KR20200103740A - 단백질 a 크로마토그래피 동안 불순물의 향상된 제거를 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
단백질 A 크로마토그래피를 통한 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)의 정제와 관련된 방법; 단백질 A 크로마토그래피 동안 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜을 포함하는 세척 용액의 사용과 관련된 방법; 및 단백질 A 크로마토그래피 전에 벤조산나트륨을 사용하여 수확물을 조정하는 방법이 본원에 제공된다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 12월 21일 출원된 미국 가출원 제62/609,214호 및 2018년 7월 5일 출원된 미국 가출원 제62/694,387호의 우선권 이익을 주장하며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 단백질 A 크로마토그래피를 통해 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)를 정제하는 방법에 관한 것이다.
항체, 및 다른 Fc 영역-함유 단백질(예컨대, 면역접합체)은 약학적/치료학적 분야에서 널리 사용되었다. (예를 들어, 인간 환자에서의) 이들 분자의 사용은 단백질 생산 동안 생길 수 있는 임의의 오염물질/불순물로부터의 조심스런 정제를 필요로 한다. 치료학적 단백질의 정제는 대개 하나 이상의 크로마토그래피 정제 단계를 사용하여 달성되고; 면역글로불린 Fc 영역을 함유하는 단백질(예를 들어, 항체)의 특히 유용한 유형의 크로마토그래피 정제는 단백질 A 크로마토그래피이다. 그러나, 숙주 세포 단백질(HCP: host cell protein)은 종래의 포획-모드 단백질 크로마토그래피(단백질 A 크로마토그래피를 포함) 동안 항체와 공동용리하는 것으로 나타났는데, 이는 이들 항체의 하류 적용에 문제가 될 수 있다. 통상적으로, 하나 이상의 세척 단계는 용리 전에 크로마토그래피 수지에 대한 산물(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역을 함유하는 단백질)의 결합 후 사용된다. 불행하게도, 염 및 완충 종으로 제조된 현재의 세척 제제는 HCP 및 다른 불순물과 다양한 단일클론 항체(mAb) 산물의 상호작용을 파괴하기에 충분하지 않을 수 있다. 따라서, (예를 들어, 단백질 A 친화도 크로마토그래피 동안) 항체와 공동정제되는 불순물(예를 들어, HCP)의 농도/수를 감소시키는 개선된 정제 방법(예를 들어, 새로운 세척 제제의 구현)의 필요성이 있다.
특허 출원, 특허 공보, 비특허 문헌 및 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호를 포함하는 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함된 것으로 표시된 것처럼 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
상기 및 다른 필요성을 충족시키기 위해, 하나 이상의 불순물로부터 Fc 영역-함유 폴리펩타이드를 정제하는 개선된 방법이 본원에 개시된다. 이 방법은 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스를 (i) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플(예를 들어, 세포 용해물)과 접촉시키는 단계 및 매트릭스를 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜을 포함하고 pH가 약 4.0 내지 10.0인 세척 용액으로 세척하는 단계를 포함한다. 본 발명은 적어도 부분적으로 단백질 A 크로마토그래피 동안 약 4.0 내지 10.0의 pH에서의 세척 용액 중의 벤조에이트염(예를 들어, 벤조산나트륨) 및/또는 벤질 알콜의 사용이 현재 사용되는 세척 제제에 비해 불순물(예를 들어, 숙주 세포 불순물)의 더 우수한 제거(clearance)를 제공한다는 놀라운 발견에 기초한다(도 1, 실시예 1 참조). 본 발명은 또한 적어도 부분적으로 벤젠설포네이트(예를 들어, 나트륨 벤젠설포네이트), 카프릴산, 헥실렌 글리콜 및/또는 아르기닌으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 성분의 포함이 세척 용액에 포함될 때 불순물의 제거를 추가로 개선할 수 있다는 발견에 기초한다(도 2 및 3, 실시예 1 참조).
따라서, 일 양태에서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 정제하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 (a) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드가 단백질 A에 결합하는 조건 하에 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스를 (i) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; 및 (b) 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 단계를 포함하고, 세척 용액은 (i) 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도의 벤조에이트염 및 (ii) 약 0.5% 내지 약 4% 용적/용적(v/v)의 농도의 벤질 알콜 중 하나 또는 둘 다를 포함하고, 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 10.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 (1) 벤조에이트염; (2) 벤질 알콜; 또는 (3) 벤조에이트염 및 벤질 알콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염은 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 농도에 있다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 벤조에이트염은 벤조에이트 알칼리염이다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 벤조에이트염은 벤조산나트륨이다. 일부 구현예에서, 벤조산나트륨은 약 0.1 M 내지 약 0.3 M의 농도에 있다. 일부 구현예에서, 벤조산나트륨은 약 0.3 M의 농도에 있다. 일부 구현예에서, 벤조산나트륨은 약 0.5 M의 농도에 있다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 1% 내지 약 4%(v/v)의 농도에 있다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 1% 내지 약 2%(v/v)의 농도에 있다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 2%(v/v)의 농도에 있다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 4%(v/v)의 농도에 있다.
임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 세척 용액은 완충제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및 시트레이트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 완충제는 약 10 mM 내지 약 50 mM 또는 약 10 mM 내지 약 500 mM의 농도에 있다. 일부 구현예에서, 완충제는 약 50 mM의 농도에 있다. 일부 구현예에서, 완충제는 약 500 mM의 농도에 있다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 5.0 내지 약 10.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 5.0 내지 약 9.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 5.0, 약 6.0, 약 7.0, 약 8.0, 약 9.0 또는 약 10.0이다.
임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 세척 용액은 나트륨 벤젠설포네이트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 나트륨 벤젠설포네이트는 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 농도에 있다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 세척 용액은 카프릴산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 카프릴산은 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도에 있다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 세척 용액은 헥실렌 글리콜을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 헥실렌 글리콜은 약 1% 내지 약 10%(v/v)의 농도에 있다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 세척 용액은 크레아티닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 크레아티닌은 약 10 mM 내지 약 100 mM의 농도에 있다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 세척 용액은 아르기닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아르기닌은 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도에 있다. 일부 구현예에서, 아르기닌은 약 0.5 M의 농도에 있다. 일부 구현예에서, 아르기닌은 아르기닌-HCl이다. 일부 구현예에서, 아르기닌을 포함하는 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 6.0이다. 일부 구현예에서, 아르기닌을 포함하는 세척 용액은 pH가 약 8.0 내지 약 10.0이다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 세척 용액은 하나 이상의 비완충 염을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비완충 염은 염화나트륨, 브롬화나트륨, 염화칼륨, 브롬화칼륨, 염화마그네슘, 브롬화마그네슘, 염화칼슘, 브롬화칼슘, 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비완충 염은 염화나트륨 및/또는 염화칼륨이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비완충 염은 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도에 있다.
임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 세척 용액은 (i) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 50 mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함하고, pH가 약 10.0인 용액; (ii) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%의 농도의 벤질 알콜, 약 0.5 M의 농도의 아르기닌 및 약 50 mM의 농도의 인산나트륨을 포함하고, pH가 약 9.0인 용액; (iii) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0인 용액; (iv) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0인 용액; (v) 약 10%(v/v)의 농도의 헥실렌 글리콜, 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0인 용액; (vi) 약 0.5 M의 농도의 벤젠설포네이트, 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0인 용액; (vii) 약 50 mM의 농도의 카프릴산, 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 0.5 M의 농도의 아르기닌 및 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0인 용액; (viii) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 아르기닌을 포함하고, pH가 약 6.0인 용액; (ix) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 아르기닌을 포함하고, pH가 약 5.0인 용액; (x) 약 4%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 5.0 내지 약 10인 용액; (xi) 약 4%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 9.0인 용액; 및 (xii) 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 아르기닌을 포함하고, pH가 약 5.0인 용액으로부터 선택된 용액이다.
임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 기재된 바대로 매트릭스를 세척 용액으로 세척하기 전에 매트릭스를 제1 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 포스페이트 완충액, 트리스 완충액, 아세테이트 완충액, 카보네이트 완충액, 시트레이트 완충액, 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 약 10 mM 내지 약 100 mM 또는 약 10 mM 내지 약 500 mM의 농도의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 포스페이트 완충액이다.
임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 기재된 바대로 매트릭스를 세척 용액으로 세척한 후에 매트릭스를 제2 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 포스페이트 완충액, 트리스 완충액, 아세테이트 완충액, 카보네이트 완충액, 시트레이트 완충액, 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 약 10 mM 내지 약 100 mM 또는 약 10 mM 내지 약 500 mM의 농도의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 pH가 약 5.0 내지 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 실질적으로 염을 적게 포함하거나 염을 포함하지 않는다.
임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 세척 단계 후 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스를 용리 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 용리물을 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 심층 여과를 통해 용리물을 여과시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물은 약 500 백만분율(ppm) 미만의 하나 이상의 불순물을 포함한다.
임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법의 적용은 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 단계가 결여된 상응하는 방법보다 더 높은 정도로 하나 이상의 불순물로부터 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드가 정제되게 한다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 하나 이상의 불순물은 숙주 세포 단백질(HCP)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 HCP는 포스포리파아제(예를 들어, 추정 포스포리파아제 B-유사 2), 클루스테린, 세린 프로테아제, 연장 인자, 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포이다.
일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 마우스 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 마우스 Fc 영역은 마우스 IgG1, IgG2 또는 IgG3 Fc 영역을 포함한다. 임의의 이전의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체이다.
일부 구현예에서, 상기 방법의 어느 하나는, 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스를 (i) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플과 접촉시키기 전에, 예를 들어 (i) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플을 제조하기 위해 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 벤조에이트염의 최종 농도 및 약 7.0 내지 약 9.0의 pH를 달성하도록 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 수확물을 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염은 벤조에이트 알칼리염이다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염은 벤조산나트륨이다. 일부 구현예에서, 수확물에서의 벤조에이트염의 최종 농도는 약 0.4 M 내지 약 0.5 M이다. 일부 구현예에서, 조정 이후의 수확물의 pH는 약 7.0 내지 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 조정 이후의 수확물의 pH는 약 8.0 내지 약 9.0이다. 일부 구현예에서, 수확물은 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 숙주 세포를 포함하는 배양물로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 진핵생물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 일부 구현예에서, 수확물은 조정 전에 청징된다. 일부 구현예에서, 수확물은 조정 후에 청징된다.
관련 양태에서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 정제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (A) 예를 들어 (i) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플을 제조하기 위해 약 0.1 M 및 약 0.5 M의 벤조에이트염의 최종 농도 및 약 7.0 내지 약 9.0의 pH를 달성하도록 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 수확물을 조정하는 단계; 및 (B) 샘플을 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스는 친화도 크로마토그래피 매트릭스를 포함한다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 매트릭스는 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스 또는 단백질 G 크로마토그래피 매트릭스이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스를 적어도 하나의 세척 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스를 용리 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 용리물을 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 심층 여과를 통해 용리물을 여과시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물은 약 500 백만분율(ppm) 미만의 하나 이상의 불순물을 포함한다.
일부 구현예에서, 벤조에이트염은 벤조에이트 알칼리염이다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염은 벤조산나트륨이다. 일부 구현예에서, 수확물에서의 벤조에이트염의 최종 농도는 약 0.4 M 내지 약 0.5 M이다. 일부 구현예에서, 조정 이후의 수확물의 pH는 약 7.0 내지 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 조정 이후의 수확물의 pH는 약 8.0 내지 약 9.0이다. 일부 구현예에서, 수확물은 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 숙주 세포를 포함하는 배양물로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 진핵생물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 일부 구현예에서, 수확물은 조정 전에 청징된다. 일부 구현예에서, 수확물은 조정 후에 청징된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플을 제조하도록 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 수확물을 조정하는 단계가 결여된 상응하는 방법보다 더 높은 정도로 하나 이상의 불순물로부터 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드가 정제되게 한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 불순물은 숙주 세포 단백질(HCP)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 HCP는 포스포리파아제, 클루스테린, 세린 프로테아제, 연장 인자, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, HCP는 추정 포스포리파아제 B-유사 2(PLBL2)이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 마우스 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 마우스 Fc 영역은 마우스 IgG1, IgG2 또는 IgG3 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체이다.
상기에 그리고 본원에 기재된 다양한 구현예의 특성 중 하나, 일부 또는 모두는 본 발명의 다른 구현예를 형성하도록 조합될 수 있다고 이해되어야 한다. 본 발명의 이들 양태 및 다른 양태는 당업자에게 명확해질 것이다. 본 발명의 이들 양태 및 다른 구현예는 하기하는 상세한 설명에 의해 추가로 기재된다.
도 1은 표시된 대조군 또는 시험 세척 용액으로 세척된 후 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포 단백질(HCP) 불순물의 농도를 보여준다.
도 2a 내지 도 2b는 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 특정 HCP(HCP-A)의 농도를 보여준다. 도 2a는 ELISA에 의해 평가된 바대로 대조군 세척과 비교하여 2% 벤질 알콜 ± 0.5 M 벤조산나트륨 및/또는 0.5 M 아르기닌으로 세척된 후 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 HCP-A의 농도를 보여준다. 도 2b는 ELISA에 의해 평가된 바대로 대조군 세척과 비교하여 9.0 또는 10.0의 pH에서의 다양한 세척 용액으로 세척된 후 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 HCP-A의 농도를 보여준다.
도 3은 ELISA에 의해 평가된 바대로 추가적인 시험 화합물을 함유하는 표시된 세척 용액으로 세척된 후 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 HCP-A의 농도를 보여준다.
도 4a 내지 도 4b는 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 일반 HCP 및 PLBL2의 농도를 보여준다. 도 4a는 ELISA에 의해 평가된 바대로 공정 대조군 세척과 비교하여 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 벤조산나트륨 또는 4% 벤질 알콜로 세척된 후 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 일반 HCP의 농도를 보여준다. 도 4b는 ELISA에 의해 평가된 바대로 공정 대조군 세척과 비교하여 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 벤조산나트륨 또는 4% 벤질 알콜로 세척된 후 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 일반 PLBL2의 농도를 보여준다.
도 5는 2% 벤질 알콜 및 0.5 M 벤조산나트륨을 포함하는 중간 세척액으로 세척된 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플의 시각 투명성의 개선을 보여준다.
도 6a 내지 도 6b는 40 g/ℓ 초과의 단백질 A 칼럼을 로딩할 때 오프-칼럼 수율 및 PLBL2 제거의 감소를 보여준다. 도 6a는 단백질 A 칼럼의 로딩 밀도가 40 g/ℓ로부터 60 g/ℓ로 증가하면서 오프-칼럼 수율의 백분율이 93.1%로부터 78.1%로 직선으로 감소한다는 것을 보여준다. 도 6b는 단백질 A 칼럼의 로딩 밀도가 40 g/ℓ로부터 60 g/ℓ로 증가하면서 단백질 A 칼럼으로부터 세척된 PLBL2의 수준이 32.1 ppm으로부터 17 ppm으로 감소한다는 것을 보여준다.
도 7은 단백질 A 정제 전 0.5 M 벤조산나트륨 및 pH 7.2로의 수확물 조정 또는 0.5 M 벤조산나트륨 및 pH 9로의 수확물 조정이 PLBL2 및 HCP 불순물의 제거를 개선한다는 것을 보여준다. pH 9.0에서의 0.5 M 벤조산나트륨으로의 수확물 조정은 PLBL2 및 HCP 불순물의 최저 수준을 보여주고, pH 조정 단독에 비해 PLBL2 제거의 더 높은 로그를 나타낸다.
도 8은 PLBL2 함량과 벤조산나트륨 농도 사이의 관계식이 대략 S자형이라는 것을 보여준다. 0.4 M 벤조산나트륨 초과의 농도에 대해 PLBL2의 제거의 감소된 이득이 관찰되었다.
도 2a 내지 도 2b는 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 특정 HCP(HCP-A)의 농도를 보여준다. 도 2a는 ELISA에 의해 평가된 바대로 대조군 세척과 비교하여 2% 벤질 알콜 ± 0.5 M 벤조산나트륨 및/또는 0.5 M 아르기닌으로 세척된 후 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 HCP-A의 농도를 보여준다. 도 2b는 ELISA에 의해 평가된 바대로 대조군 세척과 비교하여 9.0 또는 10.0의 pH에서의 다양한 세척 용액으로 세척된 후 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 HCP-A의 농도를 보여준다.
