CN111712510A - 用于在蛋白a色谱法期间增强杂质去除的方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供涉及经由蛋白A色谱法纯化包含Fc区的多肽(例如，抗体)的方法；涉及在蛋白A色谱法期间使用包含苯甲酸盐和/或苯甲醇的洗涤溶液的方法；以及在蛋白A色谱法之前使用苯甲酸钠调节收获物的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月21日提交的美国临时申请系列号62/609,214和2018年7月5日提交的美国临时申请系列号62/694,387的优先权权益，所述专利申请的内容通过提述以其整体并入本文。
发明领域
本公开涉及经由蛋白A色谱法纯化包含Fc区的多肽(例如，抗体)的方法。
背景
已经发现抗体和其它含有Fc区的蛋白质(如免疫粘附素)广泛用于药物/治疗应用中。这些分子的使用(例如，在人类患者中)需要仔细纯化以除去在蛋白质生产期间可产生的任何污染物/杂质。治疗性蛋白质的纯化常常是利用一个或多个色谱纯化步骤来实现的；含有免疫球蛋白Fc区的蛋白质(例如抗体)的色谱纯化中的一种特别有用的类型是蛋白A色谱法。然而，已显示宿主细胞蛋白(HCP)在常规捕获模式蛋白色谱(包括蛋白A色谱法)期间与抗体共洗脱，这对于这些抗体的下游应用可产生问题。通常，在洗脱之前，产物(例如，含有免疫球蛋白Fc区的蛋白质)与色谱树脂结合后，采用一个或多个洗涤步骤。不幸的是，由盐和缓冲物质组成的当前洗涤配制物可不足以破坏HCP和其它杂质与多种单克隆抗体(mAb)产物的相互作用。因此，需要改进的纯化方法(例如，实施新的洗涤配制物)，该方法减少与抗体共纯化(例如，在蛋白A亲和色谱法期间)的杂质(例如，HCP)的浓度/数目。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利出版物、非专利文献和UniProtKB/Swiss-Prot登录号均通过提述以其整体并入本文，如同每篇单独的参考文献均被具体而单独地指示以通过提述而被并入。
发明概述
为了满足上述和其它需求，本文公开了从一种或多种杂质中纯化含有Fc区的多肽的改进方法。这些方法包括使蛋白A色谱基质与包含(i)包含Fc区的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品(例如，细胞裂解物)接触，并用pH为约4.0-10.0且包含苯甲酸盐和/或苯甲醇的洗涤溶液洗涤该基质。本公开至少部分基于以下令人惊讶的发现：在蛋白A色谱法期间在pH为约4.0-10.0的洗涤溶液中使用苯甲酸盐(例如苯甲酸钠)和/或苯甲醇提供超过当前所利用的洗涤配制物的优异的杂质(例如宿主细胞杂质)清除(参见图1、实施例1)。本公开还至少部分地基于以下发现：包含一种或多种选自苯磺酸盐(例如苯磺酸钠)、辛酸、己二醇和/或精氨酸的额外组分可进一步改善包含在洗涤溶液中时的杂质的清除(参见图2和3、实施例1)。
因此，在一方面，本文提供一种纯化包含Fc区的多肽的方法，该方法包括以下步骤：在包含Fc区的多肽结合蛋白A的条件下，(a)使蛋白A色谱基质与包含(i)包含Fc区的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品接触；和(b)用洗涤溶液洗涤基质，其中洗涤溶液包含(i)浓度为约0.1M至约1.0M的苯甲酸盐和(ii)浓度为约0.5％至约4％体积/体积(v/v)的苯甲醇中的一或两者，并且其中洗涤溶液具有约4.0至约10.0的pH。在一些实施方案中，洗涤溶液包括：(1)苯甲酸盐；(2)苯甲醇；或(3)苯甲酸盐和苯甲醇。在一些实施方案中，苯甲酸盐的浓度为约0.1M至约0.5M。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲酸盐为苯甲酸碱金属盐(benzoate alkali salt)。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲酸盐是苯甲酸钠。在一些实施方案中，苯甲酸钠的浓度为约0.1M至约0.3M。在一些实施方案中，苯甲酸钠的浓度为约0.3M。在一些实施方案中，苯甲酸钠的浓度为约0.5M。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲醇的浓度为约1％至约4％(v/v)。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲醇的浓度为约1％至约2％(v/v)。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲醇的浓度为约2％(v/v)。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲醇的浓度为约4％(v/v)。
在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，洗涤溶液进一步包含缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂选自磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约10mM至约50mM或约10mM至约500mM。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约50mM。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约500mM。在一些实施方案中，洗涤溶液具有约5.0至约10.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约5.0至约9.0的pH。在一些实施方案中，洗涤溶液具有约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0或约10.0的pH。
在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，洗涤溶液进一步包含苯磺酸钠。在一些实施方案中，苯磺酸钠的浓度为约0.1M至约0.5M。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，洗涤溶液进一步包含辛酸。在一些实施方案中，辛酸的浓度为约10mM至约50mM。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，洗涤溶液进一步包含己二醇。在一些实施方案中，己二醇的浓度为约1％至约10％(v/v)。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，洗涤溶液进一步包含肌酸。在一些实施方案中，肌酸的浓度为约10mM至约100mM。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，洗涤溶液进一步包含精氨酸。在一些实施方案中，精氨酸的浓度为约0.1M至约1.0M。在一些实施方案中，精氨酸的浓度为约0.5M。在一些实施方案中，精氨酸为精氨酸-HCl。在一些实施方案中，包含精氨酸的洗涤溶液具有约4.0至约6.0的pH。在一些实施方案中，包含精氨酸的洗涤溶液具有约8.0至约10.0的pH。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，洗涤溶液进一步包含一种或多种非缓冲盐。在一些实施方案中，一种或多种非缓冲盐选自氯化钠、溴化钠、氯化钾、溴化钾、氯化镁、溴化镁、氯化钙、溴化钙及其任何组合。在一些实施方案中，一种或多种非缓冲盐是氯化钠和/或氯化钾。在一些实施方案中，一种或多种非缓冲盐的浓度为约0.1M至约1.0M。
在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，洗涤溶液是选自以下的溶液：(i)包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠和浓度为约50mM的碳酸氢钠，pH为约10.0的溶液；(ii)包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％的苯甲醇、浓度为约0.5M的精氨酸和浓度为约50mM的磷酸钠，pH为约9.0的溶液；(iii)包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠和浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，pH为约7.0的溶液；(iv)包含浓度为约0.5M浓度的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇和浓度为约0.5M的氯化钠，pH为约7.0的溶液；(v)包含浓度为10％(v/v)的己二醇、浓度为约0.5M的苯甲酸钠和浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，pH为约7.0的溶液；(vi)包含浓度为约0.5M的苯磺酸盐、浓度为约0.5M的苯甲酸钠和浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，pH为约7.0的溶液；(vii)包含浓度为约50mM的辛酸、浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约0.5M的精氨酸和浓度为约0.5M的氯化钠，pH值约7.0的溶液；(viii)包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇和浓度为约0.5M的精氨酸，pH值为约6.0的溶液；(ix)包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇和浓度为约0.5M的精氨酸，pH为约5.0的溶液；(x)包含浓度为约4％(v/v)的苯甲醇，pH为约5.0至约10的溶液；(xi)包含浓度约为4％(v/v)的苯甲醇，pH为约9.0的溶液；和(xii)包含浓度为约2％(v/v)的苯甲醇和浓度为约0.5M的精氨酸，pH为约5.0的溶液。
在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该方法进一步包括在用如上所述的洗涤溶液洗涤基质之前，用第一溶液洗涤基质的步骤。在一些实施方案中，第一溶液包含选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及其任何组合的缓冲液。在一些实施方案中，第一溶液包含浓度为约10mM至约100mM或约10mM至约500mM的缓冲液。在一些实施方案中，第一溶液是磷酸盐缓冲液。
在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，所述方法进一步包括在用如上所述的洗涤溶液洗涤基质之后，用第二溶液洗涤基质的步骤。在一些实施方案中，第二溶液包含选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及其任何组合的缓冲液。在一些实施方案中，第二溶液包含浓度为约10mM至约100mM或约10mM至约500mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述第二溶液具有约5.0至约7.0的pH。在一些实施方案中，第二溶液包含相当低的盐或不包含盐。
在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，所述方法进一步包括在一个或多个洗涤步骤之后使蛋白A色谱基质与洗脱溶液接触的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括收集包含所述包含Fc区的多肽的洗脱物的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括经由深层过滤来过滤洗脱物的步骤。在一些实施方案中，所述洗脱物包含小于约百万分之500(ppm)的所述一种或多种杂质。
在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，与缺乏用洗涤溶液洗涤基质的步骤的相应方法相比，应用本文所述的方法导致包含所述Fc区的多肽以更高的程度从一种或多种杂质中纯化出来。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，一种或多种杂质是宿主细胞蛋白(HCP)。在一些实施方案中，所述一种或多种HCP选自磷脂酶(例如推定的磷脂酶B样2)、丛生蛋白、丝氨酸蛋白酶、延伸因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一些实施方案中，所述Fc区是人Fc区。在一些实施方案中，所述人Fc区包含人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是小鼠Fc区。在一些实施方案中，所述小鼠Fc区包含小鼠IgG1、IgG2或IgG3 Fc区。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，所述包含Fc区的多肽是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。
