, em comparação com uma lavagem de controle de processo, conforme avaliada por ELISA.

[0023] A FIG. 5 mostra a melhoria na clareza visual das amostras de anticorpos eluídas das colunas de proteína A, lavadas com uma lavagem intermediária compreendendo Álcool Benzílico a 2% e Benzoato de Sódio 0,5 M.

[0024] As FIGS. 6A-B mostram a diminuição no rendimento fora da coluna e a remoção de PLBL2 ao carregar as colunas de proteína A além de 40 g/L. A FIG. 6A mostra que a porcentagem no rendimento fora da coluna diminui linearmente de 93,1% para 78,1% à medida que a densidade de carga das colunas de proteína A aumenta de 40 g/L para 60 g/L. A FIG. 6B mostra que o nível da PLBL2 removida da coluna de proteína A por lavagem diminui de 32,1 ppm para 17 ppm à medida que a densidade de carga das colunas de proteína A aumenta de 40 g/L para

60 g/L.

[0025] A FIG. 7 mostra que o ajuste da coleta para benzoato de sódio 0,5 M e pH 7,2 ou o ajuste da coleta para benzoato de sódio 0,5 M e pH 9, antes da purificação por proteína A, levou a uma remoção melhorada das impurezas de PLBL2 e HCP. O ajuste da coleta para benzoato de sódio 0,5 M em pH 9,0 mostrou o menor nível de impurezas de PLBL2 e HCP e demonstrou um log maior de separação de PLBL2 em relação apenas ao ajuste do pH.

[0026] A FIG. 8 mostra que a relação entre o teor de PLBL2 e a concentração de benzoato de sódio é aproximadamente sigmoide. Foram observados ganhos diminuídos na separação de PLBL2 para concentrações de benzoato de sódio acima de 0,4 M.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0027] São descritos neste documento métodos de reduzir o número de impurezas (por exemplo, impurezas de proteínas da célula hospedeira) purificadas juntas durante um isolamento à base de proteína A de proteínas contendo a região Fc. Os métodos da presente invenção aplicam uma etapa de lavagem intermediária, usando uma nova solução de lavagem contendo um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico que mostrou reduzir significativamente os níveis de impurezas de proteínas da célula hospedeira nos eluatos coletados durante a cromatografia por afinidade de proteína A (Ver os Exemplos 1 e 2). A inclusão de um ou mais aditivos (por exemplo, benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, creatina e/ou arginina) nesta nova solução de lavagem melhora ainda mais a separação das impurezas de um eluato de proteína que contém uma proteína contendo a região Fc, após a captura e a eluição a partir de uma matriz de proteína A. I. Definições

[0028] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve ser entendido que essa presente invenção não está limitada a composições ou sistemas biológicos particulares, os quais podem, obviamente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas as modalidades particulares, e não se destina a ser limitativa.

[0029] Conforme usadas neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem os referentes plurais, a menos que o conteúdo indique claramente de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a "uma molécula" inclui opcionalmente uma combinação de duas ou mais dessas moléculas, e similares.

[0030] O termo "cerca de", conforme usado neste documento, refere-se à faixa de erros usual para o respectivo valor, prontamente conhecida pelo especialista neste campo técnico. A referência neste documento a "cerca de" um valor ou parâmetro inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas para esse valor ou parâmetro per se.

[0031] Entende-se que os aspectos e as modalidades da presente invenção, descritos neste documento, incluem "compreendendo", "consistindo nos" e "consistindo essencialmente nos" aspectos e modalidades.

[0032] O termo "e/ou", conforme utilizada neste documento uma frase como "A e/ou B", se destina a incluir tanto A quanto B; A ou B; A (sozinho); e B (sozinho). Da mesma forma, o termo "e/ou", conforme utilizada neste documento uma frase como "A, B e/ou C", se destina a abranger cada uma das seguintes modalidades: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).

[0033] O termo "polipeptídeo" ou "proteína" é utilizado neste documento de forma intercambiável para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por compostos que não sejam aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que tenha sido modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como a conjugação com um componente de marcação ou uma toxina. Também estão incluídos na definição, por exemplo, os polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, os aminoácidos não naturais etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.

[0034] O termo "anticorpo" é usado neste documento no sentido mais amplo e inclui especificamente os anticorpos monoclonais (incluindo os anticorpos monoclonais de tamanho natural), os anticorpos policlonais, os anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, anticorpos triespecíficos etc.), os fragmentos de anticorpos ou os polipeptídeos sintéticos carregando uma ou mais CDR ou sequências derivadas de CDR, desde que os polipeptídeos exibam a atividade desejada. Os anticorpos (Abs) e as imunoglobulinas (Igs) são glicoproteínas tendo as mesmas características estruturais. Em geral, os anticorpos são considerados Igs com uma especificidade definida ou reconhecida. Assim, enquanto os anticorpos exibem especificidade de ligação para um alvo específico, as imunoglobulinas incluem tanto os anticorpos quanto outras moléculas semelhantes a anticorpos que não possuem especificidade para um alvo. Os anticorpos da presente invenção podem ser de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA etc.) ou subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG2a, gG3, IgG4, IgA1, IgA2 etc.). O "tipo" e a "classe" e o "subtipo" e a "subclasse" são usados neste documento de forma intercambiável. Os anticorpos e as imunoglobulinas nativos ou do tipo selvagem (obtidos de um membro de uma população não manipulado artificialmente) são normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 Daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia pesada tem, em uma extremidade, um domínio variável (VH) seguido por diversos domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (VL) em uma extremidade e um domínio constante na outra extremidade. Os anticorpos descritos neste documento podem ser anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos de animais não humanos (por exemplo, camundongo, rato, hamster, coelho, camelídeo etc.) ou anticorpos quiméricos.

[0035] O termo "variável", no contexto de um domínio variável de anticorpos, pode se referir a certas partes da molécula pertinente que diferem extensivamente na sequência entre os anticorpos e são usadas no reconhecimento e na ligação específicos ou em um anticorpo específico para o seu alvo particular. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente através dos domínios variáveis dos anticorpos. A variabilidade está concentrada em três segmentos chamados regiões determinantes de complementaridade (CDRs), também conhecidos como regiões hipervariáveis, nos domínios variáveis tanto da cadeia leve quanto da cadeia pesada. As partes mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas regiões ou sequências de estrutura (FR). Cada domínio variável das cadeias pesada e leve nativas compreende quatro regiões FR, adotando amplamente uma configuração de folha β, unidas por três CDRs, que formam loops unindo a, e, em alguns casos, formando parte da, estrutura de folha β. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas, frequentemente em proximidade, pelas regiões FR e, com a CDR2 da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao alvo (epítopo ou determinante) dos anticorpos (Ver Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Nation Institute of Health,

Bethesda, MD (1987)). Como utilizada neste documento, a numeração dos resíduos de aminoácidos da imunoglobulina é feita de acordo com o sistema de numeração de resíduos de aminoácidos da imunoglobulina de Kabat et al., a menos que indicado de outra forma. Uma CDR pode ter a capacidade de se ligar especificamente ao epítopo cognato.

[0036] O termo "articulação" ou "região de articulação", conforme usado neste documento, pode se referir ao polipeptídeo flexível compreendendo o aminoácido entre o primeiro e o segundo domínios constantes de um anticorpo.

[0037] O termo "anticorpos biespecíficos" pode se referir às moléculas que combinam os sítios de ligação ao antígeno de dois anticorpos, dentro de uma única molécula. Assim, um anticorpo biespecífico é capaz de ligar dois antígenos diferentes simultaneamente.

[0038] O termo "anticorpo monoclonal", usado neste documento, pode se referir a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais, neste documento, incluem especificamente os anticorpos "quiméricos", nos quais uma parte das cadeias pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, com o restante da(s) cadeia(s) idêntico com as, ou homólogo às, sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como os fragmentos de tais anticorpos, desde que mantenham a atividade desejada.

[0039] O termo "anticorpo multivalente" ou "anticorpo polivalente",

conforme usado neste documento, pode se referir a um anticorpo compreendendo dois ou mais sítios de ligação ao antígeno, podendo assim ligar dois ou mais antígenos, que podem ter uma estrutura igual ou diferente, simultaneamente. O termo "bivalente" significa que o anticorpo compreende dois sítios de ligação ao antígeno. O termo "tetravalente" significa que o anticorpo compreende quatro sítios de ligação ao antígeno.

[0040] O termo "sítio de ligação ao antígeno", conforme usado neste documento, pode se referir à parte do anticorpo que compreende a área que se liga especificamente, e é complementar, a uma parte ou à totalidade de um antígeno. Quando um antígeno for grande, um anticorpo pode se ligar apenas a uma parte particular do antígeno, parte esta que é denominada epítopo. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser proporcionado por um ou mais domínios variáveis do anticorpo e pode ser feito da associação de um domínio variável da cadeia leve (VL) do anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo.

[0041] As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, de rato) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos que contêm sequências derivadas de imunoglobulina não humana, em comparação com um anticorpo humano. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos, tipicamente dois, os domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de molde de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma parte de uma região constante da imunoglobulina, tipicamente a do molde de imunoglobulina humana escolhido. Em geral, o objetivo é ter uma molécula de anticorpo que seja minimamente imunogênica em um ser humano. Assim, é possível que um ou mais aminoácidos em uma ou mais CDRs também possam ser alterados para um que seja menos imunogênico para um hospedeiro humano, sem minimizar substancialmente a função de ligação específica das uma ou mais CDRs ao alvo. Alternativamente, a FR pode ser não humana, mas os aminoácidos mais imunogênicos são substituídos pelos menos imunogênicos. No entanto, o enxerto da CDR (como descrito acima) não é a única maneira de obter um anticorpo humanizado. Por exemplo, modificar apenas as regiões CDR pode ser insuficiente, pois não é incomum que os resíduos da estrutura tenham um papel na determinação da estrutura tridimensional dos loops de CDR e da afinidade geral do anticorpo pelo seu ligante. Portanto, qualquer meio pode ser praticado de modo que a molécula de anticorpo de origem não humana seja modificada para uma que seja menos imunogênica para um humano, e a identidade global da sequência com um anticorpo humano não seja sempre uma necessidade.

[0042] O termo "impureza" pode se referir a qualquer molécula estranha ou indesejável que esteja presente em uma solução (como uma amostra compreendendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc). Uma impureza pode ser uma (molécula) biológica (por exemplo, uma macromolécula), como o DNA, o RNA, ou uma proteína que também esteja presente em uma amostra que contém uma proteína de interesse. As impurezas podem incluir variantes indesejáveis de proteínas (por exemplo, proteínas agregadas, proteínas dobradas erroneamente, proteínas ligadas incompletamente ao dissulfeto, fragmentos etc.), outras proteínas das células hospedeiras, componentes do meio de cultura celular, moléculas que são parte de um absorvente usado para a cromatografia por afinidade (por exemplo, a proteína A), endotoxinas, ácidos nucleicos, vírus etc. II. Métodos de Isolamento e/ou Purificação dos Polipeptídeos

Contendo a Região FC Visão geral

[0043] Certos aspectos da presente invenção referem-se a um método de purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo) por meio de cromatografia de proteína A. Em algumas modalidades, o método compreende as etapas de: colocar em contato uma matriz ou resina de cromatografia de proteína A com uma amostra compreendendo (1) um polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo) e (2) uma ou mais impurezas (por exemplo, impurezas de células hospedeiras), sob uma condição que o polipeptídeo compreendendo a região Fc (por exemplo, o anticorpo) se ligue à proteína A; e lavar a matriz com uma solução de lavagem compreendendo um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o sal de benzoato em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 4% volume/volume (v/v). Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um ou mais aditivos (por exemplo, um ou mais de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento (como o cloreto de sódio), creatina e/ou arginina). Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende adicionalmente um agente de tamponamento. Em algumas modalidades, uma coleta que compreende o polipeptídeo compreendendo uma região Fc é ajustada para atingir uma concentração final de um sal de benzoato de entre cerca de 0,1 M e 0,5 M e um pH entre cerca de 7 e cerca de 9, para produzir a amostra compreendendo (1) um polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo) e (2) uma ou mais impurezas (por exemplo,

impurezas de células hospedeiras). Colocação em contato de uma amostra com uma matriz ou resina de proteína A

[0044] Certos aspectos da presente invenção referem-se aos métodos de purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo) por meio de cromatografia de proteína A. Em algumas modalidades, o método compreende uma etapa de: colocar em contato uma matriz ou resina de cromatografia de proteína A com uma amostra compreendendo (1) um polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo) e (2) uma ou mais impurezas (por exemplo, impurezas de células hospedeiras), sob uma condição que o polipeptídeo compreendendo a região Fc (por exemplo, o anticorpo) se ligue à proteína A.

[0045] Em algumas modalidades, a presente invenção se refere aos métodos de purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão etc.) a partir de uma amostra (por exemplo, uma amostra de lisado celular, uma amostra de sobrenadante da cultura de células etc.). Em algumas modalidades, a amostra é um sobrenadante da cultura de células (por exemplo, um sobrenadante de células, como as células CHO, manipulado para produzir e secretar o polipeptídeo) ou é derivada de um sobrenadante da cultura de células (por exemplo, uma amostra de sobrenadante da cultura de células parcialmente purificado). Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo uma região Fc é um polipeptídeo secretado. Em algumas modalidades, a região Fc é a região C terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina e pode incluir regiões Fc da sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada da imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida para se estender a partir de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou a partir da Pro230, até a sua extremidade de carboxila (a numeração dos resíduos na região Fc é a do índice da EU, como em Kabat). A região Fc de uma imunoglobulina em geral compreende dois domínios constantes, CH2 e CH3, e opcionalmente compreende um domínio CH4. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc obtida a partir de qualquer imunoglobulina adequada, como os subtipos IgG1 lgG2, lgG3 ou lgG4, a IgA, a IgE, a IgD ou a IgM. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma região Fc tendo a sequência de aminoácidos de uma região Fc humana, uma região Fc de animal não humano (por exemplo, um camundongo, rato, coelho, hamster etc.) ou quaisquer combinações delas. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de camundongo. Em algumas modalidades, a região Fc de camundongo compreende uma região Fc de camundongo de IgG1, IgG2 ou IgG3. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc humana. Em algumas modalidades, a região Fc humana compreende uma região Fc humana de IgG1, IgG2 e/ou IgG4.

[0046] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo uma região Fc é um anticorpo. Em algumas modalidades, "anticorpo" é usado neste documento no sentido mais amplo e abrange especificamente os anticorpos monoclonais (incluindo os anticorpos monoclonais de tamanho natural), os anticorpos policlonais, os anticorpos multivalentes (por exemplo, bivalentes, trivalentes, tetravalentes etc.) e os anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos, triespecíficos etc.). Os anticorpos podem ser de qualquer origem, incluindo, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, roedores (por exemplo, camundongo, rato, hamster etc.), coelhos, camelídeos, tubarões, e/ou produzidos de forma recombinante. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado e/ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e/ou multivalente. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico ou um anticorpo triespecífico.

[0047] Em algumas modalidades, a amostra (por exemplo, uma amostra de lisado celular, uma amostra de sobrenadante da cultura de células etc.) compreendendo o polipeptídeo compreendendo uma região Fc compreende adicionalmente uma ou mais impurezas. Em algumas modalidades, as uma ou mais impurezas estão presentes na amostra devido ao processo empregado para produzir o polipeptídeo compreendendo a região Fc (por exemplo, o processo de produção de um anticorpo secretado). Em algumas modalidades, as uma ou mais impurezas são uma ou mais impurezas derivadas de uma célula hospedeira (por exemplo, uma ou mais proteínas de uma célula hospedeira, um ou mais ácidos nucleicos de uma célula hospedeira, um ou mais lipídios de uma célula hospedeira etc.). A célula hospedeira pode ser qualquer célula hospedeira conhecida na técnica, adequada para a produção de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, incluindo, por exemplo, as células procarióticas (como as células de E. coli, as células de A. niger etc.), as células eucarióticas (como as células de levedura, as células vegetais, as células de inseto (por exemplo, as células S1) e/ou as células de mamíferos (camundongo, rato, hamster, coelho, ser humano, primata não humano etc.) (por exemplo, os hibridomas, as células CHO, as células 293T, as células PER.C6, as células NS0 etc.). Em algumas modalidades, as uma ou mais impurezas são uma ou mais proteínas da célula hospedeira (HCPs). Em algumas modalidades, uma HCP refere-se a uma proteína que não é o produto, produzida por uma célula hospedeira durante a cultura ou a fermentação celular. Em algumas modalidades, as uma ou mais impurezas são uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais etc.) proteínas da célula hospedeira (HCPs) selecionadas a partir de fosfolipases, clusterina, serina proteases, fatores de alongamento e/ou quaisquer combinações deles. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula CHO. Em algumas modalidades, as uma ou mais impurezas são uma ou mais HCPs das células CHO. Em algumas modalidades, as uma ou mais HCPs das células CHO são um ou mais de fosfolipases, clusterina, serina proteases, fatores de alongamento e/ou quaisquer combinações deles.