도 3은 ELISA에 의해 평가된 바대로 추가적인 시험 화합물을 함유하는 표시된 세척 용액으로 세척된 후 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 HCP-A의 농도를 보여준다.
도 4a 내지 도 4b는 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 일반 HCP 및 PLBL2의 농도를 보여준다. 도 4a는 ELISA에 의해 평가된 바대로 공정 대조군 세척과 비교하여 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 벤조산나트륨 또는 4% 벤질 알콜로 세척된 후 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 일반 HCP의 농도를 보여준다. 도 4b는 ELISA에 의해 평가된 바대로 공정 대조군 세척과 비교하여 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 벤조산나트륨 또는 4% 벤질 알콜로 세척된 후 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플에서의 일반 PLBL2의 농도를 보여준다.
도 5는 2% 벤질 알콜 및 0.5 M 벤조산나트륨을 포함하는 중간 세척액으로 세척된 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체 샘플의 시각 투명성의 개선을 보여준다.
도 6a 내지 도 6b는 40 g/ℓ 초과의 단백질 A 칼럼을 로딩할 때 오프-칼럼 수율 및 PLBL2 제거의 감소를 보여준다. 도 6a는 단백질 A 칼럼의 로딩 밀도가 40 g/ℓ로부터 60 g/ℓ로 증가하면서 오프-칼럼 수율의 백분율이 93.1%로부터 78.1%로 직선으로 감소한다는 것을 보여준다. 도 6b는 단백질 A 칼럼의 로딩 밀도가 40 g/ℓ로부터 60 g/ℓ로 증가하면서 단백질 A 칼럼으로부터 세척된 PLBL2의 수준이 32.1 ppm으로부터 17 ppm으로 감소한다는 것을 보여준다.
도 7은 단백질 A 정제 전 0.5 M 벤조산나트륨 및 pH 7.2로의 수확물 조정 또는 0.5 M 벤조산나트륨 및 pH 9로의 수확물 조정이 PLBL2 및 HCP 불순물의 제거를 개선한다는 것을 보여준다. pH 9.0에서의 0.5 M 벤조산나트륨으로의 수확물 조정은 PLBL2 및 HCP 불순물의 최저 수준을 보여주고, pH 조정 단독에 비해 PLBL2 제거의 더 높은 로그를 나타낸다.
도 8은 PLBL2 함량과 벤조산나트륨 농도 사이의 관계식이 대략 S자형이라는 것을 보여준다. 0.4 M 벤조산나트륨 초과의 농도에 대해 PLBL2의 제거의 감소된 이득이 관찰되었다.
단백질을 함유하는 Fc-영역의 단백질 A-기반 단리 동안 공동정제된 불순물(예를 들어, 숙주 세포 단백질 불순물)의 수를 감소시키는 방법이 본원에 기재된다. 본 발명의 방법은 단백질 A 친화도 크로마토그래피 동안 수집된 용리물에서 숙주 세포 단백질 불순물의 수준을 유의미하게 감소시키는 것으로 나타난 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜을 함유하는 신규의 세척 용액을 사용한 중간 세척 단계를 적용한다(실시예 1 및 실시예 2 참조). 이 신규의 세척 용액에서의 하나 이상의 첨가제(예를 들어, 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 크레아티닌, 및/또는 아르기닌)의 포함은 단백질 A 매트릭스로부터의 포획 및 용리 후 Fc-영역 함유 단백질을 함유하는 단백질 용리물로부터의 불순물의 제거를 추가로 개선한다.
I. 정의
본 발명을 자세히 기재하기 전에, 본 발명이 물론 변할 수 있는 특정 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한되지 않는다고 이해되어야 한다. 본원에 사용된 전문용어가 오직 특정 구현예를 기술할 목적이고, 제한인 것으로 의도되지 않는다고 또한 이해되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바대로, 단수 형태의 표현은 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "분자"의 언급은 선택적으로 2개 이상의 이러한 분자의 조합 등을 포함한다.
용어 "약"은 본원에 사용된 바대로 이 기술 분야에서의 당업자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 일반 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 값 또는 매개변수의 언급은 특히 그 값 또는 매개변수에 관한 구현예를 포함한다(그리고 이를 기재한다).
본원에 기재된 본 발명의 양태 및 구현예가 양태 및 구현예를 "포함하는", 양태 및 구현예로 "이루어진" 및 양태 및 구현예로 "본질적으로 이루어진"을 포함하는 것으로 이해된다.
"A 및/또는 B"와 같은 구절에서 용어 "및/또는"은 본원에 사용된 바대로 A와 B 둘 다; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)를 포괄하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 구절에서 용어 "및/또는"은 본원에 사용된 바대로 각각의 하기 구현예를 포괄하도록 의도된다: A, B와 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하도록 본원에서 상호교환되어 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이것은 비아미노산에 의해 중단될 수 있다. 그 용어는 또한 자연적으로 또는 중재에 의해 변형된 아미노산 중합체; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글라이코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분 또는 독소와의 접합을 포괄한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체를 함유하는 폴리펩타이드(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함), 및 당해 분야에 공지된 다른 변형이 정의 내에 또한 포함된다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 단일클론 항체(전장 단일클론 항체를 포함), 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체 등), 항체 단편, 또는 폴리펩타이드가 원하는 활성을 나타내는 한 하나 이상의 CDR 또는 CDR-유래된 서열을 보유하는 합성 폴리펩타이드를 포함한다. 항체(Ab) 및 면역글로불린(Ig)은 동일한 구조 특징을 갖는 당단백질이다. 일반적으로, 항체는 규정되거나 인식된 특이성을 갖는 Ig로 간주된다. 따라서, 항체가 특이적 표적에 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로불린은 표적 특이성이 결여된 항체 및 다른 항체-유사 분자 둘 다를 포함한다. 본 발명의 항체는 임의의 종류(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 등), 또는 하위종류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG2a, gG3, IgG4, IgA1, IgA2 등)일 수 있다. "유형" 및 "종류" 및 "아형" 및 "하위종류"는 본원에서 상호교환되어 사용된다. (집단의 비인공적으로 조작된 구성원으로부터 얻은) 자연적 또는 야생형 항체 및 면역글로불린은 보통 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사합체 당단백질이다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에서 가변 도메인(VH), 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에서 가변 도메인(VL) 및 다른 말단에서 불변 도메인을 갖는다. 본원에 기재된 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 비인간 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 낙타 등) 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
항체의 가변 도메인의 맥락에서의 용어 "가변"은, 항체들 사이에 그리고 항체들 중에 광범위하게 다르고 특이적 인식 및 결합에 사용되는 적절한 분자의 소정의 부분, 또는 이의 특정 표적에 대한 특정 항체를 지칭할 수 있다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역으로도 공지된 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)이라 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분은 프레임워크(FR) 영역 또는 서열이라 불린다. 자연적 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 대개 β-시트 구성을 채용하는 4개의 FR 영역을 포함하는데, 상기 CDR은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에 이의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 사슬에서의 CDR은 대개 FR 영역과 근접하게 함께 보유되고, 다른 사슬로부터의 CDR2에 의해 항체의 표적(에피토프 또는 결정부위) 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Nation Institute of Health, Bethesda, MD (1987)] 참조). 본원에 사용된 바대로, 면역글로불린 아미노산 잔기의 넘버링은 달리 표시되지 않는 한 Kabat 등의 면역글로불린 아미노산 잔기 넘버링 시스템에 따라 수행된다. 하나의 CDR은 동족 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 수 있다.
용어 "힌지" 또는 "힌지 영역"은 본원에 사용된 바대로 항체의 제1 불변 도메인과 제2 불변 도메인 사이에 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다.
용어 "이중특이적 항체"는 단일 분자 내에 2개의 항체의 항원 결합 부위를 조합하는 분자를 지칭할 수 있다. 따라서, 이중특이적 항체는 동시에 2개의 상이한 항원에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 지칭할 수 있고, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 본원에서 구체적으로 단일클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 종류 또는 하위종류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일한 또는 상동성이며, 이때 사슬(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 종류 또는 하위종류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일한 또는 상동성인 "키메라" 항체, 및 이러한 항체의 단편이 원하는 활성을 보유하는 한 이 단편을 포함한다.
용어 "다가 항체" 또는 "다원자가 항체"는 본원에 사용된 바대로 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함함으로써, 동일한 또는 상이한 구조를 가질 수 있는 2개 이상의 항원에 동시에 결합할 수 있는 항체를 지칭할 수 있다. 용어 "2가"는 항체가 2개의 항원 결합 부위를 포함한다는 것을 의미한다. 용어 "4가"는 항체가 4개의 항원 결합 부위를 포함한다는 것을 의미한다.
용어 "항원 결합 부위"는 본원에 사용된 바대로 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 부분을 지칭할 수 있다. 항원이 큰 경우, 항체는 특정 항원 부분에 오직 결합할 수 있고, 이 부분은 에피토프라 불린다. 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있고, 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인(VH)의 화합으로 만들어질 수 있다.
비인간(예를 들어, 쥐과) 항체의 "인간화된" 형태는 인간 항체와 비교하여 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 이의 단편이다. 일반적으로, 인간화된 항체는 1개 및 통상적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 것에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 주형 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 통상적으로 선택된 인간 면역글로불린 주형의 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, 목표는 인간에서 최소로 면역원성인 항체 분자를 갖는 것이다. 따라서, 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 아미노산이 표적에 대한 하나 이상의 CDR의 특이적 결합 기능을 실질적으로 최소화하지 않으면서 인간 숙주에 덜 면역원성인 것으로 또한 변경될 수 있는 것이 가능하다. 대안적으로, FR은 비인간일 수 있지만, 가장 면역원성인 아미노산은 덜 면역원성인 것으로 대체된다. 그렇기는 하지만, (상기 기재된 바대로) CDR 그래프팅은 인간화된 항체를 얻는 유일한 방식이 아니다. 예를 들어, 프레임워크 잔기가 CDR 루프의 3차원 구조 및 이의 리간드에 대한 항체의 전체 친화도를 결정하는 역할을 하는 것이 드물지 않으므로 단지 CDR 영역을 변형시키는 것은 불충분할 수 있다. 그러므로, 임의의 수단은 비인간 모 항체 분자가 인간에 덜 면역원성인 것으로 변형되도록 실행될 수 있고, 인간 항체와의 전반적인 서열 동일성은 항상 필수적인 것은 아니다.
용어 "불순물"은 용액에 존재하는 임의의 외래 또는 원치 않는 분자(예컨대, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 샘플)를 지칭할 수 있다. 불순물은 관심 단백질을 함유하는 샘플에 또한 존재하는 단백질, RNA 또는 DNA와 같은 생물학적 분자(예를 들어, 마크로분자)일 수 있다. 불순물은 원치 않는 단백질 변이체(예를 들어, 응집된 단백질, 미스폴딩된 단백질, 언더디설파이드-결합된 단백질, 단편 등), 숙주 세포로부터의 다른 단백질, 세포 배양 배지로부터의 성분, 친화도 크로마토그래피에 사용되는 흡착제의 부분인 분자(예를 들어, 단백질 A), 내독소, 핵산, 바이러스 등을 포함할 수 있다.
II. FC-영역 함유 폴리펩타이드를 단리하고/하거나 정제하는 방법
개관
본 발명의 소정의 양태는 단백질 A 크로마토그래피를 통해 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)를 정제하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)가 단백질 A에 결합하는 조건 하에 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스 또는 수지를 (1) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체) 및 (2) 하나 이상의 불순물(예를 들어, 숙주 세포 불순물)을 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; 및 매트릭스를 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜을 포함하는 세척 용액으로 세척하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도의 벤조에이트염을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5% 내지 약 4% 용적/용적(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 10.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 하나 이상의 첨가제(예를 들어, 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염(예컨대, 염화나트륨), 크레아티닌, 및/또는 아르기닌 중 하나 이상)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 완충제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 수확물은 (1) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체) 및 (2) 하나 이상의 불순물(예를 들어, 숙주 세포 불순물)을 포함하는 샘플을 제조하기 위해 약 0.1 M 내지 0.5 M의 벤조에이트염의 최종 농도 및 약 7 내지 약 9의 pH를 달성하도록 조정된다.
샘플과 단백질 A 매트릭스 또는 수지와의 접촉
본 발명의 소정의 양태는 단백질 A 크로마토그래피를 통해 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)를 정제하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)가 단백질 A에 결합하는 조건 하에 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스 또는 수지를 (1) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체) 및 (2) 하나 이상의 불순물(예를 들어, 숙주 세포 불순물)을 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 샘플(예를 들어, 세포 용해물 샘플, 세포 배양 상청액 샘플 등)로부터 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체, 면역접합체, 융합 단백질 등)를 정제하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 샘플은 세포 배양 상청액(예를 들어, 폴리펩타이드를 생산하거나 분비하도록 조작된 CHO 세포와 같은 세포로부터의 상청액)이거나, 세포 배양 상청액(예를 들어, 부분적으로 정제된 세포 배양 상청액 샘플)으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 분비된 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역이고, 자연적-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 Cys226 위치에서의 아미노산 잔기 또는 Pro230으로부터 이의 카복실-말단으로 펼쳐진 것으로 정의된다(Fc 영역에서의 잔기의 넘버링은 카밧에서처럼 EU 지수의 것임). 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 CH2 및 CH3의 2개의 불변 도메인을 포함하고, 선택적으로 CH4 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 임의의 적합한 면역글로불린, 예컨대 IgG1 lgG2, lgG3 또는 lgG4 아형, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 얻은 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 인간 Fc 영역, 비인간 동물 Fc 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 등), 또는 임의의 이들의 조합의 아미노산 서열을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 마우스 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 마우스 Fc 영역은 마우스 IgG1, IgG2 또는 IgG3 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, 및/또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 항체이다. 일부 구현예에서, "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 단일클론 항체(전장 단일클론 항체를 포함), 다중클론 항체, 다가 항체(예를 들어, 2가, 3가, 4가 등), 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적 등)를 구체적으로 포괄한다. 항체는 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터 등), 토끼, 낙타, 상어를 포함하는 임의의 기원이고/이거나 재조합으로 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 및/또는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 다중특이적 및/또는 다가 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체이다.
