RU2651483C2 - Способы очистки антител - Google Patents
Способы очистки антител Download PDFInfo
- Publication number
- RU2651483C2 RU2651483C2 RU2015136860A RU2015136860A RU2651483C2 RU 2651483 C2 RU2651483 C2 RU 2651483C2 RU 2015136860 A RU2015136860 A RU 2015136860A RU 2015136860 A RU2015136860 A RU 2015136860A RU 2651483 C2 RU2651483 C2 RU 2651483C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- acid
- sodium
- buffer
- contaminant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 174
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 172
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 120
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims abstract description 58
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims abstract description 56
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 41
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 40
- -1 aliphatic carboxylate Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 37
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 34
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 33
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims abstract description 31
- 229960005480 sodium caprylate Drugs 0.000 claims abstract description 31
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 claims abstract description 28
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 17
- FIWQZURFGYXCEO-UHFFFAOYSA-M sodium;decanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCC([O-])=O FIWQZURFGYXCEO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 16
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 claims description 38
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 18
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 18
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 17
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 10
- 150000007933 aliphatic carboxylic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 7
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 claims description 5
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 4
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 4
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N heptanoic acid Chemical compound CCCCCCC(O)=O MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 claims description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 claims description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCS(O)(=O)=O YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 claims description 2
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 claims description 2
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 claims description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 claims description 2
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 claims description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M hexanoate Chemical compound CCCCCC([O-])=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 2
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 claims description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 2
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 126
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 21
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- BTURAGWYSMTVOW-UHFFFAOYSA-M sodium dodecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC([O-])=O BTURAGWYSMTVOW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 3
- 238000012855 HCP-ELISA Methods 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 2
- 239000013627 low molecular weight specie Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XWHHYOYVRVGJJY-MRVPVSSYSA-N (2r)-2-amino-3-(4-fluorophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(F)C=C1 XWHHYOYVRVGJJY-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- HKUAWRVNDCVEHT-NSHDSACASA-N (2s)-2-(pyren-4-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C34 HKUAWRVNDCVEHT-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- VOIZSAUUYAGTMS-LURJTMIESA-N (2s)-2-amino-3-thiophen-3-ylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CSC=1 VOIZSAUUYAGTMS-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000537222 Betabaculovirus Species 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 241000282852 Lama guanicoe Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699696 Meriones Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- KPCZJLGGXRGYIE-UHFFFAOYSA-N [C]1=CC=CN=C1 Chemical group [C]1=CC=CN=C1 KPCZJLGGXRGYIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001295 alanines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 125000003785 benzimidazolyl group Chemical group N1=C(NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- WTOFYLAWDLQMBZ-LURJTMIESA-N beta(2-thienyl)alanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CS1 WTOFYLAWDLQMBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical class 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid group Chemical group C(CCCCC)(=O)O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- YAQXGBBDJYBXKL-UHFFFAOYSA-N iron(2+);1,10-phenanthroline;dicyanide Chemical compound [Fe+2].N#[C-].N#[C-].C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1.C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 YAQXGBBDJYBXKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N palmitic acid group Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N pentanoic acid group Chemical group C(CCCC)(=O)O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 125000004307 pyrazin-2-yl group Chemical group [H]C1=C([H])N=C(*)C([H])=N1 0.000 description 1
- 125000003226 pyrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- UDWXLZLRRVQONG-UHFFFAOYSA-M sodium hexanoate Chemical compound [Na+].CCCCCC([O-])=O UDWXLZLRRVQONG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NMTDPTPUELYEPL-UHFFFAOYSA-M sodium;heptanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCC([O-])=O NMTDPTPUELYEPL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии. Описан способ очистки белка из раствора, содержащего по меньшей мере одну загрязняющую примесь, посредством аффинной хроматографии с суперантигеном, включающий: а) адсорбирование белка на суперантигене, иммобилизованном на твердом носителе; б) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси посредством приведения в контакт иммобилизованного суперантигена, содержащего адсорбированный белок, с первым промывочным буфером, содержащим алифатический карбоксилат, где указанный алифатический карбоксилат содержит остов из 6-11 атомов углерода; и в) элюирование белка из суперантигена, иммобилизованного на твердом носителе; где белок выбран из группы, состоящей из растворимого рецептора, антитела, фрагмента антитела, одиночного вариабельного домена иммуноглобулина, Fab, F(ab')2, Fv, связанных через дисульфид Fv, scFv, мультиспецифического антитела с закрытой конформацией, связанных через дисульфид scFv или диатела. Также описан способ очистки белка из его содержащего загрязняющие примеси раствора посредством хроматографии с белком А, включающий: а) уравновешивание белка А, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка А; б) адсорбирование белка из содержащего загрязняющие примеси раствора на белке А, иммобилизованном на твердой фазе; в) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси путем промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка А, содержащим 50 мМ или 55 мМ трис-основания, 45 мМ уксусной кислоты, по меньшей мере один алифатический карбоксилат, при рН 7,2, 7,5 или 8,0, где алифатический карбоксилат выбран из группы, состоящей из 100 мМ каприлата натрия и 20 мМ деканоата натрия; и (г) извлечение белка из твердой фазы элюирующим буфером для белка А, где все буферы приготовлены без добавления NaCl. Кроме того, описан способ очистки белка из его содержащего загрязняющие примеси раствора посредством хроматографии с белком L, включающий: а) уравновешивание белка L, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка L; б) адсорбирование белка из содержащего загрязняющие примеси раствора на белке L, иммобилизованном на твердой фазе; в) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси путем промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка L, содержащим 52 мМ трис-основания, 48 мМ уксусной кислоты, по меньшей мере один алифатический карбоксилат, при рН 7,0, где алифатический карбоксилат выбран из группы, состоящей из 100 мМ каприлата натрия и 20 мМ деканоата натрия; и (г) извлечение белка из твердой фазы элюирующим буфером для белка L, где все буферы приготовлены без добавления NaCl. 3 н. и 35 з.п. ф-лы, 3 ил., 8 табл., 7 пр.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области очистки белков с применением суперантигена, такого как белок А, белок G или белок L, иммобилизованного на твердом носителе. В частности, изобретение относится к компонентам промывочного буфера и к способу использования промывочных буферов для удаления загрязняющих примесей из клетки-хозяина во время стадий промывки, минимизируя потерю желательного белкового продукта.
Предшествующий уровень техники
За последнее десятилетие аффинная хроматография с белком А стала признанной в качестве главного способа выбора для захвата моноклональных антител (mAbs) из потоков среды культивирования клеток млекопитающего. Эта стадия высокоспецифичной аффинности способна удалять 98% примесей за одну стадию благодаря специфическому связыванию между лигандом - белком А и Fc-областью антитела. В обычных рабочих условиях во время хроматографии с белком А осветленные потоки среды культивирования клеток вносят на колонку до достижения конкретной массы загрузки антител. Затем колонку обычно промывают буфером с высокой ионной силой для удаления загрязняющих примесей из клетки-хозяина, связанных со смолой посредством неспецифических взаимодействий. Затем антитело обычно элюируют из колонки посредством сдвига рН и собирают для дальнейшей обработки. Главная цель данного исследования, вследствие этого, представляет собой изучение применения детергентов, комбинированных с солями, для разрыва как ионных, так и гидрофобных взаимодействий и усиления удаления загрязняющих примесей из клетки-хозяина, снижая посредством этого нагрузку очистки на последующих стадиях выделения и очистки продукта.
Для крупномасштабной очистки много усилий затрачивается на оптимизацию компонентов промывочных и элюирующих буферов, чтобы максимально увеличить выход продукта. Однако в производственной ситуации, когда в одно и то же время очищается много различных белковых продуктов, разработка уникального промывочного буфера для каждого отдельного белкового продукта требует значительного времени и ресурсов для проверки различных компонентов буфера для определения подходящего промывочного буфера для каждого конкретного белкового продукта. "Универсальный" вспомогательный промывочный буфер, который можно было бы эффективно использовать с различными типами белков, может быть полезным и желательным. В настоящем изобретении предлагается способ очистки белков с использованием таких компонентов промывочного буфера.
Краткое изложение сущности изобретения
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ очистки белка, содержащего антитело, фрагмент антитела или одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, из раствора, содержащего по меньшей мере одну загрязняющую примесь, посредством хроматографии с суперантигеном, включающий: а) адсорбирование белка на суперантигене, иммобилизованном на твердом носителе; б) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси посредством приведения в контакт иммобилизованного суперантигена, содержащего адсорбированный белок, с первым промывочным буфером, содержащим алифатический карбоксилат; и в) элюирование белка из суперантигена, иммобилизованного на твердом носителе.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ очистки белка из его содержащего загрязняющие примеси раствора посредством хроматографии с белком А, включающий:
а) уравновешивание белка А, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка А;
б) адсорбирование белка из содержащего загрязняющие примеси раствора на белке А, иммобилизованном на твердой фазе;
в) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси путем промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка А, содержащим от примерно 50 мМ до примерно 55 мМ трис-основания, от примерно 45 мМ до примерно 50 мМ уксусной кислоты, по меньшей мере один алифатический карбоксилат при рН примерно 7,5, где алифатический карбоксилат выбран из группы, состоящей из примерно 100 мМ каприлата натрия, примерно 20 мМ деканоата натрия и примерно 20 мМ додеканоата натрия; и
г) извлечение белка из твердой фазы элюирующим буфером для белка А. В одном аспекте настоящего изобретения все буферы приготовлены без добавления NaCl.