[0048] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se aos métodos de purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc de uma ou mais impurezas, em uma amostra, por meio de cromatografia de proteína A. Em algumas modalidades, a amostra é colocada em contato com uma matriz ou resina de proteína A. Em algumas modalidades, a amostra é colocada em contato com a matriz ou a resina de proteína A sob condições adequadas para o polipeptídeo compreendendo a região Fc, na amostra, se ligar à proteína A. Os métodos e as condições adequadas para a colocação em contato e a ligação de um polipeptídeo contendo a região Fc a uma matriz ou resina de proteína A são prontamente entendidos por um especialista na técnica (por exemplo, os métodos como descritos no protocolo do fabricante de uma matriz ou resina de proteína A comercialmente disponível). Qualquer matriz ou resina de proteína A adequada conhecida na técnica pode ser utilizada nos métodos da presente invenção, incluindo, por exemplo: MabSelect, MabSelect Xtra, MabSelect Sure, MabSelect Sure LX Protein A, MabSelect pcc, MabSelect PrismA, rProtein A Sepharose CL-4B e nProtein A Sepharose 4 FF (GE Healthcare); EshmunoA, ProSep A, ProSep-vA High Capacity, ProSep-vA Ultra e ProSep-vA UltraPlus (Millipore); Poros A e Mabcapture A (Poros); IPA-300, IPA-400 e IPA-500 (RepliGen Corp.); Affigel protein A e Affiprep protein A (Bio-Rad); MABsorbent

A1PP e MABsorbent A2P (Affinity Chromatography Ltd.); Protein A Ceramic Hyper D F (Pall Corp.); Ultralink Immobilized protein A e Agarose Protein A (PIERCE); Protein A Cellthru 300 e Protein A Ultraflow (Bioseparation); Amsphere A3 (JSR); e/ou Toyopearl AF- rProtein A HC-650F (Tosoh Biosciences). Em algumas modalidades, a matriz ou a resina de proteína A é usada em um formato de cromatografia em coluna. Em algumas modalidades, um ou mais parâmetros da matriz ou da resina de proteína A (como o pH, a força iônica, a temperatura, a adição de outras substâncias) são ajustados antes do contato da matriz ou da resina de proteína A com uma amostra. Em algumas modalidades, a matriz ou a resina de proteína A é enxaguada, lavada, equilibrada, removida e/ou sanitizada antes e/ou depois da colocação em contato da matriz ou da resina de proteína A com a amostra. Em algumas modalidades, a matriz ou a resina de proteína A é equilibrada e/ou lavada antes de colocar em contato a matriz ou a resina de proteína A com a amostra. Quaisquer equilíbrio e/ou tampão de lavagem adequados, conhecidos na técnica, podem ser usados. Em algumas modalidades, a matriz ou a resina de proteína A é sanitizada, removida e/ou regenerada entre os usos. Lavagem da matriz ou da resina de proteína A com uma solução de lavagem

[0049] Certos aspectos da presente invenção referem-se aos métodos de purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc por meio de cromatografia de proteína A por lavagem de uma matriz ou resina de proteína A ligada ao polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo) com uma solução de lavagem compreendendo um sal benzoato e/ou álcool benzílico. Em algumas modalidades, o método compreende uma etapa de: colocar em contato uma matriz ou resina de cromatografia de proteína A com uma amostra compreendendo (1) um polipeptídeo compreendendo uma região Fc

(por exemplo, um anticorpo) e (2) uma ou mais impurezas (por exemplo, impurezas de células hospedeiras), sob uma condição que o polipeptídeo compreendendo a região Fc (por exemplo, o anticorpo) se ligue à proteína A; e lavar a matriz ou a resina com uma solução de lavagem compreendendo um sal de benzoato em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M e/ou o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 4% volume/volume (v/v), onde a solução de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o álcool benzílico. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e o álcool benzílico.

[0050] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma solução de lavagem compreendendo um sal de benzoato e/ou o ácido benzóico (por exemplo, pH ajustado). Qualquer fonte ou forma adequada de um sal de benzoato (por exemplo, um sal alcalino) e/ou de ácido benzóico conhecido na técnica pode ser usada nas soluções de lavagem da presente invenção, incluindo, por exemplo, o benzoato de sódio, o benzoato de potássio, o benzoato de lítio, o benzoato de cálcio, o benzoato de magnésio, o benzoato de berílio, o benzoato de bário, o benzoato de estrôncio, o benzoato de rubídio, o benzoato de césio e/ou quaisquer combinações deles. Em algumas modalidades, o sal de benzoato é um sal alcalino de benzoato. Em algumas modalidades, o sal de benzoato é o benzoato de sódio ou o benzoato de potássio. Em algumas modalidades, o sal de benzoato é o benzoato de sódio.

[0051] Em algumas modalidades, o sal de benzoato (por exemplo, benzoato de sódio) e/ou o ácido benzóico estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M. Por exemplo, o sal de benzoato (por exemplo, benzoato de sódio) e/ou o ácido benzóico podem estar presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,4 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,3 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,2 M, cerca de 0,2 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,4 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,3 M, cerca de 0,3 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,4 M, cerca de 0,4 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,5 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,5 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,5 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,5 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,5 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,6 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,6 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,6 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,6 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,7 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,7 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,7 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,8 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,8 M a cerca de 0,9 M ou cerca de 0,9 M a cerca de 1,0 M. Em algumas modalidades, o sal de benzoato (por exemplo, benzoato de sódio) e/ou o ácido benzóico estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, o sal de benzoato (por exemplo, benzoato de sódio) e/ou o ácido benzóico estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,3 M.

[0052] Em algumas modalidades, o sal de benzoato (por exemplo, benzoato de sódio) e/ou o ácido benzóico estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de quaisquer de cerca de 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,55 M, 0,6 M, 0,65 M, 0,7 M, 0,75 M, 0,8 M, 0,85 M, 0,9 M, 0,95 M ou 1,0 M. Em algumas modalidades, o sal de benzoato (por exemplo, benzoato de sódio) e/ou o ácido benzóico estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, o sal de benzoato (por exemplo, benzoato de sódio) e/ou o ácido benzóico estão presentes na solução de lavagem em um concentração de cerca de 0,1 M ou menos que cerca de 0,1 M, cerca de 0,3 M ou menos que cerca de 0,3 M, cerca de 0,5 M ou menos que cerca de 0,5 M, cerca de 0,75 M ou menos que cerca de 0,75 M, ou cerca de 1,0 M ou menos que cerca de 1,0 M. Em algumas modalidades, o sal de benzoato (por exemplo, benzoato de sódio) e/ou o ácido benzóico estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5 M ou menos que cerca de 0,5 M.

[0053] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma solução de lavagem compreendendo o álcool benzílico. Qualquer fonte ou forma adequada de álcool benzílico conhecida na técnica pode ser usada nas soluções de lavagem da presente invenção.

[0054] Em algumas modalidades, o álcool benzílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 4,0% volume/volume (v/v). Por exemplo, o álcool benzílico pode estar presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 4%, cerca de 1% a cerca de 4%, cerca de 1,5% a cerca de 4%, cerca de 2% a cerca de 4%, cerca de 2,5% a cerca de 4%, cerca de 3% a cerca de 4%, cerca de 3,5% a cerca de 4%, cerca de 0,5% a cerca de 3,5%, cerca de 1% a cerca de 3,5%, cerca de 1,5% a cerca de 3,5%, cerca de 2% a cerca de 3,5%, cerca de 2,5% a cerca de 3,5%, cerca de 3% a cerca de 3,5%, cerca de 0,5% a cerca de 3%, cerca de 1% a cerca de 3%, cerca de 1,5% a cerca de 3%, cerca de 2% a cerca de 3%, cerca de 2,5% a cerca de 3%, cerca de 0,5% a cerca de 2,5%, cerca de 1% a cerca de 2,5%, cerca de 1,5% a cerca de 2,5%, cerca de 2% a cerca de 2,5%, cerca de 0,5% a cerca de 2%, cerca de 1% a cerca de 2%, cerca de 1,5% a cerca de 2%, cerca de 0,5% a cerca de 1,5%, cerca de 1% a cerca de 1,5% ou cerca de 0,5% a cerca de 1% (v/v). Em algumas modalidades, o álcool benzílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 4% volume/volume (v/v). Em algumas modalidades, o álcool benzílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 2% volume/volume (v/v).

[0055] Em algumas modalidades, o álcool benzílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de quaisquer de cerca de 0,5%, 0,75%, 1%, 1,25%, 1,5%, 1,75%, 2%, 2,25%, 2,5%, 2,75%, 3%, 3,25%, 3,5%, 3,75% ou cerca de 4% (v/v). Em algumas modalidades, o álcool benzílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 2% (v/v). Em algumas modalidades, o álcool benzílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1% ou menos que cerca de 1%, cerca de 2% ou menos que cerca de 2%, cerca de 3% ou menos que cerca de 3% ou cerca de 4% ou menos que cerca de 4%. Em algumas modalidades, o álcool benzílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 4% ou menos que cerca de 4% (v/v). Em algumas modalidades, o álcool benzílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 4% ou menos que cerca de 2% (v/v). Aditivos

[0056] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende adicionalmente um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou todos os cinco) dos seguintes aditivos: benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e/ou creatina em quaisquer ua das concentrações descritas neste documento. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreendendo os um ou mais aditivos tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0. Em algumas modalidades, a inclusão dos um ou mais aditivos na solução de lavagem melhora ainda mais a purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc de uma ou mais impurezas (por exemplo, impurezas de células hospedeiras) pelos métodos descritos neste documento.

[0057] Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico e um de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e/ou creatina, a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0. Por exemplo, a solução de lavagem pode compreender: sal de benzoato e/ou álcool benzílico e benzenossulfonato; sal de benzoato e/ou álcool benzílico e ácido caprílico; sal de benzoato e/ou álcool benzílico e hexileno glicol; sal de benzoato e/ou álcool benzílico e um sal que não é de tamponamento; ou sal de benzoato e/ou álcool benzílico e creatina, a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0.

[0058] Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico e dois de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e/ou creatina, a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0. Por exemplo, a solução de lavagem pode compreender: sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato e ácido caprílico; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato e hexileno glicol; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, ácido caprílico e hexileno glicol; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, ácido caprílico e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, ácido caprílico e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, hexileno glicol e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, hexileno glicol e creatina; ou sal de benzoato e/ou álcool benzílico, um sal que não é de tamponamento e creatina, a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0.

[0059] Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico e três de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e/ou creatina, a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0. Por exemplo, a solução de lavagem pode compreender: sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato, ácido caprílico e hexileno glicol; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato, ácido caprílico e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato, ácido caprílico e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato, hexileno glicol e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato, hexileno glicol e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato, um sal que não é de tamponamento e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, ácido caprílico, hexileno glicol e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, ácido caprílico, hexileno glicol e creatina; ou sal de benzoato e/ou álcool benzílico, ácido caprílico, um sal que não é de tamponamento e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e creatina, a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0.

[0060] Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico e quatro de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e/ou creatina, a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0. Por exemplo, a solução de lavagem pode compreender: sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato, ácido caprílico, um sal que não é de tamponamento e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, benzenossulfonato, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e creatina; ou sal de benzoato e/ou álcool benzílico, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e creatina, a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0.

[0061] Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico e todos os cinco de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e creatina, a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0.

[0062] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma solução de lavagem compreendendo o benzenossulfonato. Qualquer forma ou fonte adequada de benzenossulfonato conhecida na técnica pode ser utilizada nas soluções de lavagem da presente invenção, incluindo, por exemplo, um sal de benzenossulfonato (por exemplo, um sal alcalino), como o benzenossulfonato de sódio ou o benzenossulfonato de potássio, o ácido benzenossulfônico e/ou quaisquer combinações deles. Em algumas modalidades, o benzenossulfonato é o benzenossulfonato de sódio.

[0063] Em algumas modalidades, o benzenossulfonato (por exemplo, benzenossulfonato de sódio) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M. Por exemplo, o benzenossulfonato de sódio pode estar presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,4 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,3 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,2 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,4 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,3 M, cerca de 0,3

M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,4 M ou cerca de 0,4 M a cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, o benzenossulfonato de sódio está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,3 M.

[0064] Em algumas modalidades, o benzenossulfonato de sódio está presente na solução de lavagem em uma concentração de quaisquer de cerca de 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M ou 0,5 M. Em alguns modalidades, o benzenossulfonato de sódio está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, o benzenossulfonato de sódio está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M ou menos que cerca de 0,1 M, cerca de 0,3 M ou menos que cerca de 0,3 M, ou cerca de 0,5 M ou menos que cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, o benzenossulfonato de sódio está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5 M ou menos que cerca de 0,5 M.

[0065] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma solução de lavagem compreendendo o ácido caprílico. Qualquer forma ou fonte adequada de ácido caprílico conhecida na técnica pode ser usada nas soluções de lavagem da presente invenção.

[0066] Em algumas modalidades, o ácido caprílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Por exemplo, o ácido caprílico pode estar presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, cerca de 10 mM a cerca de 50 mM, cerca de 20 mM a cerca de 50 mM, cerca de 30 mM a cerca de 50 mM, cerca de 40 mM a cerca de 50 mM, cerca de 1 mM a cerca de 40 mM, cerca de 10 mM a cerca de 40 mM, cerca de 20 mM a cerca de 40 mM, cerca de 30 mM a cerca de 40 mM, cerca de 1 mM a cerca de 30 mM, cerca de 10 mM a cerca de 30 mM, cerca de 20 mM a cerca de 30 mM, cerca de 1 mM a cerca de 20 mM, cerca de 10 mM a cerca de 20 mM ou cerca de 1 mM a cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, o ácido caprílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM.

[0067] Em algumas modalidades, o ácido caprílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de quaisquer de cerca de 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM ou 50 mM. Em algumas modalidades, o ácido caprílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o ácido caprílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 10 mM ou menos que cerca de 10 mM, cerca de 30 mM ou menos que cerca de 30 mM ou cerca de 50 mM ou menos que cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o ácido caprílico está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 50 mM ou menos que cerca de 50 mM.

[0068] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma solução de lavagem compreendendo o hexileno glicol. Qualquer forma ou fonte adequada de hexileno glicol conhecida na técnica pode ser usada nas soluções de lavagem da presente invenção.

[0069] Em algumas modalidades, o hexileno glicol está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 10% (v/v). Por exemplo, o hexileno pode estar presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 2% a cerca de 10%, cerca de 4% a cerca de 10%, cerca de 6% a cerca de 10%, cerca de 8% a cerca de 10%, cerca de 9% a cerca de 10%, 0,5% a cerca de 9%, cerca de 1% a cerca de 9%, cerca de 2% a cerca de 9%, cerca de 4% a cerca de 9%, cerca de 6% a cerca de 9%, cerca de 8% a cerca de 9%, cerca de 0,5% a cerca de 8%, cerca de 1% a cerca de 8%, cerca de 2% a cerca de 8%, cerca de 4% a cerca de 8%, cerca de 6% a cerca de 8%, cerca de 0,5%

a cerca de 6%, cerca de 1% a cerca de 6%, cerca de 2% a cerca de 6%, cerca de 4% a cerca de 6%, cerca de 0,5% a cerca de 4%, cerca de 1% a cerca de 4%, cerca de 2% a cerca de 4%, cerca de 0,5% a cerca de 2%, cerca de 1% a cerca de 2% ou cerca de 0,5% a cerca de 1% (v/v). Em algumas modalidades, o hexileno glicol está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 10% (v/v).