일부 구현예에서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 샘플(예를 들어, 세포 용해물 샘플, 세포 배양 상청액 샘플 등)은 하나 이상의 불순물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 불순물은 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용되는 과정(예를 들어, 분비된 항체를 생산하는 과정)으로 인해 샘플에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 불순물은 숙주 세포로부터 유래된 하나 이상의 불순물(예를 들어, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, 하나 이상의 숙주 세포 핵산, 하나 이상의 숙주 세포 지질 등)이다. 숙주 세포는 예를 들어 원핵생물 세포(예컨대, E. 콜라이 세포, A. 니게르 세포 등), 진핵생물 세포(예컨대, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, S1 세포)), 및/또는 포유류(마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 인간, 비인간 영장류 등) 세포(예를 들어, 하이브리도마, CHO 세포, 293T 세포, PER.C6 세포, NS0 세포 등)를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 생산에 적합한 당해 분야에 공지된 임의의 숙주 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 불순물은 하나 이상의 숙주 세포 단백질(HCP)이다. 일부 구현예에서, HCP는 세포 배양 또는 발효 동안 숙주 세포에 의해 생산된 비산물 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 불순물은 포스포리파아제, 클루스테린, 세린 프로테아제, 연장 인자, 및/또는 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 1개 이상(예를 들어, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 등)의 숙주 세포 단백질(HCP)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 불순물은 하나 이상의 CHO 세포 HCP이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CHO 세포 HCP는 포스포리파아제, 클루스테린, 세린 프로테아제, 연장 인자, 및/또는 임의의 이들의 조합 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 A 크로마토그래피를 통해 샘플에서의 하나 이상의 불순물로부터 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 정제하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 샘플은 단백질 A 매트릭스 또는 수지와 접촉한다. 일부 구현예에서, 샘플은 샘플에서의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드가 단백질 A에 결합하기에 적합한 조건 하에 단백질 A 매트릭스 또는 수지와 접촉한다. Fc-영역 함유 폴리펩타이드를 단백질 A 매트릭스 또는 수지와 접촉시키고 결합시키기 위한 방법 및 적합한 조건(예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 단백질 A 매트릭스 또는 수지의 제조사의 프로토콜에 기재된 바와 같은 방법)은 당업자에 의해 용이하게 이해된다. 예를 들어: MabSelect, MabSelect Xtra, MabSelect Sure, MabSelect Sure LX Protein A, MabSelect pcc, MabSelect PrismA, rProtein A Sepharose CL-4B 및 nProtein A Sepharose 4 FF(GE Healthcare); EshmunoA, ProSep A, ProSep-vA High Capacity, ProSep-vA Ultra 및 ProSep-vA UltraPlus(Millipore); Poros A 및 Mabcapture A(Poros); IPA-300, IPA-400 및 IPA-500(RepliGen Corp.); Affigel protein A 및 Affiprep protein A(Bio-Rad); MABsorbent A1PP 및 MABsorbent A2P(Affinity Chromatography Ltd.); Protein A Ceramic Hyper D F(Pall Corp.); Ultralink Immobilized protein A 및 Agarose Protein A(PIERCE); Protein A Cellthru 300 및 Protein A Ultraflow(Bioseparation); Amsphere A3 (JSR); 및/또는 Toyopearl AF-rProtein A HC-650F(Tosoh Biosciences)를 포함하는, 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 단백질 A 매트릭스 또는 수지는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 A 매트릭스 또는 수지는 칼럼 크로마토그래피 형식으로 사용된다. 일부 구현예에서, 단백질 A 매트릭스 또는 수지의 하나 이상의 매개변수(예컨대, pH, 이온 농도, 온도, 다른 물질의 첨가)는 단백질 A 매트릭스 또는 수지를 샘플과 접촉시키기 전에 조정된다. 일부 구현예에서, 단백질 A 매트릭스 또는 수지는 단백질 A 매트릭스 또는 수지를 샘플과 접촉시키기 전에 및/또는 접촉시킨 후에 플러싱, 세척, 평형화, 스트리핑 및/또는 위생처리된다. 일부 구현예에서, 단백질 A 매트릭스 또는 수지는 단백질 A 매트릭스 또는 수지를 샘플과 접촉시키기 전에 평형화 및/또는 세척된다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 평형화 및/또는 세척 완충액이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 A 매트릭스 또는 수지는 사용 사이에 위생처리, 스트리핑 및/또는 재생성된다.
세척 용액으로 단백질 A 매트릭스 또는 수지를 세척하는 것
본 발명의 소정의 양태는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)에 결합된 단백질 A 매트릭스 또는 수지를 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜을 포함하는 세척 용액으로 세척함으로써 단백질 A 크로마토그래피를 통해 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 정제하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)가 단백질 A에 결합하는 조건 하에 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스 또는 수지를 (1) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체) 및 (2) 하나 이상의 불순물(예를 들어, 숙주 세포 불순물)을 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; 및 매트릭스 또는 수지를 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도의 벤조에이트염 및/또는 약 0.5% 내지 약 4% 용적/용적(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하는 세척 용액으로 세척하는 단계를 포함하고, 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 10.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 벤조에이트염을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 벤질 알콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 벤조에이트염 및 벤질 알콜을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 벤조에이트염 및/또는 벤조산을 포함하는 세척 용액(예를 들어, pH 조정됨)에 관한 것이다. 예를 들어 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, 벤조산리튬, 벤조산칼슘, 벤조산마그네슘, 벤조산베릴륨, 벤조산바륨, 벤조산스트론튬, 벤조산루비듐, 벤조산세슘 및/또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 원천 또는 형태의 벤조에이트염(예를 들어, 알칼리염) 및/또는 벤조산이 본 발명의 세척 용액에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염은 벤조에이트 알칼리염이다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염은 벤조산나트륨 또는 벤조산칼륨이다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염은 벤조산나트륨이다.
일부 구현예에서, 벤조에이트염(예를 들어, 벤조산나트륨) 및/또는 벤조산은 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 예를 들어, 벤조에이트염(예를 들어, 벤조산나트륨) 및/또는 벤조산은 약 0.1 M 내지 약 1.0 M, 약 0.1 M 내지 약 0.9 M, 약 0.1 M 내지 약 0.8 M, 약 0.1 M 내지 약 0.7 M, 약 0.1 M 내지 약 0.6 M, 약 0.1 M 내지 약 0.5 M, 약 0.1 M 내지 약 0.4 M, 약 0.1 M 내지 약 0.3 M, 약 0.1 M 내지 약 0.2 M, 약 0.2 M 내지 약 1.0 M, 약 0.2 M 내지 약 0.9 M, 약 0.2 M 내지 약 0.8 M, 약 0.2 M 내지 약 0.7 M, 약 0.2 M 내지 약 0.6 M, 약 0.2 M 내지 약 0.5 M, 약 0.2 M 내지 약 0.4 M, 약 0.2 M 내지 약 0.3 M, 약 0.3 M 내지 약 1.0 M, 약 0.3 M 내지 약 0.9 M, 약 0.3 M 내지 약 0.8 M, 약 0.3 M 내지 약 0.7 M, 약 0.3 M 내지 약 0.6 M, 약 0.3 M 내지 약 0.5 M, 약 0.3 M 내지 약 0.4 M, 약 0.4 M 내지 약 1.0 M, 약 0.4 M 내지 약 0.9 M, 약 0.4 M 내지 약 0.8 M, 약 0.4 M 내지 약 0.7 M, 약 0.4 M 내지 약 0.6 M, 약 0.4 M 내지 약 0.5 M, 약 0.5 M 내지 약 1.0 M, 약 0.5 M 내지 약 0.9 M, 약 0.5 M 내지 약 0.8 M, 약 0.5 M 내지 약 0.7 M, 약 0.5 M 내지 약 0.6 M, 약 0.6 M 내지 약 1.0 M, 약 0.6 M 내지 약 0.9 M, 약 0.6 M 내지 약 0.8 M, 약 0.6 M 내지 약 0.7 M, 약 0.7 M 내지 약 1.0 M, 약 0.7 M 내지 약 0.9 M, 약 0.7 M 내지 약 0.8 M, 약 0.8 M 내지 약 1.0 M, 약 0.8 M 내지 약 0.9 M, 또는 약 0.9 M 내지 약 1.0 M의 농도로 세척 용액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염(예를 들어, 벤조산나트륨) 및/또는 벤조산은 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염(예를 들어, 벤조산나트륨) 및/또는 벤조산은 약 0.1 M 내지 약 0.3 M의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 벤조에이트염(예를 들어, 벤조산나트륨) 및/또는 벤조산은 약 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M, 0.5 M, 0.55 M, 0.6 M, 0.65 M, 0.7 M, 0.75 M, 0.8 M, 0.85 M, 0.9 M, 0.95 M 또는 1.0 M 중 어느 하나의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염(예를 들어, 벤조산나트륨) 및/또는 벤조산은 약 0.5 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염(예를 들어, 벤조산나트륨) 및/또는 벤조산은 약 0.1 M 또는 약 0.1 M 미만, 약 0.3 M 또는 약 0.3 M 미만, 약 0.5 M 또는 약 0.5 M 미만, 약 0.75 M 또는 약 0.75 M 미만, 또는 약 1.0 M 또는 약 1.0 M 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염(예를 들어, 벤조산나트륨) 및/또는 벤조산은 약 0.5 M 또는 약 0.5 M 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 벤질 알콜을 포함하는 세척 용액에 관한 것이다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 원천 또는 형태의 벤질 알콜은 본 발명의 세척 용액에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 0.5% 내지 약 4.0% 용적/용적(v/v)의 농도로 세척 용액에 존재한다. 예를 들어, 벤질 알콜은 약 0.5% 내지 약 4%, 약 1% 내지 약 4%, 약 1.5% 내지 약 4%, 약 2% 내지 약 4%, 약 2.5% 내지 약 4%, 약 3% 내지 약 4%, 약 3.5% 내지 약 4%, 약 0.5% 내지 약 3.5%, 약 1% 내지 약 3.5%, 약 1.5% 내지 약 3.5%, 약 2% 내지 약 3.5%, 약 2.5% 내지 약 3.5%, 약 3% 내지 약 3.5%, 약 0.5% 내지 약 3%, 약 1% 내지 약 3%, 약 1.5% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 3%, 약 2.5% 내지 약 3%, 약 0.5% 내지 약 2.5%, 약 1% 내지 약 2.5%, 약 1.5% 내지 약 2.5%, 약 2% 내지 약 2.5%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 1% 내지 약 2%, 약 1.5% 내지 약 2%, 약 0.5% 내지 약 1.5%, 약 1% 내지 약 1.5%, 또는 약 0.5% 내지 약 1%(v/v)의 농도로 세척 용액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 1% 내지 약 4% 용적/용적(v/v)의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 1% 내지 약 2% 용적/용적(v/v)의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 0.5%, 0.75%, 1%, 1.25%, 1.5%, 1.75%, 2%, 2.25%, 2.5%, 2.75%, 3%, 3.25%, 3.5%, 3.75% 또는 약 4%(v/v) 중 어느 하나의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 2%(v/v)의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 1% 또는 약 1% 미만, 약 2% 또는 약 2% 미만, 약 3% 또는 약 3% 미만, 또는 약 4% 또는 약 4% 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 4% 또는 약 4%(v/v) 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 벤질 알콜은 약 4% 또는 약 2%(v/v) 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다.
첨가제
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 본원에 기재된 임의의 농도로 1종 이상(예를 들어, 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상 또는 모든 5종)의 하기 첨가제를 추가로 포함한다: 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염, 및/또는 크레아티닌. 일부 구현예에서, 하나 이상의 첨가제를 포함하는 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 10.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액에서의 하나 이상의 첨가제의 포함은 본원에 기재된 방법에 의해 하나 이상의 불순물(예를 들어, 숙주 세포 불순물)로부터의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 정제를 추가로 개선한다.
일부 구현예에서, 세척 용액은 약 4.0 내지 약 10.0의 pH에서 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜 및 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염, 및/또는 크레아티닌 중 1종을 포함한다. 예를 들어, 세척 용액은 약 4.0 내지 약 10.0의 pH에서 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜 및 벤젠설포네이트; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜 및 카프릴산; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜 및 헥실렌 글리콜; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜 및 비완충 염; 또는 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜 및 크레아티닌을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세척 용액은 약 4.0 내지 약 10.0의 pH에서 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜 및 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염, 및/또는 크레아티닌 중 2종을 포함한다. 예를 들어, 세척 용액은 약 4.0 내지 약 10.0의 pH에서 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트 및 카프릴산; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트 및 헥실렌 글리콜; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 카프릴산 및 헥실렌 글리콜; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 카프릴산 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 카프릴산 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 헥실렌 글리콜 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 헥실렌 글리콜 및 크레아티닌; 또는 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 비완충 염 및 크레아티닌을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세척 용액은 약 4.0 내지 약 10.0의 pH에서 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜 및 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염, 및/또는 크레아티닌 중 3종을 포함한다. 예를 들어, 세척 용액은 약 4.0 내지 약 10.0의 pH에서 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트, 카프릴산 및 헥실렌 글리콜; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트, 카프릴산 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트, 카프릴산 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트, 헥실렌 글리콜 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트, 헥실렌 글리콜 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트, 비완충 염 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 카프릴산, 헥실렌 글리콜 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 카프릴산, 헥실렌 글리콜 및 크레아티닌; 또는 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 카프릴산, 비완충 염 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 헥실렌 글리콜, 비완충 염 및 크레아티닌을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세척 용액은 약 4.0 내지 약 10.0의 pH에서 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜 및 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염, 및/또는 크레아티닌 중 4종을 포함한다. 예를 들어, 세척 용액은 약 4.0 내지 약 10.0의 pH에서 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트, 카프릴산, 비완충 염 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 벤젠설포네이트, 헥실렌 글리콜, 비완충 염 및 크레아티닌; 또는 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염 및 크레아티닌을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세척 용액은 약 4.0 내지 약 10.0의 pH에서 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜 및 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염 및 크레아티닌 중 모든 5종을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 벤젠설포네이트를 포함하는 세척 용액에 관한 것이다. 예를 들어 벤젠설포네이트 염(예를 들어, 알칼리염), 예컨대 나트륨 벤젠설포네이트 또는 칼륨 벤젠설포네이트, 벤젠설폰산 및/또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 형태 또는 원천의 벤젠설포네이트가 본 발명의 세척 용액에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 벤젠설포네이트는 나트륨 벤젠설포네이트이다.
일부 구현예에서, 벤젠설포네이트(예를 들어, 나트륨 벤젠설포네이트)는 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 예를 들어, 나트륨 벤젠설포네이트는 약 0.1 M 내지 약 0.5 M, 약 0.1 M 내지 약 0.4 M, 약 0.1 M 내지 약 0.3 M, 약 0.1 M 내지 약 0.2 M, 약 0.2 M 내지 약 0.5 M, 약 0.2 M 내지 약 0.4 M, 약 0.2 M 내지 약 0.3 M, 약 0.3 M 내지 약 0.5 M, 약 0.3 M 내지 약 0.4 M, 또는 약 0.4 M 내지 약 0.5 M의 농도로 세척 용액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 나트륨 벤젠설포네이트는 약 0. 1 M 내지 약 0.3 M의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 나트륨 벤젠설포네이트는 약 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M 또는 0.5 M 중 어느 하나의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 나트륨 벤젠설포네이트는 약 0.5 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 나트륨 벤젠설포네이트는 약 0.1 M 또는 약 0.1 M 미만, 약 0.3 M 또는 약 0.3 M 미만, 또는 약 0.5 M 또는 약 0.5 M 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 나트륨 벤젠설포네이트는 약 0.5 M 또는 약 0.5 M 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 카프릴산을 포함하는 세척 용액에 관한 것이다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 형태 또는 원천의 카프릴산이 본 발명의 세척 용액에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 카프릴산은 약 1 mM 내지 약 50 mM의 농도로 세척 용액에 존재한다. 예를 들어, 카프릴산은 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 40 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 약 1 mM 내지 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 세척 용액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 카프릴산은 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 카프릴산은 약 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM 또는 50 mM 중 어느 하나의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 카프릴산은 약 50 mM의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 카프릴산은 약 10 mM 또는 약 10 mM 미만, 약 30 mM 또는 약 30 mM 미만, 또는 약 50 mM 또는 약 50 mM 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 카프릴산은 약 50 mM 또는 약 50 mM 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 헥실렌 글리콜을 포함하는 세척 용액에 관한 것이다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 형태 또는 원천의 헥실렌 글리콜이 본 발명의 세척 용액에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 헥실렌 글리콜은 약 0.5% 내지 약 10%(v/v)의 농도로 세척 용액에 존재한다. 예를 들어, 헥실렌은 약 0.5% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 10%, 약 6% 내지 약 10%, 약 8% 내지 약 10%, 약 9% 내지 약 10%, 0.5% 내지 약 9%, 약 1% 내지 약 9%, 약 2% 내지 약 9%, 약 4% 내지 약 9%, 약 6% 내지 약 9%, 약 8% 내지 약 9%, 약 0.5% 내지 약 8%, 약 1% 내지 약 8%, 약 2% 내지 약 8%, 약 4% 내지 약 8%, 약 6% 내지 약 8%, 약 0.5% 내지 약 6%, 약 1% 내지 약 6%, 약 2% 내지 약 6%, 약 4% 내지 약 6%, 약 0.5% 내지 약 4%, 약 1% 내지 약 4%, 약 2% 내지 약 4%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 1% 내지 약 2%, 또는 약 0.5% 내지 약 1%(v/v)의 농도로 세척 용액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 헥실렌 글리콜은 약 1% 내지 약 10%(v/v)의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 헥실렌 글리콜은 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10%(v/v) 중 어느 하나의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 헥실렌 글리콜은 약 10%(v/v)의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 헥실렌 글리콜은 약 1% 또는 약 1% 미만, 약 2% 또는 약 2% 미만, 약 4% 또는 약 4% 미만, 약 6% 또는 약 6% 미만, 약 8% 또는 약 8% 미만, 또는 약 10% 또는 약 10%(v/v) 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 헥실렌 글리콜은 약 10% 또는 약 10%(v/v) 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 1종 이상(예를 들어, 1종 또는 2종 이상 또는 3종 이상 등)의 비완충 염을 포함하는 세척 용액에 관한 것이다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 형태 또는 원천의 비완충 염이 본 발명의 세척 용액에 사용될 수 있다. 비완충 염은 할로겐 염(예컨대, Cl 또는 Br을 포함하는 것), 특히 알칼리 금속(예컨대, Na 또는 K) 또는 알칼리토 금속(예컨대, Ca 또는 Mg)을 포함하는 할로겐 염을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비완충 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다. 일부 구현예에서, 비완충 염은 염화나트륨이다.