在一些实施方案中，以上方法中的任何一种在将蛋白A色谱基质与包含(i)包含Fc区的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品接触之前，调节包含所述包含Fc区的多肽的收获物，以实现苯甲酸盐的最终浓度为约0.1M-约0.5M、pH为约7.0-约9.0，例如，以产生包含(i)所述包含Fc区的多肽，和(ii)一种或多种杂质的样品。在一些实施方案中，所述苯甲酸盐是苯甲酸碱金属盐。在一些实施方案中，所述苯甲酸盐是苯甲酸钠。在一些实施方案中，收获物中的苯甲酸盐的最终浓度为约0.4M-约0.5M。在一些实施方案中，调节后的收获物的pH为约7.0-约8.0。在一些实施方案中，调节后的收获物的pH为约8.0-约9.0。在一些实施方案中，所述收获物是从包含经工程化以表达多肽的宿主细胞的培养物生成的。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核宿主细胞。在一些实施方案中，所述真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，在调节之前使所述收获物澄清。在一些实施方案中，在调节之后使所述收获物澄清。
在相关方面，提供一种纯化包含Fc区的多肽的方法，该方法包括以下步骤：(A)调节包含所述包含Fc区的多肽的收获物，以实现苯甲酸盐的最终浓度为约0.1M-约0.5M、pH为约7.0-约9.0，例如，以产生包含(i)所述包含Fc区的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品；以及(B)使所述样品与至少一种色谱基质接触。在一些实施方案中，所述至少一种色谱基质包括亲和色谱基质。在一些实施方案中，所述亲和色谱基质是蛋白A色谱基质或蛋白G色谱基质。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述至少一种色谱基质与至少一种洗涤溶液接触的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述至少一种色谱基质与洗出溶液接触的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括收集包含所述包含Fc区的多肽的洗脱物的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括经由深层过滤来过滤洗脱物的步骤。在一些实施方案中，所述洗脱物包含小于约百万分之500(ppm)的所述一种或多种杂质。
在一些实施方案中，所述苯甲酸盐是苯甲酸碱金属盐。在一些实施方案中，所述苯甲酸盐是苯甲酸钠。在一些实施方案中，收获物中的苯甲酸盐的最终浓度为约0.4M-约0.5M。在一些实施方案中，调节后的收获物的pH为约7.0-约8.0。在一些实施方案中，调节后的收获物的pH为约8.0-约9.0。在一些实施方案中，所述收获物是从包含经工程化以表达多肽的宿主细胞的培养物生成的。在一些实施方案中，宿主细胞是真核宿主细胞。在一些实施方案中，所述真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，在调节之前使收获物澄清。在一些实施例中，在调节之后使收获物澄清。在一些实施方案中，与缺少调节包括含有Fc区的多肽的收获物以产生样品的步骤的相应方法相比，所述方法导致所述包含Fc区的多肽以更高的程度从所述一种或多种杂质中纯化出来。在一些实施方案中，所述一种或多种杂质是宿主细胞蛋白(HCP)。在一些实施方案中，所述一种或多种HCP选自下组：磷脂酶、丛生蛋白、丝氨酸蛋白酶、延伸因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述HCP是推定的磷脂酶B样2(PLBL2)。在一些实施方案中，所述Fc区是人Fc区。在一些实施方案中，所述人Fc区包含人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是小鼠Fc区。在一些实施方案中，所述小鼠Fc区包含小鼠IgG1、IgG2或IgG3 Fc区。在一些实施方案中，所述包含Fc区的多肽是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。
应当理解，上述和本文所述的各个实施方案中的一个、一些或全部的特性可以组合以形成本公开的其它实施方案。对于本领域技术人员来说，本公开的这些和其它方面将变得显而易见。通过下列详细描述进一步描述本公开的这些和其它实施例。
附图简述
图1显示用指示的对照或测试洗涤溶液洗涤后，从蛋白A柱洗脱的抗体样品中中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞蛋白(HCP)杂质的浓度。
图2A-B显示从蛋白A柱洗脱的抗体样品中特定HCP(HCP-A)的浓度。图2A显示与对照洗涤相比，在用2％苯甲醇±0.5M苯甲酸钠和/或0.5M精氨酸洗涤后，从蛋白A柱洗脱的抗体样品中HCP-A的浓度，如通过ELISA评估的。图2B显示与对照洗涤相比，在用pH为9.0或10.0的多种洗涤溶液洗涤后，从蛋白A柱洗脱的抗体样品中HCP-A的浓度，如通过ELSA评估的。
图3显示用指示的含有额外测试化合物的洗涤溶液洗涤后，从蛋白A柱洗脱的抗体样品中HCP-A的浓度，如通过ELISA评估的。
图4A-B显示从蛋白A柱洗脱的抗体样品中一般HCP和PLBL2的浓度。图4A显示与过程控制洗涤相比，用0.5M精氨酸、0.5M苯甲酸钠或4％苯甲醇洗涤后，从蛋白A柱洗脱的抗体样品中一般HCP的浓度，如通过ELISA评估的。图4B显示与过程控制洗涤相比，在用0.5M精氨酸、0.5M苯甲酸钠或4％苯甲醇洗涤后，从蛋白A柱洗脱的抗体样品中一般PLBL2的浓度，如通过ELISA评估的。
图5显示从蛋白A柱洗脱的抗体样品的视觉清晰度的改善，所述蛋白A柱用包含2％苯甲醇和0.5M苯甲酸钠的中间洗涤液洗涤。
图6A-B显示当蛋白A柱装载超过40g/L时，柱外收率(off-column yield)和PLBL2去除的降低。图6A显示随着蛋白A柱的装载密度从40g/L增加至60g/L，柱外收率的百分比从93.1％线性降低至78.1％。图6B显示随着蛋白A柱的装载密度从40g/L增加至60g/L，从蛋白A柱洗脱出的PLBL2的水平从32.1ppm降低至17ppm。
图7显示在蛋白A纯化之前将收获物调节至0.5M苯甲酸钠和pH 7.2或将收获物调节至0.5M苯甲酸钠和pH 9导致PLBL2和HCP杂质的去除的改善。将收获物调节至pH 9.0的0.5M苯甲酸钠显示出PLBL2和HCP杂质的最低水平，并且相对于仅pH调节证明了PLBL2清除的更大对数。
图8显示PLBL2含量与苯甲酸钠浓度之间的关系为近似为S形。对于浓度高于0.4M苯甲酸钠，观察到PLBL2的清除的增加有所减少。
发明详述
本文描述了在基于蛋白A分离含有Fc区的蛋白质期间减少共纯化的杂质(例如，宿主细胞蛋白杂质)数量的方法。本公开的方法应用使用含有苯甲酸盐和/或苯甲醇的新型洗涤溶液的中间洗涤步骤，所述新型洗涤溶液已显示出显著降低在蛋白A亲和色谱期间收集的洗脱物中的宿主细胞蛋白杂质的水平(参见实施例1和2)。在这种新型洗涤溶液中包含一种或多种添加剂(例如，苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、肌酸和/或精氨酸)进一步改善从蛋白A基质捕获并洗脱后的包含含有Fc区的蛋白质的蛋白洗脱物中的杂质的清除。
I.定义
在详细描述本公开之前，应理解，本公开不限于特定的组合物或生物系统，其当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在进行限制。
除非内容另外明确指出，否则如在本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一(a、an)”和“该、所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，对“分子”的指称任选地包括两个或更多个此类分子的组合，等等。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文中对“约”值或参数的指称包括(并且描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
应当理解，本文描述的本公开的方面和实施方案包括“包含”方面和实施方案、由方面和实施方案“组成”和“基本上由其组成”。
如本文所用的术语“和/或”如短语“A和/或B”旨在包括A和B二者；A或B；(仅)A；和(仅)B。同样，如本文所用的术语“和/或”如短语“A、B和/或C”旨在涵盖以下每个实施方案：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；(仅)A；(仅)B；和(仅)C。
术语“多肽”或“蛋白质”在本文可互换地使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语也涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分或毒素的缀合。该定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、三特异性抗体等)、抗体片段或合成多肽，其携带一个或多个CDR或CDR衍生的序列，只要该多肽表现出期望的活性。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。通常，认为抗体是具有明确的或公认的特异性的Ig。因此，尽管抗体表现出对特定靶标的结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺乏靶标特异性的其它抗体样分子。本公开的抗体可为任何类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA等)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG2a、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)。“类型”和“类别”以及“亚型”和“亚类”在本文中可互换地使用。天然或野生型(从群体的非人工操作成员获得的)抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条重链在一端具有可变域(VH)，随后是多个恒定域。每条轻链在一端具有可变域(VL)，在另一端具有恒定域。本文所述的抗体可为人抗体、人源化抗体、非人动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼科等)抗体或嵌合抗体。
在抗体的可变域的上下文中，术语“可变”可指相关分子的某些部分，其在两个抗体之间和更多个抗体之间在序列上差异很大，并用于其特定靶标的特定抗体的特异性识别和结合。然而，可变性在整个抗体的可变域中不是均匀分布的。可变性集中在轻链和重链可变域二者中的三个区段，其称为互补决定区(CDR)，也称为高变区。可变域的更高度保守的部分称为框架(FR)区或序列。天然重链和轻链的可变域各包含通过三个CDR连接的四个FR区，其主要采用β-片层构型，所述三个CDR形成连接β-片层结构并且在某些情况下形成β-片层结构的一部分的环。每条链中的CDR通常邻接FR区被保持在一起，并与来自另一条链的CDR2一起促成抗体的靶标(表位或决定簇)结合位点的形成(参见Kabat等Sequences ofProteins of Immunological Interest,Nation Institute of Health,Bethesda,MD(1987))。如本文所用的，除非另有说明，否则免疫球蛋白氨基酸残基的编号是根据Kabat等的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行的。一个CDR可具有特异性结合同源表位的能力。
如本文所用的术语“铰链”或“铰链区”可以指包含抗体的第一恒定域和第二恒定域之间的氨基酸的柔性多肽。
术语“双特异性抗体”可以指在单个分子内组合两种抗体的抗原结合位点的分子。因此，双特异性抗体能够同时结合两种不同的抗原。
本文所用的术语“单克隆抗体”可以指从基本上同源的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，包含该群体的各个抗体是相同的。本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们保留期望的活性即可。
如本文所用，术语“多价抗体(multivalent antibody)”或“多价抗体(polyvalentantibody)”可以指包含两个或更多个抗原结合位点的抗体，因此能够同时结合两个或更多个可具有相同或不同结构的抗原。术语“二价”意指抗体包含两个抗原结合位点。术语“四价”意指抗体包含四个抗原结合位点。
如本文所用，术语“抗原结合位点”可以指抗体的包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域的部分。当抗原很大时，抗体可仅与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合域可由一个或多个抗体可变域提供，并且可由抗体轻链可变域(VL)和抗体重链可变域(VH)的缔合构成。