[0070] Em algumas modalidades, o hexileno glicol está presente na solução de lavagem em uma concentração de quaisquer de cerca de 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5% ou 10% (v/v). Em algumas modalidades, o hexileno glicol está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 10% (v/v). Em algumas modalidades, o hexileno glicol está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1% ou menos que cerca de 1%, cerca de 2% ou menos que cerca de 2%, cerca de 4% ou menos que cerca de 4%, cerca de 6% ou menos que cerca de 6%, cerca de 8% ou menos que cerca de 8%, ou cerca de 10% ou menos que cerca de 10% (v/v). Em algumas modalidades, o hexileno glicol está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 10% ou menos que cerca de 10% (v/v).

[0071] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma solução de lavagem compreendendo um ou mais (por exemplo, um ou, dois ou mais, três ou mais etc.) sais que não são de tamponamento. Qualquer forma ou fonte adequada de um sal que não é de tamponamento conhecido na técnica pode ser utilizada nas soluções de lavagem da presente invenção. Os sais que não são de tamponamento podem incluir os sais de halogênio (como aqueles que compreendem Cl ou Br), em particular os sais de halogênio compreendendo os metais alcalinos (como Na ou K) ou os metais alcalino-terrosos (como Ca ou Mg). Em algumas modalidades, o sal que não é de tamponamento é o cloreto de sódio ou o cloreto de potássio. Em algumas modalidades, o sal que não é de tamponamento é o cloreto de sódio.

[0072] Em algumas modalidades, o sal que não é de tamponamento (por exemplo, cloreto de sódio) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M. Por exemplo, o sal que não é de tamponamento (por exemplo, cloreto de sódio) pode estar presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,4 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,2 M, cerca de 0,2 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,4 M, cerca de 0,4 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,5 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,5 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,5 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,6 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,6 M a cerca de 0,8 M ou cerca de 0,8 M a cerca de 1,0 M. Em algumas modalidades, o sal que não é de tamponamento (por exemplo, cloreto de sódio) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, o sal que não é de tamponamento (por exemplo, cloreto de sódio) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5 M a cerca de 1,0 M.

[0073] Em algumas modalidades, o sal que não é de tamponamento (por exemplo, cloreto de sódio) está presente na solução de lavagem em uma concentração de quaisquer de cerca de 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,55 M, 0,6 M, 0,65 M, 0,7 M, 0,75 M, 0,8 M, 0,85 M, 0,9 M, 0,95 M ou 1,0 M. Em algumas modalidades, o sal que não é de tamponamento (por exemplo, cloreto de sódio) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, o sal que não é de tamponamento (por exemplo, cloreto de sódio) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1,0 M. Em algumas modalidades, o sal que não é de tamponamento (por exemplo, cloreto de sódio) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M ou menos que cerca de 0,1 M, cerca de 0,2 M ou menos que cerca de 0,2 M, cerca de 0,4 M ou menos que cerca de 0,4 M, cerca de 0,5 M ou menos que cerca de 0,5 M, cerca de 0,6 M ou menos que cerca de 0,6 M, cerca de 0,8 M ou menos que cerca de 0,8 M ou cerca de 1,0 M ou menos que cerca de 1,0 M. Em algumas modalidades, o sal que não é de tamponamento (por exemplo, cloreto de sódio) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5 M ou menos que cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, o sal que não é de tamponamento (por exemplo, cloreto de sódio) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1,0 M ou menos que cerca de 1,0 M.

[0074] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma solução de lavagem compreendendo a creatina. Qualquer forma ou fonte adequada de creatina conhecida na técnica pode ser usada nas soluções de lavagem da presente invenção, incluindo, por exemplo, a creatina-HCl, os ésteres de creatina, o piruvato de creatina, o fosfato de creatina, o alfa-cetoglutarato de creatina, o citrato de creatina e/ou quaisquer combinações deles. Em algumas modalidades, a creatina é a creatina-HCl.

[0075] Em algumas modalidades, a creatina está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM. Por exemplo, a creatina pode estar presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM, cerca de 10 mM a cerca de 100 mM, cerca de 25 mM a cerca de 100 mM, cerca de 50 mM a cerca de 100 mM, cerca de 75 mM a cerca de

100 mM, cerca de 1 mM a cerca de 75 mM, cerca de 10 mM a cerca de 75 mM, cerca de 25 mM a cerca de 75 mM, cerca de 50 mM a cerca de 75 mM, cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, cerca de 10 mM a cerca de 50 mM, cerca de 25 mM a cerca de 50 mM, cerca de 1 mM a cerca de 25 mM, cerca de 10 mM a cerca de 25 mM ou cerca de 1 mM a cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, a creatina está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM. Em algumas modalidades, a creatina está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, a creatina está presente na solução de lavagem em uma concentração de quaisquer de cerca de 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM ou 100 mM. Em algumas modalidades, a creatina está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 50 mM. Arginina

[0076] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma solução de lavagem compreendendo ainda a arginina e/ou um derivado de arginina. Em algumas modalidades, a inclusão de arginina e/ou um derivado de arginina na solução de lavagem melhora ainda mais a purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc de uma ou mais impurezas (por exemplo, impurezas de células hospedeiras) pelos métodos descritos neste documento. Qualquer forma ou fonte adequada de arginina e/ou um derivado de arginina conhecido na técnica pode ser utilizada nas soluções de lavagem da presente invenção, incluindo, por exemplo, a arginina, a arginina-HCl, a acetil arginina, a agmatina, o ácido arginico, a N-alfa-butiroil-L-arginina, a N-alfa-pivaloil arginina e/ou quaisquer combinações deles. A arginina e/ou o derivado de arginina podem ser a L-arginina e/ou a D-arginina e os seus derivados. Em algumas modalidades, a arginina e/ou o derivado de arginina é a arginina-HCl.

[0077] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se ao uso de arginina e/ou um derivado de arginina (por exemplo, arginina- HCl) em uma solução de lavagem compreendendo um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e a arginina e/ou um derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl). Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o álcool benzílico e a arginina e/ou um derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl). Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato, o álcool benzílico e a arginina e/ou um derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl). Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende adicionalmente um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou todos os cinco) de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e/ou creatina, em quaisquer das concentrações descritas neste documento. Em algumas modalidades, uma solução de lavagem compreendendo a arginina e/ou um derivado de arginina tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0. Em algumas modalidades, uma solução de lavagem compreendendo a arginina e/ou um derivado de arginina tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 6,0. Em algumas modalidades, uma solução de lavagem compreendendo a arginina e/ou um derivado de arginina tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 5,0. Em algumas modalidades, uma solução de lavagem compreendendo a arginina e/ou um derivado de arginina tem um pH de cerca de 8,0 a cerca de 10,0. Em algumas modalidades, uma solução de lavagem compreendendo a arginina e/ou um derivado de arginina tem um pH de cerca de 8,0 a cerca de 9,0.

[0078] Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico, a arginina e/ou um derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) e um de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e/ou creatina. Por exemplo, a solução de lavagem pode compreender: sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina e benzenossulfonato; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina e ácido caprílico; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina e hexileno glicol; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina e um sal que não é de tamponamento; ou sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina e creatina.

[0079] Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico, a arginina e/ou um derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) e dois de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e/ou creatina. Por exemplo, a solução de lavagem pode compreender: sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato e ácido caprílico; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato e hexileno glicol; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, ácido caprílico e hexileno glicol; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, ácido caprílico e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, ácido caprílico e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, hexileno glicol e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, hexileno glicol e creatina; ou sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, um sal que não é de tamponamento e creatina.

[0080] Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico, a arginina e/ou um derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) e três de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e/ou creatina. Por exemplo, a solução de lavagem pode compreender: sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato, ácido caprílico e hexileno glicol; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato, ácido caprílico e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato, ácido caprílico e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato, hexileno glicol e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato, hexileno glicol e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato, um sal que não é de tamponamento e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, ácido caprílico, hexileno glicol e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, ácido caprílico, hexileno glicol e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, ácido caprílico, um sal que não é de tamponamento e creatina; ou sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e creatina.

[0081] Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico, a arginina e/ou um derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) e quatro de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e/ou creatina. Por exemplo, a solução de lavagem pode compreender: sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol e um sal que não é de tamponamento; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato, ácido caprílico, um sal que não é de tamponamento e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, benzenossulfonato, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e creatina; sal de benzoato e/ou álcool benzílico, arginina, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e creatina.

[0082] Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico, a arginina e/ou um derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) e todos os cinco de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol, um sal que não é de tamponamento e creatina.

[0083] Em algumas modalidades, a arginina e/ou o derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M. Por exemplo, a arginina e/ou o derivado de arginina (por exemplo, arginina- HCl) podem estar presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,4 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,3 M, cerca de 0,1 M a cerca de 0,2 M, cerca de 0,2 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,4 M, cerca de 0,2 M a cerca de 0,3 M, cerca de 0,3 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,3 M a cerca de 0,4 M, cerca de 0,4 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,4 M a cerca de 0,5 M, cerca de 0,5 M a cerca de 1,0 M, cerca de

0,5 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,5 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,5 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,5 M a cerca de 0,6 M, cerca de 0,6 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,6 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,6 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,6 M a cerca de 0,7 M, cerca de 0,7 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,7 M a cerca de 0,9 M, cerca de 0,7 M a cerca de 0,8 M, cerca de 0,8 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,8 M a cerca de 0,9 M ou cerca de 0,9 M a cerca de 1,0 M. Em algumas modalidades, a arginina e/ou o derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, a arginina e/ou o derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,3 M.

[0084] Em algumas modalidades, a arginina e/ou o derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de quaisquer de cerca de 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,55 M, 0,6 M, 0,65 M, 0,7 M, 0,75 M, 0,8 M, 0,85 M, 0,9 M, 0,95 M ou 1,0 M. Em algumas modalidades, a arginina e/ou o derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, a arginina e/ou o derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) estão presentes na solução de lavagem em um concentração de cerca de 0,1 M ou menos que cerca de 0,1 M, cerca de 0,2 M ou menos que cerca de 0,2 M, cerca de 0,3 M ou menos que cerca de 0,3 M, cerca de 0,4 M ou menos que cerca de 0,4 M, cerca de 0,5 M ou menos que cerca de 0,5 M, cerca de 0,75 M ou menos que cerca de 0,75 M, ou cerca de 1,0 M ou menos que cerca de 1,0 M. Em algumas modalidades, a arginina e/ou o derivado de arginina (por exemplo, arginina-HCl) estão presentes na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 0,5 M ou menos que cerca de 0,5 M.

pH

[0085] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma solução de lavagem tendo um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0. Por exemplo, a solução de lavagem pode ter um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0, cerca de 5,0 a cerca de 10,0, cerca de 6,0 a cerca de 10,0, cerca de 6,5 a cerca de 10,0, cerca de 7,0 a cerca de 10,0, cerca de 7,5 a cerca de 10,0, cerca de 8,0 a cerca de 10,0, cerca de 9,0 a cerca de 10,0, 4,0 a cerca de 9,0, cerca de 5,0 a cerca de 9,0, cerca de 6,0 a cerca de 9,0, cerca de 6,5 a cerca de 9,0, cerca de 7,0 a cerca de 9,0, cerca de 7,5 a cerca de 9,0, cerca de 7,0 a cerca de 9,0, 4,0 a cerca de 8,0, cerca de 5,0 a cerca de 8,0, cerca de 6,0 a cerca de 8,0, cerca de 6,5 a cerca de 8,0, cerca de 7,0 a cerca de 8,0, cerca de 7,5 a cerca de 8,0, 4,0 a cerca de 7,5, cerca de 5,0 a cerca de 7,5, cerca de 6,0 a cerca de 7,5, cerca de 6,5 a cerca de 7,5, cerca de 7,0 a cerca de 7,5, cerca de 4,0 a cerca de 7,0, cerca de 5,0 a cerca de 7,0, cerca de 6,0 a cerca de 7,0, cerca de 6,5 a cerca de 7,0, 4,0 a cerca de 6,5, cerca de 5,0 a cerca de 6,5, cerca de 6,0 a cerca de 6,5, 4,0 a cerca de 6,0, cerca de 5,0 a cerca de 6,0 ou cerca de 4,0 a cerca de 5,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 9,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 6,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 5,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 8,0 a cerca de 10,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 8,0 a cerca de 9,0.

[0086] Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de quaisquer de cerca de 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,25, 5,5, 5,75, 6,0, 6,25, 6,5, 6,75, 7,0, 7,25, 7,5, 7,75, 8,0, 8,25, 8,5, 8,75, 9,0, 9,25, 9,5, 9,75 ou 10,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 4,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 5,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 6,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 6,5. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 7,5. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 9,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem tem um pH de cerca de 10,0. Agente de Tamponamento

[0087] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende adicionalmente um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais etc.) agentes de tamponamento. Qualquer agente de tamponamento adequado conhecido na técnica pode ser utilizado nas soluções de lavagem da presente invenção, incluindo, por exemplo, o fosfato, a tris (tris(hidroximetil)metilamina), a bis-tris, o bis-tris propano, a arginina, a histidina, a trietanolamina, a dietanolamina, o formato, o acetato, o carbonato, o MES (ácido 2-(N-mofolino)etanossulfônico), o citrato, o HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinaetanossulfônico), o MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico), o TAPS (ácido 3- {[tris(hidroximetil)metil]amino}propanossulfônico), a Bicina (N,N-bis(2- hidroxietil)glicina), a Tricina (N-tris(hidroximetil)metilglicina), o TES (ácido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino}etanossulfônico), o PIPES (piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanossulfônico), o cacodilato (ácido dimetilarsínico), o SSC (citrato de sódio salino) e/ou quaisquer combinações deles. Em algumas modalidades, o agente de tamponamento é um ou mais de fosfato, tris, arginina, acetato e/ou citrato.

[0088] Em algumas modalidades, o agente de tamponamento (por exemplo, fosfato, tris, arginina, acetato e/ou citrato) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM ou cerca de 1 mM a cerca de 500 mM. Por exemplo, o agente de tamponamento (por exemplo, fosfato, tris, arginina, acetato e/ou citrato) pode estar presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 500 mM, 10 mM a cerca de 500 mM, 50 mM a cerca de 500 mM, 100 mM a cerca de 500 mM, 150 mM a cerca de 500 mM, 200 mM a cerca de 500 mM, 250 mM a cerca de 500 mM, 300 mM a cerca de 500 mM, 350 mM a cerca de 500 mM, 400 mM a cerca de 500 mM, 450 mM a cerca de 500 mM, 1 mM a cerca de 450 mM, 1 mM a cerca de 400 mM, 1 mM a cerca de 350 mM, 1 mM a cerca de 350 mM, 1 mM a cerca de 300 mM, 1 mM a cerca de 250 mM, 1 mM a cerca de 200 mM, 1 mM a cerca de 150 mM, 1 mM a cerca de 100 mM, cerca de 10 mM a cerca de 100 mM, cerca de 25 mM a cerca de 100 mM, cerca de 40 mM a cerca de 100 mM, cerca de 50 mM a cerca de 100 mM, cerca de 60 mM a cerca de 100 mM, cerca de 75 mM a cerca de 100 mM, cerca de 1 mM a cerca de 75 mM, cerca de 10 mM a cerca de 75 mM, cerca de 40 mM a cerca de 75 mM, cerca de 50 mM a cerca de 75 mM, cerca de 60 mM a cerca de 75 mM, cerca de 1 mM a cerca de 60 mM, cerca de 10 mM a cerca de 60 mM, cerca de 25 mM a cerca de 60 mM, cerca de 40 mM a cerca de 60 mM, cerca de 50 mM a cerca de 60 mM, cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, cerca de 10 mM a cerca de 50 mM, cerca de 25 mM a cerca de 50 mM, cerca de 40 mM a cerca de 50 mM, cerca de 1 mM a cerca de 40 mM, cerca de 10 mM a cerca de 40 mM, cerca de 25 mM a cerca de 40 mM, cerca de 1 mM a cerca de 25 mM, cerca de 10 mM a cerca de 25 mM ou cerca de 1 mM a cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, o agente de tamponamento (por exemplo, fosfato, tris, arginina, acetato e/ou citrato) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM ou cerca de 10 mM a cerca de 500 mM.