일부 구현예에서, 비완충 염(예를 들어, 염화나트륨)은 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 예를 들어, 비완충 염(예를 들어, 염화나트륨)은 약 0.1 M 내지 약 1.0 M, 약 0.1 M 내지 약 0.8 M, 약 0.1 M 내지 약 0.6 M, 약 0.1 M 내지 약 0.5 M, 약 0.1 M 내지 약 0.4 M, 약 0.1 M 내지 약 0.2 M, 약 0.2 M 내지 약 1.0 M, 약 0.2 M 내지 약 0.8 M, 약 0.2 M 내지 약 0.6 M, 약 0.2 M 내지 약 0.5 M, 약 0.2 M 내지 약 0.4 M, 약 0.4 M 내지 약 1.0 M, 약 0.4 M 내지 약 0.8 M, 약 0.4 M 내지 약 0.6 M, 약 0.4 M 내지 약 0.5 M, 약 0.5 M 내지 약 1.0 M, 약 0.5 M 내지 약 0.8 M, 약 0.5 M 내지 약 0.6 M, 약 0.6 M 내지 약 1.0 M, 약 0.6 M 내지 약 0.8 M, 또는 약 0.8 M 내지 약 1.0 M의 농도로 세척 용액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 비완충 염(예를 들어, 염화나트륨)은 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 비완충 염(예를 들어, 염화나트륨)은 약 0.5 M 내지 약 1.0 M의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 비완충 염(예를 들어, 염화나트륨)은 약 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M, 0.5 M, 0.55 M, 0.6 M, 0.65 M, 0.7 M, 0.75 M, 0.8 M, 0.85 M, 0.9 M, 0.95 M 또는 1.0 M 중 어느 하나의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 비완충 염(예를 들어, 염화나트륨)은 약 0.5 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 비완충 염(예를 들어, 염화나트륨)은 약 1.0 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 비완충 염(예를 들어, 염화나트륨)은 약 0.1 M 또는 약 0.1 M 미만, 약 0.2 M 또는 약 0.2 M 미만, 약 0.4 M 또는 약 0.4 M 미만, 약 0.5 M 또는 약 0.5 M 미만, 약 0.6 M 또는 약 0.6 M 미만, 약 0.8 M 또는 약 0.8 M 미만, 또는 약 1.0 M 또는 약 1.0 M 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 비완충 염(예를 들어, 염화나트륨)은 약 0.5 M 또는 약 0.5 M 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 비완충 염(예를 들어, 염화나트륨)은 약 1.0 M 또는 약 1.0 M 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 크레아티닌을 포함하는 세척 용액에 관한 것이다. 예를 들어, 크레아티닌-HCl, 크레아티닌 에스테르, 크레아티닌 피루베이트, 크레아티닌 포스페이트, 크레에이트 알파-케토글루타레이트, 크레아티닌 시트레이트 및/또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 형태 또는 원천의 크레아티닌이 본 발명의 세척 용액에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 크레아티닌은 크레아티닌-HCl이다.
일부 구현예에서, 크레아티닌은 약 1 mM 내지 약 100 mM의 농도로 세척 용액에 존재한다. 예를 들어, 크레아티닌은 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 75 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 75 mM, 약 10 mM 내지 약 75 mM, 약 25 mM 내지 약 75 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 25 mM, 약 10 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 세척 용액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 크레아티닌은 약 10 mM 내지 약 100 mM의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 크레아티닌은 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 크레아티닌은 약 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM 또는 100 mM 중 어느 하나의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 크레아티닌은 약 50 mM의 농도로 세척 용액에 존재한다.
아르기닌
일부 구현예에서, 본 발명은 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체를 추가로 포함하는 세척 용액에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 세척 용액에서의 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체의 포함은 본원에 기재된 방법에 의해 하나 이상의 불순물(예를 들어, 숙주 세포 불순물)로부터의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 정제를 추가로 개선한다. 예를 들어, 아르기닌, 아르기닌-HCl, 아세틸 아르기닌, 아그마틴, 아르기닌산, N-알파-부티로일-L-아르기닌, N-알파-피발로일 아르기닌, 및/또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 형태 또는 원천의 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체가 본 발명의 세척 용액에 사용될 수 있다. 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체는 L-아르기닌 및/또는 D-아르기닌, 및 이들의 유도체일 수 있다. 일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체는 아르기닌-HCl이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜을 포함하는 세척 용액에서의 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)의 사용에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 벤조에이트염 및 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 벤질 알콜 및 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 벤조에이트염, 벤질 알콜 및 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 본원에 기재된 임의의 농도로 1종 이상(예를 들어, 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 또는 모든 5종)의 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염, 및/또는 크레아티닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 10.0이다. 일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 6.0이다. 일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 5.0이다. 일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액은 pH가 약 8.0 내지 약 10.0이다. 일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액은 pH가 약 8.0 내지 약 9.0이다.
일부 구현예에서, 세척 용액은 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl), 및 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염, 및/또는 크레아티닌 중 1종을 포함한다. 예를 들어, 세척 용액은 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌 및 벤젠설포네이트; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌 및 카프릴산; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌 및 헥실렌 글리콜; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌 및 비완충 염; 또는 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌 및 크레아티닌을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세척 용액은 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl), 및 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염, 및/또는 크레아티닌 중 2종을 포함한다. 예를 들어, 세척 용액은 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트 및 카프릴산; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트 및 헥실렌 글리콜; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 카프릴산 및 헥실렌 글리콜; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 카프릴산 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 카프릴산 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 헥실렌 글리콜 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 헥실렌 글리콜 및 크레아티닌; 또는 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 비완충 염 및 크레아티닌을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세척 용액은 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl), 및 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염, 및/또는 크레아티닌 중 3종을 포함한다. 예를 들어, 세척 용액은 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트, 카프릴산 및 헥실렌 글리콜; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트, 카프릴산 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트, 카프릴산 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트, 헥실렌 글리콜 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트, 헥실렌 글리콜 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트, 비완충 염 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 카프릴산, 헥실렌 글리콜 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 카프릴산, 헥실렌 글리콜 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 카프릴산, 비완충 염 및 크레아티닌; 또는 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 헥실렌 글리콜, 비완충 염 및 크레아티닌을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세척 용액은 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl), 및 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염, 및/또는 크레아티닌 중 4종을 포함한다. 예를 들어, 세척 용액은 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜 및 비완충 염; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트, 카프릴산, 비완충 염 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 벤젠설포네이트, 헥실렌 글리콜, 비완충 염 및 크레아티닌; 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염 및 크레아티닌을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세척 용액은 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl), 및 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜, 비완충 염 및 크레아티닌 중 모든 5종을 포함한다.
일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)는 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 예를 들어, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)는 약 0.1 M 내지 약 1.0 M, 약 0.1 M 내지 약 0.9 M, 약 0.1 M 내지 약 0.8 M, 약 0.1 M 내지 약 0.7 M, 약 0.1 M 내지 약 0.6 M, 약 0.1 M 내지 약 0.5 M, 약 0.1 M 내지 약 0.4 M, 약 0.1 M 내지 약 0.3 M, 약 0.1 M 내지 약 0.2 M, 약 0.2 M 내지 약 1.0 M, 약 0.2 M 내지 약 0.9 M, 약 0.2 M 내지 약 0.8 M, 약 0.2 M 내지 약 0.7 M, 약 0.2 M 내지 약 0.6 M, 약 0.2 M 내지 약 0.5 M, 약 0.2 M 내지 약 0.4 M, 약 0.2 M 내지 약 0.3 M, 약 0.3 M 내지 약 1.0 M, 약 0.3 M 내지 약 0.9 M, 약 0.3 M 내지 약 0.8 M, 약 0.3 M 내지 약 0.7 M, 약 0.3 M 내지 약 0.6 M, 약 0.3 M 내지 약 0.5 M, 약 0.3 M 내지 약 0.4 M, 약 0.4 M 내지 약 1.0 M, 약 0.4 M 내지 약 0.9 M, 약 0.4 M 내지 약 0.8 M, 약 0.4 M 내지 약 0.7 M, 약 0.4 M 내지 약 0.6 M, 약 0.4 M 내지 약 0.5 M, 약 0.5 M 내지 약 1.0 M, 약 0.5 M 내지 약 0.9 M, 약 0.5 M 내지 약 0.8 M, 약 0.5 M 내지 약 0.7 M, 약 0.5 M 내지 약 0.6 M, 약 0.6 M 내지 약 1.0 M, 약 0.6 M 내지 약 0.9 M, 약 0.6 M 내지 약 0.8 M, 약 0.6 M 내지 약 0.7 M, 약 0.7 M 내지 약 1.0 M, 약 0.7 M 내지 약 0.9 M, 약 0.7 M 내지 약 0.8 M, 약 0.8 M 내지 약 1.0 M, 약 0.8 M 내지 약 0.9 M, 또는 약 0.9 M 내지 약 1.0 M의 농도로 세척 용액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)는 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)는 약 0.1 M 내지 약 0.3 M의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)는 약 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M, 0.5 M, 0.55 M, 0.6 M, 0.65 M, 0.7 M, 0.75 M, 0.8 M, 0.85 M, 0.9 M, 0.95 M 또는 1.0 M 중 어느 하나의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)는 약 0.5 M의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)는 약 0.1 M 또는 약 0.1 M 미만, 약 0.2 M 또는 약 0.2 M 미만, 약 0.3 M 또는 약 0.3 M 미만, 약 0.4 M 또는 약 0.4 M 미만, 약 0.5 M 또는 약 0.5 M 미만, 약 0.75 M 또는 약 0.75 M 미만, 또는 약 1.0 M 또는 약 1.0 M 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체(예를 들어, 아르기닌-HCl)는 약 0.5 M 또는 약 0.5 M 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다.
pH
일부 구현예에서, 본 발명은 pH가 약 4.0 내지 약 10.0인 세척 용액에 관한 것이다. 예를 들어, 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 10.0, 약 5.0 내지 약 10.0, 약 6.0 내지 약 10.0, 약 6.5 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 7.5 내지 약 10.0, 약 8.0 내지 약 10.0, 약 9.0 내지 약 10.0, 4.0 내지 약 9.0, 약 5.0 내지 약 9.0, 약 6.0 내지 약 9.0, 약 6.5 내지 약 9.0, 약 7.0 내지 약 9.0, 약 7.5 내지 약 9.0, 약 8.0 내지 약 9.0, 4.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 7.5 내지 약 8.0, 4.0 내지 약 7.5, 약 5.0 내지 약 7.5, 약 6.0 내지 약 7.5, 약 6.5 내지 약 7.5, 약 7.0 내지 약 7.5, 약 4.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 6.0 내지 약 7.0, 약 6.5 내지 약 7.0, 4.0 내지 약 6.5, 약 5.0 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 6.5, 4.0 내지 약 6.0, 약 5.0 내지 약 6.0, 또는 약 4.0 내지 약 5.0일 수 있다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 5.0 내지 약 9.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 6.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 5.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 8.0 내지 약 10.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 8.0 내지 약 9.0이다.
일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 4.0, 4.25, 4.5, 4.75, 5.0, 5.25, 5.5, 5.75, 6.0, 6.25, 6.5, 6.75, 7.0, 7.25, 7.5, 7.75, 8.0, 8.25, 8.5, 8.75, 9.0, 9.25, 9.5, 9.75 또는 10.0 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 4.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 5.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 6.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 6.5이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 9.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 10.0이다.
완충제
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 1종 이상(예를 들어, 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상 등)의 완충제를 추가로 포함한다. 예를 들어 포스페이트, 트리스(트리스(하이드록시메틸)메틸아민), 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 아르기닌, 히스티딘, 트리에탄올아민, 디에탄올아민, 포르메이트, 아세테이트, 카보네이트 MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), 시트레이트, HEPES(4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산), TAPS(3-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산), 비신(Bicine)(N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), 트리신(Tricine)(N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), TES(2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), 카코딜라에(cacodylae)(디메틸비산), SSC(식염수 시트르산나트륨), 및/또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 완충제가 본 발명의 세척 용액에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제는 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및/또는 시트레이트 중 1종 이상이다.
일부 구현예에서, 완충제(예를 들어, 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및/또는 시트레이트)는 약 1 mM 내지 약 100 mM 또는 약 1 mM 내지 약 500 mM의 농도로 세척 용액에 존재한다. 예를 들어, 완충제(예를 들어, 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및/또는 시트레이트)는 약 1 mM 내지 약 500 mM, 10 mM 내지 약 500 mM, 50 mM 내지 약 500 mM, 100 mM 내지 약 500 mM, 150 mM 내지 약 500 mM, 200 mM 내지 약 500 mM, 250 mM 내지 약 500 mM, 300 mM 내지 약 500 mM, 350 mM 내지 약 500 mM, 400 mM 내지 약 500 mM, 450 mM 내지 약 500 mM, 1 mM 내지 약 450 mM, 1 mM 내지 약 400 mM, 1 mM 내지 약 350 mM, 1 mM 내지 약 300 mM, 1 mM 내지 약 250 mM, 1 mM 내지 약 200 mM, 1 mM 내지 약 150 mM, 1 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 60 mM 내지 약 100 mM, 약 75 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 75 mM, 약 10 mM 내지 약 75 mM, 약 40 mM 내지 약 75 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 약 60 mM 내지 약 75 mM, 약 1 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 25 mM 내지 약 60 mM, 약 40 mM 내지 약 60 mM, 약 50 mM 내지 약 60 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 약 50 mM, 약 40 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 25 mM 내지 약 40 mM, 약 1 mM 내지 약 25 mM, 약 10 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 세척 용액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제(예를 들어, 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및/또는 시트레이트)는 약 10 mM 내지 약 50 mM 또는 약 10 mM 내지 약 500 mM의 농도로 세척 용액에 존재한다.
일부 구현예에서, 완충제(예를 들어, 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및/또는 시트레이트)는 약 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM 또는 100 mM 중 어느 하나의 농도로 세척 용액에 존재한다. 대안적으로, 완충제(예를 들어, 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및/또는 시트레이트)는 약 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM 또는 500 mM 중 어느 하나의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 완충제(예를 들어, 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및/또는 시트레이트)는 약 500 mM의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 완충제(예를 들어, 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및/또는 시트레이트)는 약 50 mM의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 완충제(예를 들어, 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및/또는 시트레이트)는 약 10 mM 또는 약 10 mM 미만, 약 25 mM 또는 약 25 mM 미만, 약 50 mM 또는 약 50 mM 미만, 약 75 mM 또는 약 75 mM 미만, 또는 약 100 mM 또는 약 100 mM 미만, 또는 약 500 mM 또는 약 500 mM 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 완충제(예를 들어, 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및/또는 시트레이트)는 약 50 mM 또는 약 50 mM 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 완충제(예를 들어, 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및/또는 시트레이트)는 약 500 mM 또는 약 500 mM 미만의 농도로 세척 용액에 존재한다.