В одном воплощении промывочный буфер для белка А дополнительно содержит от примерно 1 мМ до примерно 500 мМ ацетата натрия. В одном воплощении промывочный буфер для белка А содержит примерно 300 мМ ацетата натрия.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ очистки белка из его содержащего загрязняющие примеси раствора посредством хроматографии с белком L, включающий:
а) уравновешивание белка L, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка L;
б) адсорбирование белка из содержащего загрязняющие примеси раствора на белке L, иммобилизованном на твердой фазе;
в) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси путем промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка L, содержащим от примерно 50 мМ до примерно 55 мМ трис-основания, от примерно 45 мМ до примерно 50 мМ уксусной кислоты, по меньшей мере один алифатический карбоксилат при рН примерно 7,5, где алифатический карбоксилат выбран из группы, состоящей из примерно 100 мМ каприлата натрия, примерно 20 мМ деканоата натрия и примерно 20 мМ додеканоата натрия; и
г) извлечение белка из твердой фазы при помощи элюирующего буфера для белка L. В одном аспекте настоящего изобретения все буферы приготовлены без добавления NaCl.
В одном воплощении промывочный буфер для белка L дополнительно содержит от примерно 1 мМ до примерно 500 мМ ацетата натрия. В одном воплощении промывочный буфер для белка L содержит примерно 300 мМ ацетата натрия.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - результаты изучения концентрации каприлата - анти-OSM.
Фиг. 2 - результаты изучения концентрации каприлата - анти-IL13.
Фиг. 3 - результаты сравнительного анализа карбоновых кислот.
Подробное описание изобретения
Понятно, что данное изобретение не ограничивается конкретными способами, реагентами, соединениями, композициями или биологическими системами, которые, конечно, могут варьироваться. Понятно также, что терминология, используемая в данном описании изобретения, предназначается для цели описания только конкретных воплощений, и не предназначена для ограничения. При использовании в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают объекты во множественном числе, если содержание не указывает явно на иное. Таким образом, например, ссылка на "полипептид" включает комбинацию двух или более полипептидов и тому подобное.
"Примерно" при использовании в данном описании изобретения при ссылке на измеряемую величину, такую как количество, период времени и тому подобное, предназначен охватывать отклонения на ±20% или ±10%, включая ±5%, ±1% и ±0,1% от конкретной величины, так как такие отклонения являются подходящими для выполнения раскрытых способов.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании изобретения, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится изобретение. Хотя любые способы и вещества, подобные или эквивалентные описанным в данном описании, можно применять на практике для тестирования настоящего изобретения, предпочтительные вещества и способы описаны в данном описании. При описании и составлении формулы настоящего изобретения используют следующую терминологию.
"Полипептид", "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо в данном описании для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Полипептид может быть природного происхождения (полученный из тканей), рекомбинантным, или натуральным образом экспрессированным из прокариотических или эукариотических клеточных препаратов, или изготовленным химически посредством синтетических способов. Термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков представляют собой искусственные химические миметики соответствующих природных аминокислот, а также к полимерам природных аминокислот и полимерам не встречающихся в природе аминокислот. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от обычной химической структуры аминокислоты, но которая функционирует аналогично природной аминокислоте. Не встречающиеся в природе остатки подробно описаны в научной и патентной литературе; несколько показательных не встречающихся в природе композиций, полезных в качестве миметиков природных аминокислотных остатков, и методические указания описываются ниже. Миметики ароматических аминокислот могут быть образованы посредством замены, например, на D- или L-нафтилалан; D- или L-фенилглицин; D- или L-2-тиенилаланин; D- или L-1, -2,3- или 4-пиренилаланин; D- или L-3 тиенилаланин; D- или L-(2-пиридинил)-аланин; D- или L-(3-пиридинил)-аланин; D- или L-(2-пиразинил)-аланин; D- или L-(4-изопропил)-фенилглицин; D-(трифторметил)-фенилглицин; D-(трифторметил)-фенилаланин; D-пара-фтор-фенилаланин; D-или L-пара-бифенилфенилаланин; K- или L-пара-метокси-бифенилфенилаланин; D- или L-2-индол(алкил)аланины; и D- или L-алкилаланины, где алкил может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, втор-изотил, изо-пентил или некислотные аминокислоты. Ароматические кольца не встречающейся в природе аминокислоты включают, например, тиазолильные, тиофенильные, пиразолильные, бензимидазолильные, нафтильные, фуранильные, пирролильные и пиридильные ароматические кольца.
"Пептид" при использовании в данном описании включает пептиды, которые представляют собой консервативные варианты пептидов, специально показанных в данном описании изобретения. "Консервативный вариант" при использовании в данном описании означает замену аминокислотного остатка другим биологически подобным остатком. Примеры консервативных вариантов включают, но без ограничения ими, замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин, аланин, цистеин, глицин, фенилаланин, пролин, триптофан, тирозин, норлейцин или метионин, на другой, или замену одного полярного остатка на другой, такую как замена аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин, и тому подобное. Нейтральные гидрофильные аминокислоты, которые могут быть заменены друг другом, включают аспарагин, глутамин, серии и треонин. "Консервативный вариант" также включает использование замещенной аминокислоты вместо незамещенной родительской аминокислоты при условии, что антитела, полученные к замещенному полипептиду, также иммунореактивны по отношению к незамещенному полипептиду. Такие консервативные замены попадают в определение классов пептидов по изобретению. "Катионный" при использовании в данном описании изобретения относится к любому пептиду, который имеет суммарный положительный заряд при рН 7,4. Биологическая активность пептидов может быть определена посредством стандартных способов, известных специалисту в данной области техники и раскрытых в данном описании.
"Рекомбинантный" при использовании в отношении белка показывает, что белок был модифицирован путем интродукции гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменением нативной нуклеиновой кислоты или белка.
При использовании в данном описании "терапевтический белок" относится к любому белку и/или полипептиду, которых можно вводить млекопитающему, чтобы вызвать биологический или клинический ответ ткани, системы, животного или человека, которого добивается, например, исследователь или врач. Терапевтический белок может вызывать более одного биологического или клинического ответа. Кроме того, термин "терапевтически эффективное количество" означает любое количество, которое, при сравнении с соответствующим субъектом, который не получил такое количество, имеет результатом, без ограничения этим, исцеление, предупреждение или уменьшение интенсивности симптомов заболевания, расстройства или побочного эффекта, или снижение показателя распространения заболевания или расстройства. Термин также включает в свои рамки количества, эффективные в усилении нормальной физиологической функции, а также количества, эффективные в содействии физиологической функции у пациента, которая усиливает или поддерживает терапевтический эффект второго фармацевтического агента.
Все "аминокислотные" остатки, идентифицированные в данном описании, находятся в природной L-конфигурации. Аббревиатуры для аминокислотных остатков согласно стандартной номенклатуре полипептидов, показаны в следующей таблице.
Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков представлены в данном описании формулами, чья ориентация слева направо представляет собой обычное направление от амино-конца к карбокси-концу.
В другом воплощении полипептид представляет собой антигенсвязывающий полипептид. В одном воплощении антигенсвязывающий полипептид выбран из группы, состоящей из растворимого рецептора, антитела, фрагмента антитела, одиночного вариабельного домена иммуноглобулина, Fab, F(ab')2, Fv, связанных через дисульфид Fv, scFv, мультиспецифичного антитела с закрытой конформацией, связанных через дисульфид scFv или диател.
Термин "антигенсвязывающий полипептид" при использовании в данном описании относится к антителам, фрагментам антител и другим белковым структурам, которые способны связываться с антигеном.
Термины Fv, Fc, Fd, Fab или F(ab)2 используются в их обычных значениях (см., например Harlow et al., Antibody A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
"Химерное антитело" относится к типу созданного генно-инженерным путем антитела, которое содержит природную вариабельную область (легкую цепь и тяжелые цепи), полученную из донорного антитела, ассоциированную с константными областями легкой и тяжелой цепи, полученными от акцепторного антитела.