非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是与人抗体相比含有衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。通常，人源化抗体将基本上包含一个可变域，通常是两个可变域的全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR，而所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白模板序列的FR区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(通常是所选择的人免疫球蛋白模板的恒定区)的至少一部分。通常，目标是得到在人体中具有最小免疫原性的抗体分子。因此，可能的是还将一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸变化为对人宿主免疫原性较低的氨基酸，而不会实质上使一个或多个CDR与靶标的特异性结合功能最小化。或者，FR可为非人的，但是那些免疫原性最强的氨基酸被免疫原性较弱的氨基酸代替。虽然如此，CDR移植(如上所述)不是获得人源化抗体的唯一方法。例如，仅修饰CDR区可能是不足的，因为对于框架残基在确定CDR环的三维结构和抗体对其配体的总体亲和力中起作用是不常见的。因此，可以实践任何手段，使得非人亲本抗体分子被修饰为对人免疫原性较低的分子，而且与人抗体的全局序列同一性并非总是必需的。
术语“杂质”可指溶液中存在的任何外来或非期望的分子(如包括含有Fc区的多肽的样品)。杂质可为生物(分子)(例如，大分子)，如还存在于含有感兴趣蛋白质的样品中的蛋白质、DNA或RNA。杂质可包括非期望的蛋白质变体(例如，聚集的蛋白质、错误折叠的蛋白质、二硫键结合不足的(underdisulfide-bonded)蛋白质，片段等)、来自宿主细胞的其它蛋白质、来自细胞培养基的组分，作为用于亲和色谱法的吸收剂的一部分的分子(例如，蛋白A)、内毒素、核酸、病毒等。
II.分离和/或纯化含有Fc区的多肽的方法
概述
本公开的某些方面涉及经由蛋白A色谱法纯化包含Fc区的多肽(例如，抗体)的方法。在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：在包含Fc区的多肽(例如抗体)与蛋白A结合的条件下，使蛋白A色谱基质或树脂与包含如下的样品接触：(1)包含Fc区的多肽(例如抗体)和(2)一种或多种杂质(例如宿主细胞杂质)；和用包含苯甲酸盐和/或苯甲醇的洗涤溶液洗涤基质。在一些实施方案中，洗涤溶液包含浓度为约0.1M至约1.0M的苯甲酸盐。在一些实施方案中，洗涤溶液包含浓度为约0.5％至约4％体积/体积(v/v)的苯甲醇。在一些实施方案中，洗涤溶液具有约4.0至约10.0的pH。在一些实施方案中，洗涤溶液包含一种或多种添加剂(例如，苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐(如氯化钠)、肌酸和/或精氨酸中的一种或多种)。在一些实施方案中，洗涤溶液进一步包含缓冲剂。在一些实施方案中，调节包括含有Fc区的多肽的收获物以达到苯甲酸盐的最终浓度为约0.1M至0.5M和pH为约7至约9，以产生包含如下的样品：(1)包含Fc区的多肽(例如，抗体)和(2)一种或多种杂质(例如，宿主细胞杂质)。
使样品与蛋白A基质或树脂接触
本公开的某些方面涉及经由蛋白A色谱法纯化包含Fc区的多肽(例如，抗体)的方法。在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：在包含Fc区的多肽(例如，抗体)与蛋白A结合的条件下，使蛋白A色谱基质或树脂与包含如下的样品接触：(1)包含Fc区的多肽(例如抗体)和(2)一种或多种杂质(例如宿主细胞杂质)。
在一些实施方案中，本公开涉及从样品(例如，细胞裂解物样品、细胞培养上清液样品等)中纯化包含Fc区的多肽(例如，抗体、免疫粘附素、融合蛋白等)的方法。在一些实施方案中，所述样品是细胞培养物上清液(例如，来自细胞(如CHO细胞)的上清液，其经工程化以产生和分泌多肽)，或衍生自细胞培养物上清液(例如，部分纯化的细胞培养上清液样品)。在一些实施方案中，所述包含Fc区的多肽是分泌的抗体。在一些实施方案中，所述Fc区是免疫球蛋白重链的C末端区，并可包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但通常将人IgG重链Fc区定义为从位置Cys226或Pro230处的氨基酸残基延伸到其羧基末端(Fc区中的残基的编号是如Kabat中的EU指数的编号。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定域，CH2和CH3，并且任选地包含CH4域。在一些实施方案中，所述Fc区是获自任何合适的免疫球蛋白的Fc区，所述免疫球蛋白如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，IgA、IgE、IgD或IgM。在一些实施方案中，所述多肽包含具有人Fc区、非人动物Fc区(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的氨基酸序列的Fc区，或其任何组合。在一些实施方案中，所述Fc区是小鼠Fc区。在一些实施方案中，所述小鼠Fc区包含小鼠IgG1、IgG2或IgG3 Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是人Fc区。在一些实施方案中，所述人Fc区包含人IgG1、IgG2和/或IgG4Fc区。
在一些实施方案中，所述包含Fc区的多肽是抗体。在一些实施方案中，“抗体”在本文中以最广义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体(例如，二价、三价、四价等)和多特异性抗体(例如双特异性、三特异性等)。抗体可来自任何来源，包括例如人、非人灵长类、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔、骆驼科动物、鲨鱼和/或重组产生的。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多特异性抗体和/或多价抗体。在一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。
在一些实施方案中，包括含有Fc区的多肽的样品(例如，细胞裂解物样品、细胞培养上清液样品等)进一步包含一种或多种杂质。在一些实施方案中，由于用于产生包含Fc区的多肽的方法(例如，产生分泌的抗体的过程)，所述一种或多种杂质存在于样品中。在一些实施方案中，所述一种或多种杂质是衍生自宿主细胞的一种或多种杂质(例如，一种或多种宿主细胞蛋白、一种或多种宿主细胞核酸、一种或多种宿主细胞脂质等)。宿主细胞可以是本领域已知的适合产生包含Fc区的多肽的任何宿主细胞，包括例如原核细胞(如大肠杆菌(E.coli)细胞、黑曲霉(A.niger)细胞等)、真核细胞(如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞(例如，S1细胞)和/或哺乳动物(小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、人、非人灵长类动物等)细胞(例如杂交瘤、CHO细胞、293T细胞、PER.C6细胞、NS0细胞等)。在一些实施方案中，所述一种或多种杂质是一种或多种宿主细胞蛋白(HCP)。在一些实施方案中，HCP是指在细胞培养或发酵过程由宿主细胞产生的非产物蛋白质。在一些实施方案中，所述一种或多种杂质是选自磷脂酶、丛生蛋白、丝氨酸蛋白酶、延长因子和/或其任何组合的一种或多种(例如，一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种等)宿主细胞蛋白(HCP)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种杂质是一种或多种CHO细胞HCP。在一些实施方案中，所述一种或多种CHO细胞HCP是磷脂酶、丛生蛋白、丝氨酸蛋白酶、延伸因子及其任何组合中的一种或多种。
在一些实施方案中，本公开涉及经由蛋白A色谱法从样品中的一种或多种杂质中纯化出包含Fc区的多肽的方法。在一些实施方案中，所述样品与蛋白A基质或树脂接触。在一些实施方案中，在适合于样品中包含Fc区的多肽与蛋白A结合的条件下，使所述样品与蛋白A基质或树脂接触。使含有Fc区的多肽与蛋白A基质或树脂接触并结合的方法和合适条件是本领域普通技术人员容易理解的(例如，如可商购的蛋白A基质或树脂的制造商方案中所述的方法)。本领域已知的任何合适的蛋白A基质或树脂均可在本公开的方法中使用，包括，例如：MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelect Sure、MabSelect Sure LX蛋白A、MabSelectpcc、MabSelect PrismA、rProtein A琼脂糖CL-4B和nProtein A琼脂糖4FF(GEHealthcare)；EshmunoA、ProSep A、ProSep-vA High Capacity，ProSep-vA Ultra和ProSep-vA UltraPlus(Millipore)；Poros A和Mabcapture A(Poros)；IPA-300、IPA-400和IPA-500(RepliGen Corp.)；Affigel蛋白A和Affiprep蛋白A(Bio-Rad)；MABsorbent A1PP和MABsorbent A2P(Affinity Chromatography Ltd.)；蛋白A Ceramic Hyper D F(PallCorp.)；Ultralink固定化蛋白A和琼脂糖蛋白A(PIERCE)；蛋白A Cellthru 300和蛋白AUltraflow(Bioseparation)；Amsphere A3(JSR)；和/或Toyopearl AF-rProtein A HC-650F(Tosoh Biosciences)。在一些实施方案中，所述蛋白A基质或树脂以柱色谱形式使用。在一些实施方案中，在使蛋白A基质或树脂与样品接触之前，调节蛋白A基质或树脂的一个或多个参数(如pH、离子强度、温度、其它物质的添加)。在一些实施方案中，在使蛋白A基质或树脂与样品接触之前和/或之后，冲洗、洗涤、平衡、剥离和/或清洁蛋白A基质或树脂。在一些实施方案中，在使蛋白A基质或树脂与样品接触之前，平衡和/或洗涤蛋白A基质或树脂。可使用本领域已知的任何合适的平衡和/或洗涤缓冲液。在一些实施方案中，蛋白A基质或树脂在两次使用之间被清洁、剥离和/或再生。
用洗涤液洗涤蛋白A基质或树脂
本公开的某些方面涉及经由蛋白A色谱法通过用包含苯甲酸盐和/或苯甲醇的洗涤溶液洗涤与包含Fc区的多肽(例如抗体)结合的蛋白A基质或树脂来纯化包含Fc区的多肽的方法。在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：在包含Fc区的多肽与蛋白A接触的条件下使蛋白A色谱基质或树脂与包含(1)包含Fc区的多肽(例如抗体)和(2)一种或多种杂质(例如宿主细胞杂质)的样品接触；以及用洗涤溶液洗涤所述基质或树脂，该洗涤溶液包含浓度为约0.1M至约1.0M的苯甲酸盐和/或浓度为约0.5％至约4％体积/体积(v/v)的苯甲醇，其中洗涤溶液具有约4.0至约10.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲醇。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐和苯甲醇。
在一些实施方案中，本公开涉及包含苯甲酸盐和/或苯甲酸(例如，pH调节的)的洗涤溶液。本领域已知的任何合适来源或形式的苯甲酸盐(例如，碱金属盐)和/或苯甲酸可用于本公开的洗涤溶液中，包括例如苯甲酸钠、苯甲酸钾、苯甲酸锂、苯甲酸钙、苯甲酸镁、苯甲酸铍、苯甲酸钡、苯甲酸锶、苯甲酸铷、苯甲酸铯和/或其任何组合。在一些实施方案中，所述苯甲酸盐是苯甲酸碱金属盐。在一些实施方案中，所述苯甲酸盐是苯甲酸钠或苯甲酸钾。在一些实施方案中，所述苯甲酸盐是苯甲酸钠。
在一些实施方案中，所述苯甲酸盐(例如苯甲酸钠)和/或苯甲酸以约0.1M至约1.0M的浓度存在于洗涤溶液中。例如，苯甲酸盐(例如，苯甲酸钠)和/苯甲酸可以以下述浓度存在于洗涤溶液中：约0.1M至约1.0M、约0.1M至约0.9M、约0.1M至约0.8M、约0.1M至约0.7M、约0.1M至约0.6M、约0.1M至约0.5M、约0.1M至约0.4M、约0.1M至约0.3M、约0.1M至约0.2M、约0.2M至约1.0M、约0.2M至约0.9M、约0.2M至约0.8M、约0.2M至约0.7M、约0.2M至约0.6M、约0.2M至约0.5M、约0.2M至约0.4M、约0.2M至约0.3M、约0.3M至约1.0M、约0.3M至约0.9M、约0.3M至约0.8M、约0.3M至约0.7M、约0.3M至约0.6M、约0.3M至约0.5M、约0.3M至约0.4M、约0.4M至约1.0M、约0.4M至约0.9M、约0.4M至约0.8M、约0.4M至约0.7M、约0.4M至约0.6M、约0.4M至约0.5M、约0.5M至约1.0M、约0.5M至约0.9M、约0.5M至约0.8M、约0.5M至约0.7M、约0.5M至约0.6M、约0.6M至约1.0M、约0.6M至约0.9M、约0.6M至约0.8M、约0.6M至约0.7M、约0.7M至约1.0M、约0.7M至约0.9M、约0.7M至约0.8M、约0.8M至约1.0M、约0.8M至约0.9M或约0.9M至约1.0M。在一些实施方案中，所述苯甲酸盐(例如，苯甲酸钠)和/或苯甲酸以约0.1M至约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述苯甲酸盐(例如，苯甲酸钠)和/或苯甲酸以约0.1M至约0.3M的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，所述苯甲酸盐(例如，苯甲酸钠)和/或苯甲酸以约0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M、0.85M、0.9M、0.95M或1.0M中的任一浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，苯甲酸盐(例如，苯甲酸钠)和/或苯甲酸以约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，苯甲酸盐(例如，苯甲酸钠)和/或苯甲酸以约0.1M或小于约0.1M、约0.3M或小于约0.3M、约0.5M或小于约0.5M、约0.75M或小于约0.75M或约1.0M或小于约1.0M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，苯甲酸盐(例如，苯甲酸钠)和/或苯甲酸以约0.5M或小于约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，本公开涉及包含苯甲醇的洗涤溶液。本领域已知的任何合适来源或形式的苯甲醇均可用于本公开的洗涤溶液中。