예시적인 세척 용액
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤조산나트륨 및/또는 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및/또는 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 (예를 들어, 약 50 mM의 농도의) 포스페이트 완충액을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤조산나트륨, 벤질 알콜, 및/또는 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜, 및/또는 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 (예를 들어, 약 50 mM의 농도의) 포스페이트 완충액을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤조산나트륨, 벤질 알콜, 아르기닌, 및/또는 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜, 약 0.5 M의 농도의 아르기닌, 및/또는 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜, 약 0.5 M의 농도의 아르기닌 및 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 (예를 들어, 약 50 mM의 농도의) 포스페이트 완충액을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤조산나트륨, 벤질 알콜, 포스페이트 완충액, 및/또는 아르기닌을 포함하고, pH가 약 9.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜, 약 50 mM의 농도의 포스페이트 완충액, 및/또는 약 0.5 M의 농도의 아르기닌을 포함하고, pH가 약 9.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜, 약 50 mM의 농도의 포스페이트 완충액 및 약 0.5 M의 농도의 아르기닌을 포함하고, pH가 약 9.0이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤조산나트륨, 벤질 알콜, 및/또는 아르기닌을 포함하고, pH가 약 6.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜, 및/또는 약 0.5 M의 농도의 아르기닌을 포함하고, pH가 약 6.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 아르기닌을 포함하고, pH가 약 6.0이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 헥실렌 글리콜, 벤조산나트륨, 및/또는 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 10%(v/v)의 농도의 헥실렌 글리콜, 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 및/또는 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 10%(v/v)의 농도의 헥실렌 글리콜, 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤젠설포네이트, 벤조산나트륨, 및/또는 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤젠설포네이트, 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 및/또는 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤젠설포네이트, 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤조산나트륨, 벤질 알콜, 및/또는 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl)을 포함하고, pH가 약 5.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜, 및/또는 약 0.5 M의 농도의 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl)을 포함하고, pH가 약 5.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl)을 포함하고, pH가 약 5.0이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤조산나트륨, 벤질 알콜, 및/또는 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl)을 포함하고, pH가 약 6.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜, 및/또는 약 0.5 M의 농도의 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl)을 포함하고, pH가 약 6.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl)을 포함하고, pH가 약 6.0이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤질 알콜 및/또는 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl)을 포함하고, pH가 약 5.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및/또는 약 0.5 M의 농도의 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl)을 포함하고, pH가 약 5.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl)을 포함하고, pH가 약 5.0이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤조산나트륨, 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl), 카프릴산 및/또는 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 9.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 9.0이며 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 0.5 M의 농도의 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl), 약 50 mM의 농도의 카프릴산 및/또는 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 9.0이며 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 0.5 M의 농도의 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl), 약 50 mM의 농도의 카프릴산 및 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤조산나트륨, 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl), 카프릴산 및/또는 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 7.0이며 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 0.5 M의 농도의 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl), 약 50 mM의 농도의 카프릴산 및/또는 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 pH가 약 7.0이며 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 0.5 M의 농도의 아르기닌(예를 들어, 아르기닌-HCl), 약 50 mM의 농도의 카프릴산 및 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 벤조산나트륨 및/또는 중탄산나트륨을 포함하고, pH가 약 10.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및/또는 약 50 mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함하고, pH가 약 10.0이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 50 mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함하고, pH가 약 10.0이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세척 용액은 약 4%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 5.0 내지 약 10이다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 약 4%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 9.0이다.
크로마토그래피 전에 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 수확물의 조정
일 양태에서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 정제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (A) (i) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플을 제조하기 위해 약 0.1 M 및 약 0.5 M의 벤조에이트염의 최종 농도 및 약 7.0 내지 약 9.0의 pH를 달성하도록 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 수확물을 조정하는 단계; 및 (B) 샘플을 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스는 친화도 크로마토그래피 매트릭스, 예를 들어 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스 및/또는 단백질 G 크로마토그래피 매트릭스이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스를 적어도 하나의 세척 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스를 용리 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 용리물을 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 용어 "수확물"은 세포 배양의 종료 시 또는 세포 배양 후 존재하는 유체, 예를 들어 세포 용해물 샘플, 또는 세포 배양 상청액 샘플(예를 들어, 폴리펩타이드를 생산하고 분비하도록 조작된 CHO 세포와 같은 세포로부터의 상청액)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 수확물은 온전한 숙주 세포 및/또는 세포 부스러기를 포함한다. 일부 구현예에서, 수확물은 온전한 숙주 세포 및/또는 세포 부스러기를 포함하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 배양의 종료 시 또는 세포 배양 후 존재하는 유체는 약 0.1 M 및 약 0.5 M의 벤조에이트염의 최종 농도 및 약 7.0 내지 약 9.0의 pH를 달성하기 위해 조정 전에 하나 이상의 원심분리 및/또는 여과 단계로 처리된다. 일부 구현예에서, 수확물은 세포 배양의 종료 시 또는 세포 배양 후 존재하는 유체로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 배양의 종료 시 또는 세포 배양 후 존재하는 유체는 세포 분리 및/또는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 정제를 최적화하기 위한 하나 이상의 예비처리 단계로 처리된다.
관련 양태에서, 본원에 기재된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 정제하는 방법 중 어느 하나는 (i) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플을 제조하기 위해 0.1 M 및 약 0.5 M의 벤조에이트염의 최종 농도 및 약 7.0 내지 약 9.0의 pH를 달성하도록 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 수확물을 조정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 벤조에이트염은 벤조에이트 알칼리염이다. 일부 구현예에서, 벤조에이트염은 벤조산나트륨이다. 일부 구현예에서, 수확물은 약 0.025 M, 0.05 M, 0.075 M, 0.1 M, 0.125 M, 0.15 M, 0.175 M, 0.2 M, 0.225 M, 0.25 M, 0.275 M, 0.3 M, 0.325 M, 0.35 M, 0.375 M, 0.4 M, 0.425 M, 0.45 M, 0.475 M, 0.5 M, 0.525 M, 0.55 M, 0.575 M, 0.6 M, 0.625 M, 0.65 M, 0.675 M, 0.7 M, 0.725 M, 0.75 M, 0.775 M 또는 0.8 M 중 어느 하나와 이들 값들 사이의 임의의 범위의 벤조에이트염(예를 들어, 벤조산나트륨)의 최종 농도를 달성하도록 조정된다. 일부 구현예에서, 수확물의 pH는 약 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 또는 10.0 중 어느 하나와 이들 값들 사이의 임의의 범위로 조정된다. 일부 구현예에서, 수확물은 조정(예를 들어, 벤조산나트륨의 첨가 및 pH의 조정) 전에 청징된다. 일부 구현예에서, 수확물은 조정(예를 들어, 벤조산나트륨의 첨가 및 pH의 조정) 후에 청징된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 약 0.5 M의 최종 벤조산나트륨 농도 및 약 7의 pH를 달성하도록 수확물을 조정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 약 0.1 M의 최종 벤조산나트륨 농도 및 약 9의 pH를 달성하도록 수확물을 조정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 약 0.2 M의 최종 벤조산나트륨 농도 및 9의 pH를 달성하도록 수확물을 조정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 약 0.3 M의 최종 벤조산나트륨 농도 및 9의 pH를 달성하도록 수확물을 조정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 약 0.4 M의 최종 벤조산나트륨 농도 및 9의 pH를 달성하도록 수확물을 조정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 약 0.5 M의 최종 벤조산나트륨 농도 및 9의 pH를 달성하도록 수확물을 조정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 수확물을 조정하는 것(예를 들어, 벤조산나트륨의 첨가 및 pH의 조정)은 샘플을 제조하기 위해 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 수확물을 조정하는 단계가 결여된 상응하는 방법보다 더 높은 정도로 하나 이상의 불순물로부터 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드가 정제되게 한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 불순물은 숙주 세포 단백질(HCP), 예컨대 포스포리파아제, 클루스테린, 세린 프로테아제, 연장 인자, 및 임의의 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, HCP는 추정 포스포리파아제 B-유사 2(PLBL2)이다.
일부 구현예에서, (예를 들어, 벤조산나트륨이 본원에 기재된 최종 농도 및 본원에 기재된 바대로 조정된 pH를 달성하도록 첨가된) 조정된 수확물은 (i) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스와 접촉한다(예를 들어, 샘플은 적어도 하나의 크로마토그래피 단계로 처리됨). 일부 구현예에서, 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스는 임의의 순서로 친화도 크로마토그래피 매트릭스, 혼합-모드 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 다중모드 크로마토그래피 매트릭스), 소수성 상호작용(HIC) 크로마토그래피 매트릭스, 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스, 양이온 교환 크로마토그래피 매트릭스, 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스, 세라믹 수산화인회석(CHT) 크로마토그래피 매트릭스, 및/또는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 매트릭스 등 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 친화도 크로마토그래피 매트릭스, 예를 들어 단백질 A 매트릭스 또는 단백질 G 매트릭스와 접촉한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스를 적어도 하나의 세척 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스를 용리 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 용리물을 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
불순물 제거
본 발명의 소정의 양태는 하나 이상의 불순물로부터의 폴리펩타이드의 정제를 개선하기 위해 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)에 결합된 단백질 A 매트릭스를 벤조에이트염 및/또는 벤질 알콜을 포함하는 세척 용액으로 세척함으로써 단백질 A 크로마토그래피를 통해 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 정제하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)가 단백질 A에 결합하는 조건 하에 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스를 (1) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체) 및 (2) 하나 이상의 불순물(예를 들어, 숙주 세포 불순물)을 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; 및 매트릭스를 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도의 벤조에이트염 및/또는 약 0.5% 내지 약 4% 용적/용적(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하는 세척 용액으로 세척하는 단계(여기서, 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 10.0임)를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 A 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 것은 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 단계가 결여된 (상기 기재된 바와 같은) 상응하는 방법보다 더 높은 정도로 하나 이상의 불순물로부터 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드가 정제되게 한다.
표준 단백질 A 공정은 통상적으로 본원에 기재된 바와 같은 세척 단계의 사용 없이 약 95%의 생성물 순도를 발생시킨다. 생성물에서의 가장 높은 비율의 불순물은 생성물의 고분자량(HMW) 응집물 및/또는 저분자량(LMW) 단편으로 인한다. 이 생성물 변이체는 다양한 매개변수(예를 들어, 전하, 소수화도, 크기 차이 등)에 기초하여 생성물로부터 분리되는 이의 능력으로 인해 불순물이라 생각된다. 이 HMW 및 LMW 불순물은 단백질 A 풀의 약 4% 내지 5%를 차지한다. 더욱이, 본원에 기재된 바와 같은 세척 단계의 사용이 결여된 표준 단백질 A 공정은 또한 통상적으로 생성물 풀의 1000 ppm 또는 약 0.1%의 차수로 숙주 세포 단백질(HCP) 불순물이 포함되게 한다. 그러나, 주사용 mAb 생성물에 기재된 사양(예를 들어, FDA 가이드라인 참조)으로 인해, 이 0.1%의 HCP 불순물의 감소 및/또는 완전한 제거는 상당히 중요하다. 본원에 기재된 세척 용액을 적용하는 단계의 포함은 약 100 내지 10 ppm으로 풀에 존재하는 HCP의 양을 감소시킬 수 있어(본원에 기재된 세척 단계가 결여된 동일한 단백질 A 공정에 비해 HCP의 10배 내지 100배 감소), 90 내지 99%의 상대 개선을 차지한다. (예를 들어, ELISA 검정에 의해) 샘플 단백질 순도 및/또는 불순물 수준을 측정하는 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 표준 방법 대 임의의 본원에 기재된 방법을 사용한 하나 이상의 숙주 세포 단백질로부터의 단일클론 항체(mAb)의 예시적인 정제는 하기 표 A에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 약 500 ppm(백만분율) 미만의 HCP(예를 들어, CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)를 함유하는 단백질 A 용리 후 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 단일클론 항체)를 함유하는 단백질 풀을 생성한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 함유하는 단백질 풀은 약 500 ppm 미만, 약 450 ppm 미만, 약 400 ppm 미만, 약 350 ppm 미만, 약 300 ppm 미만, 약 250 ppm 미만, 약 200 ppm 미만, 약 150 ppm 미만, 약 100 ppm 미만, 약 75 ppm 미만, 약 50 ppm 미만, 약 25 ppm 미만, 약 10 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만의 HCP(예를 들어, CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 함유하는 단백질 풀은 약 100 ppm 미만의 HCP(예를 들어, CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 함유하는 단백질 풀은 약 10 ppm 미만의 HCP(예를 들어, CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)를 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 약 0.1% 미만의 HCP(예를 들어, CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)를 함유하는 단백질 A 용리 후 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 단일클론 항체)를 함유하는 단백질 풀을 생성한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 함유하는 단백질 풀은 약 0.1% 미만, 약 0.09% 미만, 약 0.08% 미만, 약 0.07% 미만, 약 0.06% 미만, 약 0.05% 미만, 약 0.04% 미만, 약 0.03% 미만, 약 0.02% 미만 또는 약 0.01% 미만의 HCP(예를 들어, CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 함유하는 단백질 풀은 약 0.05% 미만의 HCP(예를 들어, CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 함유하는 단백질 풀은 약 0.01% 미만의 HCP(예를 들어, CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)를 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 단백질 A 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 단계가 결여된 상응하는 방법에 의해 정제된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드와 동시정제된 하나 이상의 불순물의 양에 비해 적어도 약 10%만큼 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드와 동시정제된 하나 이상의 불순물(예를 들어, 하나 이상의 HCP, 예컨대 CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)의 양 및/또는 농도(예를 들어, 백만분율)를 감소시킨다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 단백질 A 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 단계가 결여된 상응하는 방법에 의해 정제된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드와 동시정제된 하나 이상의 불순물의 양에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%만큼 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드와 동시정제된 하나 이상의 불순물(예를 들어, 하나 이상의 HCP, 예컨대 CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)의 양 및/또는 농도(예를 들어, 백만분율)를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 단백질 A 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 단계가 결여된 상응하는 방법에 의해 정제된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드와 동시정제된 하나 이상의 불순물의 양에 비해 적어도 약 1.5배로 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드와 동시정제된 하나 이상의 불순물(예를 들어, 하나 이상의 HCP, 예컨대 CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)의 양 및/또는 농도(예를 들어, 백만분율)를 감소시킨다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 단백질 A 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 단계가 결여된 상응하는 방법에 의해 정제된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드와 동시정제된 하나 이상의 불순물의 양에 비해 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 50배, 또는 적어도 약 100배로 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드와 동시정제된 하나 이상의 불순물(예를 들어, 하나 이상의 HCP, 예컨대 CHO 세포로부터의 하나 이상의 HCP)의 양 및/또는 농도(예를 들어, 백만분율)를 감소시킨다.
추가적인 단계
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 하나 이상의 추가적인 세척 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 하나 이상의 용리 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 하나 이상의 세척 단계 및 하나 이상의 용리 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 A 매트릭스를 세척 용액으로 세척하기 전에 매트릭스를 제1 용액으로 세척하는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 매트릭스는 매트릭스를 세척 용액으로 세척하기 전에 제1 용액으로 1회 이상(예를 들어, 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상 등) 세척된다. 일부 구현예에서, 매트릭스는 매트릭스를 세척 용액으로 세척하기 전에 제1 용액으로 1회 세척된다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 완충액을 포함한다. 예를 들어 포스페이트, 트리스(트리스(하이드록시메틸)메틸아민), 아세테이트, 카보네이트, 시트레이트, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 아르기닌, 히스티딘, 트리에탄올아민, 디에탄올아민, 포르메이트, MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), HEPES(4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산), TAPS(3-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산), 비신(N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), 트리신(N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), TES(2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), 카코딜라에(디메틸비산), SSC(식염수 시트르산나트륨), 및/또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 완충액이 제1 용액에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 포스페이트 완충액, 트리스 완충액, 아세테이트 완충액, 카보네이트 완충액, 및/또는 시트레이트 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 포스페이트 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 하나 이상의 추가적인 성분(예를 들어, 본원에 기재된 벤조에이트염, 벤질 알콜, 하나 이상의 첨가제 등)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 pH가 약 5.0 내지 약 10.0(예를 들어, 약 6.0 내지 약 10.0, 약 6.0 내지 약 9.0, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 9.0, 약 8.0 내지 약 10.0, 약 8.0 내지 약 9.0, 약 9.0 내지 약 10.0, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 6.0 내지 약 7.0, 또는 약 5.0 내지 약 6.0)이다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 pH가 약 7.0이다.