"Гуманизированное антитело" относится к типу созданного генно-инженерным путем антитела, CDR которого получены из иммуноглобулина донора, отличного от человека, а остальные происходящие из иммуноглобулина части молекулы получены из иммуноглобулина(ов) одного (или более) человека. Кроме того, остатки каркасной основы могут быть изменены для сохранения аффинности связывания (см., например, Queen et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9: 421 (1991)). Подходящее человеческое акцепторное антитело может представлять собой антитело, выбранное из обычной базы данных, например базы данных KABAT.RTM., базы данных Los Alamos и базы данных Swiss Protein, по гомологии с нуклеотидной и аминокислотной последовательностями донорного антитела. Человеческое антитело, характеризующееся гомологией с каркасными областями донорного антитела (на основе аминокислот), может быть подходящим для получения константной области тяжелой цепи и/или вариабельной каркасной области тяжелой цепи для включения донорных CDR. Подходящее акцепторное антитело, способное отдавать константные области или вариабельные каркасные области легкой цепи, может быть выбрано аналогично. Следует заметить, что тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела необязательно происходят от одного и того же акцепторного антитела. В известном уровне техники описано несколько способов получения таких гуманизированных антител, см., например, ЕР-А-0239400 и ЕР-А-054951.
Термин "донорное антитело" относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), которое отдает аминокислотные последовательности своих вариабельных областей, CDR или других функциональных фрагментов или их аналоги первому иммуноглобулиновому партнеру, чтобы получить измененную кодирующую область иммуноглобулина и результирующее экспрессированное измененное антитело с антигенной специфичностью и нейтрализующей активностью, свойственными донорному антителу.
Термин "акцепторное антитело" относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), гетерологичному с донорным антителом, которое отдает все (или любую часть, но в некоторых воплощениях - все) аминокислотные последовательности, кодирующие его каркасные области тяжелой и/или легкой цепи и/или его константные области тяжелой и/или легкой цепи, первому иммуноглобулиновому партнеру. В некоторых воплощениях человеческое антитело представляет собой акцепторное антитело.
"CDR" определяют как аминокислотные последовательности определяющей комплементарность области антитела, которые представляют собой гипервариабельные области тяжелых и легких цепей иммуноглобулина. См., например, Kabat et al., Sequences of Protein of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). В вариабельном участке иммуноглобулина присутствуют три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи (или области CDR). Таким образом, "CDR" при использовании в данном описании изобретения относится ко всем трем CDR тяжелой цепи или ко всем трем CDR легкой цепи (или ко всем CDR как тяжелой, так и легкой цепи, при необходимости). Структура и укладка белка антитела может означать, что другие остатки считаются частью антигенсвязывающей области и должны пониматься специалистом таким образом. См., например, Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883.
При использовании в данном описании изобретения термин "домен" относится к прошедшей фолдинг белковой структуре, которая имеет третичную структуру независимо от оставшейся части белка. Обычно домены отвечают за обособленные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена. "Одиночный вариабельный домен антитела" представляет собой домен прошедшего фолдинг полипептида, содержащий последовательности, свойственные вариабельным доменам антител. Поэтому он включает целые вариабельные домены и модифицированные вариабельные домены антитела, например, в которых одна или более петель была заменена последовательностями, которые не являются свойственными вариабельным доменам антитела, или вариабельные домены антитела, которые были укорочены или содержат N- или С-концевые удлинения, а также прошедшие фолдинг фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют по меньшей мере связывающую активность и специфичность полноразмерного домена.
Выражение "одиночный вариабельный домен иммуноглобулина" относится к вариабельному домену антитела (VH, VHH, VL, который специфически связывает антиген или эпитоп независимо от другой V-области или домена. Одиночный вариабельный домен иммуноглобулина может присутствовать в виде структуры (гомо- или гетеро-мультимер) с другими различными вариабельными областями или вариабельными доменами, когда другие области или домены не требуются для связывания антигена при помощи одиночного вариабельного домена иммуноглобулина (то есть когда одиночный вариабельный домен иммуноглобулина связывает антиген независимо от дополнительных вариабельных доменов). "Однодоменное антитело" или "dAb" представляет собой то же самое, что и "одиночный вариабельный домен иммуноглобулина", который способен к связыванию с антигеном, как этот термин используется в данном описании. Одиночный вариабельный домен иммуноглобулина может представлять собой вариабельный домен человеческого антитела, но также включает одиночные вариабельные домены антител от других видов, таких как грызуны (например, как раскрыто в WO 00/29004), VHH dAbs (нанотела) усатых акул и представителей семейства верблюдовых. VHH верблюдовых представляют собой полипептиды одиночного вариабельного домена иммуноглобулина, которые получены от представителей видов, включающих верблюдов, лам, альпак, дромадеров и гуанако, которые продуцируют антитела только с тяжелыми цепями, естественным образом лишенные легких цепей. Такие VHH домены могут быть гуманизированы согласно стандартным методикам, доступным в данной области техники, и такие домены тем не менее считаются "однодоменными антителами" согласно изобретению. При использовании в данном описании "VH" включает VHH домены верблюдовых. NARV представляют собой другой тип одиночного вариабельного домена иммуноглобулина, которые были идентифицированы у хрящевых рыб, включая усатых акул. Эти домены также известны как "Novel Antigen Receptor variable region" (обычно сокращено до V(NAR) или NARV). Подробности см. в Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) и US 20050043519 A.
Термин "эпитоп-связывающий домен" относится к домену, который специфически связывает антиген или эпитоп независимо от другой V-области или домена, он может представлять собой однодоменное антитело (dAb), например человека, одиночный вариабельный домен иммуноглобулина верблюдовых или акулы.
Термин "антигенсвязывающий участок", используемый в данном описании, относится к сайту белка, который способен к специфическому связыванию антигена, он может представлять собой одиночный домен, например эпитоп-связывающий домен, или он может представлять собой спаренные VH/VL домены, которые могут быть обнаружены в стандартном антителе. В некоторых аспектах изобретения антигенсвязывающие участки могут образовывать одноцепочечные Fv (ScFv) домены.
Термины "mAbdAb" и dAbmAb" при использовании в данном описании относятся к антигенсвязывающим белкам по настоящему изобретению. Эти два термина могут применяться взаимозаменяемо, и предназначены иметь одно и то же значение при использовании в данном описании.
В одном аспекте настоящего изобретение направлено на способ очистки белка, содержащего антитело, фрагмент антитела или одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, из раствора, содержащего по меньшей мере одну загрязняющую примесь, посредством хроматографии с суперантигеном, включающий: (а) адсорбирование белка на суперантигене, иммобилизованном на твердом носителе; б) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси посредством приведения в контакт иммобилизованного суперантигена, содержащего адсорбированный белок, с первым промывочным буфером, содержащим алифатический карбоксилат; и (в) элюирование белка из суперантигена, иммобилизованного на твердом носителе.
В одном воплощении аффинную хроматографию выполняют, используя суперантиген. "Суперантиген" относится к типичным лигандам, которые взаимодействуют с членами суперсемейства иммуноглобулинов в сайте, который отличен от сайтов связывания лиганда-мишени этих белков. Стафиллококковые энтеротоксины являются примерами суперантигенов, которые взаимодействуют с Т-клеточными рецепторами. Суперантигены, которые связывают антитела, включают, но без ограничения ими, белок G, который связывается с константной областью IgG (Bjorck and Kronvall, J. Immunol., 733:969 (1984)); белок А, который связывается с константной областью IgG и VH доменами (Forsgren и Sjoquist, J. Immunol., 97: 822 (1966)); и белок L, который связывается с Vu доменами (Bjorck, J. Immunol., 740: 1194 (1988). В одном воплощении суперантиген выбирают из группы, состоящей из белка А, белка G и белка L.
При использовании в данном описании термин "белок А" охватывает белок А, выделенный из природного источника, белок А, полученный синтетическим путем (например посредством пептидного синтеза или посредством рекомбинантных технологий), и его варианты, которые сохраняют способность связывать белки, которые имеют область CH2/CH3. Белок А может быть приобретен коммерческим образом от Repligen, Pharmacia и Fermatech.
При использовании в данном описании "аффинная хроматография" представляет собой хроматографический метод, в котором для осуществления хроматографического разделения используются специфические обратимые взаимодействия между биомолекулами, а не общие свойства биомолекул, такие как изоэлектрическая точка, гидрофобность или размер. "Аффинная хроматография с белком А" или "хроматография с белком А" относится к специфическому методу аффинной хроматографии, в котором используется аффинность IgG-связывающих доменов белка А в отношении Fc-участка молекулы иммуноглобулина. Этот Fc-участок содержит константные домены CH2 и CH3 иммуноглобулина человека или животного или домены иммуноглобулина, по существу подобные им. Белок А охватывает нативный белок из клеточной стенки Staphylococcus aureus, белок А, полученный рекомбинантными или синтетическими методами, и варианты, которые сохраняют способность связываться с Fc-областью. На практике хроматография с белком А охватывает использование белка А, иммобилизованного на твердом носителе. См. Gagnon, Protein A Affinity Chromotography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, pp. 155-198, Validated Biosystems, 1996. Белок G и белок L также можно применять для аффинной хроматографии. Твердый носитель представляет собой неводную матрицу, к которой прилипает белок А (например колонку, смолу, матрицу, шарики, гель и так далее). Такие носители включают агарозу, сефарозу, стекло, диоксид кремния, полистирол, коллодированный уголь, песок, полиметакрилат, поперечно-сшитый поли(стирол-дивинилбензол) и агарозу с нагруженной декстраном поверхностью и любой другой подходящий материал. Такие вещества хорошо известны в данной области техники. Для закрепления суперантигена на твердом носителе может быть использован любой подходящий метод. Способы фиксации белков на подходящих твердых носителях хорошо известны в данной области техники. См., например, Ostrove, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, 182: 357-371, 1990. Такие твердые носители с иммобилизованным белком А или белком L либо без них легко доступны из многих коммерческих источников, включая такие, как Vector Laboratory (Burlingame, Calif.), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Calif.), BioRad (Hercules, Calif.), Amersham Biosciences (часть GE Healthcare, Uppsala, Sweden) и Millipore (Billerica, Mass.).