在一些实施方案中，苯甲醇以约0.5％至约4.0％体积/体积(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。例如，苯甲醇可以约0.5％至约4％、约1％至约4％、约1.5％至约4％、约2％至约4％、2.5％至约4％、约3％至约4％、约3.5％至约4％、约0.5％至约3.5％、约1％至约3.5％、约1.5％至约3.5％、约2％至约3.5％、约2.5％至约3.5％、约3％至约3.5％、约0.5％至约3％、约1％至约3％、约1.5％至约3％、约2％至约3％、大约2.5％至大约3％、大约0.5％至大约2.5％、大约1％至大约2.5％、大约1.5％至大约2.5％、约2％至大约2.5％、约0.5％至约2％、约1％至约2％、约1.5％至约2％、约0.5％至约1.5％、约1％至约1.5％或约0.5％至约1％(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述苯甲醇以约1％至约4％体积/体积(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述苯甲醇以约1％至约2％体积/体积(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，所述苯甲醇以约0.5％、0.75％、1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.25％、2.5％、2.75％、3％、3.25％、3.5％、3.75％或约4％(v/v)的任何浓度存在于所述洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述苯甲醇以约2％(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述苯甲醇以约1％或小于约1％、约2％或小于约2％、约3％或小于约3％或约4％或小于约4％的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述苯甲醇以约4％或小于约4.0％(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述苯甲醇以约4％(v/v)或小于约2％(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。
添加剂
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液进一步包含一种或多种(例如，一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或全部五种)下列添加剂：本文所述的任何浓度的苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐和/或肌酸。在一些实施方案中，包含一种或多种添加剂的洗涤溶液具有约4.0至约10.0的pH。在一些实施方案中，在洗涤溶液中包含一种或多种添加剂进一步通过本文所述的方法改善从一种或多种杂质(例如，宿主细胞杂质)中纯化出包含Fc区的多肽。
在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含pH为约4.0至约10.0的苯甲酸盐和/或苯甲醇以及苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐和/或肌酸中的一种。例如，所述洗涤溶液可包含：苯甲酸盐和/或苯甲醇和苯磺酸(盐)；苯甲酸盐和/或苯甲醇和辛酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇和己二醇；苯甲酸盐和/或苯甲醇和非缓冲盐；或苯甲酸盐和/或苯甲醇和肌酸，pH为约4.0至约10.0。
在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐和/或苯甲醇以及苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐和/或肌酸中的两种，pH为约4.0至约10.0。例如，所述洗涤溶液可包含：苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸盐和辛酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸盐和己二醇；苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸盐和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸盐和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、辛酸和己二醇；苯甲酸盐和/或苯甲醇、辛酸和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、辛酸和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、己二醇和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、己二醇和肌酸；或苯甲酸盐和/或苯甲醇、非缓冲盐和肌酸，其pH值为约4.0至约10.0。
在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐和/或苯甲醇以及苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐和/或肌酸中的三种，pH为约4.0至约10.0。例如，所述洗涤溶液可包含：苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸(盐)、辛酸和己二醇；苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸(盐)、辛酸和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸(盐)、辛酸和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸(盐)、己二醇和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸(盐)、己二醇和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸(盐)、非缓冲盐和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、辛酸、己二醇和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、辛酸、己二醇和肌酸；或苯甲酸盐和/或苯甲醇、辛酸、非缓冲盐和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、己二醇、非缓冲盐和肌酸；pH为约4.0至约10.0。
在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含pH为约4.0至约10.0的苯甲酸盐和/或苯甲醇以及苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐和/或肌酸中的四种。例如，所述洗涤溶液可包含：苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸(盐)、辛酸、非缓冲盐和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、苯磺酸(盐)、己二醇、非缓冲盐和肌酸；或苯甲酸盐和/或苯甲醇、辛酸、己二醇、非缓冲盐和肌酸，pH值为约4.0至约10.0。
在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐和/或苯甲醇以及苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐和肌酸中的全部五种，pH为约4.0至约10.0。
在一些实施方案中，本公开涉及包含苯磺酸(盐)的洗涤溶液。本领域已知的任何合适形式或来源的苯磺酸(盐)均可用于本公开的洗涤溶液中，包括例如苯磺酸盐(例如，碱金属盐)如苯磺酸钠或苯磺酸钾、苯磺酸和/或其任何组合。在一些实施方案中，所述苯磺酸(盐)是苯磺酸钠。
在一些实施方案中，苯磺酸盐(例如苯磺酸钠)以约0.1M至约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。例如，所述苯磺酸钠可以以约0.1M至约0.5M、约0.1M至约0.4M、约0.1M至约0.3M、约0.1M至约0.2M、约0.2M至约0.5M、约0.2M至约0.4M、约0.2M至约0.3M、约0.3M至约0.5M、约0.3M至约0.4M或约0.4M至约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方式中，所述苯磺酸钠以约0.1M至约0.3M的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，所述苯磺酸钠以约0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M或0.5M中的任一浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述苯磺酸钠以约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述苯磺酸钠以约0.1M或小于约0.1M、约0.3M或约或小于约0.3M或约0.5M或小于约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述苯磺酸钠以约0.5M或小于约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，本公开涉及包含辛酸的洗涤溶液。本领域已知的任何合适形式或来源的辛酸均可用于本公开的洗涤溶液中。
在一些实施方案中，所述辛酸以约1mM至约50mM的浓度存在于洗涤溶液中。例如，所述辛酸可以以约1mM至约50mM、约10mM至约50mM、约20mM至约50mM、约30mM至约50mM、约40mM至约50mM、约1mM至约40mM、约10mM至约40mM、约20mM至约40mM、约30mM至约40mM、约1mM至约30mM、约10mM大约30mM、约20mM至大约30mM、大约1mM至约20mM、约10mM至约20mM或约1mM至约10mM的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述辛酸以约10mM至约50mM的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，所述辛酸以约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM中的任一浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述辛酸以约50mM的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述辛酸以约10mM或小于约10mM、约30mM或小于约30mM、或约50mM或小于约50mM的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述辛酸以约50mM或小于约50mM的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，本公开涉及包含己二醇的洗涤溶液。本领域已知的任何合适形式或来源的己二醇均可在本公开的洗涤溶液中使用。