[0089] Em algumas modalidades, o agente de tamponamento (por exemplo, fosfato, tris, arginina, acetato e/ou citrato) está presente na solução de lavagem em uma concentração de quaisquer de cerca de 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM ou 100 mM. Como alternativa, o agente de tamponamento (por exemplo, fosfato, tris, arginina, acetato e/ou citrato) está presente na solução de lavagem em uma concentração de quaisquer de cerca de 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM ou 500 mM. Em algumas modalidades, o agente de tamponamento (por exemplo, fosfato, tris, arginina, acetato e/ou citrato) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 500 mM. Em algumas modalidades, o agente de tamponamento (por exemplo, fosfato, tris, arginina, acetato e/ou citrato) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o agente de tamponamento (por exemplo, fosfato, tris, arginina, acetato e/ou citrato) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 10 mM ou menos que cerca de 10 mM, cerca de 25 mM ou menos que cerca de 25 mM, cerca de 50 mM ou menos que cerca de 50 mM, cerca de 75 mM ou menos que cerca de 75 mM, ou cerca de 100 mM ou menos que cerca de 100 mM, ou cerca de 500 mM ou menos que cerca de 500 mM. Em algumas modalidades, o agente de tamponamento (por exemplo, fosfato, tris, arginina, acetato e/ou citrato) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 50 mM ou menos que cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o agente de tamponamento (por exemplo, fosfato, tris, arginina, acetato e/ou citrato) está presente na solução de lavagem em uma concentração de cerca de 500 mM ou menos que cerca de 500 mM. Soluções de lavagem ilustrativas

[0090] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o benzoato de sódio e/ou o álcool benzílico e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e/ou o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende adicionalmente um tampão fosfato (por exemplo, em uma concentração de cerca de 50 mM).

[0091] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o benzoato de sódio, o álcool benzílico e/ou o cloreto de sódio e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e/ou o cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e o cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende adicionalmente um tampão fosfato (por exemplo, em uma concentração de cerca de 50 mM).

[0092] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o benzoato de sódio, o álcool benzílico, a arginina e/ou o cloreto de sódio e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v), a arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M e/ou o cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v), a arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M e o cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende adicionalmente um tampão fosfato (por exemplo, em uma concentração de cerca de 50 mM).

[0093] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o benzoato de sódio, o álcool benzílico, o tampão fosfato e/ou a arginina e tem um pH de cerca de 9,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v), o tampão fosfato em uma concentração de cerca de 50 mM e/ou a arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M e tem um pH de cerca de 9,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v), o tampão fosfato em uma concentração de cerca de 50 mM e a arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M e tem um pH de cerca de 9,0.

[0094] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o benzoato de sódio, o álcool benzílico e/ou a arginina e tem um pH de cerca de 6,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e/ou a arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M e tem um pH de cerca de 6,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e a arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M e tem um pH de cerca de 6,0 .

[0095] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o hexileno glicol, o benzoato de sódio e/ou o álcool benzílico e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o hexileno glicol em uma concentração de cerca de 10% (v/v), o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e/ou o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o hexileno glicol em uma concentração de cerca de 10% (v/v), o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e tem um pH de cerca de 7,0.

[0096] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o benzenossulfonato, o benzoato de sódio e/ou o álcool benzílico e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzenossulfonato em uma concentração de cerca de 0,5 M, o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e/ou o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzenossulfonato em uma concentração de cerca de 0,5 M, o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e tem um pH de cerca de 7,0.

[0097] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o benzoato de sódio, o álcool benzílico e/ou a arginina (por exemplo, arginina-HCl) e tem um pH de cerca de 5,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e/ou a arginina (por exemplo, arginina-HCl) em uma concentração de cerca de 0,5 M, tem um pH de cerca de 5,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e a arginina (por exemplo, arginina-HCl) em uma concentração de cerca de 0,5 M, tem um pH de cerca de 5,0.

[0098] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o benzoato de sódio, o álcool benzílico e/ou a arginina (por exemplo, arginina-HCl) e tem um pH de cerca de 6,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e/ou a arginina (por exemplo, arginina-HCl) em uma concentração de cerca de 0,5 M, tem um pH de cerca de 6,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e a arginina (por exemplo, arginina-HCl) em uma concentração de cerca de 0,5 M, tem um pH de cerca de 6,0.

[0099] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o álcool benzílico e/ou a arginina (por exemplo, arginina-HCl) e tem um pH de cerca de 5,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e/ou a arginina (por exemplo, arginina-HCl) em uma concentração de cerca de 0,5 M e tem um pH de cerca de 5,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2%

(v/v) e a arginina (por exemplo, arginina-HCl) em uma concentração de cerca de 0,5 M e tem um pH de cerca de 5,0.

[00100] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o benzoato de sódio, a arginina (por exemplo, arginina-HCl), o ácido caprílico e/ou o cloreto de sódio e tem um pH de cerca de 9,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, a arginina (por exemplo, arginina-HCl) em uma concentração de cerca de 0,5 M, o ácido caprílico em uma concentração de cerca de 50 mM e/ou o cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 9,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, a arginina (por exemplo, arginina-HCl) em uma concentração de cerca de 0,5 M, o ácido caprílico em uma concentração de cerca de 50 mM e o cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 9,0.

[00101] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o benzoato de sódio, a arginina (por exemplo, arginina-HCl), o ácido caprílico e/ou o cloreto de sódio e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, a arginina (por exemplo, arginina-HCl) em uma concentração de cerca de 0,5 M, o ácido caprílico em uma concentração de cerca de 50 mM e/ou o cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, a arginina (por exemplo, arginina-HCl) em uma concentração de cerca de 0,5 M, o ácido caprílico em uma concentração de cerca de 50 mM e o cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 7,0.

[00102] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o benzoato de sódio e/ou o bicarbonato de sódio e tem um pH de cerca de 10,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e/ou o bicarbonato de sódio em uma concentração de cerca de 50 mM e tem um pH de cerca de 10,0. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e o bicarbonato de sódio em uma concentração de cerca de 50 mM e tem um pH de cerca de 10,0.

[00103] Em algumas modalidades, uma solução de lavagem da presente invenção compreende o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 4% (v/v) e tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 10. Em algumas modalidades, a solução de lavagem compreende o álcool benzílico em uma concentração de cerca de 4% (v/v) e tem um pH de cerca de 9,0. Ajuste de uma Coleta que Compreende um Polipeptídeo Compreendendo uma Região Fc antes da Cromatografia

[00104] Em um aspecto, é proporcionado um método de purificar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, compreendendo as etapas de: (A) ajustar uma coleta compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc, para atingir uma concentração final de um sal de benzoato de cerca de 0,1 M e cerca de 0,5 M e um pH entre cerca de 7,0 e cerca de 9,0, para produzir uma amostra compreendendo (i) o polipeptídeo compreendendo a região Fc e (ii) uma ou mais impurezas; e (B) colocar em contato a amostra com pelo menos uma matriz de cromatografia. Em algumas modalidades, a pelo menos uma matriz de cromatografia é uma matriz de cromatografia por afinidade, por exemplo, uma matriz de cromatografia de Proteína A e/ou uma matriz de cromatografia de proteína G. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de colocar em contato a pelo menos uma matriz de cromatografia com pelo menos uma solução de lavagem. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de colocar em contato a pelo menos uma matriz de cromatografia com uma solução de eluição. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de coletar um eluato compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc.

[00105] Em algumas modalidades, o termo "coleta" refere-se ao fluido presente no final da cultura das células ou após a cultura das células, por exemplo, uma amostra de lisado celular ou uma amostra de sobrenadante da cultura de células (por exemplo, um sobrenadante de células, como as células CHO, manipuladas para produzir e secretar o polipeptídeo). Em algumas modalidades, a coleta compreende células hospedeiras intactas e/ou fragmentos celulares. Em algumas modalidades, a coleta não compreende células hospedeiras intactas e/ou fragmentos celulares. Por exemplo, em algumas modalidades, o fluido presente no final da cultura das células ou após a cultura das células é submetido a uma ou mais etapas de centrifugação e/ou filtração, antes do ajuste para atingir uma concentração final de um sal de benzoato de cerca de 0,1 M e cerca de 0,5 M e um pH entre cerca de 7,0 e cerca de 9,0. Em algumas modalidades, a coleta é derivada do fluido presente no final da cultura das células ou após a cultura das células. Por exemplo, em algumas modalidades, o fluido presente no final da cultura das células ou após a cultura das células é submetido a uma ou mais etapas de pré-tratamento para otimizar a separação e/ou a purificação celular do polipeptídeo compreendendo uma região Fc.

[00106] Em um aspecto relacionado, qualquer um dos métodos de purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc descrito neste documento compreende adicionalmente uma etapa de ajustar uma coleta que compreende um polipeptídeo compreendendo uma região Fc para atingir uma concentração final de um sal de benzoato de 0,1 M e cerca de 0,5 M e um pH entre cerca de 7,0 e cerca de 9,0, para produzir a amostra compreendendo (i) o polipeptídeo compreendendo a região Fc e (ii) uma ou mais impurezas.

[00107] Em algumas modalidades, o sal de benzoato é um sal alcalino de benzoato. Em algumas modalidades, o sal de benzoato é o benzoato de sódio. Em algumas modalidades, a coleta é ajustada para atingir uma concentração final de um sal de benzoato (por exemplo, benzoato de sódio) de cerca de qualquer uma de 0,025 M, 0,05 M, 0,075 M, 0,1 M, 0,125 M, 0,15 M, 0,175 M, 0,2 M, 0,225 M, 0,25 M, 0,275 M, 0,3 M, 0,325 M, 0,35 M, 0,375 M, 0,4 M, 0,425 M, 0,45 M, 0,475 M, 0,5 M, 0,525 M, 0,55 M, 0,575 M, 0,6 M, 0,625 M, 0,65 M, 0,675 M, 0,7 M, 0,725 M, 0,75 M, 0,775 M ou 0,8 M, incluindo qualquer faixa entre esses valores. Em algumas modalidades, o pH da coleta é ajustado para aproximadamente qualquer um de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0, incluindo qualquer faixa entre esses valores. Em algumas modalidades, a coleta é purificada antes do ajuste (por exemplo, adição de benzoato de sódio e ajuste do pH). Em algumas modalidades, a coleta é purificada após o ajuste (por exemplo, adição de benzoato de sódio e ajuste do pH).

[00108] Em algumas modalidades, o método compreende ajustar a coleta para atingir uma concentração final de benzoato de sódio de cerca de 0,5 M e um pH de cerca de 7. Em algumas modalidades, o método compreende ajustar a coleta para atingir uma concentração final de benzoato de sódio de cerca de 0,1 M e um pH de cerca de 9. Em algumas modalidades, o método compreende ajustar a coleta para atingir uma concentração final de benzoato de sódio de cerca de 0,2 M e um pH de 9. Em algumas modalidades, o método compreende ajustar a coleta para atingir uma concentração final de benzoato de sódio de cerca de 0,3 M e um pH de 9. Em algumas modalidades, o método compreende ajustar a coleta para atingir uma concentração final de benzoato de sódio de cerca de 0,4 M e um pH de 9. Em algumas modalidades, o método compreende ajustar a coleta para atingir uma concentração final de benzoato de sódio de cerca de 0,5 M e um pH de

9.

[00109] Em algumas modalidades, o ajuste da coleta (por exemplo, adição de benzoato de sódio e ajuste do pH) resulta no polipeptídeo compreendendo a região Fc sendo purificado das uma ou mais impurezas até um grau maior do que um método correspondente, sem a etapa de ajustar a coleta compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc para produzir a amostra. Em algumas modalidades, uma ou mais impurezas são proteínas da célula hospedeira (HCPs), como as fosfolipases, a clusterina, as serina proteases, os fatores de alongamento e quaisquer combinações deles. Em algumas modalidades, a HCP é a Fosfolipase B-like 2 (PLBL2) Putativa.

[00110] Em algumas modalidades, a coleta ajustada (por exemplo, à qual o benzoato de sódio foi adicionado para atingir uma concentração final descrita neste documento e cujo pH foi ajustado conforme descrito neste documento) compreende ou é a amostra compreendendo (i) o polipeptídeo compreendendo a região Fc e (ii) uma ou mais impurezas. Em algumas modalidades, a amostra está em contato com pelo menos uma matriz de cromatografia (por exemplo, a amostra é submetida a pelo menos uma etapa de cromatografia). Em algumas modalidades, a pelo menos uma matriz de cromatografia compreende qualquer uma ou mais de: uma matriz de cromatografia por afinidade, uma matriz de cromatografia de modo misto (por exemplo, uma matriz de cromatografia multimodal), uma matriz de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), uma matriz de cromatografia de troca aniônica, uma matriz de cromatografia de troca catiônica, uma matriz de cromatografia por exclusão de tamanho, uma matriz de cromatografia em hidroxiapatita cerâmica (CHT) e/ou uma matriz de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) etc., em qualquer ordem. Em algumas modalidades, a amostra é colocada em contato com uma matriz de cromatografia por afinidade, por exemplo, uma matriz de Proteína A ou uma matriz de proteína G. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de colocar em contato a pelo menos uma matriz de cromatografia com pelo menos uma solução de lavagem. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de colocar em contato a pelo menos uma matriz de cromatografia com uma solução de eluição. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de coletar um eluato compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc. Remoção das impurezas

[00111] Certos aspectos da presente invenção referem-se aos métodos de purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc por meio de cromatografia de proteína A, por lavagem de uma matriz de proteína A ligada ao polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo) com uma solução de lavagem compreendendo um sal de benzoato e/ou o álcool benzílico, a fim de melhorar a purificação do polipeptídeo de uma ou mais impurezas. Em algumas modalidades, o método compreende as etapas de: colocar em contato uma matriz de cromatografia de Proteína A com uma amostra compreendendo (1) um polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo) e (2) uma ou mais impurezas (por exemplo, impurezas de células hospedeiras), sob uma condição que o polipeptídeo compreendendo a região Fc (por exemplo, o anticorpo) se ligue à proteína A; e lavar a matriz com uma solução de lavagem compreendendo um sal de benzoato, em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M, e/ou o álcool benzílico, em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 4% volume/volume (v/v), onde a solução de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0. Em algumas modalidades, a lavagem da matriz de proteína A com a solução de lavagem resulta no polipeptídeo compreendendo a região Fc sendo purificado das uma ou mais impurezas até um grau maior do que um método correspondente (como descrito acima), sem a etapa de lavagem da matriz com a solução de lavagem.

[00112] Um processo padrão de proteína A resulta tipicamente em uma pureza do produto de cerca de 95%, sem o uso de uma etapa de lavagem como descrito neste documento. As maiores proporções das impurezas no produto são devidas a agregados de alto peso molecular (HMW) e/ou fragmentos de baixo peso molecular (LMW) do produto. Essas variantes do produto são consideradas impurezas devido à sua capacidade de serem separadas do produto com base em vários parâmetros (por exemplo, carga, hidrofobicidade, diferença de tamanho etc.). Essas impurezas de HMW e LMW são responsáveis por cerca de 4-5% do agrupamento de proteínas A. Além disso, um processo padrão de proteína A, sem o uso de uma etapa de lavagem como descrito neste documento, também resulta tipicamente na inclusão de impurezas de proteínas da célula hospedeira (HCP) na ordem de 1000 ppm ou ~0,1% do agrupamento de produtos. No entanto, devido às especificações definidas para os produtos de mAb injetáveis (ver, por exemplo, as diretrizes da FDA), a redução e/ou a remoção completa desse 0,1% de impurezas de HCP é de considerável importância. A inclusão de uma etapa que aplica uma solução de lavagem descrita neste documento pode reduzir a quantidade de HCPs presentes no agrupamento para ~100-10 ppm (uma redução de 10 a 100 vezes nas HCPs em relação ao mesmo processo de proteína A, sem a etapa de lavagem descrita neste documento), sendo responsável por uma melhoria relativa de 90-

99%. Os métodos de medir os níveis de pureza e/ou impureza da proteína da amostra (por exemplo, pelo ensaio ELISA) são, em geral, conhecidos dos versados na técnica. Uma purificação ilustrativa de um anticorpo monoclonal (mAb) de uma ou mais proteínas da célula hospedeira, usando um método padrão vs. quaisquer dos métodos descritos neste documento, é mostrada na Tabela A abaixo. Tabela A: processo de purificação ilustrativa Composição (Após a proteína A) HCP mAb Condição: ppm: % % Padrão 1000 0,10 94,90 Incluindo a etapa de lavagem 100 0,01 94,99 (conforme descrita neste documento) Mudança (%) 90 90 0,09

[00113] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento produzem um agrupamento de proteínas contendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo monoclonal), após a eluição da proteína A, que contém menos que cerca de 500 ppm (partes por milhão) de HCPs (por exemplo, uma ou mais HCPs de uma célula CHO). Por exemplo, um agrupamento de proteínas contendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, produzido pelos métodos descritos neste documento, pode conter menos que cerca de 500 ppm, menos que cerca de 450 ppm, menos que cerca de 400 ppm, menos que cerca de 350 ppm, menos que cerca de 300 ppm, menos que cerca de 250 ppm, menos que cerca de 200 ppm, menos que cerca de 150 ppm, menos que cerca de 100 ppm, menos que cerca de 75 ppm, menos que cerca de 50 ppm, menos que cerca de 25 ppm, menos que cerca de 10 ppm ou menos que cerca de 1 ppm de HCPs (por exemplo, uma ou mais HCPs de uma célula CHO). Em algumas modalidades, um agrupamento de proteínas contendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, produzido pelos métodos descritos neste documento, contém menos que cerca de 100 ppm de HCPs (por exemplo, uma ou mais HCPs de uma célula CHO). Em algumas modalidades, um agrupamento de proteínas contendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, produzido pelos métodos descritos neste documento, contém menos que cerca de 10 ppm de HCPs (por exemplo, uma ou mais HCPs de uma célula CHO).