Алифатический карбоксилат может быть либо прямоцепочечным, либо разветвленным. В некоторых воплощениях алифатический карбоксилат представляет собой алифатическую карбоновую кислоту или ее соль, либо источником алифатического карбоксилата является алифатическая карбоновая кислота или ее соль. В некоторых воплощениях алифатический карбоксилат является прямоцепочечным и выбран из группы, состоящей из метановой (муравьиной) кислоты, этановой (уксусной) кислоты, пропановой (пропионовой) кислоты, бутановой (масляной) кислоты, пентановой (валериановой) кислоты, гексановой (капроновой) кислоты, гептановой (этантовой) кислоты, октановой (каприловой) кислоты, нонановой (пеларгоновой) кислоты, декановой (каприновой) кислоты, ундекановой (ундециловой) кислоты, додекановой (лауриновой) кислоты, тридекановой (тридециловой) кислоты, тетрадекановой (миристиновой) кислоты, пентадекановой кислоты, гексадекановой (пальмитиновой) кислоты, гептадекановой (маргариновой) кислоты, октадекановой (стеариновой) кислоты и эйкозановой (арахиновой) кислоты или любых их солей. Таким образом, алифатический карбоксилат может содержать углеродный остов из 1-20 атомов углерода в длину. В одном воплощении алифатический карбоксилат содержит остов из 6-12 атомов углерода. В одном воплощении алифатический карбоксилат выбран из группы, состоящей из капроата, гептаноата, каприлата, деканоата и додеканоата. В одном воплощении источник алифатического карбоксилата выбран из группы, состоящей из алифатической карбоновой кислоты, натриевой соли алифатической карбоновой кислоты и калиевой соли алифатической карбоновой кислоты. В одном воплощении промывочный буфер содержит каприлат натрия, деканоат натрия или додеканоат натрия. В одном воплощении промывочный буфер содержит от примерно 10 мМ до примерно 125 мМ каприлата натрия, от примерно 1 мМ до примерно 30 мМ деканоата натрия или от примерно 1 мМ до примерно 30 мМ додеканоата натрия. В одном воплощении промывочный буфер содержит примерно 100 мМ каприлата натрия, примерно 20 мМ деканоата натрия или примерно 20 мМ додеканоата натрия. В одном воплощении промывочный буфер содержит от примерно 1 мМ до примерно 500 мМ ацетата натрия. В одном воплощении промывочный буфер содержит примерно 300 мМ ацетата натрия.
В одном воплощении по меньшей мере одна загрязняющая примесь представляет собой белок клетки-хозяина или ДНК клетки-хозяина. В некоторых воплощениях клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из клеток СНО (яичника китайского хомячка), клеток NS0, клеток Sp2/0, клеток COS, клеток К562, клеток ВНК, клеток PER.C6 и клеток НЕК (почки эмбриона человека). Клетка-хозяин может представлять собой бактериальную клетку, выбранную из группы, состоящей из Е. coll (например W3110, BL21), B. subtilis и/или других подходящих бактерий; эукариотические клетки, такие как клетки грибов или дрожжевые клетки (например Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa).
"Буфер" представляет собой забуференный раствор, который препятствует изменениям рН посредством его сопряженных кислотно-основных компонентов.
"Уравновешивающий буфер" в данном описании представляет собой буфер, используемый для приготовления твердой фазы для хроматографии.
"Загрузочный буфер" представляет собой буфер, который используют для загрузки смеси белка и загрязняющей(их) примеси(ей) на хроматографическую матрицу. Уравновешивающий и загрузочный буферы могут быть одинаковыми.
"Элюирующий буфер" используют для элюирования белков из хроматографической матрицы.
"Соль" представляет собой соединение, образованное посредством взаимодействия кислоты и основания.
В одном воплощении промывочный буфер содержит органическую кислоту, соль щелочного металла или аммониевую соль сопряженного основания органической кислоты и органическое основание. В одном воплощении промывочный буфер готовят без добавления NaCl.
В одном воплощении органическая кислота включает, но без ограничения ими, муравьиную кислоту, уксусную кислоту, молочную кислоту, лимонную кислоту, яблочную кислоту, малеиновую кислоту, глицин, фосфорную кислоту, глицил-глицин, янтарную кислоту, TES (2-{[трис(гидроксиметил)-метил]амино}этансульфоновая кислота), MOPS (3-(N-морфолино)-пропансульфоновая кислота), PIPES (пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновая кислота)) и MES (2-Щморфолино)этансульфоновая кислота).
В одном воплощении органическое основание включает, но без ограничения ими, группу, состоящую из трис-основания, аргинина, бис-трис, бис-трис-пропана, бицина (N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин), HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота) и трицина (N-трис(гидроксиметил)метилглицин).
В одном воплощении сопряженное основание органической кислоты представляет собой натриевую, калиевую или аммониевую соль сопряженного основания органической кислоты. В одном воплощении органическая кислота представляет собой уксусную кислоту, и сопряженное основание уксусной кислоты представляет собой натриевую соль.
В одном воплощении белок представляет собой антиген-связывающий белок. В одном воплощении антиген-связывающий белок представляет собой антитело. В одном воплощении антитело принадлежит к классу IgG. В одном воплощении антиген-связывающий белок представляет собой одиночный вариабельный домен иммуноглобулина.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ очистки белка из его содержащего загрязняющие примеси раствора посредством хроматографии с белком А, включающий:
(а) уравновешивание белка А, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка А;
(б) адсорбирование белка из содержащего загрязняющие примеси раствора на белке А, иммобилизованном на твердой фазе;
(в) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси путем промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка А, содержащим от примерно 50 мМ до примерно 55 мМ трис-основания, от примерно 45 мМ до примерно 50 мМ уксусной кислоты, по меньшей мере один алифатический карбоксилат, при рН примерно 7,5, где алифатический карбоксилат выбран из группы, состоящей из примерно 100 мМ каприлата натрия, примерно 20 мМ деканоата натрия и примерно 20 мМ додеканоата натрия; и
(г) извлечение белка из твердой фазы элюирующим буфером для белка А. В одном воплощении все буферы готовят без добавления NaCl. В одном воплощении промывочный буфер для белка А дополнительно содержит от примерно 1 мМ до примерно 500 мМ ацетата натрия. В одном воплощении промывочный буфер для белка А содержит примерно 300 мМ ацетата натрия.
В одном воплощении уравновешивающий буфер содержит от примерно 50 мМ до примерно 55 мМ трис-основания, от примерно 45 мМ до примерно 50 мМ уксусной кислоты, при рН примерно 7,2; и элюирующий буфер содержит 1,8 мМ ацетата натрия и от примерно 28,2 мМ до примерно 300 мМ уксусной кислоты, при рН от примерно 2,4 до примерно рН 3,6.
В одном воплощении способ дополнительно включает следующую стадию после стадии (в) и перед стадией (г): удаление загрязняющих примесей путем промывания твердой фазы вторым промывочным буфером для белка А, содержащим 55 мМ трис-основания, 45 мМ уксусной кислоты, при рН примерно 7,2. В одном воплощении второй промывочный буфер для белка А приготовлен без добавления NaCl.
В одном воплощении способ дополнительно включает следующие стадии после стадии (г): (д) титрование раствора, содержащего извлеченный белок, до рН примерно 3,0 с помощью 30 мМ уксусной кислоты, 100 мМ HCl; (е) выдерживание раствора со стадии (д) при рН примерно 3,0 в течение от примерно 30 до примерно 60 минут; и (ж) доведение рН раствора со стадии (е) до рН примерно 7,5 посредством 1 М трис.
В одном воплощении способ дополнительно включает фильтрование раствора, полученного на стадии (ж).
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ очистки белка из его содержащего загрязняющие примеси раствора посредством хроматографии с белком L, включающий:
(а) уравновешивание белка L, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка L;
(б) адсорбирование белка из содержащего загрязняющие примеси раствора на белке L, иммобилизованном на твердой фазе;
(в) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси путем промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка L, содержащим от примерно 50 мМ до примерно 55 мМ трис-основания, от примерно 45 мМ до примерно 50 мМ уксусной кислоты, по меньшей мере один алифатический карбоксилат, при рН примерно 7,5, где алифатический карбоксилат выбран из группы, состоящей из примерно 100 мМ каприлата натрия, примерно 20 мМ деканоата натрия и примерно 20 мМ додеканоата натрия; и
(г) извлечение белка из твердой фазы при помощи элюирующего буфера для белка L. В одном воплощении все буферы готовят без добавления NaCl. В одном воплощении промывочный буфер для белка L дополнительно содержит от примерно 1 мМ до примерно 500 мМ ацетата натрия. В одном воплощении промывочный буфер для белка L содержит примерно 300 мМ ацетата натрия.