일부 구현예에서, 제1 용액은 약 10 mM 내지 약 100 mM 또는 약 10 mM 내지 약 500 mM의 농도의 완충액을 포함한다. 예를 들어, 제1 용액은 약 10 mM 내지 약 500 mM, 약 100 mM 내지 약 500 mM, 약 150 mM 내지 약 500 mM, 약 200 mM 내지 약 500 mM, 약 250 mM 내지 약 500 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 약 350 mM 내지 약 500 mM, 약 400 mM 내지 약 500 mM, 약 450 mM 내지 약 500 mM, 약 10 mM 내지 약 450 mM, 약 10 mM 내지 약 400 mM, 약 10 mM 내지 약 350 mM, 약 10 mM 내지 약 300 mM, 약 10 mM 내지 약 250 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 60 mM 내지 약 100 mM, 약 75 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 75 mM, 약 25 mM 내지 약 75 mM, 약 40 mM 내지 약 75 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 약 60 mM 내지 약 75 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 25 mM 내지 약 60 mM, 약 40 mM 내지 약 60 mM, 약 50 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 약 50 mM, 약 40 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 25 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 25 mM의 농도의 완충액을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 약 10 mM 내지 약 50 mM 또는 약 10 mM 내지 약 500 mM의 농도의 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 용액은 약 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM 또는 100 mM 중 어느 하나의 농도의 완충액을 포함한다. 대안적으로, 제1 용액은 약 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM 또는 500 mM 중 어느 하나의 농도의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 약 500 mM의 농도의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 약 50 mM의 농도의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 약 500 mM의 농도의 포스페이트 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 약 50 mM의 농도의 포스페이트 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 용액은 포스페이트 완충액(예를 들어, 인산나트륨) 및 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 포스페이트 완충액(예를 들어, 인산나트륨) 및 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 약 50 mM의 농도의 포스페이트 완충액(예를 들어, 인산나트륨) 및 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용액은 약 50 mM의 농도의 포스페이트 완충액(예를 들어, 인산나트륨) 및 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 A 매트릭스를 세척 용액으로 세척한 후 매트릭스를 제2 용액으로 세척하는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 매트릭스는 매트릭스를 세척 용액으로 세척한 후 1회 이상(예를 들어, 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상 등) 제2 용액으로 세척된다. 일부 구현예에서, 매트릭스는 매트릭스를 세척 용액으로 세척한 후 제2 용액으로 1회 세척된다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 완충액을 포함한다. 예를 들어 포스페이트, 트리스(트리스(하이드록시메틸)메틸아민), 아세테이트, 카보네이트, 시트레이트, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 아르기닌, 히스티딘, 트리에탄올아민, 디에탄올아민, 포르메이트, MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), HEPES(4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산), TAPS(3-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산), 비신(N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), 트리신(N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), TES(2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), 카코딜라에(디메틸비산), SSC(식염수 시트르산나트륨), 및/또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 완충액이 제2 용액에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 포스페이트 완충액, 트리스 완충액, 아세테이트 완충액, 카보네이트 완충액, 및/또는 시트레이트 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 포스페이트 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 실질적으로 염을 적게 포함하거나 염을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 8.0(예를 들어, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 4.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 6.0 내지 약 7.0, 약 4.0 내지 약 6.0, 약 5.0 내지 약 6.0, 또는 약 4.0 내지 약 5.0)이다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 pH가 약 5.0 내지 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 실질적으로 염을 적게 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 염을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 제2 용액은 약 10 mM 내지 약 100 mM 또는 약 10 mM 내지 약 500 mM의 농도의 완충액을 포함한다. 예를 들어, 제2 용액은 약 10 mM 내지 약 500 mM, 약 100 mM 내지 약 500 mM, 약 150 mM 내지 약 500 mM, 약 200 mM 내지 약 500 mM, 약 250 mM 내지 약 500 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 약 350 mM 내지 약 500 mM, 약 400 mM 내지 약 500 mM, 약 450 mM 내지 약 500 mM, 약 10 mM 내지 약 450 mM, 약 10 mM 내지 약 400 mM, 약 10 mM 내지 약 350 mM, 약 10 mM 내지 약 300 mM, 약 10 mM 내지 약 250 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 60 mM 내지 약 100 mM, 약 75 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 75 mM, 약 25 mM 내지 약 75 mM, 약 40 mM 내지 약 75 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 약 60 mM 내지 약 75 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 25 mM 내지 약 60 mM, 약 40 mM 내지 약 60 mM, 약 50 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 약 50 mM, 약 40 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 25 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 25 mM의 농도의 완충액을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 약 10 mM 내지 약 50 mM 또는 약 10 mM 내지 약 500 mM의 농도의 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 용액은 약 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM 또는 100 mM 중 어느 하나의 농도의 완충액을 포함한다. 대안적으로, 제2 용액은 약 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM 또는 500 mM 중 어느 하나의 농도의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 약 500 mM의 농도의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 약 50 mM의 농도의 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 용액은 포스페이트 완충액(예를 들어, 인산나트륨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 포스페이트 완충액(예를 들어, 인산나트륨)을 포함하고, pH가 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 약 50 mM의 농도의 포스페이트 완충액(예를 들어, 인산나트륨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용액은 약 50 mM의 농도의 포스페이트 완충액(예를 들어, 인산나트륨)을 포함하고, pH가 약 7.0이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 단백질 A 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 것에 관한 것이고, 매트릭스를 제1 용액(세척 용액 전에) 또는 제2 용액(세척 용액 후에)으로 세척하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 단백질 A 매트릭스를 제1 용액으로 세척하는 것, 이후 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 것에 관한 것이고, 매트릭스를 제2 용액(세척 용액 후에)으로 세척하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 단백질 A 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 것 및 이후 매트릭스를 제2 용액으로 세척하는 것에 관한 것이고, 매트릭스를 제1 용액(세척 용액 전에)으로 세척하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 단백질 A 매트릭스를 제1 용액으로 세척하는 것, 이후 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 것, 및 이후 매트릭스를 제2 용액으로 세척하는 것에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 단백질 A 매트릭스는 하나 이상의 세척 단계 후 용리 용액과 1회 이상(예를 들어, 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상 등) 접촉한다. 일부 구현예에서, 매트릭스는 용리 용액과 1회 접촉한다. 단백질 A 매트릭스에 결합된 폴리펩타이드를 용리시키기에 적합한 당해 분야에 공지된 임의의 용액은 본 발명의 방법에서 용리 용액(예를 들어, pH가 약 3.1인 40 mM 아세트산나트륨을 포함하는 용리 용액)으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 용리 용액은 하나 이상의 추가적인 성분(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 농도에서의 아르기닌)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 용리물은 매트릭스를 용리 용액과 접촉시킨 후 수집된다. 일부 구현예에서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 2개 이상의 용리물은 매트릭스를 용리 용액과 2회 이상 접촉시킨 후 수집된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 용리물은 용리 후 배합된다. 일부 구현예에서, 용리물(들)은 여과된다. 예를 들어, 심층 여과를 통한 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 용리물을 여과하는 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 용리물(들)은 심층 여과를 통해 여과된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 단백질 A 매트릭스로부터의 용리물은 (예를 들어, 추가적인 크로마토그래피 및/또는 여과 단계를 사용하여(예컨대, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합-모드 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 부동화된 금속 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 정용여과, 한외여과, 및/또는 바이러스 제거 여과 중 하나 이상을 사용하여)) 추가로 처리되고/되거나 정제되고/되거나, (예를 들어, 필요로 하는 대상체(예컨대, 인간 대상체)에 대한 투여에 적합한 약학적 제형을 제조하기 위해) 제형화될 수 있다.
상기 서면 설명서는 당업자가 본 발명을 실행하게 하기에 충분하다고 생각된다. 하기 실시예는 오직 예시적인 목적을 위해 제공되고, 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 실제로, 본원에 도시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명으로부터 당업자에게 명확해지고 첨부된 청구항의 범위 내에 해당한다.
실시예
실시예 1: 항체 정제 동안 불순물의 제거를 개선하거나 향상시키기 위한 세척 용액
하기 실시예는 단백질 A 크로마토그래피 동안 불순물의 제거를 개선/향상시키기 위해 중간 세척 용액 중의 벤조산나트륨 및 벤질 알콜의 다양한 조합의 사용을 기재한다.
물질 및 방법
샘플 제조
2개의 별개의 인간 단일클론 항체 수확물 재료를 하기한 바대로 단백질 A 크로마토그래피를 위해 제조하였다: 항체 중 하나를 구성적으로 발현하도록 조작된 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 현탁 배양에서 수확물을 생성하였다. 재조합 생성물은 배양 배지로 분비되고, 이후 이것을 하류 공정을 위해 원심분리하고 심층 여과에 의해 청징하였다. 청징된 수확물 재료를 단백질 A 칼럼에 로딩하기 전에 0.22 ㎛ 폴리에테르설폰(PES) 필터로 여과시켰다.
단백질 A 크로마토그래피
단백질 A 수지/칼럼을 하기한 바대로 제조하였다: MabSelect Sure LX 단백질 A 크로마토그래피 수지(GE Healthcare Life Sciences; 카탈로그 17-5474호)를 0.5 M 염화나트륨 용액으로 중력 침강을 통해 교환하였다. (A) 1.0 cm 직경 칼럼(Essential Life Solutions 10/250 Snap 칼럼; 카탈로그 S10/250-PPSL-OE-FP10호) 또는 (B) 0.66 cm 직경 칼럼(Omnifit™ 6.6/100; 카탈로그 006BCC0610FF호) 중 어느 하나를 사용하여 AKTA Pure 또는 AKTA Avant(GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 칼럼을 패킹하였다. 칼럼 (A)에 대해 20 cm ± 10%의 베드 높이로, 또는 칼럼 (B)에 대해 5 cm ± 10%의 비드 높이로 수지를 패킹하였다. 0.1 M 염화나트륨 용액에 평형화된 칼럼에 1.0 M 염화나트륨 용액의 1% 칼럼 체적 주입을 사용하여 칼럼 능력을 수행하고, Unicorn Evaluation 소프트웨어를 사용하여 전도도 트레이스를 분석하였다. 칼럼의 효율은 미터당 적어도 775개의 이론적 플레이트가 되도록 요구되고, 0.8 내지 1.8의 비대칭을 나타내도록 요구된다.
수확물 재료를 로딩하기 전, 칼럼을 역삼투 탈이온화 물로 플러싱하여 20% 에탄올의 저장 완충액을 제거하였다. 후속하여, 평형화 전에 임의의 결합된 집합체의 제거를 보장하도록 칼럼을 0.5 M 아세트산으로 플러싱하였다. 칼럼의 pH가 6.5 초과일 때까지 칼럼을 50 mM 포스페이트 완충액과 0.5 M 염화나트륨으로 평형화시켰다.
이후, 제조된 샘플을 단백질 A 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 mAb A(IgG1 아형) 또는 mAb B(IgG4 아형) 중 어느 하나로 40 g/ℓ 수지의 목표로 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 50 mM 포스페이트 및 0.5 M 염화나트륨을 함유하는 포스페이트 완충액 용액으로 상기 기재된 바대로 세척하였다. 다음에, 칼럼을 시험 세척 용액으로 세척한 후, 완충 용액을 갖는 염 유리 세척액(pH 7)으로 세척하였다. 마지막으로, 3.1의 pH에서 40 mM 아세트산나트륨을 함유하는 용액을 사용하여 칼럼으로부터 항체를 용리시켰다. 하기 표 1은 예시적인 크로마토그래피 공정을 제공한다.
숙주 세포 단백질 검출
용리 후, 제조사의 프로토콜에 따라 3세대 CHO HCP ELISA 키트(Cygnus Technologies)를 사용하여 숙주 세포 단백질(HCP) 불순물의 존재에 대해 항체 샘플을 시험하였다. HCP ELISA는 1:400 내지 1:800의 희석으로 수행되고, 흡광도는 Spectramax Plus 384 플레이트 판독기를 사용하여 450/600 nm에서 판독되었다.
특정 "HCP-A" 검출
제조사의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 햄스터(CHO) ELISA 키트(ICL Labs)를 사용하여 용리된 항체 샘플에서 특정 HCP(HCP-A)의 농도를 정량화하였다. HCP-A ELISA는 1:100 내지 1:800의 희석으로 수행되고, 흡광도는 Spectramax Plus 384 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독되었다.
결과
숙주 세포 단백질(HCP)은 단일클론 항체(mAb)와 공동용리하는 것으로 나타났고, 이는 이 항체의 하류 적용에 문제가 될 수 있다. 관심 mAb와 공동용리하는 오염물질 HCP의 양을 감소시킬 수 있는 가능한 세척 첨가제를 확인하기 위해, 1.7 mL의 단백질 A 크로마토그래피 칼럼을 CHO 세포로부터 수확된 분비된 IgG1 인간 단일클론 항체(mAb A)를 함유하는 샘플로 로딩하였고, 이 세포는 하류 공정 전에 원심분리 및 심층 여과에 의한 청징 둘 다를 거쳤다(표 1 참조). 칼럼을 처음에 포스페이트 완충액 용액으로 세척하였다. 다음에, 칼럼을 개별적으로 또는 pH 7.0에서의 벤조산나트륨, 벤질 알콜 및 아르기닌과 조합하여 50 mM 포스페이트 및 첨가제를 함유하는 다수의 시험 세척 용액 중 하나로 세척하였다(도 1). 대조군 실행은 어떠한 첨가제 세척을 도입하지 않았다. 시험 세척 후, 칼럼을 염 유리 50 mM 포스페이트(pH 7.0)로 세척하였다. 마지막으로, 단일클론 항체를 칼럼으로부터 용리시키고, 2 M 트리스 염기를 사용하여 6.0의 pH로 pH 조정하였다. 조정 후, 용리물 풀은 0.22 ㎛ PES 필터를 사용하여 여과되고, HCP 불순물의 존재에 대해 시험되었다(도 1). 흥미롭게도, 2% 벤질 알콜 및/또는 0.5 M 벤조산나트륨을 함유하는 세척액은 용리된 항체 샘플에서 오염 HCP의 수준을 효과적으로 감소시켰다. 세척에서의 아르기닌의 포함은 HCP 제거를 개선하는 것으로 또한 관찰되었다.
다음에, 특정 HCP-A의 존재는 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 항체에서 조사되었다. 이 실험에 사용된 시험 및 대조군 세척 용액은 하기 표 2에 표시된다.
HCP 불순물을 제거하는 벤질 알콜 및 벤조산나트륨의 조합의 능력을 나타내면서, 추가적인 제형은 HCP-A의 제거를 표적화하도록 시험되었다. 공지된 높은 HCP-A 발현을 갖는 IgG4 항체(mAb B)는 칼럼에서 HCP-A 부담을 특이적으로 증가시키도록 사용되었다. 표 1은 정제 공정 동안 수행된 단계의 요약을 제공한다. 간단히, 로드 pH 및 전도도로 평형화 후, 15.7 mL의 단백질 A 크로마토그래피 칼럼을 하류 공정 전에 원심분리 및 심층 여과에 의한 청징 둘 다를 통해 CHO 세포로부터 수확된 분비된 인간 단일클론 항체를 함유하는 샘플로 로딩하였다. (수지의) 40 g/ℓ 로드가 도달되면, 칼럼을 포스페이트 완충액 용액을 사용하여 재평형화시켰다. 이후, 표 2에 기재된 세척액(시험 용액 1, 2 및 7) 중 하나는 2 칼럼 체적(CV)으로서, 다음에 즉시 pH 7.0에서의 염 유리 포스페이트 완충액 용액의 3의 CV로 적용되었다. 40 mM 아세트산나트륨에 의한 용리 후, 용리물 풀은 2 M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.5로 조정되었다. 이후, 용리물 풀을 0.22 ㎛ PES 필터 또는 Millipore C0HC Depth 필터로 여과시키고, ELISA에 의해 HCP-A 함량에 대해 시험하였다(도 2a). 모든 3개의 세척 조건(시험 용액 1, 2 및 7)은 대조군(294 ppm)에 비해 추가적인 HCP-A를 제거할 수 있었다. 결과는 또한 벤질 알콜, 벤조산나트륨 및 아르기닌의 조합이 대조군에 비해 거의 90%의 HCP-A를 제거하면서 HCP-A의 제거의 효과가 누적이라는 것을 제안한다. 더욱이, 심층 여과는 세척 조건 용리물에 대해 후속하는 15% 내지 25%의 추가적인 HCP-A 제거를 제공하였다.