[00114] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento produzem um agrupamento de proteínas contendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc (por exemplo, um anticorpo monoclonal), após a eluição da proteína A, que contém menos de cerca de 0,1% de HCPs (por exemplo, uma ou mais HCPs de uma célula CHO). Por exemplo, um agrupamento de proteínas contendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, produzido pelos métodos descritos neste documento, pode conter menos que cerca de 0,1%, menos que cerca de 0,09%, menos que cerca de 0,08%, menos que cerca de 0,07%, menos que cerca de 0,06%, menos que cerca de 0,05%, menos que cerca de 0,04%, menos que cerca de 0,03%, menos que cerca de 0,02% ou menos que cerca de 0,01% de HCPs (por exemplo, uma ou mais HCPs de uma célula CHO). Em algumas modalidades, um agrupamento de proteínas contendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, produzido pelos métodos descritos neste documento, contém menos que cerca de 0,05% de HCPs (por exemplo, uma ou mais HCPs de uma célula CHO). Em algumas modalidades, um agrupamento de proteínas contendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, produzido pelos métodos descritos neste documento, contém menos que cerca de 0,01% de HCPs (por exemplo, uma ou mais HCPs de uma célula CHO).

[00115] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento reduzem a quantidade e/ou a concentração (por exemplo,

partes por milhão) de uma ou mais impurezas (por exemplo, uma ou mais HCPs, tal como uma ou mais HCPs de uma célula CHO), purificadas juntamente com o polipeptídeo compreendendo a região Fc, em pelo menos cerca de 10% em relação à quantidade das uma ou mais impurezas purificadas juntamente com um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, purificados por um método correspondente, sem a etapa de lavagem da matriz de proteína A com a solução de lavagem.

Por exemplo, os métodos descritos neste documento reduzem a quantidade e/ou a concentração (por exemplo, partes por milhão) de uma ou mais impurezas (por exemplo, uma ou mais HCPs, tal como uma ou mais HCPs de uma célula CHO), purificadas juntamente com o polipeptídeo compreendendo a região Fc, em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% em relação à quantidade de uma ou mais impurezas purificadas juntamente com um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, purificados por um método correspondente, sem a etapa de lavagem da matriz de proteína A com a solução de lavagem.

Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento reduzem a quantidade e/ou a concentração (por exemplo, partes por milhão) de uma ou mais impurezas (por exemplo, uma ou mais HCPs, tal como uma ou mais HCPs de uma célula CHO), purificadas juntamente com o polipeptídeo compreendendo a região Fc, em pelo menos cerca de 1,5 vez em relação à quantidade de uma ou mais impurezas purificadas juntamente com um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, purificados por um método correspondente, sem a etapa de lavagem da matriz de proteína A com a solução de lavagem. Por exemplo, os métodos descritos neste documento reduzem a quantidade e/ou a concentração (por exemplo, partes por milhão) de uma ou mais impurezas (por exemplo, uma ou mais HCPs, tal como uma ou mais HCPs de uma célula CHO), purificadas juntamente o polipeptídeo compreendendo a região Fc, em pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 3,5 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 4,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 5,5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 6,5 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 7,5 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 8,5 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 9,5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes em relação à quantidade de uma ou mais impurezas purificadas juntamente com um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, purificados por um método correspondente, sem a etapa de lavagem da matriz de proteína A com a solução de lavagem. Etapas adicionais

[00116] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento compreendem ainda uma ou mais etapas de lavagem adicionais. Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento compreendem ainda uma ou mais etapas de eluição. Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento compreendem ainda uma ou mais etapas de lavagem e uma ou mais etapas de eluição.

[00117] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à lavagem da matriz de proteína A com uma primeira solução, antes de lavar a matriz com a solução de lavagem. Em algumas modalidades, a matriz é lavada com a primeira solução uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais etc.) vezes, antes de lavar a matriz com a solução de lavagem.

Em algumas modalidades, a matriz é lavada uma vez com a primeira solução, antes de lavar a matriz com a solução de lavagem.

Em algumas modalidades, a primeira solução compreende um tampão.

Qualquer tampão adequado conhecido na técnica pode ser usado na primeira solução, incluindo, por exemplo, o fosfato, a tris (tris(hidroximetil)metilamina), o acetato, o carbonato, o citrato, a bis-tris, o bis-tris propano, a arginina, a histidina, a trietanolamina, a dietanolamina, o formato, o MES (ácido 2- (N-mofolino)etanossulfônico), o HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1- piperazinaetanossulfônico), o MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico), o TAPS (ácido 3- {[tris(hidroximetil)metil]amino}propanossulfônico), a Bicina (N,N-bis(2- hidroxietil)glicina), a Tricina (N-tris(hidroximetil)metilglicina), o TES (ácido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino}etanossulfônico), o PIPES (piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanossulfônico), o cacodilato (ácido dimetilarsínico), o SSC (citrato de sódio salino) e/ou quaisquer combinações deles.

Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão fosfato, o tampão tris, o tampão acetato, o tampão carbonato e/ou o tampão citrato.

Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão fosfato.

Em algumas modalidades, a primeira solução compreende um ou mais componentes adicionais (por exemplo, sal de benzoato, álcool benzílico, um ou mais aditivos descritos neste documento etc.). Em algumas modalidades, a primeira solução tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 10,0 (por exemplo, cerca de 6,0 a cerca de 10,0, cerca de 6,0 a cerca de 9,0, cerca de 7,0 a cerca de 10,0, cerca de 7,0 a cerca de 9,0, cerca de 8,0 a cerca de 10,0, cerca de 8,0 a cerca de 9,0, cerca de 9,0 a cerca de 10,0, cerca de 5,0 a cerca de 8,0, cerca de 6,0 a cerca de 8,0, cerca de

7,0 a cerca de 8,0, cerca de 5,0 a cerca de 7,0, cerca de 6,0 a cerca de 7,0 ou cerca de 5,0 a cerca de 6,0). Em algumas modalidades, a primeira solução tem um pH de cerca de 7,0.

[00118] Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM ou cerca de 10 mM a cerca de 500 mM. Por exemplo, a primeira solução pode compreender o tampão em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 500 mM, cerca de 100 mM a cerca de 500 mM, cerca de 150 mM a cerca de 500 mM, cerca de 200 mM a cerca de 500 mM, cerca de 250 mM a cerca de 500 mM, cerca de 300 mM a cerca de 500 mM, cerca de 350 mM a cerca de 500 mM, cerca de 400 mM a cerca de 500 mM, cerca de 450 mM a cerca de 500 mM, cerca de 10 mM a cerca de 450 mM, cerca de 10 mM a cerca de 400 mM, cerca de 10 mM a cerca de 350 mM, cerca de 10 mM a cerca de 300 mM, cerca de 10 mM a cerca de 250 mM, cerca de 10 mM a cerca de 200 mM, cerca de 10 mM a cerca de 150 mM, cerca de 10 mM a cerca de 100 mM, cerca de 25 mM a cerca de 100 mM, cerca de 40 mM a cerca de 100 mM, cerca de 50 mM a cerca de 100 mM, cerca de 60 mM a cerca de 100 mM, cerca de 75 mM a cerca de 100 mM, cerca de 10 mM a cerca de 75 mM, cerca de 25 mM a cerca de 75 mM, cerca de 40 mM a cerca de 75 mM, cerca de 50 mM a cerca de 75 mM, cerca de 60 mM a cerca de 75 mM, cerca de 10 mM a cerca de 60 mM, cerca de 25 mM a cerca de 60 mM, cerca de 40 mM a cerca de 60 mM, cerca de 50 mM a cerca de 60 mM, cerca de 10 mM a cerca de 50 m M, cerca de 25 mM a cerca de 50 mM, cerca de 40 mM a cerca de 50 mM, cerca de 10 mM a cerca de 40 mM, cerca de 25 mM a cerca de 40 mM ou cerca de 10 mM a cerca de 25 mM. Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM ou cerca de 10 mM a cerca de 500 mM.

[00119] Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão em uma concentração de quaisquer de cerca de 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM ou 100 mM. Alternativamente, a primeira solução compreende o tampão em uma concentração de quaisquer de cerca de 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM ou 500 mM. Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 500 mM. Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão fosfato em uma concentração de cerca de 500 mM. Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão fosfato em uma concentração de cerca de 50 mM.

[00120] Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) e o cloreto de sódio. Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) e o cloreto de sódio e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) em uma concentração de cerca de 50 mM e o cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M. Em algumas modalidades, a primeira solução compreende o tampão fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) em uma concentração de cerca de 50 mM e o cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e tem um pH de cerca de 7,0.

[00121] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à lavagem da matriz de proteína A com uma segunda solução, após a lavagem da matriz com a solução de lavagem. Em algumas modalidades, a matriz é lavada com a segunda solução uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais etc.) vezes, após lavar a matriz com a solução de lavagem.

Em algumas modalidades, a matriz é lavada uma vez com a segunda solução, após lavar a matriz com a solução de lavagem.

Em algumas modalidades, a segunda solução compreende um tampão.

Qualquer tampão adequado conhecido na técnica pode ser usado na segunda solução, incluindo, por exemplo, o fosfato, a tris (tris(hidroximetil)metilamina), o acetato, o carbonato, o citrato, a bis-tris, o bis-tris propano, a arginina, a histidina, a trietanolamina, a dietanolamina, o formato, o MES (ácido 2-(N-mofolino)etanossulfônico), o HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinaetanossulfônico), o MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico), o TAPS (ácido 3- {[tris(hidroximetil)metil]amino}propanossulfônico), a Bicina (N,N-bis(2- hidroxietil)glicina), a Tricina (N-tris(hidroximetil)metilglicina), o TES (ácido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino}etanossulfônico), o PIPES (piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanossulfônico), o cacodilato (ácido dimetilarsínico), o SSC (citrato de sódio salino) e/ou quaisquer combinações deles.

Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão fosfato, o tampão tris, o tampão acetato, o tampão carbonato e/ou o tampão citrato.

Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão fosfato.

Em algumas modalidades, a segunda solução compreende substancialmente pouco sal ou nenhum sal.

Em algumas modalidades, a segunda solução tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 8,0 (por exemplo, cerca de 5,0 a cerca de 8,0, cerca de 6,0 a cerca de 8,0, cerca de 7,0 a cerca de 8,0, cerca de 4,0 a cerca de 7,0, cerca de 5,0 a cerca de 7,0, cerca de 6,0 a cerca de 7,0, cerca de 4,0 a cerca de 6,0, cerca de 5,0 a cerca de 6,0 ou cerca de 4,0 a cerca de 5,0). Em algumas modalidades, a segunda solução tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a segunda solução tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a segunda solução compreende substancialmente pouco sal.

Em algumas modalidades, a segunda solução não compreende sal.

[00122] Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM ou cerca de 10 mM a cerca de 500 mM. Por exemplo, a segunda solução pode compreender o tampão em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 500 mM, cerca de 100 mM a cerca de 500 mM, cerca de 150 mM a cerca de 500 mM, cerca de 200 mM a cerca de 500 mM, cerca de 250 mM a cerca de 500 mM, cerca de 300 mM a cerca de 500 mM, cerca de 350 mM a cerca de 500 mM, cerca de 400 mM a cerca de 500 mM, cerca de 450 mM a cerca de 500 mM, cerca de 10 mM a cerca de 450 mM, cerca de 10 mM a cerca de 400 mM, cerca de 10 mM a cerca de 350 mM, cerca de 10 mM a cerca de 300 mM, cerca de 10 mM a cerca de 250 mM, cerca de 10 mM a cerca de 200 mM, cerca de 10 mM a cerca de 150 mM, cerca de 10 mM a cerca de 100 mM, cerca de 25 mM a cerca de 100 mM, cerca de 40 mM a cerca de 100 mM, cerca de 50 mM a cerca de 100 mM, cerca de 60 mM a cerca de 100 mM, cerca de 75 mM a cerca de 100 mM, cerca de 10 mM a cerca de 75 mM, cerca de 25 mM a cerca de 75 mM, cerca de 40 mM a cerca de 75 mM, cerca de 50 mM a cerca de 75 mM, cerca de 60 mM a cerca de 75 mM, cerca de 10 mM a cerca de 60 mM, cerca de 25 mM a cerca de 60 mM, cerca de 40 mM a cerca de 60 mM, cerca de 50 mM a cerca de 60 mM, cerca de 10 mM a cerca de 50 mM, cerca de 25 mM a cerca de 50 mM, cerca de 40 mM a cerca de 50 mM, cerca de 10 mM a cerca de 40 mM, cerca de 25 mM a cerca de 40 mM ou cerca de 10 mM a cerca de 25 mM. Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM ou cerca de 10 mM a cerca de 500 mM.

[00123] Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão em uma concentração de quaisquer de cerca de 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM ou 100 mM. Alternativamente, a segunda solução compreende o tampão em uma concentração de quaisquer de cerca de 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM ou 500 mM. Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 500 mM. Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 50 mM.

[00124] Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão fosfato (por exemplo, fosfato de sódio). Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) e tem um pH de cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) em uma concentração de cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, a segunda solução compreende o tampão fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) em uma concentração de cerca de 50 mM e tem um pH de cerca de 7,0.

[00125] Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção se referem à lavagem de uma matriz de proteína A com uma solução de lavagem e não incluem uma etapa de lavagem da matriz com uma primeira solução (antes da solução de lavagem) ou uma segunda solução (após a solução de lavagem). Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção se referem à lavagem de uma matriz de proteína A com uma primeira solução, depois a lavagem da matriz com uma solução de lavagem e não incluem uma etapa de lavagem da matriz com uma segunda solução (após a solução de lavagem). Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção se referem à lavagem de uma matriz de proteína A com uma solução de lavagem e depois a lavagem da matriz com uma segunda solução e não incluem uma etapa de lavagem da matriz com uma primeira solução (antes da solução de lavagem). Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção se referem à lavagem de uma matriz de proteína A com uma primeira solução, então a lavagem da matriz com uma solução de lavagem e depois a lavagem da matriz com uma segunda solução.