В одном воплощении уравновешивающий буфер содержит от примерно 50 мМ до примерно 55 мМ трис-основания, от примерно 45 мМ до примерно 50 мМ уксусной кислоты, при рН примерно 7,2; и элюирующий буфер содержит 1,8 мМ ацетата натрия и от примерно 28,2 мМ до примерно 300 мМ уксусной кислоты, при рН от примерно 2,4 до примерно рН 3,6.
В одном воплощении способ дополнительно включает следующую стадию после стадии (в) и перед стадией (г): удаление загрязняющих примесей путем промывания твердой фазы вторым промывочным буфером для белка L, содержащим 55 мМ трис-основания, 45 мМ уксусной кислоты, при рН примерно 7,2. В одном воплощении второй промывочный буфер для белка L готовят без добавления NaCl.
В одном воплощении способ дополнительно включает следующие стадии после стадии (г): (д) титрование раствора, содержащего извлеченный белок, до рН примерно 3,0 с помощью 30 мМ уксусной кислоты, 100 мМ HCl; (е) выдерживание раствора со стадии (д) при рН примерно 3,0 в течение от примерно 30 до примерно 60 минут; и (ж) доведение рН раствора со стадии (е) до рН примерно 7,5 посредством 1 М трис.
В одном воплощении способ дополнительно включает фильтрование раствора, полученного на стадии (ж).
"Раствор" может представлять собой среду для культивирования клеток, например поток питательных веществ клеточной культуры. Поток питательных веществ может быть профильтрованным. Раствор может представлять собой осветленную необработанную питательную среду (CUB) (или осветленную ферментативную питательную среду/супернатант). CUB также известен как супернатант клеточной культуры, из которого посредством осветления удалены все клетки и/или продукты распада клеток,. Альтернативно собирают по меньшей мере один периплазматический экстракт, используя способы, известные в данной области техники. Раствор может представлять собой лизированный препарат клеток, экспрессирующих белок (например раствор представляет собой лизат).
"Загрязняющая примесь" относится к любой чужеродной или нежелательной молекуле, которая присутствует в образце для загрузки перед хроматографией с суперантигеном или в элюате после хроматографии с суперантигеном. Она может представлять собой присутствующие "технологические загрязнения". Они представляют собой загрязнения, которые присутствуют как результат процесса, посредством которого продуцируется представляющий интерес белок. Например, они включают белки клетки-хозяина (НСР), РНК и ДНК (например вирусы). "НСР" относится к белкам, не связанным с представляющим интерес белком, продуцированным клеткой-хозяином во время культивирования клеток или ферментации, включая внутриклеточные и/или секретируемые белки. Примером белка клетки-хозяина является протеаза, которая может вызывать повреждение представляющего интерес белка, если все еще присутствует во время и после очистки. Например, если протеаза остается в образце, содержащем представляющий интерес белок, она может производить связанные с продуктом вещества или загрязнения, которые изначально не присутствовали. Присутствие протеаз может вызывать распад представляющего интерес белка с течением времени в ходе процесса очистки и/или в конечной композиции. Удаление НСР или пониженные уровни НСР по определению тождественны удалению или снижению уровня протеаз.
Технологические загрязнения также включают компоненты, используемые для роста клеток или для обеспечения экспрессии представляющего интерес белка, например растворители (например метанол, используемый для культивирования дрожжевых клеток), антибиотики, метотрексат (MTX), компоненты питательной среды, флокулянты и так далее. Также они включают молекулы, которые представляют собой часть твердой фазы суперантигена, которые вымываются в образец во время предшествующих стадий, например белок А, белок G или белок L.
Загрязняющие примеси также включают "связанные с продуктом вещества", которые включают белки, сохраняющие свою активность, но отличные по своей структуре; и "связанные с продуктом загрязнения", которые включают белки, потерявшие свою активность из-за их отличия по структуре. Эти связанные с продуктом варианты включают, например, высокомолекулярные разновидности (HMW), низкомолекулярные разновидности (LMW), агрегированные белки, предшественники, деградированные белки, неправильно уложенные белки, белки с пониженным содержанием дисульфидных связей, фрагменты и дезамидированные разновидности.
Присутствие любого из этих загрязнений в элюате может быть измерено для того, чтобы установить, была ли успешной стадия промывки. Например, авторы изобретения показали обнаруженное снижение уровня НСР, измеренное в нанограммах НСР на миллиграмм белка (см. Примеры).
Таким образом, элюат с твердого носителя суперантигена может содержать белок в образце вместе с НСР или ДНК, присутствующими в количестве примерно 5000 частей на миллион (млн-1) или менее, 4000 частей на миллион (млн-1) или менее, 3000 частей на миллион (млн-1) или менее, 2500 частей на миллион (млн-1) или менее, 2000 частей на миллион (млн-1) или менее, 1500 частей на миллион (млн-1) или менее, 1000 частей на миллион (млн-1) или менее, примерно 900 частей на миллион (млн-1) или менее, примерно 800 частей на миллион (млн-1) или менее, примерно 700 частей на миллион (млн-1) или менее, примерно 600 частей на миллион (млн-1) или менее, примерно 500 частей на миллион (млн-1) или менее, примерно 400 частей на миллион (млн-1) или менее, примерно 300 частей на миллион (млн-1) или менее, примерно 200 частей на миллион (млн-1) или менее, примерно 100 частей на миллион (млн-1) или менее, примерно 90 млн-1 или менее, примерно 80 млн-1 или менее, примерно 70 млн-1 или менее, примерно 60 млн-1 или менее или примерно 50 млн-1 или менее. "Млн-1" эквивалентно нг/мг, и "млрд-1" ("частей на миллиард") эквивалентно пг/мг.
Снижение может быть показано по сравнению со стадией промывки контроля без алифатического карбоксилата. Альтернативно, снижение может быть показано по сравнению со стадией промывки контроля без алифатического карбоксилата и ацетата натрия.
Описан способ, где степень извлечения представляющего интерес белка из элюата после стадии промывки по изобретению составляет 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% или менее, включая любое дискретное значение в диапазоне от 100% до 50% или в любом поддиапазоне, определяемом любой парой дискретных величин в этом диапазоне. Степень извлечения в элюате в процентах (%) вычисляют путем определения количества представляющего интерес белка в элюате как процента от количества представляющего интерес белка, нанесенного на колонку, согласно следующей формуле:
Степень извлечения в процентах = Количество продукта в элюате Х100
Количество продукта в загрузке
Количество загрязняющей примеси, присутствующей в элюате, может быть определено посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), OCTET или других методов определения уровня или одной или более загрязняющих примесей, описанных выше. В Примерах, представленных в данном описании, для определения уровня НСР в образце используют метод ELISA.
Пример 1. Материалы и методы
Все хроматографические процедуры осуществляли, используя систему АКТА Explorer 100 от GE Healthcare (Uppsala, Sweden). Концентрацию белка чистых образцов определяли путем измерения оптической плотности при 280 нм, используя Thermo Scientific NanoDrop 1000 (RN). Концентрации белка из неочищенных образцов определяли, используя колонку POROS Protein А (2,1×30 мм), полученную от Applied Biosystems (Foster City, CA), на Agilent 1100 HPLC от Hewlett Packard (Palo Alto, CA). Среду MabSelect SuRe Protein А получали от GE Healthcare (Uppsala, Sweden). Колонки Vantage получали от Millipore Corporation (Bedford, MA). Измерения мутности выполняли, используя турбидиметр 2100P со стеклянными ячейками для образцов, номер по каталогу #24347-06, полученный от HACH Company (Loveland, СО, USA). Все химические реактивы получали от JT Baker (Phillipsburg, NJ) или Sigma Aldrich (St Louis, МО), и они представляли собой реагенты согласно стандартам USP (Фармакопея США).
Все хроматографические эксперименты выполняли на колонке MabSelect SuRe 1,1×25 см в хроматографической системе АКТА Explorer 100, если не указано иное. Концентрацию антител в фильтрате клеточной культуры определяли с помощью аналитического белка А, либо ее определяли с помощью анализа для определения концентрации белка Biacore в Bioanalytical Sciences group в GSK, Upper Merion.