상기 기재된 바와 같은 유사한 절차 후, 높은 pH 세척액의 유효성은 다음에 9.0 또는 10.0의 pH에서 칼럼을 세척하여 시험되었다. IgG4 항체(mAb B)는 단백질 A 칼럼에서 HCP-A 부담을 특이적으로 증가시키도록 공지된 높은 HCP-A 발현을 갖는 세포주에서 생산되었다. 표 1은 정제 공정 동안 수행된 단계의 요약을 제공한다. 간단히, 로드 pH 및 전도도로 평형화 후, 15.7 mL의 단백질 A 크로마토그래피 칼럼을 하류 공정 전에 원심분리 및 심층 여과에 의한 청징 둘 다를 통해 CHO 세포로부터 수확된 분비된 인간 단일클론 항체를 함유하는 샘플로 로딩하였다. (수지의) 60 g/ℓ 로드가 도달되면, 칼럼을 포스페이트 완충액 용액을 사용하여 재평형화시켰다. 시험 용액 8 또는 9(표 2) 중 어느 하나는 적용될 때 2의 CV, 다음에 즉시 pH 7.0에서의 염 유리 포스페이트 완충액 용액의 3의 CV에 대한 것이었다. 40 mM 아세트산나트륨에 의한 용리 후, 용리물 풀은 2 M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.5로 조정되었다. 이후, 용리물 풀을 0.22 ㎛ PES 필터로 여과시켰다. 도 2b에 도시된 것처럼, 0.5 M 벤조산나트륨과 pH 10.0에서의 완충 염은 대조군에 비해 HCP-A를 감소시키는 데 고도로 효과적이었다(92% 감소). 더욱이, 벤질 알콜 및 아르기닌의 첨가는 다시 보완적이고, pH 9.0에서의 HCP-A의 제거를 증가시켰다. 종합하면, 도 2a 내지 도 2b에 도시된 결과는 HCP-A의 유의미한 제거를 허용하는 pH의 탄탄한 범위를 보여준다.
마지막으로, 2% 벤질 알콜 및 0.5 M 벤조산나트륨의 세척액을 더 향상시키도록 추가적인 첨가제를 스크리닝하였다. 1.7 mL의 스케일 칼럼에서 동일한 IgG4 mAb(mAb B)를 사용하였다. 표 1은 정제 공정 동안 수행된 단계의 요약을 제공한다. 간단히, 평형화 후 칼럼을 40 g/ℓ로 로딩하였다. 이후, 표 2에 기재된 4가지 세척액(시험 용액 3 내지 6) 중 1가지를 칼럼에 적용하였다. 이후에, 용리 샘플을 2 M 트리스 염기로 pH 5.5로 조정하고, 0.22 ㎛ PES 필터를 사용하여 여과시켰다. 이후, HCP-A 함량은 HCP-A-특이적 ELISA를 사용하여 측정되었다(도 3). 시험 용액에 의한 세척은 2% 벤질 알콜 및 0.5 M 벤조산나트륨 조합(201.3 ppm)과 비교하여 아르기닌, 카프릴산, 벤젠설포네이트 및 헥실렌 글리콜의 첨가로 인해 HCP-A 제거에서 누적 반응을 나타냈다. 2% 벤질 알콜, 0.5 M 벤조산나트륨, 및 헥실렌 글리콜, 나트륨 벤젠설포네이트, 카프릴산 또는 아르기닌으로부터 선택된 성분을 함유하는 세척액은 HCP-A를 제거하는 데 고도로 효과적이었다.
종합하면, 이 실시예에 제공된 데이터는 벤조산나트륨 및/또는 벤질 알콜을 함유하는 중간 세척 단계가 인간 단일클론 항체의 단백질 A 정제 동안 숙주 세포 단백질 불순물의 더 우수한 제거를 제공할 수 있다는 것을 보여준다. 게다가, 세척 용액에서의 벤젠설포네이트, 카프릴산, 헥실렌 글리콜 및/또는 아르기닌으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제의 포함은 표적 단일클론 항체의 단백질 A 정제 동안 숙주 세포 단백질 불순물의 제거를 더 개선하였다.
실시예 2: 단백질 A 크로마토그래피 후 존재하는 특이적 숙주 세포 단백질의 확인, 항체 정제 동안 불순물의 제거를 개선하거나 향상시키기 위한 세척 용액의 전개 및 인간 단일클론 항체와의 추정 포스포리파아제 B-유사 2 상호작용의 평가
하기 실시예는 단백질 A 크로마토그래피 후 정제된 항체 용리물에서의 특이적 숙주 세포 단백질(HCP)의 확인을 기재한다. 실시예는 단백질 A 크로마토그래피 동안 추정 포스포리파아제 B-유사 2(PLBL2)를 포함하는 HCP의 제거를 개선/향상시키기 위해 중간 세척 용액에서의 벤조산나트륨 및 벤질 알콜의 사용을 더 기재한다. 마지막으로, 실시예는 단백질 A 크로마토그래피 효율에 대한 로딩 조건의 효과를 기재한다.
물질 및 방법
샘플 제조
인간 단일클론 항체 수확물 재료를 실시예 1에 기재된 바대로 단백질 A 크로마토그래피를 위해 제조하였다. 간단히, 수확물은 인간 단일클론 항체 중 어느 하나를 구성적으로 발현하도록 조작된 재조합 CHO 세포의 현탁 배양에서 생성되었다. 재조합 생성물은 배양 배지로 분비되고, 이후 이것을 하류 공정을 위해 원심분리하고 심층 여과에 의해 청징하였다. 청징된 수확물 재료를 단백질 A 칼럼에 로딩하기 전에 0.22 ㎛ 폴리에테르설폰(PES) 필터로 여과시켰다.
단백질 A 크로마토그래피
단백질 A 수지/칼럼을 실시예 1에 기재된 바대로 제조하였다. 간단히, MabSelect Sure LX 단백질 A 크로마토그래피 수지(GE Healthcare Life Sciences; 카탈로그 17-5474호)를 0.5 M 염화나트륨 용액으로 중력 침강을 통해 교환하였다. (A) 1.0 cm 직경 칼럼(Essential Life Solutions 10/250 Snap 칼럼; 카탈로그 S10/250-PPSL-OE-FP10호) 또는 (B) 0.66 cm 직경 칼럼(Omnifit™ 6.6/100; 카탈로그 006BCC0610FF호) 중 어느 하나를 사용하여 AKTA Pure 또는 AKTA Avant(GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 칼럼을 패킹하였다. 칼럼 (A)에 대해 20 cm ± 10%의 베드 높이로, 또는 칼럼 (B)에 대해 5 cm ± 10%의 비드 높이로 수지를 패킹하였다. 0.1 M 염화나트륨 용액에 평형화된 칼럼에 1.0 M 염화나트륨 용액의 1% 칼럼 체적 주입을 사용하여 칼럼 능력을 수행하고, Unicorn Evaluation 소프트웨어를 사용하여 전도도 트레이스를 분석하였다. 칼럼의 효율은 미터당 적어도 775개의 이론적 플레이트가 되도록 요구되고, 0.8 내지 1.8의 비대칭을 나타내도록 요구된다.
수확물 재료를 로딩하기 전, 칼럼을 역삼투 탈이온화 물로 플러싱하여 20% 에탄올의 저장 완충액을 제거하였다. 후속하여, 평형화 전에 임의의 결합된 집합체의 제거를 보장하도록 칼럼을 0.5 M 아세트산으로 플러싱하였다. 칼럼의 pH가 6.5 초과일 때까지 칼럼을 50 mM 포스페이트 완충액과 0.5 M 염화나트륨으로 평형화시켰다.
이후, 제조된 샘플을 단백질 A 칼럼에 로딩하였다. 일반적으로, 칼럼을 인간 단일클론 항체 A(IgG1 아형) 또는 인간 단일클론 항체 B(IgG4 아형) 중 어느 하나로 40 g/ℓ 수지의 목표로 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 50 mM 포스페이트 및 0.5 M 염화나트륨을 함유하는 포스페이트 완충액 용액으로 상기 기재된 바대로 세척하였다. 다음에, 칼럼을 시험 세척 용액으로 세척한 후, 완충 용액을 갖는 염 유리 세척액(pH 7)으로 세척하였다. 그러나, 대조군 처리는 시험 세척 용액으로 세척되지 않았다. 마지막으로, 3.1의 pH에서 40 mM 아세트산나트륨을 함유하는 용액을 사용하여 칼럼으로부터 항체를 용리시켰다. 표 1은 예시적인 크로마토그래피 공정을 제공한다.
질량 분광법에 의한 HCP 검출
표준 조건 하에 단백질 A 칼럼 정제 및 용리 후, 인간 단일클론 항체 용리물은 각각의 HCP의 상대 양을 결정하도록 질량 분광법에 의해 분석되었다. 구체적으로, 클루스테린 및 추정 포스포리파아제 B-유사 2(PLBL2)의 상대 양은 단백질 A 정제된 인간 단일클론 항체 샘플에서 확인되었다. Acquity H-Class Xevo G2-XS Q-Tof 및 2.1 x 150 mm ACQUITY UPLC 칼럼 1.7 ㎛ CSH C18을 사용하여 질량 분광학을 수행하였다. 샘플을 처음에 50 mM 중탄산암모늄 중 0.05% Rapigest를 사용하여 변성시키고, 이후 20 mM DTT(디티오트레이톨) 및 40 mM IAA(요오도아세트아미드)를 사용하여 환원시키고 알킬화하였다. 효소 소화를 밤새 2% LysC에 의해 수행한 후, 4% 트립신으로 3시간 동안 수행하였다. Rapigest를 원심분리를 통해 제거하고, 포름산을 사용하여 샘플을 산성화시켰다. 이후, 2.5 fmol/㎕의 ClpB E. 콜라이의 스파이크-인 내부 표준품을 첨가하여 HCP 및 PLBL2의 상대 양을 비교하였다. 잠근 질량 조정을 785.8426 m/z 주위에 수행하였다. MSE를 사용하여 이온 데이터를 분석하고 HCP를 확인하였다.
ELISA에 의한 HCP 검출
용리 후, 인간 단일클론 항체 샘플에서의 일반 HCP의 존재는 실시예 1에 기재된 바대로 평가되었다. 간단히, 제조사의 프로토콜에 따라 3세대 CHO HCP ELISA 키트(Cygnus Technologies)를 사용하여 HCP 불순물의 존재에 대해 항체 샘플을 시험하였다. HCP ELISA는 1:400 내지 1:800의 희석으로 수행되고, 흡광도는 Spectramax Plus 384 플레이트 판독기를 사용하여 450/600 nm에서 판독되었다.
ELISA에 의한 PLBL2 검출
제조사의 프로토콜에 따라 상업적으로 입수 가능한 햄스터(CHO) ELISA 키트(ICL Labs, E-65PLB)를 사용하여 용리된 항체 샘플에서 PLBL2의 농도를 정량화하였다. PLBL2 ELISA는 1:100 내지 1:800의 희석으로 수행되고, 흡광도는 Spectramax Plus 384 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독되었다.
결과
질량 분광법에 의한 HCP의 검출
단백질 A 정제 후, HCP는 인간 단일클론 항체와 공동용리하는 것으로 나타났고, 이는 이 항체의 하류 적용에 문제가 될 수 있다. 단백질 A 정제 후 정제된 인간 단일클론 항체 용액에 존재하는 특정 HCP를 확인하기 위해, 1.7 mL의 단백질 A 크로마토그래피 칼럼을 CHO 세포로부터 수확된 분비된 IgG1 인간 단일클론 항체(mAb A)를 함유하는 샘플로 로딩하였고, 이 세포는 하류 공정 전에 원심분리 및 심층 여과에 의한 청징 둘 다를 거쳤다(표 1 참조). 칼럼을 처음에 포스페이트 완충액 용액으로 세척하였다. 다음에, 칼럼을 염 유리 50 mM 포스페이트(pH 7.0)로 세척하였다. 마지막으로, 단일클론 항체를 칼럼으로부터 용리시키고, 2 M 트리스 염기를 사용하여 6.0의 pH로 pH 조정하였다. 조정 후, 용리물 풀은 0.22 ㎛ PES 필터를 사용하여 여과되고, HCP의 상대 양을 확인하기 위해 질량 분광법에 의해 분석되었다. 특히, 클루스테린 및 PLBL2는 인간 단일클론 항체 용리물에 존재하는 2가지의 가장 풍부한 HCP였다.
HCP/PLBL2 제거를 개선하기 위한 중간 세척 조건의 확인.
상기 기재된 질량 분광법 분석은 PLBL2를 포함하는 HCP가 단백질 A 정제 후 인간 단일클론 항체와 공동용리한다는 추가의 증거를 제공하였다. 다음에, ELISA 스크린은 HCP 및 PLBL2 제거를 더 개선하고 향상시키기 위해 사용될 수 있는 중간 세척 용액을 확인하기 위해 개발되었다(도 4a 및 도 4b). 흥미롭게도, 4% 벤질 알콜 또는 0.5 M 벤조산나트륨을 포함하는 중간 세척액은 항체 용리물 샘플에서 오염 HCP 및 PLBL2의 수준을 효과적으로 감소시켰다. 0.5 M 아르기닌 단독을 함유하는 세척액은 일반 HCP의 수준을 감소시키지 않고, 오염 PLBL2의 수준을 감소시켰다.
PLBL2 ELISA 스크린은 1) 2% 벤질 알콜 및 0.5 M 아르기닌(pH 5.0), 2) 2% 벤질 알콜 및 0.5 M 벤조산나트륨(pH 7.0), 또는 3) 2% 벤질 알콜, 0.5 M 벤조산나트륨, 0.5 M 아르기닌(pH 6.0)을 포함하는 중간 세척액과 조합된 심층 여과가 단백질 A 정제 동안 PLBL2를 효과적으로 제거한다는 것을 추가로 보여준다. 또한, 상승된 pH 수준을 갖는 세척액(0.5 M 벤조산나트륨 및 50 mM 중탄산나트륨(pH 10.0) 또는 2% 벤질 알콜, 0.5 M 벤조산나트륨, 0.5 M 아르기닌 및 50 mM 인산나트륨(pH 9.0))은 단백질 A 정제 동안 PLBL2를 제거하는 데 고도로 효과적이었다. 실제로, 50 mM 중탄산나트륨을 갖는 벤조산나트륨 세척액(pH 10.0)은 대조군 처리와 비교하여 92% 초과의 PLBL2를 제거할 수 있었다. 마지막으로, 1) 0.5 M 벤조산나트륨, 2% 벤질 알콜 및 0.5 M 벤젠설포네이트(pH 7.0), 2) 0.5 M 벤조산나트륨, 50 mM 카프릴산, 0.5 M 아르기닌 및 0.5 M 염화나트륨(pH 7.0), 3) 0.5 M 벤조산나트륨, 2% 벤질 알콜 및 10% 헥실렌 글리콜(pH 7.0), 또는 4) 0.5 M 벤조산나트륨, 2% 벤질 알콜 및 0.5 M 아르기닌(pH 6.0)을 포함하는 세척액은 대조군 세척액과 비교하여 PLBL2를 제거하는 튼튼한 능력을 나타냈다.
추가로, 실험 및 대조군 세척액 둘 다 이후의 항체 용리물의 시각 비교는 2% 벤질 알콜 및 0.5 M 벤조산나트륨으로 세척된 샘플이 대조군 세척된 샘플에 비해 개선된 투명성을 갖는다는 것을 밝혀냈다(도 5).
상기 기재된 PLBL2 ELISA는 벤질 알콜 및 벤조산나트륨을 함유하는 중간 세척액이 단백질 A 정제된 항체 용리물에서 PLBL2의 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 다음에, 이 결과는 질량 분광법을 통해 직각으로 추가로 확인되었다. 질량 분광법 결과는 시험 세척 0.5 M 벤조산나트륨, 0.5 M 아르기닌, 50 mM 카프릴산, 0.5 M NaCl(pH 9.0)이 대조군 처리에 비해 용리물로부터 거의 93%의 PLBL2를 제거한다는 것을 보여준다.
수율 및 PLBL2 제거에 대한 칼럼 로딩의 영향의 평가
상기 실험은 숙주 세포 단백질 PLBL2가 단백질 A 정제된 항체 용리물에 존재하고, 벤질 알콜 및 벤조산나트륨을 함유하는 중간 세척 용액을 사용하여 효과적으로 제거될 수 있다는 것을 나타낸다. 다음에, 오프-칼럼 수율 및 PLBL2 제거에 대한 단백질 A 칼럼 로딩 수준의 영향을 평가하였다. 오프-칼럼 수율 및 PLBL2 제거 둘 다를 최대화하기 위한 이상적인 로딩 조건을 확인하기 위해, 단백질 A 칼럼은 40 내지 60 g/ℓ의 범위에서 로딩되었다(도 6a 및 도 6b). 결과는 40 g/ℓ를 넘어 증가하는 칼럼 로드가 오프-칼럼 수율 및 PLBL2 제거 둘 다를 감소시킨다는 것을 나타낸다.