[00126] Em algumas modalidades, a matriz de proteína A é colocada em contato com uma solução de eluição uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais etc.) vezes, após uma ou mais etapas de lavagem. Em algumas modalidades, a matriz é colocada em contato com a solução de eluição uma vez. Qualquer solução conhecida na técnica, adequada para eluir um polipeptídeo ligado a uma matriz de proteína A, pode ser usada como uma solução de eluição nos métodos da presente invenção (por exemplo, uma solução de eluição compreendendo acetato de sódio 40 mM tendo um pH de cerca de 3,1). Em algumas modalidades, a solução de eluição compreende adicionalmente um ou mais componentes adicionais (por exemplo, arginina em quaisquer das concentrações descritas neste documento). Em algumas modalidades, um eluato compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc é coletado após a colocação em contato da matriz com a solução de eluição. Em algumas modalidades, dois ou mais eluatos compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc são coletados após a colocação em contato da matriz, duas ou mais vezes, com a solução de eluição. Em algumas modalidades, os dois ou mais eluatos são combinados após a eluição. Em algumas modalidades, o(s) eluato(s) é(são) filtrado(s). Qualquer método adequado de filtrar um eluato conhecido na técnica pode ser utilizado, incluindo, por exemplo, por meio de filtração de profundidade. Em algumas modalidades, o(s) eluato(s) é(são) filtrado(s) por meio de filtração de profundidade.

[00127] Em algumas modalidades, os eluatos de uma matriz de proteína A, conforme descritos neste documento, podem ser adicionalmente processados e/ou purificados (por exemplo, usando uma etapa adicional de cromatografia e/ou filtração (tal como pelo uso de uma ou mais de cromatografia de troca iônica, cromatografia de modo misto, cromatografia por afinidade, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por afinidade de metal imobilizado, cromatografia por exclusão de tamanho, diafiltração, ultrafiltração e/ou filtração de remoção viral)) e/ou formulados (por exemplo, preparando uma formulação farmacêutica adequada para a administração a um paciente que necessita dela (como um paciente humano)).

[00128] A descrição escrita anterior é considerada ser suficiente para permitir que um especialista na técnica pratique a presente invenção. Os Exemplos a seguir são oferecidos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de forma alguma. De fato, várias modificações da presente invenção, além daquelas mostradas e descritas neste documento, tornar-se-ão evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição anterior e enquadrar-se- ão no escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS Exemplo 1: soluções de lavagem para melhorar ou aumentar a remoção de impurezas durante a purificação de anticorpos

[00129] O exemplo a seguir descreve o uso de várias combinações de benzoato de sódio e álcool benzílico em soluções de lavagem intermediárias, para melhorar/aumentar a remoção de impurezas durante a cromatografia de proteína A. Materiais e Métodos Preparação da amostra

[00130] Dois materiais separados de coleta de anticorpos monoclonais humanos foram preparados para a cromatografia de proteína A, como se segue: a coleta foi gerada em uma cultura de suspensão de células recombinantes de Ovário de Hamster Chinês (CHO), manipuladas para expressar constitutivamente qualquer um dos anticorpos. O produto recombinante foi secretado no meio de cultura, que foi então centrifugado e purificado por filtração de profundidade para processamento a jusante. O material de coleta purificado foi filtrado com um filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 µm, antes do carregamento sobre a coluna de proteína A. Cromatografia de proteína A

[00131] A resina/colunas de proteína A foram preparadas como se segue: A resina de cromatografia de proteína A MabSelect Sure LX (GE Healthcare Life Sciences; cat. No. 17-5474) foi trocada, por meio de sedimentação por gravidade, com uma solução de cloreto de sódio 0,5 M. As colunas foram recheadas usando um AKTA Pure ou AKTA Avant (GE Healthcare Life Sciences), usando (A) uma coluna de 1,0 cm de diâmetro (Essential Life Solutions 10/250 Snap Column; cat. no. S10/250-PPSL-OE-FP10) ou (B) uma coluna de 0,66 cm de diâmetro (Omnifit® 6.6/100; cat. no. 006BCC0610FF). A resina foi recheada até uma altura de leito de 20 cm ± 10% para a coluna (A) ou até uma altura de glóbulos de 5 cm ± 10% para a coluna (B). A qualificação da coluna foi realizada usando uma injeção de volume de coluna a 1% de solução de cloreto de sódio 1,0 M sobre a coluna equilibrada em solução de cloreto de sódio 0,1 M, e o traço de condutividade foi analisado usando o software Unicorn Evaluation. A eficiência da coluna precisou ser pelo menos 775 placas teóricas por metro e precisou demonstrar uma assimetria de 0,8-1,8.

[00132] Antes de carregar o material de coleta, as colunas foram enxaguadas com água de deionização por osmose reversa para remover o tampão de armazenamento de 20% de etanol. Subsequentemente, a coluna foi enxaguada com ácido acético 0,5 M para garantir a remoção de quaisquer entidades ligadas antes do equilíbrio. A coluna foi equilibrada com tampão fosfato 50 mM com cloreto de sódio 0,5 M até o pH da coluna ser >6,5.

[00133] As amostras preparadas foram então carregadas nas colunas de proteína A.

As colunas foram carregadas até um alvo de 40 g/L de resina com mAb A (subtipo IgG1) ou mAb B (subtipo IgG4). As colunas carregadas foram lavadas, como descrito acima, com uma solução de tampão fosfato contendo fosfato 50 mM e cloreto de sódio 0,5 M.

Em seguida, as colunas foram lavadas com a solução de lavagem de teste, seguida por uma lavagem sem sal com uma solução tamponada em pH 7. Finalmente, o anticorpo foi eluído da coluna usando uma solução contendo acetato de sódio 40 mM a um pH de 3,1. A Tabela 1 abaixo proporciona um processo de cromatografia ilustrativo.

Tabela 1: Descrição do processo de cromatografia em coluna Tempo de Direção do Volume Etapa Tampão/Solução Residência fluxo (CV) (min) Enxague Água para Injeção (WFI) Descendente 8 2,5 Remoção ácido acético a 0,5 M Descendente 5 2 fosfato de sódio 50 mM, Equilíbrio cloreto de sódio 0,5 M, Descendente 5 3 pH 7,0 coleta de mAb, filtrada Carga Descendente 5 em 0,22 µm fosfato de sódio 50 mM, Lavagem 1 cloreto de sódio 0,5 M, Descendente 5 3 pH 7,0 Lavagem 2 Solução de teste Descendente 5 2 fosfato de sódio 50 mM, Lavagem 3 Descendente 5 3 pH 7,0 acetato de sódio 40 mM, Eluição Descendente 5 2 pH 3,1 Remoção ácido acético a 0,5 M Descendente 5 3 fosfato de sódio 50 mM, Pós- cloreto de sódio 0,5 M, Ascendente 5 3 equilíbrio pH 7,0 Sanitização hidróxido de sódio 0,5 M Ascendente 5 3 fosfato de sódio 50 mM, Pós- cloreto de sódio 0,5 M, Ascendente 5 2 equilíbrio pH 7,0 Armazena- mento etanol a 20% Ascendente 8 2

Detecção das proteínas da célula hospedeira

[00134] Após a eluição, as amostras de anticorpos foram testadas quanto à presença de impurezas de proteínas da célula hospedeira (HCP), usando o Kit 3rd Generation CHO HCP ELISA (Cygnus Technologies), de acordo com o protocolo do fabricante. O HCP ELISA foi realizado em diluições entre 1:400 e 1:800 e a absorbância foi lida a 450/600 nm usando uma leitora de placas Spectramax Plus 384. Detecção da “HCP-A” específica

[00135] A concentração de uma HCP específica (HCP-A) foi quantificada nas amostras de anticorpos eluídos, usando um kit Hamster (CHO) ELISA disponível comercialmente (ICL Labs), de acordo com o protocolo do fabricante. A HCP-A ELISA foi realizada em diluições entre 1:100 e 1:800, e a absorbância foi lida a 450 nm usando uma leitora de placas Spectramax Plus 384. Resultados

[00136] As proteínas da célula hospedeira (HCPs) mostraram eluir juntamente com os anticorpos monoclonais (mAbs), o que pode ser problemático para as aplicações a jusante desses anticorpos. Para identificar os aditivos de lavagem potenciais, capazes de reduzir a quantidade de HCPs contaminantes que eluem juntamente com um mAb de interesse, uma coluna de cromatografia de proteína A de 1,7 mL foi carregada com uma amostra contendo um anticorpo monoclonal humano IgG1 secretado (mAb A), coletada de células CHO que foram tanto centrifugadas quanto purificadas por filtração de profundidade, antes do processamento a jusante (Ver a Tabela 1). As colunas foram primeiro lavadas com uma solução de tampão fosfato. Em seguida, as colunas foram lavadas com uma de várias soluções de lavagem de teste contendo fosfato 50 mM e um aditivo, individualmente ou como uma combinação com o benzoato de sódio, o álcool benzílico e a arginina, em pH 7,0 (FIG. 1). As corridas de controle não incorporaram nenhuma lavagem aditiva. Após as lavagens de teste, as colunas foram lavadas com fosfato 50 mM sem sal, pH 7,0. Finalmente, o anticorpo monoclonal foi eluído da coluna e o pH ajustado para um pH de 6,0 usando uma base de tris 2 M. Após o ajuste, os agrupamentos de eluatos foram filtrados usando um filtro de PES de 0,22 µm e foram testados quanto à presença de impurezas de HCP (FIG. 1). Curiosamente, as lavagens contendo álcool benzílico a 2% e/ou benzoato de sódio 0,5 M reduziram efetivamente os níveis de HCPs contaminantes nas amostras de anticorpos eluídos. A inclusão de arginina na lavagem também foi observada melhorar a separação da HCP.

[00137] Em seguida, a presença específica de HCP-A foi examinada nos anticorpos eluídos das colunas de proteína A. As soluções de lavagem de teste e controle, usadas nesta experiência, estão indicadas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Soluções de lavagem de teste Solução Componentes: pH: de teste: Controle Sem lavagem adicional 7,0 1 álcool benzílico a 2%; benzoato de sódio 0,5 M 7,0 2 álcool benzílico a 2%; benzoato de sódio 0,5 M; arginina 0,5 M 6,0 benzenossulfonato 0,5 M; benzoato de sódio 0,5 M; álcool 7,0 3 benzílico a 2% ácido caprílico 50 mM; benzoato de sódio 0,5 M; arginina 0,5 9,0 4 M, cloreto de sódio 0,5 M hexileno glicol a 10%; álcool benzílico a 2%; benzoato de sódio 7,0 5 0,5 M 6 álcool benzílico a 2%; benzoato de sódio 0,5 M; arginina 0,5 M 6,0 7 álcool benzílico a 2%; arginina 0,5 M 5,0 8 benzoato de sódio 0,5 M, bicarbonato de sódio 50 mM 10,0 álcool benzílico a 2%, benzoato de sódio 0,5 M, arginina 0,5 M, 9,0 9 fosfato de sódio 40 mM

[00138] Tendo demonstrado a capacidade da combinação de álcool benzílico e benzoato de sódio de remover as impurezas de HCP,

formulações adicionais foram testadas para atingir a remoção da HCP- A. Um anticorpo IgG4 (mAb B), com alta expressão conhecida da HCP- A, foi usado para aumentar especificamente a carga de HCP-A na coluna. A Tabela 1 proporciona um resumo das etapas executadas durante o processo de purificação. Resumidamente, após o equilíbrio para carregar o pH e a condutividade, uma coluna de cromatografia de proteína A de 15,7 mL foi carregada com uma amostra contendo o anticorpo monoclonal humano secretado, coletado das células CHO por meio tanto de centrifugação quanto de purificação por filtração de profundidade, antes do processamento a jusante. Uma vez atingida uma carga de 40 g/L (de resina), a coluna foi reequilibrada usando a solução de tampão fosfato. Uma das lavagens (soluções de teste 1, 2 e 7) representadas na Tabela 2 foi então aplicada como 2 volumes de coluna (CVs) e imediatamente seguida por 3 CVs de solução de tampão fosfato sem sal, em pH 7,0. Após eluição com acetato de sódio 40 mM, os agrupamentos de eluatos foram ajustados para pH 5,5 usando uma base de Tris 2 M. Os agrupamentos de eluatos foram então filtrados com um filtro de PES de 0,22 µm ou com um Filtro de Profundidade Millipore C0HC e foram testados quanto ao teor de HCP-A por ELISA (FIG. 2A). Todas as três condições de lavagem (soluções de teste 1, 2 e 7) foram capazes de separar a HCP-A adicional em relação ao controle (294 ppm). Os resultados também sugeriram que o efeito da remoção da HCP-A foi cumulativo, pois a combinação de álcool benzílico, benzoato de sódio e arginina removeu quase 90% da HCP-A em relação ao controle. Além disso, a filtração de profundidade proporcionou uma remoção de HCP-A adicional subsequente de 15- 25% para os eluatos das condições de lavagem.

[00139] Seguindo um procedimento semelhante ao descrito acima, a eficácia das lavagens com alto pH foi testada a seguir por lavagem das colunas em um pH de 9,0 ou 10,0. Um anticorpo IgG4 (mAb B) foi produzido em uma linhagem celular com alta expressão conhecida da HCP-A, para aumentar especificamente a carga de HCP-A na coluna de proteína A. A Tabela 1 proporciona um resumo das etapas executadas durante o processo de purificação. Resumidamente, após o equilíbrio para carregar o pH e a condutividade, uma coluna de cromatografia de proteína A de 15,7 mL foi carregada com uma amostra contendo o anticorpo monoclonal humano secretado, coletado a partir das células CHO coletadas por meio tanto de centrifugação quanto de purificação por filtração de profundidade, antes do processamento a jusante. Uma vez atingida uma carga de 60 g/L (de resina), a coluna foi reequilibrada usando uma solução de tampão fosfato. Uma das soluções de teste 8 ou 9 (Tabela 2) foi então aplicada para dois CVs e imediatamente seguidos por três CVs de solução de tampão fosfato sem sal, em pH 7,0. Após a eluição com acetato de sódio 40 mM, os agrupamentos de eluatos foram ajustados para pH 5,5 usando uma base de tris 2 M. Os agrupamentos de eluatos foram então filtrados com um filtro de PES de 0,22 µm. Como mostrado na FIG. 2B, o benzoato de sódio 0,5 M com um sal de tamponamento em pH 10,0 foi altamente eficaz na remoção da HCP-A (redução de 92%) em relação ao controle. Além disso, a adição de álcool benzílico e arginina foi novamente complementar e aumentou a separação da HCP-A em pH 9,0. Considerados juntos, os resultados representados nas FIGS. 2A-B mostram essa faixa consistente de pHs que permitiu uma separação significativa da HCP- A.

[00140] Finalmente, foram examinados aditivos adicionais para melhorar ainda mais uma lavagem de álcool benzílico a 2% e benzoato de sódio 0,5 M. O mesmo mAb IgG4 (mAb B) foi usado em uma coluna de escala de 1,7 mL. A Tabela 1 proporciona um resumo das etapas executadas durante o processo de purificação. Resumidamente, a coluna foi carregada a 40 g/L após o equilíbrio. Uma das quatro lavagens (soluções de teste 3-6) representadas na Tabela 2 foi então aplicada à coluna. Depois, as amostras de eluição foram ajustadas para pH 5,5 com uma base de Tris 2 M e foram filtradas usando um filtro de PES de 0,22 µm. O teor de HCP-A foi então medido usando um ELISA específico para HCP-A (FIG. 3). As lavagens com as soluções de teste demonstraram a resposta cumulativa na remoção da HCP-A devida à adição de arginina, ácido caprílico, benzenossulfonato e hexileno glicol, em comparação com a combinação de álcool benzílico a 2% e benzoato de sódio 0,5 M (201,3 ppm). Uma lavagem contendo álcool benzílico a 2%, benzoato de sódio 0,5 M e um componente selecionado a partir de hexileno glicol, benzenossulfonato de sódio, ácido caprílico ou arginina foi altamente eficaz na remoção da HCP-A.