在一些实施方案中，所述己二醇以约0.5％至约10％(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。例如，所述己二醇可以以约0.5％至约10％、约1％至约10％、约2％至约10％、约4％至约10％、约6％至约10％、约8％至约10％、约9％至约10％,0.5％至约9％、约1％至约9％、约2％至约9％、约4％至约9％、约6％至约9％、约8％至约9％、约0.5％至约8％、约1％至约8％、约2％至约8％、约4％至约8％、约6％至约8％、约0.5％至约6％、约1％至约6％、约2％至约6％、约4％至约6％、约0.5％至约4％、约1％至约4％、约2％至约4％、约0.5％至约2％、约1％至约2％，或约0.5％至约1％(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述己二醇以约1％至约10％(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，所述苯甲醇以约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％(v/v)的浓度存在于所述洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述己二醇以约10％(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述己二醇以约1％或小于约1％、约2％或小于约2％、约4％或小于约4％、约6％或小于约6％、约8％或小于约8％，或约10％或小于约10％的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述己二醇以约10％或小于10％(v/v)的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，本公开涉及包含一种或多种(例如，一种或两种或多种，三种或更多种等)非缓冲盐的洗涤溶液。本领域已知的任何合适形式或来源的非缓冲盐均可在本公开的洗涤溶液中使用。非缓冲盐可包括卤素盐(如包含Cl或Br的盐)，特别是包含碱金属(如Na或K)或碱土金属(如Ca或Mg)的卤素盐。在一些实施方案中，非缓冲盐是氯化钠和/或氯化钾。在一些实施方案中，非缓冲盐是氯化钠。
在一些实施方案中，所述非缓冲盐(例如氯化钠)以约0.1M至约1.0M的浓度存在于洗涤溶液中。例如，所述非缓冲盐(例如，氯化钠)可以以约0.1M至约1.0M、约0.1M至约0.8M、约0.1M至约0.6M、约0.1M至约0.5M、约0.1M至约0.4M、约0.1M至约0.2M、约0.2M至约1.0M、约0.2M至约0.8M、约0.2M至约0.6M、约0.2M至约0.5M、约0.2M至约0.4M、约0.4M至约1.0M、约0.4M至约0.8M、约0.4M至约0.6M、约0.4M至约0.5M、约0.5M至约1.0M、约0.5M至约0.8M、约0.5M至约0.6M、约0.6M至约1.0M、约0.6M至约0.8M或约0.8M至约1.0M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述非缓冲盐(例如，氯化钠)以约0.1M至约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述非缓冲盐(例如，氯化钠)以约0.5M至约1.0M的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，所述非缓冲盐(例如，氯化钠)以约0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M、0.85M、0.9M、0.95M或1.0M中的任一浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述非缓冲盐(例如，氯化钠)以约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述非缓冲盐(例如氯化钠)以约1.0M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述非缓冲盐(例如氯化钠)以约0.1M或小于约0.1M、约0.2M或小于约0.2M、约0.4M或小于约0.4M、约0.5M或小于约0.5M、约0.6M或小于约0.6M、约0.8M或小于约0.8M、或约1.0M或小于约1.0M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述非缓冲盐(例如，氯化钠)以约0.5M或小于约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述非缓冲盐(例如氯化钠)以约1.0M或小于约1.0M的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，本公开涉及包含肌酸的洗涤溶液。本领域已知的任何合适形式或来源的肌酸可用于本公开的洗涤溶液中，包括例如肌酸-HCl、肌酸酯、肌酸丙酮酸、磷酸肌酸、肌酸α-酮戊二酸、柠檬酸肌酸和/或其任何组合。在一些实施方案中，所述肌酸是肌酸-HCl。
在一些实施方案中，所述肌酸以约1mM至约100mM的浓度存在于洗涤溶液中。例如，所述肌酸可以以约1mM至约100mM、约10mM至约100mM、约25mM至约100mM、约50mM至约100mM、约75mM至约100mM、约1mM至约75mM、约10mM至约75mM、约25mM至约75mM、约50mM至约75mM、约1mM至约50mM、约10mM至约50mM、约25mM至约50mM、约1mM至约25mM、约10mM至约25mM、或约1mM至约10mM的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述肌酸以约10mM至约100mM的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述肌酸以约10mM至约50mM的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述肌酸以约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM中的任一浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述肌酸以约50mM的浓度存在于洗涤溶液中。
精氨酸
在一些实施方案中，本公开涉及进一步包含精氨酸和/或精氨酸衍生物的洗涤溶液。在一些实施方案中，在洗涤溶液中包含精氨酸和/或精氨酸衍生物进一步通过本文所述的方法改善从一种或多种杂质(例如，宿主细胞杂质)中纯化出包含Fc区的多肽。本领域已知的任何合适形式或来源的精氨酸和/或精氨酸衍生物均可用于本公开的洗涤溶液，所述精氨酸和/或精氨酸衍生物包括例如精氨酸、精氨酸-HCl、乙酰精氨酸、胍基丁胺、精氨酸(arginic acid)、N-α-丁酰基-L-精氨酸、N-α-戊酰基-精氨酸和/或其任何组合。精氨酸和/或精氨酸衍生物可以是L-精氨酸和/或D-精氨酸，及其衍生物。在一些实施方案中，所述精氨酸和/或精氨酸衍生物是精氨酸-HCl。
在一些实施方案中，本公开涉及精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)在包含苯甲酸盐和/或苯甲醇的洗涤溶液中的用途。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐和精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲醇和精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐、苯甲醇和精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)。在一些实施方案中，所述洗涤溶液进一步包含本文所述的任何浓度的苯磺酸盐，辛酸，己二醇，非缓冲盐，和/或肌酸中的一种或多种(例如，一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种或全部五种)。在一些实施方案中，包含精氨酸和/或精氨酸衍生物的洗涤溶液具有约4.0至约10.0的pH。在一些实施方案中，包含精氨酸和/或精氨酸衍生物的洗涤溶液具有约4.0至约6.0的pH。在一些实施方案中，包含精氨酸和/或精氨酸衍生物的洗涤溶液具有约4.0至约5.0的pH。在一些实施方案中，包含精氨酸和/或精氨酸衍生物的洗涤溶液具有约8.0至约10.0的pH。在一些实施方案中，包含精氨酸和/或精氨酸衍生物的洗涤溶液具有约8.0至约9.0的pH。
在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如精氨酸-HCl)，以及苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐和/或肌酸中的一种。例如，所述洗涤溶液可包含：苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸和苯磺酸(盐)；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸和辛酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸和己二醇；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸和非缓冲盐；或苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸和肌酸。
在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如精氨酸-HCl)，以及苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐和/或肌酸中的两种。例如，所述洗涤溶液可包含：苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)和辛酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)和己二醇；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、辛酸和己二醇；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、辛酸和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、辛酸和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、己二醇和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、己二醇和肌酸；或苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、非缓冲盐和肌酸。
在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如精氨酸-HCl)，以及苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐和/或肌酸中的三种。例如，所述洗涤溶液可包含：苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)、辛酸和己二醇；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)、辛酸和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)、辛酸和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)、己二醇和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)、己二醇和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)、非缓冲盐和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、辛酸、己二醇和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、辛酸、己二醇和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、辛酸、非缓冲盐和肌酸；或苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、己二醇、非缓冲盐和肌酸。
在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如精氨酸-HCl)，以及苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐和/或肌酸中的四种。例如，所述洗涤溶液可包含：苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇和非缓冲盐；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)、辛酸、非缓冲盐和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、苯磺酸(盐)、己二醇、非缓冲盐和肌酸；苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸、辛酸、己二醇、非缓冲盐和肌酸。
在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含苯甲酸盐和/或苯甲醇、精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如精氨酸-HCl)，以及苯磺酸(盐)、辛酸、己二醇、非缓冲盐和/或肌酸中的全部五种。