Пример 2. Предварительный скрининг добавок промывочного буфера
Буферы готовили путем титрования до конкретных рН, используя уксусную кислоту или трис-основание. В качестве контроля условия скрининга сравнивали с результатами с промывочным буфером, аналогичным стандартному высокосолевому промывочному буферу для белка А, 50 мМ трис, уксусная кислота, 1 М NaCl, рН 7,2. См. Фиг. 1 касательно полного перечня пяти испытывавшихся экспериментальных условий и Таблицы 3 и 4 касательно соответствующих результатов. Промывочные буферы тестировали в ходе хроматографии с белком А фильтрата клеточных культур анти-OSM (GSK315234) и анти-ILIS (GSK679586) от GSK. Эти два отдельных случая имели результатом аналогичные тенденции снижения НСР и ДНК. Уровни загрязнений в продуктах белка А для промывочных буферов Тритон Х100 и Тритон Х114 не оценивали далее из-за измененного и нетипичного профиля элюирования и чрезмерной потери продукта. Буфер, содержащий PS80, неионное поверхностно-активное вещество на основе полимера оксида этилена, показывал минимальную очистку по сравнению со стандартным 1 М NaCl промывочным буфером. Наибольшее снижение НСР и ДНК имело место в случае промывочного буфера, содержащего 100 мМ каприлат натрия, натриевую соль карбоновой кислоты, октановой кислоты. Буфер 100 мМ каприлат обеспечивал приблизительно 5-кратное уменьшение НСР по сравнению с контролем как для анти-OSM, так и для анти-IL13. Кроме того, он имел результатом 100-кратное и 60-кратное снижение ДНК по сравнению с контролем для анти-IL13 и анти-OSM, соответственно. См. Таблицу 3 и Таблицу 4 касательно полного выхода, НСР, ДНК и данных SEC для анти-OSM и анти-IL13 вместе с условиями скрининга промывки.
Пример 3. Эффект концентрации каприлата на очистку от примесей
Для изучения эффекта концентрации каприлата натрия на удаление загрязнений испытывали ряд концентраций каприлата натрия. См. Таблицу 5 касательно перечня буферов и скоростей потока, используемых для изучения действия концентрации каприлата на удаление загрязнений для анти-OSM и анти-IL13. Данные исследований концентраций каприлата обобщены на Фиг. 1 и Фиг. 2 для анти-OSM и анти-IL13. Для хроматографии как с анти-IL13, так и с анти-OSM, изменения концентрации каприлата явно влияют на снижение СНО НСР и ДНК. Чем выше была концентрация каприлата, тем большее снижение НСР и ДНК наблюдали как для анти-OSM, так и для анти-IL13. Однако самое большое снижение НСР и ДНК наблюдали для комбинации каприлата натрия и 0,3 М ацетата натрия. Комбинированный эффект детергента и соли увеличивал очищающую способность буфера по сравнению с одним детергентом или одной солью.
Максимальная испытывавшаяся концентрация каприлата натрия в этом исследовании составляла 100 мМ каприлата натрия, исходя из эмпирически определенной растворимости приблизительно 125 мМ каприлата натрия при рН 7,2. Так как ожидается, что растворимость увеличивается при более высоком рН, могли бы быть испытаны более высокие концентрации каприлата путем корректировки буферной системы и компонентов, если бы потребовалось удаление большего количества загрязняющих примесей из клетки-хозяина. Однако на основе этого исследования авторы изобретения определили, что 100 мМ каприлат натрия в комбинации с 0,3 M ацетата натрия обеспечивал адекватное удаление примесей из клетки-хозяина.
Пример 4. Скрининг карбоновой кислоты
Каприлат натрия представляет собой натриевую соль каприловой кислоты, состоящей из длинной алифатической цепи из восьми атомов углерода, принадлежащей к классу карбоновых кислот. Эти амфипатические насыщенные неразветвленные соли действуют в качестве детергентов благодаря своим насыщенным карбоновым хвостам и заряженной карбоксильной головной группе. Для определения действия длины карбонового хвоста на удаление загрязняющей примеси тестировали несколько других натриевых солей. Эти другие испытываемые соли включают капроат натрия, гептаноат натрия, каприлат натрия, деканоат натрия и додеканоат натрия. План эксперимента обобщен в Таблице 6. Результаты этого эксперимента обобщены на Фиг. 3. Додеканоат натрия исключили из анализа из-за низкого выхода и измененной характеристики элюирования, наблюдаемой в предварительных экспериментах. Хотя все эти различные соли имели результатом аналогичные выходы продукта, за исключением додеканоата, все они имели результатом очень разные профили распределения примесей. Так, увеличение количества атомов углерода в цепи снижало уровни примесей. Натриевые соли с углеродными цепями меньше, чем у каприлата (С8) натрия, имели результатом намного более высокие уровни примесей. Лучшие два кандидата в добавки для промывочного буфера представляют собой каприлат натрия и деканоат натрия.
Пример 5. Действие оптимизированной промывки на мутность
Также изучали действия оптимизированной каприлатной промывки на последующие конкретные операции; с особым вниманием на ее влияние на минимизацию последующего осаждения белка А и улучшение фильтруемости. Фильтрат клеточной культуры анти-IL13 из фильтрата клеточной культуры анти-IL13 при 1,16 г/л анализировали на 2,6×27 см колонке MabSelect SuRe, используя два различных режима промывки. Половину этого материала подвергали хроматографии с белком А, применяя оптимизированный режим промывки, включающей каприлат натрия. Другую половину материала обрабатывали уравновешивающим буфером вместо промывки с каприлатом. Используя мутность в качестве показателя фильтруемости, регистрировали измерения мутности пулов элюата. Затем элюаты титровали до рН 3,5 посредством 30 мМ уксусной кислоты, 100 мМ соляной кислоты. Еще раз выполняли и регистрировали измерения мутности. После одного часа инкубации образцов элюата при рН 3,5 их затем титровали до рН 6,0, подготавливая для следующего операции. Выполняли и регистрировали измерения мутности пулов с доведенным рН. Полученные данные обобщены в Таблице 7, профиль распределения примесей представлен в Таблице 8. Рассматривая мутность в качестве индикатора фильтруемости, каприлатная промывка позволила снизить некоторую часть нагрузки на фильтрацию благодаря 50%-ному уменьшению мутности материала для загрузки на анионообменник.
Пример 6. Очистка однодоменного антитела, используя каприлатный буфер в трис-ацетатном буфере для белка А
DOM0100, dAb молекулу 25 кДа (Vk-VH albudAb + TNFR1dAb), экспрессированную в Е. coli, очищали, используя белок A, MabSelect Xtra от GE Healthcare, упакованый в колонку 0,5×20 см. Скорость потока составляла 300 см/ч для всех стадий. После уравновешивания при помощи 55 мМ трис-основания, 45 мМ уксусной кислоты, рН 7,5, фильтрат клеточной культуры загружали на колонку в количестве 13,5 мг/мл смолы. Титр загрузки составлял 1,88 мг/мл. Затем колонку промывали, используя 5 объемов колонки 55 мМ трис-основания, 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, 100 мМ каприлата натрия, рН 7,5. Затем белок элюировали и после этого колонку очищали, санировали и убирали на хранение. Анализ пика элюирования посредством ELISA давал 1,440 млн-1 НСР (белки клетки-хозяина) для выхода 74,9%. Этот же эксперимент, повторенный дважды в тех же самых условиях, но с высокосолевой промывкой вместо промывки с каприлатом давал 2,398 млн–1 и 2,456 млн-1 НСР согласно ELISA для выхода 77,2% и 76,0% соответственно. Оценка влияния хроматографической последовательности, проводившаяся на колонке 0,5 см × 10 см с выравниванием временем пребывания, показал, что она не влияла на способность к динамическому связыванию вплоть до 150 циклов. Селективность смолы равным образом изучали для MabSelect и основной стабильной Stable MabSelect, используя одну и ту же хроматографическую последовательность опытов, и получали сравнимое НСР качество продукта.
Пример 7. Очистка DAT06 dAb, используя белок L, промывку с каприлатом и трис-ацетатный буфер
DAT06, dAb молекулу 11,5 кДа (Vk), экспрессированную в Е. coli, очищали с применением белка L (Capto L от GE Healthcare), упакованного в колонке 0,5 см × 20 см. Скорость потока составляла 300 см/ч для всех стадий. После уравновешивания при помощи 52 мМ трис-основания, 48 мМ уксусной кислоты, рН 7, загружали фильтрат клеточной культуры в количестве 13 мг/мл смолы. Затем колонку промывали, используя 5CV, 52 мМ трис-основание, 48 мМ уксусную кислоту, 100 мМ каприлат натрия, рН 7, после чего повторно уравновешивали, элюировали, очищали, санировали и убирали на хранение. Анализ пика элюирования посредством ELISA дает 5,815 млн-1 НСР для степени извлечения 96,4%. Для сравнения, такая же хроматографическая последовательность с 52 мМ трис, 48 мМ уксусной кислотой, 2 M NaCl, стадией высокосолевой промывки с рН 7,0 дает 7,476 млн-1 НСР согласно ELISA и степень извлечения 85,1%. Стадия промывки с уравновешивающим буфером, 52 мМ трис, 48 мМ уксусной кислоты, рН 7,0, дает 12,523 млн-1 НСР согласно ELISA и степень извлечения 94,1%.