[00141] Considerados juntos, os dados proporcionados neste exemplo mostram que uma etapa de lavagem intermediária contendo benzoato de sódio e/ou álcool benzílico foi capaz de proporcionar uma separação superior das impurezas de proteínas da célula hospedeira durante a purificação por proteína A de um anticorpo monoclonal humano. Além disso, a inclusão de um ou mais aditivos selecionados a partir de benzenossulfonato, ácido caprílico, hexileno glicol e/ou arginina na solução de lavagem melhorou ainda mais a separação das impurezas de proteínas da célula hospedeira durante a purificação por proteína A do anticorpo-alvo monoclonal. Exemplo 2: Identificação das proteínas específicas da célula hospedeira presentes após a cromatografia de proteína A, desenvolvimento das soluções de lavagem para melhorar ou aumentar a remoção de impurezas durante a purificação de anticorpos e avaliação da interação da Fosfolipase B-like 2 Putativa com o anticorpo monoclonal humano

[00142] O exemplo a seguir descreve a identificação das proteínas da célula hospedeira (HCPs) específicas no eluato de anticorpos purificados após a cromatografia de proteína A. O exemplo descreve ainda o uso de benzoato de sódio e álcool benzílico em soluções de lavagem intermediárias para melhorar/aumentar a remoção das HCPs, incluindo a Fosfolipase B-like 2 (PLBL2) Putativa, durante a cromatografia de proteína A. Finalmente, o exemplo descreve o efeito das condições de carga sobre a eficiência da cromatografia de proteína A. Materiais e Métodos Preparação da amostra

[00143] Os materiais de coleta de anticorpos monoclonais humanos foram preparados para a cromatografia de proteína A como descrito no Exemplo 1. Resumidamente, a coleta foi gerada em uma cultura de suspensão de células CHO recombinantes, manipuladas para expressar constitutivamente qualquer um dos anticorpos monoclonais humanos. O produto recombinante foi secretado no meio de cultura, que foi então centrifugado e purificado por filtração de profundidade, para processamento a jusante. O material de coleta purificado foi filtrado com um filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 µm, antes do carregamento na coluna de proteína A. Cromatografia de proteína A

[00144] A resina/colunas de proteína A foram preparadas como descrito no Exemplo 1. Resumidamente, a resina de cromatografia de Proteína A MabSelect Sure LX (GE Healthcare Life Sciences; cat. No. 17-5474) foi trocada, por meio de sedimentação por gravidade, com uma solução de cloreto de sódio 0,5 M. As colunas foram recheadas usando um AKTA Pure ou AKTA Avant (GE Healthcare Life Sciences), usando (A) uma coluna de 1,0 cm de diâmetro (Essential Life Solutions 10/250 Snap Column; cat. no. S10/250-PPSL-OE-FP10) ou (B) uma coluna de 0,66 cm de diâmetro (Omnifit® 6.6/100; cat. no. 006BCC0610FF). A resina foi recheada até uma altura de leito de 20 cm

± 10% para a coluna (A) ou até uma altura de glóbulos de 5 cm ± 10% para a coluna (B). A qualificação da coluna foi realizada usando uma injeção de volume de coluna a 1% de solução de cloreto de sódio 1,0 M sobre a coluna equilibrada em solução de cloreto de sódio 0,1 M, e o traço de condutividade foi analisado usando o software Unicorn Evaluation. A eficiência da coluna precisou ser pelo menos 775 placas teóricas por metro e precisou demonstrar uma assimetria de 0,8-1,8.

[00145] Antes de carregar o material de coleta, as colunas foram enxaguadas com água de deionização por osmose reversa para remover o tampão de armazenamento de 20% de etanol. Subsequentemente, a coluna foi enxaguada com ácido acético 0,5 M para garantir a remoção de quaisquer entidades ligadas antes do equilíbrio. A coluna foi equilibrada com tampão fosfato 50 mM com cloreto de sódio 0,5 M até o pH da coluna ser >6,5.

[00146] As amostras preparadas foram então carregadas nas colunas de proteína A. Em geral, as colunas foram carregadas até um alvo de 40 g/L de resina com anticorpo monoclonal humano A (subtipo IgG1) ou anticorpo monoclonal humano B (subtipo IgG4). As colunas carregadas foram lavadas, como descrito acima, com uma solução de tampão fosfato contendo fosfato 50 mM e cloreto de sódio 0,5 M. Em seguida, as colunas foram lavadas com a solução de lavagem de teste, seguida por uma lavagem sem sal com uma solução tamponada em pH

7. Entretanto, os tratamentos de controle não foram lavados com uma solução de lavagem de teste. Finalmente, o anticorpo foi eluído da coluna usando uma solução contendo acetato de sódio 40 mM a um pH de 3,1. A Tabela 1 proporciona um processo de cromatografia ilustrativo. Detecção das HCPs por Espectrometria de Massa

[00147] Após a purificação e a eluição da coluna de proteína A sob condições padrão, os eluatos de anticorpos monoclonais humanos foram analisados por Espectrometria de Massa, para determinar a quantidade relativa de cada HCP. Especificamente, a quantidade relativa de Clusterina e Fosfolipase B-like 2 (PLBL2) Putativa foi identificada nas amostras de anticorpos monoclonisl humanos purificados por proteína A. A espectroscopia de massa foi realizada usando um Acquity H-Class Xevo G2-XS Q-Tof e uma coluna de UPLC ACQUITY de 2,1 x 150 mm, 1,7 µm CSH C18. As amostras foram primeiro desnaturadas usando Rapigest a 0,05% em Bicarbonato de Amônio 50 mM e depois reduzidas e alquiladas usando DTT (ditiotreitol) 20 mM e IAA (Iodoacetamida) 40 mM. A digestão enzimática foi realizada por 2% de LysC, durante a noite, seguida por 3 horas com 4% de Tripsina. O Rapigest foi removido por meio de centrifugação e as amostras foram acidificadas usando ácido fórmico. Um padrão interno exógeno (“spike-in”) de 2,5 fmol/ul de E.coli ClpB foi então adicionado para comparar as quantidades relativas de HCP e PLBL2. Uma calibração da massa de bloqueio foi realizada em torno de 785,8426 m/z. O MSE foi utilizado para analisar os dados de íons e identificar as HCPs. Detecção das HCPs por ELISA

[00148] Após a eluição, a presença de HCPs genéricas em amostras de anticorpos monoclonais humanos foi avaliada como descrito no Exemplo 1. Resumidamente, as amostras de anticorpos foram testadas quanto à presença de impurezas de HCP usando o Kit 3rd Generation CHO HCP ELISA (Cygnus Technologies), de acordo com o protocolo do fabricante. O HCP ELISA foi realizado em diluições entre 1:400 e 1:800 e a absorbância foi lida a 450/600 nm usando uma leitora de placas Spectramax Plus 384. Detecção da PLBL2 por ELISA

[00149] A concentração de uma PLBL2 foi quantificada nas amostras de anticorpos eluídos usando um kit Hamster (CHO) ELISA disponível comercialmente (ICL Labs, E-65PLB), de acordo com o protocolo do fabricante. O PLBL2 ELISA foi realizado em diluições entre 1:100 e 1:800, e a absorbância foi lida a 450 nm usando uma leitora de placas Spectramax Plus 384. Resultados Detecção das HCPs por Espectrometria de Massa

[00150] Após a purificação por proteína A, as HCPs mostraram eluir juntamente com o anticorpo monoclonal humano, o que pode ser problemático para as aplicações a jusante desses anticorpos. Para identificar as HCPs específicas, presentes na solução de anticorpo monoclonal humano purificado após a purificação por proteína A, uma coluna de cromatografia de proteína A de 1,7 mL foi carregada com uma amostra contendo um anticorpo monoclonal humano IgG1 secretado (mAb A), coletada de células CHO que foram tanto centrifugadas quanto purificadas por filtração de profundidade, antes do processamento a jusante (Ver a Tabela 1). As colunas foram primeiro lavadas com uma solução de tampão fosfato. Em seguida, as colunas foram lavadas com fosfato 50 mM sem sal, pH 7,0. Finalmente, o anticorpo monoclonal foi eluído da coluna e o pH ajustado para um pH de 6,0 usando uma base de tris 2 M. Após o ajuste, os agrupamentos de eluatos foram filtrados usando um filtro de PES de 0,22 µm e foram analisados por Espectrometria de Massa para identificar as quantidades relativas de HCPs. Notavelmente, a Clusterina e a PLBL2 eram as duas HCPs mais abundantes presentes no eluato de anticorpo monoclonal humano. Identificação das Condições de Lavagem Intermediárias para Melhorar a Remoção de HCP/PLBL2.

[00151] A análise por Espectrometria de Massa, detalhada acima, proporcionou mais evidências que as HCPs, incluindo a PLBL2, eluem juntamente com os anticorpos monoclonais humanos após a purificação por proteína A. Em seguida, foram desenvolvidos exames por ELISA para identificar as soluções de lavagem intermediárias que poderiam ser usadas para melhorar e aumentar ainda mais a remoção de HCPs e PLBL2 (FIGs. 4A e 4B). Curiosamente, as lavagens intermediárias compreendendo álcool benzílico a 4% ou benzoato de sódio 0,5 M reduziram efetivamente os níveis de HCPs e PLBL2 contaminantes nas amostras de eluato de anticorpos. As lavagens contendo apenas Arginina 0,5 M não reduziram o nível de HCPs genéricas, mas reduziram de fato o nível de PLBL2 contaminante.

[00152] Os exames por PLBL2 ELISA mostram ainda que a filtração profunda combinada com as lavagens intermediárias compreendendo: 1) álcool benzílico a 2% e arginina 0,5 M, pH 5,0, 2) álcool benzílico a 2% e benzoato de sódio 0,5 M, pH 7,0, ou 3) álcool benzílico a 2%, benzoato de sódio 0,5 M, arginina 0,5 M, pH 6,0, removeu efetivamente a PLBL2 durante a purificação por proteína A. Além disso, as lavagens com níveis elevados de pH (benzoato de sódio 0,5 M e bicarbonato de sódio 50 mM, pH 10,0, ou álcool benzílico a 2%, benzoato de sódio 0,5 M, arginina 0,5 M e fosfato de sódio 50 mM, pH 9,0) foram altamente eficazes na remoção da PLBL2 durante a purificação por proteína A. De fato, a lavagem com benzoato de sódio com bicarbonato de sódio 50 mM, pH 10,0, foi capaz de remover mais que 92% da PLBL2, em comparação ao tratamento de controle. Por último, as lavagens compreendendo: 1) benzoato de sódio 0,5 M, álcool benzílico a 2% e benzenossulfonato 0,5 M, pH 7,0, 2) benzoato de sódio 0,5 M, ácido caprílico 50 mM, arginina 0,5 M e cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,0, 3) benzoato de sódio 0,5 M, álcool benzílico a 2% e hexileno glicol a 10%, pH 7,0, ou 4) benzoato de sódio 0,5 M, álcool benzílico a 2% e arginina 0,5 M, pH 6,0, demonstraram uma capacidade sólida de remover a PLBL2 em comparação com as lavagens de controle.

[00153] Além disso, a comparação visual do eluato de anticorpos, após as lavagens tanto experimentais quanto de controle, revelou que as amostras lavadas com Álcool Benzílico a 2% e Benzoato de Sódio 0,5 M apresentaram pureza melhorada em relação às amostras lavadas de controle (FIG. 5).

[00154] Os PLBL2 ELISAs, detalhados acima, demonstram que a lavagem intermediária contendo álcool benzílico e benzoato de sódio pode efetivamente reduzir o nível de PLBL2 no eluato de anticorpos purificados por proteína A. Em seguida, esse resultado foi adicionalmente confirmado ortogonalmente através da Espectrometria de Massa. Os resultados da Espectrometria de Massa mostram que a lavagem de teste com Benzoato de Sódio 0,5 M, Arginina 0,5 M, Ácido Caprílico 50 mM, NaCl 0,5 M, pH 9,0, removeu quase 93% da PLBL2 do eluato em relação ao tratamento de controle. Avaliação do Impacto da Carga da Coluna sobre o Rendimento e a Remoção da PLBL2

[00155] As experiências acima demonstram que a proteína da célula hospedeira PLBL2 está presente no eluato de anticorpos purificados por proteína A e pode ser efetivamente removida usando soluções de lavagem intermediárias contendo Álcool Benzílico e Benzoato de Sódio. Em seguida, foi avaliado o impacto do nível de carga da coluna de proteína A sobre o rendimento fora da coluna e a remoção da PLBL2. Para identificar as condições de carga ideais para maximizar o rendimento fora da coluna e a remoção da PLBL2, as colunas de proteína A foram carregadas em faixas de 40-60 g/L (FIGs. 6A e 6B). Os resultados demonstram que a carga da coluna crescente, além de 40 g/L, diminui tanto o rendimento fora da coluna equanto a remoção da PLBL2.

[00156] Considerados em conjunto, os dados proporcionados neste exemplo mostram que PLBL2 está entre as proteínas da célula hospedeira que eluem juntamente com o anticorpo monoclonal humano, após a purificação por proteína A. Além disso, os dados demonstram que uma etapa de lavagem intermediária contendo benzoato de sódio e/ou álcool benzílico foi capaz de proporcionar uma separação superior das impurezas de proteínas da célula hospedeira e da PLBL2 durante a purificação por proteína A de um anticorpo monoclonal humano. Além disso, os dados mostram que a sobrecarga da coluna de resina de proteína A pode diminuir o rendimento fora da coluna e a remoção da PLBL2. Exemplo 3: Avaliação dos efeitos do pH e da concentração de sal de benzoato em uma coleta compreendendo um anticorpo sobre a remoção das impurezas durante a purificação de anticorpos.

[00157] O exemplo a seguir descreve as experiências que foram realizadas para determinar se o ajuste da concentração de benzoato de sódio e do pH de uma coleta compreendendo um anticorpo monoclonal melhora ou aumenta a remoção de impurezas durante a purificação do anticorpo.

[00158] As coletas de anticorpos monoclonais humanos foram preparadas como descrito no Exemplo 1. A coleta purificada e filtrada em profundidade foi ajustada para pH e concentrações de aditivo variáveis para examinar os impactos sobre a separação de HCP e PLBL2. O benzoato de sódio, previamente mostrado ser eficaz para a remoção da PLBL2 como parte de uma etapa de lavagem adicional, foi adicionado como um sólido, em quantidades suficientes para atingir uma concentração-alvo final para um dado volume de coleta. Após a adição, o pH-alvo foi atingido através da adição de uma base de tris 2 M. Uma primeira coleta foi suplementada com benzoato de sódio para atingir uma concentração final de 0,5 M de benzoato de sódio e ajustada para um pH de 7,2. Uma segunda coleta foi suplementada com benzoato de sódio para atingir uma concentração final de 0,5 M de benzoato de sódio e ajustada para um pH de 9. Uma terceira coleta foi ajustada para um pH de 9 (nenhum benzoato de sódio foi adicionado).

Ver a Tabela 3: Tabela 3. Aditivos da Coleta pH Apenas Ajuste com Base de Tris 9,0 Benzoato de Sódio 0,5 M 7,2 Benzoato de Sódio 0,5 M 9,0

[00159] Assim que cada coleta foi ajustada e filtrada em 0,22 µm, três colunas de proteína A foram, cada uma, carregadas até um alvo de 50 g/L de resina com a coleta ajustada. As colunas carregadas foram lavadas com uma solução de tampão fosfato contendo fosfato 50 mM e cloreto de sódio 0,5 M. Em seguida, as colunas foram lavadas com água desionizada por osmose reversa (RODI). Finalmente, o anticorpo foi eluído da coluna usando uma solução contendo acetato de sódio 40 mM, em um pH de 3,1. A Tabela 4 abaixo proporciona um processo de cromatografia ilustrativo. Tabela 4. Tempo de Direção do Volume Etapa Tampão/Solução Residência fluxo (CV) (min) Enxague Água para Injeção (WFI) Descendente 8 2,5 Remoção ácido acético 0,5 M Descendente 5 2 fosfato de sódio 50 mM, Equilíbrio cloreto de sódio 0,5 M, pH Descendente 5 3 7,0 coleta de mAb ajustada, Carga Descendente 5 filtrada em 0,22 µm fosfato de sódio 50 mM, Lavagem 1 cloreto de sódio 0,5 M, pH Descendente 5 3 7,0 Água Deionizada por Lavagem 2 Descendente 5 2 Osmose Reversa (RODI) acetato de sódio 40 mM, Eluição Descendente 5 2 pH 3,1 Remoção ácido acético 0,5 M Descendente 5 3 fosfato de sódio 50 mM, Pós- cloreto de sódio 0,5 M, pH Ascendente 5 3 equilíbrio 7,0

Sanitização hidróxido de sódio 0,5 M Ascendente 5 3 fosfato de sódio 50 mM, Pós- cloreto de sódio 0,5 M, pH Ascendente 5 2 equiíbrio 7,0 Armazenam etanol a 20% Ascendente 8 2 ento

[00160] Cada um dos três eluatos de Oroteína A foi então testado quanto à presença de impurezas de proteínas da célula hospedeira (HCP), por meio do ELISA, como descrito no Exemplo 1, e quanto à presença de PLBL2 por meio de ELISA de costume. Como mostrado na FIG. 7, o benzoato de sódio 0,5 M em pH 9,0 mostrou o menor nível de impurezas de PLBL2 e HCP e demonstrou um log maior de separação da PLBL2 em relação a um ajuste de pH somente. Quando o benzoato de sódio 0,5 M foi adicionado à coleta em pH 7,2, apenas a separação da HCP foi melhorada. O ajuste tanto do pH quanto do benzoato de sódio na coleta foi necessário para um efeito sobre a PLBL2. O HMW não foi impactado pelos ajustes (não mostrado). Em comparação com a coleta não ajustada com apenas uma lavagem com RODI durante a etapa da Proteína A, a HCP foi reduzida em 65%, enquanto a PLBL2 foi reduzida em aproximadamente 79%.