在一些实施方案中，所述精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)以约0.1M至约1.0M的浓度存在于洗涤溶液中。例如，所述精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)可以以约0.1M至约1.0M、约0.1M至约0.9M、约0.1M至约0.8M、约0.1M至约0.7M、约0.1M至约0.6M、约0.1M至约0.5M、约0.1M至约0.4M、约0.1M至约0.3M、约0.1M至约0.2M、约0.2M至约1.0M、约0.2M至约0.9M、约0.2M至约0.8M、约0.2M至约0.7M、约0.2M至约0.6M、约0.2M至约0.5M、约0.2M至约0.4M、约0.2M至约0.3M、约0.3M至约1.0M、约0.3M至约0.9M、约0.3M至约0.8M、约0.3M至约0.7M、约0.3M至约0.6M、约0.3M至约0.5M、约0.3M至约0.4M、约0.4M至约1.0M、约t 0.4M至约0.9M、约0.4M至约0.8M、约0.4M至约0.7M、约0.4M至约0.6M、约0.4M至约0.5M、约0.5M至约1.0M、约0.5M至约0.9M、约0.5M至约0.8M、约0.5M至约0.7M、约0.5M至约0.6M、约0.6M至约1.0M、约0.6M至约0.9M、约0.6M至约0.8M、约0.6M至约0.7M、约0.7M至约1.0M、约0.7M至约0.9M、约0.7M至约0.8M、约0.8M至约1.0M、约0.8M至约0.9M、或约0.9M至约1.0M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)以约0.1M至约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)以约0.1M至约0.3M的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，所述精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)以约0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M、0.85M、0.9M、0.95M或1.0M中的任一浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)以约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)以约0.1M或小于约0.1M、约0.2M或小于约0.2M、约0.3M或小于约0.3M、约0.4M或小于约0.4M、约0.5M或小于约0.5M、约0.75M或小于约0.75M、或约1.0M或小于约1.0M的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述精氨酸和/或精氨酸衍生物(例如，精氨酸-HCl)以约0.5M或小于约0.5M的浓度存在于洗涤溶液中。
pH
在一些实施方案中，本公开涉及pH为约4.0至约10.0的洗涤溶液。例如，洗涤溶液可具有约4.0至约10.0、约5.0至约10.0、约6.0至约10.0、约6.5至约10.0、约7.0至约10.0、约7.5至约10.0、约8.0至约10.0、约9.0至约10.0、4.0至约9.0、约5.0至约9.0、约6.0至约9.0、约6.5至约9.0、约7.0至约9.0、约7.5至约9.0、约8.0至约9.0、4.0至约8.0、约5.0至约8.0、约6.0至约8.0、约6.5至约8.0、约7.0至约8.0、约7.5至约8.0、4.0至约7.5、约5.0至约7.5、约6.0至约7.5、约6.5至约7.5、约7.0至约7.5、约4.0至约7.0、约5.0至约7.0、约6.0至约7.0、约6.5至约7.0、4.0至约6.5、约5.0至约6.5、约6.0至约6.5、4.0至约6.0、约5.0至约6.0或约4.0至约5.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约5.0至约9.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约4.0至约6.0的pH。在一些实施方案中，洗涤溶液具有约4.0至约5.0的pH。在一些实施方案中，洗涤溶液具有约8.0至约10.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约8.0至约9.0的pH。
在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.5、9.75或10.0中的任一个的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约4.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约5.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约6.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约6.5的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约7.5的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约9.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液具有约10.0的pH。
缓冲剂
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液进一步包含一种或多种(例如，一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种等)缓冲剂。本领域已知的任何合适的缓冲剂均可用于本公开的洗涤溶液中，包括例如磷酸盐、三(三(羟甲基)甲胺)、Bis-Tris、Bis-Tris丙烷、精氨酸、组氨酸、三乙醇胺、二乙醇胺、甲酸盐、乙酸盐、碳酸盐MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)、柠檬酸盐、HEPES(4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、TAPS(3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸)、Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)，Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、TES(2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸、PIPES(哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)、Cacodylae(二甲基次胂酸)、SSC(柠檬酸钠盐水)和/或其任何组合。在一些实施方案中，所述缓冲剂是磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和柠檬酸盐中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述缓冲剂(例如磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐)以约1mM至约100mM或约1mM至约500mM的浓度存在于洗涤溶液中。例如，缓冲剂(例如，磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐)可以以约1mM至约500mM、10mM至约500mM、50mM至500mM、100mM至约500mM、150mM至约500mM、200mM至约500mM、250mM至约500mM、300mM至约500mM、350mM至约500mM、400mM至约500mM、450mM至约500mM、1mM至约450mM、1mM至约400mM、1mM至约350mM、1mM至约300mM、1mM至约250mM、1mM至约200mM、1mM至约150mM、1mM至约100mM、约10mM至约100mM、约25mM至约100mM、约40mM至约100mM、约50mM至约100mM、约60mM至约100mM、约75mM至约100mM、约1mM至约75mM、约10mM至约75mM、约40mM至约75mM、约50mM至约75mM、约60mM至约75mM、约1mM至约60mM、约10mM至约60mM、约25mM至约60mM、约40mM至约60mM、约50mM至约60mM、约1mM至约50mM、约10mM至约50mM、约25mM至约50mM、约40mM至约50mM、约1mM至约40mM、约10mM至约40mM、约25mM至约40mM、约1mM至约25mM、约10mM至约25mM或约1mM至约10mM的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述缓冲剂(例如，磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐)以约10mM至约50mM或约10mM至约500mM的浓度存在于洗涤溶液中。
在一些实施方案中，所述缓冲剂(例如，磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐)以约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM中的任一浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述缓冲剂(例如磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐)以约150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM中的任一浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述缓冲剂(例如磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐)以约500mM的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述缓冲剂(例如磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐)以约50mM的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述缓冲剂(例如磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐)以约10mM或小于约10mM，约25mM或小于约25mM、约50mM或小于约50mM、约75mM或小于约75mM、或约100mM或小于约100mM、或约500mM或小于约500mM的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述缓冲剂(例如磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐)以约50mM或小于约50mM的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述缓冲剂(例如磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐)以约500mM或小于约500mM的浓度存在于洗涤溶液中。
示例性洗涤溶液
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯甲酸钠和/或苯甲醇，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠和/或浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠和浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液进一步包含磷酸盐缓冲液(例如，浓度为约50mM)。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯甲酸钠、苯甲醇和/或氯化钠，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，和/或浓度为0.5M的氯化钠，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，和浓度为0.5M的氯化钠，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液进一步包含磷酸盐缓冲液(例如，浓度为约50mM)。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯甲酸钠、苯甲醇、精氨酸、和/或氯化钠，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、浓度为0.5M的精氨酸和/或浓度为0.5M的氯化钠，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、浓度为0.5M的精氨酸、和浓度为0.5M的氯化钠，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液进一步包含磷酸盐缓冲液(例如，浓度为约50mM)。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯甲酸钠、苯甲醇、磷酸盐缓冲液、和/或精氨酸，并具有约9.