Claims (47)
1. Способ очистки белка из раствора, содержащего по меньшей мере одну загрязняющую примесь, посредством аффинной хроматографии с суперантигеном, включающий: а) адсорбирование белка на суперантигене, иммобилизованном на твердом носителе; б) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси посредством приведения в контакт иммобилизованного суперантигена, содержащего адсорбированный белок, с первым промывочным буфером, содержащим алифатический карбоксилат, где указанный алифатический карбоксилат содержит остов из 6-11 атомов углерода; и в) элюирование белка из суперантигена, иммобилизованного на твердом носителе;
где белок выбран из группы, состоящей из растворимого рецептора, антитела, фрагмента антитела, одиночного вариабельного домена иммуноглобулина, Fab, F(ab')2, Fv, связанных через дисульфид Fv, scFv, мультиспецифического антитела с закрытой конформацией, связанных через дисульфид scFv или диатела.
2. Способ по п. 1, где суперантиген выбран из группы, состоящей из белка А, белка G и белка L.
3. Способ по п. 1, где алифатический карбоксилат выбран из группы, состоящей из капроата, гептаноата, каприлата и деканоата.
4. Способ по п. 1, где источник алифатического карбоксилата выбран из группы, состоящей из алифатической карбоновой кислоты, натриевой соли алифатической карбоновой кислоты и калиевой соли алифатической карбоновой кислоты.
5. Способ по п. 1, где промывочный буфер содержит каприлат натрия или деканоат натрия.
6. Способ по п. 1, где промывочный буфер содержит от 25 мМ до 100 мМ каприлата натрия или 20 мМ деканоата натрия.
7. Способ по п. 1, где промывочный буфер содержит 100 мМ каприлата натрия или 20 мМ деканоата натрия.
8. Способ по п. 1, где промывочный буфер дополнительно содержит 300 мМ ацетата натрия.
9. Способ по п. 1, где суперантиген представляет собой белок А и алифатический карбоксилат представляет собой каприлат натрия.
10. Способ по п. 9, где промывочный буфер содержит от 25 мМ до 100 мМ каприлата натрия.
11. Способ по п. 1, где по меньшей мере одна загрязняющая примесь представляет собой белок клетки-хозяина или ДНК клетки-хозяина.
12. Способ по п. 11, где клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, выбранную из группы, состоящей из клеток СНО (яичника китайского хомяка), клеток NS0, клеток Sp2/0, клеток COS, клеток K562, клеток ВНK, клеток PER.C6 и клеток НЕK (почки эмбриона человека).
13. Способ по п. 11, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из E. coli, клеток грибов или дрожжевых клеток.
14. Способ по п. 1, где твердый носитель выбран из группы, состоящей из агарозы, полиметакрилата, поперечно-сшитого поли(стирол-дивинилбензол)а и агарозы с нагруженной декстраном поверхностью.
15. Способ по п. 1, где раствор представляет собой клеточный культуральный фильтрат.
16. Способ по п. 1, где после стадии (в) относительное кратное уменьшение белков клетки-хозяина является 4,6-кратным.
17. Способ по п. 1, где после стадии (в) относительное кратное уменьшение ДНК составляет от 2- до 150-кратного.
18. Способ по п. 17, где после стадии (в) относительное кратное уменьшение ДНК является 107-кратным.
19. Способ по п. 1, где после стадии (в) количество белка или ДНК клетки-хозяина составляет 5,815 млн-1 или 1,440 млн-1.
20. Способ по п. 1, где после стадии (в) белок не подвергают никакой дополнительной аффинной хроматографии.
21. Способ по п. 1, где промывочный буфер дополнительно содержит органическую кислоту, соль щелочного металла или аммониевую соль сопряженного основания органической кислоты и органическое основание и где промывочный буфер приготовлен без добавления NaCl.
22. Способ по п. 21, где органическая кислота выбрана из группы, состоящей из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, молочной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, малеиновой кислоты, глицина, глицил-глицина, янтарной кислоты, TES (2-{[трис(гидроксиметил)-метил]амино}этансульфоновая кислота), MOPS (3-(N-морфолино)-пропансульфоновая кислота), PIPES (пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновая кислота)) и MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота).
23. Способ по п. 21, где органическое основание выбрано из группы, состоящей из трис-основания, бис-триса, бис-трис-пропана, бицина (N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин), HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота) и трицина(N-трис(гидроксиметил)метилглицин).
24. Способ по любому из пп. 21-23, где сопряженное основание органической кислоты представляет собой натриевую, калиевую или аммониевую соль сопряженного основания органической кислоты.
25. Способ по любому из пп. 21-23, где органическая кислота представляет собой уксусную кислоту.
26. Способ по любому из пп. 21-23, где органическое основание представляет собой трис-основание.
27. Способ по любому из пп. 21-23, где органическая кислота представляет собой уксусную кислоту, и сопряженное основание уксусной кислоты представляет собой натриевую соль.
28. Способ очистки белка из его содержащего загрязняющие примеси раствора посредством хроматографии с белком А, включающий:
а) уравновешивание белка А, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка А;
б) адсорбирование белка из содержащего загрязняющие примеси раствора на белке А, иммобилизованном на твердой фазе;
в) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси путем промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка А, содержащим 50 мМ или 55 мМ трис-основания, 45 мМ уксусной кислоты, по меньшей мере один алифатический карбоксилат, при рН 7,2, 7,5 или 8,0, где алифатический карбоксилат выбран из группы, состоящей из 100 мМ каприлата натрия и 20 мМ деканоата натрия; и
(г) извлечение белка из твердой фазы элюирующим буфером для белка А, где все буферы приготовлены без добавления NaCl.
29. Способ по п. 28, где уравновешивающий буфер содержит 50 мМ или 55 мМ трис-основания, 45 мМ уксусной кислоты, при рН 7,2; и элюирующий буфер содержит 30 мМ уксусной кислоты, при рН 3,6.
30. Способ по п. 28 или 29, дополнительно включающий следующую стадию после стадии (в) и перед стадией (г): удаление загрязняющих примесей путем промывания твердой фазы вторым промывочным буфером для белка А, содержащим 50 мМ трис-основания, 45 мМ уксусной кислоты, при рН 7,2, где второй промывочный буфер для белка А приготовлен без добавления NaCl.
31. Способ по п. 28 или 29, дополнительно включающий следующие стадии после стадии (г): (д) титрование раствора, содержащего извлеченный белок, до рН 3,5 с помощью 30 мМ уксусной кислоты, 100 мМ HCl; (е) выдерживание раствора со стадии (д) при рН 3,5 в течение 60 минут; и (ж) доведение раствора со стадии (е) до рН 6,0 посредством 1 М трис.
32. Способ по п. 31, дополнительно включающий фильтрование раствора, полученного на стадии (ж).
33. Способ очистки белка из его содержащего загрязняющие примеси раствора посредством хроматографии с белком L, включающий:
а) уравновешивание белка L, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка L;
б) адсорбирование белка из содержащего загрязняющие примеси раствора на белке L, иммобилизованном на твердой фазе;
в) удаление по меньшей мере одной загрязняющей примеси путем промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка L, содержащим 52 мМ трис-основания, 48 мМ уксусной кислоты, по меньшей мере один алифатический карбоксилат, при рН 7,0, где алифатический карбоксилат выбран из группы, состоящей из 100 мМ каприлата натрия и 20 мМ деканоата натрия; и
(г) извлечение белка из твердой фазы элюирующим буфером для белка L, где все буферы приготовлены без добавления NaCl.
34. Способ по п. 33, где уравновешивающий буфер содержит 52 мМ трис-основания, 48 мМ уксусной кислоты, при рН 7,0; и элюирующий буфер содержит 30 мМ уксусной кислоты, при рН 3,6.
35. Способ по п. 33 или 34, дополнительно включающий следующую стадию после стадии (в) и перед стадией (г): удаление загрязняющих примесей путем промывания твердой фазы вторым промывочным буфером для белка L, содержащим 55 мМ трис-основания, 45 мМ уксусной кислоты, при рН 7,2, где второй промывочный буфер для белка L приготовлен без добавления NaCl.
36. Способ по п. 33 или 34, дополнительно включающий следующие стадии после стадии (г): (д) титрование раствора, содержащего извлеченный белок, до рН 3,5 с помощью 30 мМ уксусной кислоты, 100 мМ HCl; (е) выдерживание раствора со стадии (д) при рН 3,5 в течение 60 минут; и (ж) доведение рН раствора со стадии (е) до рН 6,0 посредством 1 М трис.
37. Способ по п. 36, дополнительно включающий фильтрование раствора, полученного на стадии (ж).