[00161] Em seguida, as coletas foram suplementadas com benzoato de sódio para atingir uma concentração final de 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M ou 0,5 M e ajustadas para um pH de 9 antes da purificação por proteína A, como descrito acima. Ver a Tabela 5. Tabela 5. Aditivos da Coleta pH Benzoato de Sódio 0,1 M 9,0 Benzoato de Sódio 0,2 M 9,0 Benzoato de Sódio 0,3 M 9,0 Benzoato de Sódio 0,4 M 9,0 Benzoato de Sódio 0,5 M 9,0

[00162] Cada eluato de Proteína A foi então testado quanto à presença de PLBL2 por meio de ELISA de costume, e o rendimento de anticorpo em cada eluato foi avaliado. A FIG. 8 mostra que a relação entre o teor de PLBL2 e a concentração de benzoato de sódio é aproximadamente sigmoide. Foram observados ganhos diminuídos na separação da PLBL2 para concentrações acima de 0,4 M de benzoato de sódio. O rendimento de anticorpos diminuiu ligeiramente com a concentração crescente de benzoato de sódio. De 0,1 M até 0,5 M de benzoato de sódio, o rendimento de anticorpos diminuiu de 94,8% para 89,4%. O maior rendimento e a maior separação de PLBL2 foram observados quando a coleta foi ajustada para 0,4 M de benzoato de sódio e pH 9,0 antes da purificação por Proteína A. O aumento da concentração de benzoato de sódio acima de 0,4 M resultou em ganhos reduzidos na separação às custas de um rendimento de anticorpos ligeiramente diminuído. Todas as amostras de benzoato de sódio 0,1 M apresentaram separação das HCPs comparável em aproximadamente 250 ppm. Em 0,1 M de benzoato de sódio e abaixo, a HCP era aproximadamente 500 ppm. A concentração de benzoato de sódio entre 0,2 M e 0,5 M não causou impacto sobre o perfil de variação da carga e todos os eluatos estavam dentro dos limites especificados.

[00163] Considerados em conjunto, esses dados sugerem que a presença de benzoato de sódio em solução torna a associação das impurezas das células hospedeiras com o mAb altamente desfavorável em pHs altos. Estas condições podem ser atingidas através de uma etapa de lavagem separada, após o mAb ter sido ligado à resina de proteína A, ou em solução, antes ou durante a fase de carga da coluna. Isso proporciona maior flexibilidade na operação da etapa de purificação por proteína A e suporta ainda mais as propriedades únicas do benzoato de sódio como um aditivo de lavagem.

[00164] Embora a descrição anterior tenha sido descrita em algum detalhe a título de ilustração e exemplo para fins de clareza e entendimento, as descrições e os exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de purificar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de: (a) colocar em contato uma matriz de cromatografia de Proteína A com uma amostra compreendendo (i) o polipeptídeo compreendendo a região Fc e (ii) uma ou mais impurezas, sob uma condição que o polipeptídeo compreendendo a região Fc se ligue à Proteína A; e (b) lavar a matriz com uma solução de lavagem, em que a solução de lavagem compreende um ou ambos de (i) um sal de benzoato em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M e (ii) álcool benzílico em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 4% volume/volume (v/v), e em que a solução de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 10,0.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem compreende: 1) sal de benzoato; 2) álcool benzílico; ou 3) sal de benzoato e álcool benzílico.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o sal de benzoato está em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o sal de benzoato é um sal alcalino de benzoato.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o sal de benzoato é o benzoato de sódio.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o benzoato de sódio está em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,3 M.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o benzoato de sódio está em uma concentração de cerca de 0,3 M.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o benzoato de sódio está em uma concentração de cerca de 0,5 M.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o álcool benzílico está em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 4% (v/v).

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o álcool benzílico está em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 2% (v/v).

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o álcool benzílico está em uma concentração de cerca de 2% (v/v) a cerca de 4% (v/v).

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem compreende adicionalmente um agente de tamponamento.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o agente de tamponamento é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato, tris, arginina, acetato e citrato.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 13, caracterizado pelo fato de que o agente de tamponamento está em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 500 mM.

15. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 13, caracterizado pelo fato de que o agente de tamponamento está em uma concentração de cerca de 50 mM ou 500 mM.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 10,0.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 9,0.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem tem um pH de cerca de 5,0, cerca de 6,0, cerca de 7,0, cerca de 9,0 ou cerca de 10,0.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem compreende adicionalmente o benzenossulfonato de sódio.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o benzenossulfonato de sódio está em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem compreende adicionalmente o ácido caprílico.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o ácido caprílico está em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem compreende adicionalmente o hexileno glicol.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o hexileno glicol está em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 10% (v/v).

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem compreende adicionalmente a creatina.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a creatina está em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem compreende adicionalmente a arginina.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a arginina está em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a arginina está em uma concentração de cerca de 0,5 M.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que a arginina é a arginina-HCl.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem compreendendo a arginina tem um pH de cerca de 4,0 a cerca de 6,0.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem compreendendo a arginina tem um pH de cerca de 8,0 a cerca de 10,0.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem compreende adicionalmente um ou mais sais que não são de tamponamento.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que os um ou mais sais que não são de tamponamento são selecionados a partir do grupo que consiste em cloreto de sódio, brometo de sódio, cloreto de potássio, brometo de potássio, cloreto de magnésio, brometo de magnésio, cloreto de cálcio, brometo de cálcio e quaisquer combinações deles.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que os um ou mais sais que não são de tamponamento são o cloreto de sódio e/ou o cloreto de potássio.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35, caracterizado pelo fato de que os um ou mais sais que não são de tamponamento estão em uma concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 1,0 M.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem é uma solução selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e bicarbonato de sódio em uma concentração de cerca de 50 mM, tendo um pH de cerca de 10,0; (ii) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2%, arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M e fosfato de sódio em uma concentração de cerca de 50 mM, tendo um pH de cerca de 9,0; (iii) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v), tendo um pH de cerca de 7,0; (iv) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 7,0; (v) uma solução compreendendo hexileno glicol em uma concentração de cerca de 10% (v/v), benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v), tendo um pH de cerca de 7,0; (vi) uma solução compreendendo benzenossulfonato em uma concentração de cerca de 0,5 M, benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M e álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v), tendo um pH de cerca de 7,0; (vii) uma solução compreendendo ácido caprílico em uma concentração de cerca de 50 mM, benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M e cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 7,0; (viii) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 6,0; (ix) uma solução compreendendo benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,5 M, álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 5,0; e (x) uma solução compreendendo álcool benzílico em uma concentração de cerca de 2% (v/v) e arginina em uma concentração de cerca de 0,5 M, tendo um pH de cerca de 5,0.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de lavagem da matriz com uma primeira solução antes de lavar a matriz com a solução de lavagem da etapa (b) na reivindicação 1.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a primeira solução compreende um tampão selecionado a partir do grupo que consiste em um tampão fosfato, um tampão tris, um tampão acetato, um tampão carbonato, um tampão citrato e quaisquer combinações deles.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a primeira solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

38 a 40, caracterizado pelo fato de que a primeira solução é um tampão fosfato.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de lavagem da matriz com uma segunda solução após lavar a matriz com a solução de lavagem da etapa (b) na reivindicação 1.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a segunda solução compreende um tampão selecionado a partir do grupo que consiste em um tampão fosfato, um tampão tris, um tampão acetato, um tampão carbonato, um tampão citrato e quaisquer combinações deles.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a segunda solução compreende o tampão em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM.

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 44, caracterizado pelo fato de que a segunda solução tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 45, caracterizado pelo fato de que a segunda solução compreende substancialmente pouco sal ou nenhum sal.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de colocar em contato a matriz de cromatografia de Proteína A com uma solução de eluição após uma ou mais etapas de lavagem.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de coletar um eluato compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de filtrar o eluato por meio de filtração de profundidade.

50. Método, de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de que o eluato compreende menos que cerca de 500 partes por milhão (ppm) das uma ou mais impurezas.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o método resulta no polipeptídeo compreendendo a região Fc sendo purificado das uma ou mais impurezas até um grau maior do que um método correspondente sem a etapa de lavar a matriz com a solução de lavagem.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais impurezas são proteínas da célula hospedeira (HCPs).

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais HCPs são selecionadas a partir do grupo que consiste em fosfolipases, clusterina, serina proteases, fatores de alongamento e quaisquer combinações deles.

54. Método, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, caracterizado pelo fato de que a HCP é uma Fosfolipase B-like 2 (PLBL2) Putativa.

55. Método, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de mamífero.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 55, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de ovário de hamster chinês (CHO).

57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 56, caracterizado pelo fato de que a região Fc é uma região Fc humana.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a região Fc humana compreende uma região Fc humana de IgG1, IgG2 ou IgG4.

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 56, caracterizado pelo fato de que a região Fc é uma região Fc de camundongo.

60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a região Fc de camundongo compreende uma região Fc de camundongo de IgG1, IgG2 ou IgG3.

61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreendendo a região Fc é um anticorpo.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.

63. Método, de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

64. Método, de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico ou um anticorpo triespecífico.

65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente, antes da etapa (a), ajustar uma coleta compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc para atingir uma concentração final de um sal de benzoato de entre cerca de 0,1 M e cerca de 0,5 M e um pH entre cerca de 7,0 e cerca de 9,0 para produzir a amostra compreendendo (i) o polipeptídeo compreendendo a região Fc e (ii) uma ou mais impurezas.

66. Método de purificar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de: (A) ajustar uma coleta compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc para atingir uma concentração final de um sal de benzoato de cerca de 0,1 M e cerca de 0,5 M e um pH entre cerca de 7,0 e cerca de 9,0 para produzir uma amostra compreendendo (i) o polipeptídeo compreendendo a região Fc e (ii) uma ou mais impurezas; e (B) colocar em contato a amostra com pelo menos uma matriz de cromatografia.

67. Método, de acordo com a reivindicação 65 ou 66, caracterizado pelo fato de que o sal de benzoato é um sal alcalino de benzoato.

68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o sal de benzoato é o benzoato de sódio.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 68, caracterizado pelo fato de que a concentração final do sal de benzoato na coleta é entre cerca de 0,4 M e cerca de 0,5 M.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 69, caracterizado pelo fato de que o pH da coleta é entre cerca de 7,0 e cerca de 8,0.

71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 69, caracterizado pelo fato de que o pH da coleta é entre cerca de 8,0 e cerca de 9,0.

72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 67, caracterizado pelo fato de que a coleta é gerada a partir de uma cultura compreendendo uma célula hospedeira manipulada para expressar o polipeptídeo.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira eucariótica é uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 74, caracterizado pelo fato de que a coleta é purificada antes do ajuste.

76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 74, caracterizado pelo fato de que a coleta é purificada após o ajuste.

77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 76, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma matriz de cromatografia compreende uma matriz de cromatografia por afinidade.

78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que a matriz de cromatografia por afinidade é uma matriz de cromatografia de Proteína A ou uma matriz de cromatografia de Proteína G.

79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 78, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de colocar em contato a pelo menos uma matriz de cromatografia com pelo menos uma solução de lavagem.

80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 79, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de colocar em contato a pelo menos uma matriz de cromatografia com uma solução de eluição.

81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de coletar um eluato compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc.

82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de filtrar o eluato por meio de filtração de profundidade.

83. Método, de acordo com a reivindicação 81 ou 82, caracterizado pelo fato de que o eluato compreende menos que cerca de 500 partes por milhão (ppm) das uma ou mais impurezas.

84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 83, caracterizado pelo fato de que o método resulta no polipeptídeo compreendendo a região Fc sendo purificado das uma ou mais impurezas até um grau maior do que um método correspondente sem a etapa de ajustar a coleta compreendendo o polipeptídeo compreendendo a região Fc para produzir a amostra.

85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 84, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais impurezas são proteínas da célula hospedeira (HCPs).

86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais HCPs são selecionadas a partir do grupo que consiste em fosfolipases, clusterina, serina proteases, fatores de alongamento e quaisquer combinações deles.

87. Método, de acordo com a reivindicação 85 ou 86, caracterizado pelo fato de que a HCP é uma Fosfolipase B-like 2 (PLBL2) Putativa.

88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 87, caracterizado pelo fato de que a região Fc é uma região Fc humana.

89. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a região Fc humana compreende uma região Fc humana de IgG1, IgG2 ou IgG4.

90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 89, caracterizado pelo fato de que a região Fc é uma região Fc de camundongo.

91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que a região Fc de camundongo compreende uma região Fc de camundongo de IgG1, IgG2 ou IgG3.

92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

66 a 91, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreendendo a região Fc é um anticorpo.

93. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.

94. Método, de acordo com a reivindicação 92 ou 93, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

95. Método, de acordo com a reivindicação 92 ou 93, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico ou um anticorpo triespecífico.

Petição 870200075149, de 17/06/2020, pág. 108/132 Álcool Benzílico a 2% Benzoato de Sódio 0,5 M 1/9

Controle Benzoato de Sódio 0,5 M Álcool Benzílico a 2% Álcool Benzílico a 2% Álcool Benzílico a 2% Benzoato de Sódio 0,5 M Benzoato de Sódio 0,5 M Arginina 0,5 M NaCl 0,5 M

Petição 870200075149, de 17/06/2020, pág. 109/132 Filtrados em 0,22 µm 2/9

Kit de HCP-A genérica Controle Benzílico a 2% Benzílico a 2% Benzílico a 2% Álcool a 0,5 M Álcool a 0,5 M Álcool a 0,5 M Arginina pH0,5 Benzoato de Benzoato de Sódio pH Sódio 0,5 7,0 M Arginina pH 6,0

Petição 870200075149, de 17/06/2020, pág. 110/132 3/9 Kit de HCP-A genérica Benzoato de Álcool Benzílico a 2% Controle Sódio 0,5 M, Arginina 0,5 M Bicarbonato de Fosfato de Sódio 50 mM Sódio 50 mM

10.0

Petição 870200075149, de 17/06/2020, pág. 111/132 4/9

Kit de HCP-A genérica Benzenossulfonato Ácido Caprílico 50 mM Hexileno Glicol a 10% 2% Álcool de Sódio 0,5 M Benzoato de 2% Álcool Benzílico Benzoato de Sódio 0,5 M Benzílico Benzoato de Sódio 0,5 M Arginina 0,5 M Benzoato de Sódio 0,5 M Álcool Benzílico NaCl 0,5 M Sódio 0,5 M Arginina pH 6,0 a 2% pH 7,0 pH 7,0 7,0

Petição 870200075149, de 17/06/2020, pág. 112/132 Kit de HCP genérica Kit de PLBL2 genérica 5/9

Arginina Benzoato Álcool Controle de Arginina Benzoato de Álcool Controle de 0,5 M de Benzílico Processo 0,5 M Sódio 0,5 M Benzílico Processo Sódio 0,5 M a 4% a 4%

Aditivos Aditivos

Controle Benzoato de Sódio 0,5 M Álcool Benzílico a 2%

Carga da Coluna

ELISA (ppm) PLBL2 Genérica Carga da Coluna

Fora da Coluna Rendimento

Petição 870200075149, de 17/06/2020, pág. 115/132 8/9

Benzoato de Sódio 0,5 M pH7 Benzoato de Sódio 0,5 M pH9 Coleta Ajustada para pH 9

Rendimento (%)

Concentração de Benzoato de Sódio

PLBL2 de Costume