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、浓度为50mM的磷酸盐缓冲液、和/或浓度为0.5M的精氨酸，并具有约9.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、浓度为约50mM的磷酸盐缓冲液、和浓度为0.5M的精氨酸，并具有约9.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯甲酸钠、苯甲醇、和/或精氨酸，并具有约6.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、和/或浓度为0.5M的精氨酸，并具有约6.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、和浓度为0.5M的氯化钠，并具有约6.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含己二醇、苯甲酸钠、和/或苯甲醇，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约10％(v/v)的己二醇、浓度为约0.5M的苯甲酸钠和/或浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约10％(v/v)的己二醇、浓度为约0.5M的苯甲酸钠和浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，并具有约7.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯磺酸(盐)、苯甲酸钠、和/或苯甲醇，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯磺酸(盐)、浓度为约0.5M的苯甲酸钠、和/或浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯磺酸(盐)、浓度为约0.5M的苯甲酸钠、和浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，并具有约7.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯甲酸钠、苯甲醇、和/或精氨酸(例如精氨酸-HCl)，并且具有约5.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、和/或浓度为约0.5M的精氨酸(例如，精氨酸-HCl)，具有约5.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、和浓度为约0.5M的精氨酸(例如，精氨酸-HCl)，具有约5.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯甲酸钠、苯甲醇、和/或精氨酸(例如，精氨酸-HCl)，并且具有约6.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、和/或浓度为约0.5M的精氨酸(例如，精氨酸-HCl)，具有约6.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、和浓度为约0.5M的精氨酸(例如，精氨酸-HCl)，具有约6.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯甲醇和/或精氨酸(例如精氨酸-HCl)，并且具有约5.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约2％(v/v)的苯甲醇和/或浓度为约0.5M的精氨酸(例如，精氨酸-HCl)，并且具有约5.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约2％(v/v)的苯甲醇和浓度为约0.5M的精氨酸(例如，精氨酸-HCl)，并具有约5.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯甲酸钠、精氨酸(例如，精氨酸-HCl)、辛酸、和/或氯化钠，并且具有约9.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约0.5M的精氨酸(例如，精氨酸-HCl)、浓度为约50mM的辛酸和/或浓度为0.5M的氯化钠，pH为约9.0。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约0.5M的精氨酸(例如，精氨酸-HCl)、浓度为约50mM的辛酸和浓度为0.5M的氯化钠，具有约9.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯甲酸钠、精氨酸(例如，精氨酸-HCl)、辛酸和/或氯化钠，并且具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约0.5M的精氨酸(例如，精氨酸-HCl)、浓度为约50mM的辛酸和/或浓度为0.5M的氯化钠，具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约0.5M的精氨酸(例如，精氨酸-HCl)、浓度为约50mM的辛酸和浓度为0.5M的氯化钠，具有约7.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含苯甲酸钠和/或碳酸氢钠，并具有约10.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠和/或浓度为约50mM的碳酸氢钠，并具有约10.0的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠和浓度为约50mM的碳酸氢钠，并具有约10.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的洗涤溶液包含浓度为约4％(v/v)的苯甲醇，并具有约5.0至约10的pH。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含浓度为约4％(v/v)的苯甲醇，并具有约9.0的pH。
在色谱法之前调节包括含有Fc区的多肽的收获物
在一方面，提供一种纯化包含Fc区的多肽的方法，该方法包括以下步骤：(A)调节包括含有Fc区的多肽的收获物，以实现最终浓度为约0.1M至约0.5M、pH为约7.0-约9.0的苯甲酸盐，以产生包含(i)包含Fc区的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品；以及(B)使所述样品与至少一种色谱基质接触。在一些实施方案中，所述至少一种色谱基质是亲和色谱基质，例如，蛋白A色谱基质或蛋白G色谱基质。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述至少一种色谱基质与至少一种洗涤溶液接触的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述至少一种色谱基质与洗脱溶液接触的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括收集包括含有Fc区的多肽的洗脱物的步骤。
在一些实施方案中，术语“收获物”是指细胞培养结束时或细胞培养之后存在的流体，例如细胞裂解物样品或细胞培养物上清液样品(例如，来自细胞如CHO细胞的上清液，该细胞经工程化以产生并分泌多肽)。在一些实施方案中，所述收获物包含完整的宿主细胞和/或细胞碎片。在一些实施方案中，所述收获物不包含完整的宿主细胞和/或细胞碎片。例如，在一些实施方案中，在调节之前对细胞培养结束时或细胞培养之后存在的流体进行一个或多个离心和/或过滤步骤，以获得最终浓度为约0.1M-约0.5M，pH为约7.0-约9.0的苯甲酸盐。在一些实施方案中，所述收获物源自细胞培养结束时或细胞培养之后存在的流体中。例如，在一些实施方案中，对细胞培养结束时或细胞培养之后存在的流体进行一个或多个预处理步骤，以优化细胞分离和/或包含Fc区的多肽的纯化。
在相关方面，本文所述的纯化包含Fc区的多肽的方法中的任何一种进一步包括调节包括含有Fc区的多肽的收获物的步骤，以获得0.1M-约0.5M的苯甲酸盐的最终浓度，和约7.0-约9.0的pH，以产生包含(i)包含Fc区的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品。
在一些实施方案中，所述苯甲酸盐是苯甲酸碱金属盐。在一些实施方案中，所述苯甲酸盐是苯甲酸钠。在一些实施方案中，所述收获物经调节以获得0.025M、0.05M、0.075M、0.1M、0.125M、0.15M、0.175M、0.2M、0.225M、0.25M、0.275M、0.3M、0.325M、0.35M、0.375M、0.4M、0.425M、0.45M、0.475M、0.5M、0.525M、0.55M、0.575M、0.6M、0.625M、0.65M、0.675M、0.7M、0.725M、0.75M、0.775M或0.8M中的任何一种(包括这些值之间的任何范围)的苯甲酸盐(例如，苯甲酸钠)的最终浓度。在一些实施方案中，将所述收获物的pH调节至约7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。在一些实施方案中，在调节之前(例如，添加苯甲酸钠和调节pH)使收获物澄清。在一些实施方案中，在调节后(例如，添加苯甲酸钠和调节pH)使收获物澄清。
在一些实施方案中，该方法包括调节收获物以实现最终苯甲酸钠浓度为约0.5M，pH为约7。在一些实施方案中，该方法包括调节收获物以实现最终苯甲酸钠浓度为约0.1M，pH为约9。在一些实施方案中，该方法包括调节收获物以实现最终苯甲酸钠浓度为约0.2M，pH为9。在一些实施方案中，该方法包括调节收获物以实现最终苯甲酸钠浓度为约0.3M，pH为约9。在一些实施方案中，该方法包括调节收获物以实现最终苯甲酸钠浓度为约0.4M，pH为9。在一些实施方案中，该方法包括调节收获物以实现最终苯甲酸钠浓度为约0.5M，pH为9。
在一些实施方案中，与缺乏调节包括含有Fc区的多肽的收获物的步骤的相应方法相比，调节收获物(例如，添加苯甲酸钠和调节pH)导致包含Fc区的多肽以更高的程度从一种或多种杂质中纯化出来以产生所述样品。在一些实施方案中，一种或多种杂质是宿主细胞蛋白(HCP)，如磷脂酶、丛生蛋白、丝氨酸蛋白酶、延伸因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述HCP是推定的磷脂酶B样2(PLBL2)。
在一些实施方案中，经调节的收获物(例如，已向其中添加苯甲酸钠以实现本文所述的最终浓度并且已经如本文所述对其pH进行调节)包含(i)包含Fc的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品或者者为所述样品。在一些实施方案中，所述样品与至少一种色谱基质接触(例如，对该样品进行至少一个色谱步骤)。在一些实施方案中，所述至少一种色谱基质包括以下任何一种或多种：亲和色谱基质、混合模式色谱基质(例如，多模式色谱基质)、疏水性相互作用(HIC)色谱基质、阴离子交换色谱基质、阳离子交换色谱基质、尺寸排阻色谱基质、陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱基质和/或亲水性相互作用液相色谱(HILIC)基质等，以任何顺序。在一些实施方案中，所述样品与亲和色谱基质，例如蛋白A基质或蛋白G基质接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述至少一种色谱基质与至少一种洗涤溶液接触的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述至少一种色谱基质与洗脱溶液接触的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括收集包括含有Fc区的多肽的洗脱物的步骤。
杂质去除
本公开的某些方面涉及经由蛋白A色谱通过用包含苯甲酸盐和/或苯甲醇的洗涤溶液洗涤与包含Fc区的多肽(例如抗体)结合的蛋白A基质来纯化包含Fc区的多肽的方法，以便改善该多肽从一种或多种杂质中纯化出来。在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：在包含Fc区的多肽与蛋白A接触的条件下使蛋白A色谱基质与包含以下的样品接触：(1)包含Fc区的多肽(例如抗体)和(2)一种或多种杂质(例如宿主细胞杂质)；并用洗涤溶液洗涤所述基质，该洗涤溶液包含浓度为约0.1M至约1.0M的苯甲酸盐和/或浓度为约0.5％至约4％体积/体积(v/v)的苯甲醇，其中洗涤溶液具有约4.0至约10.0的pH。在一些实施方案中，与缺乏用洗涤溶液洗涤蛋白A基质的步骤的相应方法(如以上所述的)相比，用洗涤溶液洗涤蛋白A基质导致包含Fc区的多肽以更高的程度从一种或多种杂质中纯化出来。