종합하면, 이 실시예에 제공된 데이터는 PLBL2가 단백질 A 정제 후 인간 단일클론 항체와 공동용리하는 숙주 세포 단백질 중에 있다는 것을 보여준다. 추가로, 데이터는 벤조산나트륨 및/또는 벤질 알콜을 함유하는 중간 세척 단계가 인간 단일클론 항체의 단백질 A 정제 동안 숙주 세포 단백질 불순물 및 PLBL2의 더 우수한 제거를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 게다가, 데이터는 단백질 A 수지 칼럼의 과로딩이 오프-칼럼 수율 및 PLBL2 제거를 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 3: 항체 정제 동안 불순물의 제거에 대한 항체를 함유하는 수확물에서의 pH 및 벤조에이트염 농도의 효과의 평가
하기 실시예는 단일클론 항체를 포함하는 수확물의 벤조산나트륨 농도 및 pH를 조정하는 것이 항체의 정제 동안 불순물의 제거를 개선하거나 향상시키는지를 결정하기 위해 수행된 실험을 기재한다.
인간 단일클론 항체 수확물을 실시예 1에 기재된 바대로 제조하였다. 청징되고 심층 여과된 수확물은 HCP 및 PLBL2 제거에 대한 영향에 대해 스크리닝하도록 변하는 pH 및 첨가제 농도로 조정되었다. 추가적인 세척 단계의 일부로서 PLBL2 제거에 효과적인 것으로 이전에 나타난 벤조산나트륨을 주어진 수확물 체적에 대해 목표 최종 농도에 도달하기에 충분한 분량으로 고체로서 첨가하였다. 첨가 후, 목표 pH는 2 M 트리스 염기의 첨가를 통해 도달되었다. 제1 수확물은 0.5 M 벤조산나트륨의 최종 농도를 달성하도록 벤조산나트륨이 보충되고, 7.2의 pH로 조정되었다. 제2 수확물은 0.5 M 벤조산나트륨의 최종 농도를 달성하도록 벤조산나트륨이 보충되고, 9의 pH로 조정되었다. 제3 수확물은 9의 pH로 조정되었다(벤조산나트륨이 첨가되지 않았다). 표 3을 참조한다:
각각의 수확물을 조정하고 0.22 ㎛ 여과하면, 3개의 단백질 A 칼럼을 각각 조정된 수확물로 50 g/ℓ 수지의 목표로 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 50 mM 포스페이트 및 0.5 M 염화나트륨을 함유하는 포스페이트 완충액 용액으로 세척하였다. 다음에, 칼럼을 역삼투 탈이온(RODI)수로 세척하였다. 마지막으로, 3.1의 pH에서 40 mM 아세트산나트륨을 함유하는 용액을 사용하여 칼럼으로부터 항체를 용리시켰다. 하기 표 4는 예시적인 크로마토그래피 공정을 제공한다.
이후, 실시예 1에 기재된 바와 같은 ELISA를 통해 숙주 세포 단백질(HCP) 불순물의 존재에 대해 및 커스텀 ELISA를 통해 PLBL2의 존재에 대해 3개의 단백질 A 용리물의 각각을 시험하였다. 도 7에 도시된 바대로, pH 9.0에서의 0.5 M 벤조산나트륨은 PLBL2 및 HCP 불순물의 가장 낮은 수준을 보여주었고, pH 조정 단독에 비해 PLBL2 제거의 더 큰 로그를 나타냈다. 0.5 M 벤조산나트륨을 pH 7.2에서 수확물에 첨가할 때, 오직 HCP 제거가 개선되었다. PLBL2에 대한 효과에 대해 수확물로의 pH 및 벤조산나트륨 조정 둘 다가 필요했다. HMW는 조정에 의해 영향을 받지 않았다(비도시). 단백질 A 단계 동안 오직 RODI 세척에 의한 비조정된 수확물과 비교하여, HCP는 65%만큼 감소한 반면, PLBL2는 대략 79%만큼 감소하였다.
다음에, 상기 기재된 바대로 수확물은 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M 또는 0.5 M의 최종 농도를 달성하도록 벤조산나트륨이 보충되고, 단백질 A 정제 전 9의 pH로 조정되었다. 표 5를 참조한다.
이후, 각각의 단백질 A 용리물은 커스텀 ELISA를 통해 PLBL2의 존재에 대해 시험되고, 각각의 용리물에서의 항체의 수율이 평가되었다. 도 8은 PLBL2 함량과 벤조산나트륨 농도 사이의 관계식이 대략 S자형이라는 것을 보여준다. 0.4 M 벤조산나트륨 초과의 농도에 대해 PLBL2의 제거의 감소된 이득이 관찰되었다. 항체 수율은 증가하는 농도의 벤조산나트륨에 따라 약간 감소하였다. 0.1 M 내지 0.5 M의 벤조산나트륨으로, 항체 수율은 94.8%로부터 89.4%로 감소하였다. 수확물이 단백질 A 정제 전 0.4 M 벤조산나트륨 및 pH 9.0으로 조정될 때 가장 높은 수율 및 가장 높은 PLBL2 제거가 관찰되었다. 0.4 M 초과의 벤조산나트륨 농도의 증가는 약간 감소된 항체 수율을 이용하여 제거 이득을 감소시켰다. 0.1 M 벤조산나트륨의 모든 샘플은 대략 250 ppm에 필적하는 HCP 제거를 가졌다. 0.1 M 이하의 벤조산나트륨에서, HCP는 대략 500 ppm이었다. 0.2 M 내지 0.5 M의 벤조산나트륨 농도는 전하 분산 프로필에 영향을 미치지 않았고, 모든 용리물은 한정된 한계 내에 있었다.
종합하면, 이 데이터는 용액에서의 벤조산나트륨의 존재가 숙주 세포 불순물과 mAb의 회합이 높은 pH에서 매우 선호되지 않게 한다는 것을 제안한다. 이 조건은 mAb가 단백질 A 수지에 결합된 후에 별개의 세척 단계를 통해 또는 칼럼의 로딩 단계 전에 또는 동안에 용액 중에 달성될 수 있다. 이것은 단백질 A 정제 단계의 공정의 더 큰 유연성을 제공하고, 세척 첨가제로서의 벤조산나트륨의 고유한 특성을 더 뒷받침한다.
상기 발명이 명확성 및 이해의 목적을 위해 예시 및 예에 의해 약간 자세히 기재되어 있지만, 설명 및 예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
Claims (95)
- Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 정제하는 방법으로서,
(a) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드가 단백질 A에 결합하는 조건 하에 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스를 (i) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(b) 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 단계이되, 세척 용액은 (i) 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도의 벤조에이트염 및 (ii) 약 0.5% 내지 약 4% 용적/용적(v/v)의 농도의 벤질 알콜 중 하나 또는 둘 다를 포함하고, 세척 용액은 pH가 4.0 내지 약 10.0인 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 세척 용액은 1) 벤조에이트염; 2) 벤질 알콜; 또는 3) 벤조에이트염과 벤질 알콜을 포함하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 벤조에이트염은 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 벤조에이트염은 벤조에이트 알칼리염인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 벤조에이트염은 벤조산나트륨인, 방법.
- 제5항에 있어서, 벤조산나트륨은 약 0.1 M 내지 약 0.3 M의 농도인, 방법.
- 제5항에 있어서, 벤조산나트륨은 약 0.3 M의 농도인, 방법.
- 제5항에 있어서, 벤조산나트륨은 약 0.5 M의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 벤질 알콜은 약 1% 내지 약 4%(v/v)의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 벤질 알콜은 약 1% 내지 약 2%(v/v)의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 벤질 알콜은 약 2%(v/v) 내지 약 4%(v/v)의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 완충제를 추가로 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 완충제는 포스페이트, 트리스, 아르기닌, 아세테이트 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제11항 또는 제13항에 있어서, 완충제는 약 10 mM 내지 약 500 mM의 농도인, 방법.
- 제11항 또는 제13항에 있어서, 완충제는 약 50 mM 또는 500 mM의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 pH가 약 5.0 내지 약 10.0인, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 pH가 약 5.0 내지 약 9.0인, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 pH가 약 5.0, 약 6.0, 약 7.0, 약 9.0 또는 약 10.0인, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 나트륨 벤젠설포네이트를 추가로 포함하는, 방법.
- 제19항에 있어서, 나트륨 벤젠설포네이트는 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 카프릴산을 추가로 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 카프릴산은 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 헥실렌 글리콜을 추가로 포함하는, 방법.
- 제23항에 있어서, 헥실렌 글리콜은 약 1% 내지 약 10%(v/v)의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 크레아티닌을 추가로 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 크레아티닌은 약 10 mM 내지 약 100 mM의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 아르기닌을 추가로 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서, 아르기닌은 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도인, 방법.
- 제27항에 있어서, 아르기닌은 약 0.5 M의 농도인, 방법.
- 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌은 아르기닌-HCl인, 방법.
- 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌을 포함하는 세척 용액은 pH가 약 4.0 내지 약 6.0인, 방법.
- 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌을 포함하는 세척 용액은 pH가 약 8.0 내지 약 10.0인, 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 하나 이상의 비완충 염을 추가로 포함하는, 방법.
- 제33항에 있어서, 하나 이상의 비완충 염은 염화나트륨, 브롬화나트륨, 염화칼륨, 브롬화칼륨, 염화마그네슘, 브롬화마그네슘, 염화칼슘, 브롬화칼슘, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제33항에 있어서, 하나 이상의 비완충 염은 염화나트륨 및/또는 염화칼륨인, 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 비완충 염은 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은
(i) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 50 mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함하고, pH가 약 10.0인 용액;
(ii) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%의 농도의 벤질 알콜, 약 0.5 M의 농도의 아르기닌 및 약 50 mM의 농도의 인산나트륨을 포함하고, pH가 약 9.0인 용액;
(iii) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0인 용액;
(iv) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0인 용액;
(v) 약 10%(v/v)의 농도의 헥실렌 글리콜, 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0인 용액;
(vi) 약 0.5 M의 농도의 벤젠설포네이트, 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨 및 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜을 포함하고, pH가 약 7.0인 용액;
(vii) 약 50 mM의 농도의 카프릴산, 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 0.5 M의 농도의 아르기닌 및 약 0.5 M의 농도의 염화나트륨을 포함하고, pH가 약 7.0인 용액;
(viii) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 아르기닌을 포함하고, pH가 약 6.0인 용액;
(ix) 약 0.5 M의 농도의 벤조산나트륨, 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 아르기닌을 포함하고, pH가 약 5.0인 용액; 및
(x) 약 2%(v/v)의 농도의 벤질 알콜 및 약 0.5 M의 농도의 아르기닌을 포함하고, pH가 약 5.0인 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 용액인, 방법. - 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스를 제1항에서의 단계 (b)의 세척 용액으로 세척하기 전에 매트릭스를 제1 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 제1 용액은 포스페이트 완충액, 트리스 완충액, 아세테이트 완충액, 카보네이트 완충액, 시트레이트 완충액, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액을 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, 제1 용액은 약 10 mM 내지 약 100 mM의 농도의 완충액을 포함하는, 방법.
- 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용액은 포스페이트 완충액인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스를 제1항에서의 단계 (b)의 세척 용액으로 세척한 후에 매트릭스를 제2 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제42항에 있어서, 제2 용액은 포스페이트 완충액, 트리스 완충액, 아세테이트 완충액, 카보네이트 완충액, 시트레이트 완충액, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액을 포함하는, 방법.
- 제43항에 있어서, 제2 용액은 약 10 mM 내지 약 100 mM의 농도의 완충액을 포함하는, 방법.
- 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용액은 pH가 약 5.0 내지 약 7.0인, 방법.
- 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용액은 실질적으로 염을 적게 포함하거나 염을 포함하지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 세척 단계 후 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스를 용리 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제47항에 있어서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 용리물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제48항에 있어서, 심층 여과를 통해 용리물을 여과시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제48항 또는 제49항에 있어서, 용리물은 약 500 백만분율(ppm) 미만의 하나 이상의 불순물을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 매트릭스를 세척 용액으로 세척하는 단계가 결여된 상응하는 방법보다 더 높은 정도로 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드가 하나 이상의 불순물로부터 정제되게 하는, 방법.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 불순물은 숙주 세포 단백질(HCP: host cell protein)인, 방법.
- 제52항에 있어서, 하나 이상의 HCP는 포스포리파아제, 클루스테린, 세린 프로테아제, 연장 인자, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, HCP는 추정 포스포리파아제 B-유사 2(PLBL2)인, 방법.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 숙주 세포는 포유류 숙주 세포인, 방법.
- 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 인간 Fc 영역인, 방법.
- 제57항에 있어서, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 영역을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 마우스 Fc 영역인, 방법.
- 제59항에 있어서, 마우스 Fc 영역은 마우스 IgG1, IgG2 또는 IgG3 Fc 영역을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 항체인, 방법.
- 제61항에 있어서, 항체는 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체인, 방법.
- 제61항 또는 제62항에 있어서, 항체는 단일클론 항체인, 방법.
- 제61항 또는 제62항에 있어서, 항체는 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체인, 방법.
- 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 전에, (i) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플을 제조하기 위해 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 벤조에이트염의 최종 농도 및 약 7.0 내지 약 9.0의 pH를 달성하도록 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 수확물을 조정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 정제하는 방법으로서,
(A) (i) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플을 제조하기 위해 약 0.1 M 및 약 0.5 M의 벤조에이트염의 최종 농도 및 약 7.0 내지 약 9.0의 pH를 달성하도록 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 수확물을 조정하는 단계; 및
(B) 샘플을 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제65항 또는 제66항에 있어서, 벤조에이트염은 벤조에이트 알칼리염인, 방법.
- 제67항에 있어서, 벤조에이트염은 벤조산나트륨인, 방법.
- 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 수확물에서의 벤조에이트염의 최종 농도는 약 0.4 M 내지 약 0.5 M인, 방법.
- 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 수확물의 pH는 약 7.0 내지 약 8.0인, 방법.
- 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 수확물의 pH는 약 8.0 내지 약 9.0인, 방법.
- 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 수확물은 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 숙주 세포를 포함하는 배양물로부터 생성되는, 방법.
- 제72항에 있어서, 숙주 세포는 진핵생물 숙주 세포인, 방법.
- 제73항에 있어서, 진핵생물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 방법.
- 제65항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 수확물은 조정 전에 청징되는, 방법.
- 제65항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 수확물은 조정 후에 청징되는, 방법.
- 제66항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스는 친화도 크로마토그래피 매트릭스를 포함하는, 방법.
- 제77항에 있어서, 친화도 크로마토그래피 매트릭스는 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스 또는 단백질 G 크로마토그래피 매트릭스인, 방법.
- 제65항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스를 적어도 하나의 세척 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제65항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 크로마토그래피 매트릭스를 용리 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제80항에 있어서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 용리물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제81항에 있어서, 심층 여과를 통해 용리물을 여과시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제81항 또는 제82항에 있어서, 용리물은 약 500 백만분율(ppm) 미만의 하나 이상의 불순물을 포함하는, 방법.
- 제66항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 샘플을 제조하도록 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 수확물을 조정하는 단계가 결여된 상응하는 방법보다 더 높은 정도로 하나 이상의 불순물로부터 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드가 정제되게 하는, 방법.
- 제66항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 불순물은 숙주 세포 단백질(HCP)인, 방법.
- 제85항에 있어서, 하나 이상의 HCP는 포스포리파아제, 클루스테린, 세린 프로테아제, 연장 인자, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제85항 또는 제86항에 있어서, HCP는 추정 포스포리파아제 B-유사 2(PLBL2)인, 방법.
- 제66항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 인간 Fc 영역인, 방법.
- 제82항에 있어서, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 영역을 포함하는, 방법.
- 제66항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 마우스 Fc 영역인, 방법.
- 제90항에 있어서, 마우스 Fc 영역은 마우스 IgG1, IgG2 또는 IgG3 Fc 영역을 포함하는, 방법.
- 제66항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 항체인, 방법.
- 제92항에 있어서, 항체는 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체인, 방법.
- 제92항 또는 제93항에 있어서, 항체는 단일클론 항체인, 방법.
- 제92항 또는 제93항에 있어서, 항체는 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체인, 방법.
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