38. Способ по п. 28 или 33, где промывочный буфер для белка А или белка L содержит 300 мМ ацетата натрия.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361787309P | 2013-03-15 | 2013-03-15 | |
US61/787,309 | 2013-03-15 | ||
PCT/IB2014/059755 WO2014141150A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-03-13 | Methods for purifying antibodies |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015136860A RU2015136860A (ru) | 2017-04-28 |
RU2651483C2 true RU2651483C2 (ru) | 2018-04-19 |
Family
ID=50391244
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015136860A RU2651483C2 (ru) | 2013-03-15 | 2014-03-13 | Способы очистки антител |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10676503B2 (ru) |
EP (3) | EP3680000B1 (ru) |
JP (2) | JP6599773B2 (ru) |
KR (1) | KR102114021B1 (ru) |
CN (1) | CN105188872B (ru) |
AU (1) | AU2014229280B2 (ru) |
BR (1) | BR112015022321A2 (ru) |
CA (1) | CA2902287A1 (ru) |
DK (2) | DK2969098T3 (ru) |
ES (1) | ES2765206T3 (ru) |
IL (1) | IL240753B (ru) |
RU (1) | RU2651483C2 (ru) |
SG (1) | SG11201506494XA (ru) |
TW (1) | TWI625335B (ru) |
WO (1) | WO2014141150A1 (ru) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI625335B (zh) * | 2013-03-15 | 2018-06-01 | Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 2) Limited | 純化抗體的方法 |
WO2014186350A1 (en) | 2013-05-15 | 2014-11-20 | Medimmune Limited | Purification of recombinantly produced polypeptides |
JP6700197B2 (ja) | 2014-04-30 | 2020-05-27 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | カプリル酸を用いてタンパク質を精製する方法 |
WO2016121701A1 (ja) | 2015-01-26 | 2016-08-04 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質精製用アフィニティー分離マトリックス |
JP6663360B2 (ja) | 2015-01-26 | 2020-03-11 | 株式会社カネカ | 変異型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド |
WO2017195638A1 (ja) * | 2016-05-09 | 2017-11-16 | 株式会社カネカ | 抗体またはκ鎖可変領域含有抗体断片の精製方法 |
CA3035853A1 (en) | 2016-09-07 | 2018-03-15 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Methods for purifying antibodies |
CN106939045B (zh) * | 2017-05-01 | 2020-03-31 | 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 | 一种单克隆抗体细胞培养液澄清的方法 |
CN108085358A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-05-29 | 保定冀中药业有限公司 | 一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法 |
TW202003555A (zh) | 2018-03-07 | 2020-01-16 | 英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司 | 用於純化重組多肽之方法 |
TW202000891A (zh) * | 2018-03-07 | 2020-01-01 | 英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司 | 純化抗體之方法 |
CN114133446A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-03-04 | 方坦思(上海)生物医药有限公司 | 单克隆抗体的纯化方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012135415A1 (en) * | 2011-03-29 | 2012-10-04 | Glaxosmithkline Llc | Buffer system for protein purification |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57106673A (en) | 1980-12-24 | 1982-07-02 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US5429746A (en) * | 1994-02-22 | 1995-07-04 | Smith Kline Beecham Corporation | Antibody purification |
US6955917B2 (en) | 1997-06-20 | 2005-10-18 | Bayer Healthcare Llc | Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies |
IL127127A0 (en) | 1998-11-18 | 1999-09-22 | Peptor Ltd | Small functional units of antibody heavy chain variable regions |
EP1584242B1 (en) * | 2001-06-01 | 2010-01-20 | Upfront Chromatography A/S | Fractionation of protein containing mixtures |
EP1419179B1 (en) | 2001-08-10 | 2010-03-03 | Aberdeen University | Antigen binding domains from fish |
CN100403028C (zh) | 2002-05-31 | 2008-07-16 | 印度农业研究委员会 | Bt-cry毒素的迅速检测 |
BRPI0508096B8 (pt) * | 2004-02-27 | 2021-05-25 | Octapharma Ag | método de preparação de um preparado de anticorpo seguro purificado contra vírus e vírus inativado |
EP1786827A4 (en) * | 2004-05-14 | 2008-10-29 | Kirin Holdings Kk | PROCESS FOR IMMUNOGLOBULINE CLEANING |
US8263750B2 (en) | 2006-03-16 | 2012-09-11 | Amgen Inc. | Method for purifying a protein using protein-A affinity chromatography using an intermediate wash step |
US20080167450A1 (en) * | 2007-01-05 | 2008-07-10 | Hai Pan | Methods of purifying proteins |
TWI625335B (zh) | 2013-03-15 | 2018-06-01 | Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 2) Limited | 純化抗體的方法 |
WO2014186350A1 (en) | 2013-05-15 | 2014-11-20 | Medimmune Limited | Purification of recombinantly produced polypeptides |
-
2014
- 2014-03-13 TW TW103108898A patent/TWI625335B/zh active
- 2014-03-13 CN CN201480016016.XA patent/CN105188872B/zh active Active
- 2014-03-13 KR KR1020157029042A patent/KR102114021B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-13 DK DK14713926.5T patent/DK2969098T3/da active
- 2014-03-13 EP EP19198005.1A patent/EP3680000B1/en active Active
- 2014-03-13 DK DK19198005.1T patent/DK3680000T3/da active
- 2014-03-13 RU RU2015136860A patent/RU2651483C2/ru active
- 2014-03-13 AU AU2014229280A patent/AU2014229280B2/en not_active Ceased
- 2014-03-13 EP EP14713926.5A patent/EP2969098B1/en active Active
- 2014-03-13 ES ES14713926T patent/ES2765206T3/es active Active
- 2014-03-13 CA CA2902287A patent/CA2902287A1/en not_active Abandoned
- 2014-03-13 EP EP24155364.3A patent/EP4371996A2/en active Pending
- 2014-03-13 BR BR112015022321A patent/BR112015022321A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-03-13 JP JP2015562513A patent/JP6599773B2/ja active Active
- 2014-03-13 US US14/775,868 patent/US10676503B2/en active Active
- 2014-03-13 WO PCT/IB2014/059755 patent/WO2014141150A1/en active Application Filing
- 2014-03-13 SG SG11201506494XA patent/SG11201506494XA/en unknown
-
2015
- 2015-08-23 IL IL240753A patent/IL240753B/en active IP Right Grant
-
2019
- 2019-10-03 JP JP2019182562A patent/JP7002511B2/ja active Active
-
2020
- 2020-05-13 US US15/931,062 patent/US20200277330A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012135415A1 (en) * | 2011-03-29 | 2012-10-04 | Glaxosmithkline Llc | Buffer system for protein purification |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
WO 2012135415 A1, 04.10.2012, формула. Brodsky Y. et al. Caprylic acid precipitation method for impurity reduction: an alternative to conventional chromatography for monoclonal antibody purification //Biotechnology and bioengineering. - 2012. - Vol. 109. - n. 10. - P. 2589-2598. * |
формула. Brodsky Y. et al. Caprylic acid precipitation method for impurity reduction: an alternative to conventional chromatography for monoclonal antibody purification //Biotechnology and bioengineering. - 2012. - Vol. 109. - n. 10. - P. 2589-2598. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20150131235A (ko) | 2015-11-24 |
US20200277330A1 (en) | 2020-09-03 |
EP3680000B1 (en) | 2024-03-13 |
EP3680000A1 (en) | 2020-07-15 |
TWI625335B (zh) | 2018-06-01 |
AU2014229280A1 (en) | 2015-10-01 |
IL240753A0 (en) | 2015-10-29 |
ES2765206T3 (es) | 2020-06-08 |
BR112015022321A2 (pt) | 2017-07-18 |
DK2969098T3 (da) | 2020-01-27 |
JP2016519052A (ja) | 2016-06-30 |
AU2014229280B2 (en) | 2017-01-05 |
EP4371996A2 (en) | 2024-05-22 |
TW201522365A (zh) | 2015-06-16 |
CN105188872B (zh) | 2019-01-15 |
CA2902287A1 (en) | 2014-09-18 |
JP7002511B2 (ja) | 2022-02-21 |
US10676503B2 (en) | 2020-06-09 |
DK3680000T3 (da) | 2024-04-02 |
KR102114021B1 (ko) | 2020-05-22 |
JP2020019795A (ja) | 2020-02-06 |
EP2969098A1 (en) | 2016-01-20 |
EP2969098B1 (en) | 2019-10-30 |
CN105188872A (zh) | 2015-12-23 |
IL240753B (en) | 2021-01-31 |
US20160024146A1 (en) | 2016-01-28 |
RU2015136860A (ru) | 2017-04-28 |
JP6599773B2 (ja) | 2019-10-30 |
SG11201506494XA (en) | 2015-09-29 |
WO2014141150A1 (en) | 2014-09-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2651483C2 (ru) | Способы очистки антител | |
US9868761B2 (en) | Buffer system for protein purification | |
JP7058272B2 (ja) | 抗体を精製するための方法 | |
KR20200019630A (ko) | 양이온 교환 크로마토그래피 세척 완충액 | |
KR20200103740A (ko) | 단백질 a 크로마토그래피 동안 불순물의 향상된 제거를 위한 방법 | |
KR20200129133A (ko) | 항체를 정제하는 방법 | |
US20210054051A1 (en) | Methods for purifying recombinant polypeptides |