标准蛋白A过程在不使用如本文所述的洗涤步骤的情况下通常产生约95％的产物纯度。产物中最大比例的杂质是由于产物的高分子量(HMW)聚集体和/或低分子量(LMW)片段。这些产物变体被认为是杂质，因为它们具有基于各种参数(例如，电荷、疏水性、大小差异等)与产品分离的能力。这些HMW和LMW杂质占蛋白A池的约4-5％。此外，缺乏使用如本文所述的洗涤步骤的标准蛋白A过程也通常导致以产物池的1000ppm或～0.1％的量级(order)含有宿主细胞蛋白质(HCP)杂质。然而，由于针对可注射mAb产品设定的规格(参见例如，FDA指南)，减少和/或完全去除该0.1％的HCP杂质非常重要。包括应用本文所述的洗涤溶液的步骤可将所述池中存在的HCP量减少至～100-10ppm(相对于缺少本文所述洗涤步骤的相同蛋白A过程，HCP减少为1/10至1/100)，占90-99％相对改善。测量样品蛋白质纯度和/或杂质水平的方法(例如，通过ELISA测定法)是本领域普通技术人员通常已知的。相对于本文描述的任何方法，使用标准方法从一种或多种宿主细胞蛋白纯化出单克隆抗体(mAb)的示例性纯化显示在下表A中。
表A：示例性纯化过程
在一些实施方案中，本文所述的方法在蛋白A洗脱后产生含有包含Fc区(例如，单克隆抗体)的多肽的蛋白质池，所述蛋白质池包含少于约500ppm(百万分之一)的HCP(例如，来自CHO细胞的一种或多种HCP)。例如，含有通过本文所述的方法产生的包含Fc区的多肽的蛋白质池可含有小于约500ppm、小于约450ppm、小于约400ppm、小于约350ppm、小于约300ppm、小于约250ppm、小于约200ppm、小于约150ppm、小于约100ppm、小于约75ppm、小于约50ppm、小于约25ppm、小于约10ppm、或少于约1ppm的HCP(例如，来自CHO细胞的一种或多种HCP)。在一些实施方案中，含有通过本文所述的方法产生的包含Fc区的多肽的蛋白质池包含少于约100ppm的HCP(例如，来自CHO细胞的一种或多种HCP)。在一些实施方案中，包含通过本文所述的方法产生的包含Fc区的多肽的蛋白质池含有少于约10ppm的HCP(例如，来自CHO细胞的一种或多种HCP)。
在一些实施方案中，本文所述的方法在蛋白A洗脱后产生含有包含Fc区的多肽(例如，单克隆抗体)的蛋白池，所述蛋白质池包含少于约0.1％的HCP(例如，来自CHO细胞的一种或多种HCP)。例如，含有通过本文所述的方法产生的包含Fc区的多肽的蛋白质池可含有小于约0.1％、小于约0.09％、小于约0.08％、小于约0.07％、小于约0.06％、小于约0.05％、小于约0.04％、小于约0.03％、小于约0.02％、或少于约0.01％HCP(例如，来自CHO细胞的一种或多种HCP)。在一些实施方案中，含有通过本文所述的方法产生的包含Fc区的多肽的蛋白质池含有少于约0.05％的HCP(例如，来自CHO细胞的一种或多种HCP)。在一些实施方案中，含有通过本文所述的方法产生的包含Fc区的多肽的蛋白质池含有少于约0.01％HCP(例如，来自CHO细胞的一种或多种HCP)。
在一些实施方案中，相对于通过缺少用洗涤溶液洗涤蛋白A基质的步骤的相应方法纯化的与包含Fc区的多肽共纯化的一种或多种杂质(例如一种或多种HCP，如一种或多种来自CHO细胞的HCP)的量，本文所述的方法使与包含Fc区的多肽共纯化的一种或多种杂质的量和/或浓度(例如，百万分率)降低至少约10％。例如，相对于通过缺少用洗涤溶液洗涤蛋白A基质的步骤的相应方法纯化的与包含Fc区的多肽共纯化的一种或多种杂质(例如一种或多种HCP，如一种或多种来自CHO细胞的HCP)的量，本文所述的方法使与包含Fc区的多肽共纯化的一种或多种杂质的量和/或浓度(例如，百万分率)降低至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些实施方案中，相对于通过缺少用洗涤溶液洗涤蛋白A基质的步骤的相应方法纯化的与包含Fc区的多肽共纯化的一种或多种杂质的量，本文所述的方法使与包含Fc区的多肽共纯化的一种或多种杂质的量和/或浓度(例如，百万分率)降低为至多约1/1.5。例如，相对于通过缺少用洗涤溶液洗涤蛋白A基质的步骤的相应方法纯化的与包含Fc区的多肽共纯化的一种或多种杂质(例如一种或多种HCP，如一种或多种来自CHO细胞的HCP)的量，本文所述的方法使与包含Fc区的多肽共纯化的一种或多种杂质的量和/或浓度(例如，百万分率)降低为至多约1/1.5、至多约1/2、至多约1/2.5、至多约1/3、至多约1/3.5、至多约1/4、至多约1/4.5、至多约1/5、至多约1/5.5、至多约1/6、至多约1/6.5、至多约1/7、至多约1/7.5、至多约1/8、至多约1/8.5、至多约1/9、至多约1/9.5、至多约1/10、至多约1/50或或至多约1/100。
额外步骤
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括一个或多个额外的洗涤步骤。在一些实施方案中，本文描述的方法进一步包括一个或多个洗脱步骤。在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括一个或多个洗涤步骤以及一个或多个洗脱步骤。
在一些实施方案中，本公开涉及在用洗涤溶液洗涤基质之前，用第一溶液洗涤蛋白A基质。在一些实施方案中，在用洗涤液洗涤基质之前，用第一溶液洗涤基质一次或多次(例如，一次或多次、两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、五次或更多次等)。在一些实施方案中，在用洗涤溶液洗涤基质之前，用第一溶液洗涤基质一次。在一些实施方案中，所述第一溶液包含缓冲液。本领域已知的任何合适的缓冲液均可用于第一溶液中，包括例如磷酸盐、三(三(羟甲基)甲胺)、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、Bis-Tris、Bis-Tris丙烷、精氨酸、组氨酸、三乙醇胺、二乙醇胺、甲酸盐、MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)、HEPES(4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、TAPS(3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸)、Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)，Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、TES(2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸、PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)、Cacodylae(二甲基次胂酸)、SSC(柠檬酸钠盐水)和/或其任何组合。在一些实施方案中，所述第一溶液包含磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和/或柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述第一溶液包含磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述第一溶液包含一种或多种额外的组分(例如，苯甲酸盐、苯甲醇、本文所述的一种或多种添加剂等)。在一些实施方案中，所述第一溶液约5.0至约10.0(例如，约6.0至约10.0、约6.0至约9.0、约7.0至约10.0、约7.0至约9.0、约8.0至约10.0、约8.0至约9.0、约9.0至约10.0、约5.0至约8.0、约6.0至约8.0、约7.0至约8.0、约5.0至约7.0、约6.0至约7.0或约5.0至约6.0)的pH。在一些实施方案中，所述第一洗涤溶液具有约7.0的pH。
在一些实施方案中，所述第一溶液包含浓度为约10mM至约100mM或约10mM至约500mM的缓冲液。例如，所述第一溶液可包含浓度为约10mM至约500mM、约100mM至约500mM、约150mM至约500mM、约200mM至约500mM、约250mM至约500mM、约300mM至约500mM、约350mM至约500mM、约400mM至约500mM、约450mM至约500mM、约10mM至约450mM、约10mM至约400mM、约10mM至约350mM、约10mM至约300mM、约10mM至约250mM、约10mM至约200mM、约10mM至约150mM、约10mM至约100mM、约25mM至约100mM、约40mM至约100mM、约50mM至约100mM、约60mM至约100mM、约75mM至约100mM、约10mM至约75mM、约25mM至约75mM、约40mM至约75mM、约50mM至约75mM、约60mM至约75mM、约10mM至约60mM、约25mM至约60mM、约40mM至约60mM、约50mM至约60mM、约10mM至约50mM、约25mM至约50mM、约40mM至约50mM、约10mM至约40mM、约25mM至约40mM、或约10mM至约25mM。在一些实施方案中，所述第一溶液包含浓度为约10mM至约50mM或约10mM至约500mM的缓冲液。
在一些实施方案中，所述第一溶液包含浓度为约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM中的任一个的缓冲液。可替换地，所述第一溶液包含浓度为约150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM中的任一个的缓冲液。在一些实施方案中，所述第一溶液包含浓度为约500mM的缓冲液。在一些实施方案中，所述第一溶液包含浓度为约50mM的缓冲液。在一些实施方案中，所述第一溶液包含浓度为约500mM的磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述第一溶液包含浓度为约50mM的磷酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，所述第一溶液包含磷酸盐缓冲液(例如，磷酸钠)和氯化钠。在一些实施方案中，所述第一溶液包含磷酸盐缓冲剂液(例如，磷酸钠)和氯化钠，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述第一溶液包含浓度为约50mM的磷酸盐缓冲液(例如，磷酸钠)和浓度为约0.5M的氯化钠。在一些实施方案中，所述第一溶液包含浓度约为50mM的磷酸盐缓冲液(例如，磷酸钠)和浓度约为0.5M的氯化钠，并具有约7.0的pH。
在一些实施方案中，本公开涉及在用洗涤溶液洗涤基质之后，用第二溶液洗涤蛋白A基质。在一些实施方案中，在用洗涤液洗涤基质之前，用第二溶液洗涤基质一次或多次(例如，一次或多次、两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、五次或更多次等)。在一些实施方案中，在用洗涤溶液洗涤基质之后，用第二溶液洗涤基质一次。在一些实施方案中，所述第二溶液包含缓冲液。本领域已知的任何合适的缓冲液均可用于第二溶液中，包括例如磷酸盐、三(三(羟甲基)甲胺)、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、Bis-Tris、Bis-Tris丙烷、精氨酸、组氨酸、三乙醇胺、二乙醇胺、甲酸盐、MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)、HEPES(4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、TAPS(3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸)、Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)，Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、TES(2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸、PIPES(哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)、Cacodylae(二甲基次胂酸)、SSC(柠檬酸钠盐水)和/或其任何组合。在一些实施方案中，所述第二溶液包含磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和/或柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述第二溶液包含磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述第二溶液包含相当低的盐或不包含盐。在一些实施方案中，所述第二溶液具有约4.0至约8.0(例如，约5.0至约8.0、约6.0至约8.0、约7.0至约8.0、约4.0至约7.0、约5.0至约7.0、约6.0至约7.0、约4.0至约6.0、约5.0至约6.0或约4.0至约5.0)的pH。在一些实施方案中，所述第二溶液具有约5.0至约7.0的pH。在一些实施方案中，所述第二溶液的pH为约7.0。在一些实施方案中，所述第二溶液包含相当低的盐。在一些实施方案中，所述第二溶液不包含盐。
在一些实施方案中，所述第二溶液包含浓度为约10mM至约100mM或约10mM至约500mM的缓冲液。例如，所述第二溶液可包含浓度为约10mM至约500mM、约100mM至约500mM、约150mM至约500mM、约200mM至约500mM、约250mM至约500mM、约300mM至约500mM、约350mM至约500mM、约400mM至约500mM、约450mM至约500mM、约10mM至约450mM、约10mM至约400mM、约10mM至约350mM、约10mM至约300mM、约10mM至约250mM、约10mM至约200mM、约10mM至约150mM、约10mM至约100mM、约25mM至约100mM、约40mM至约100mM、约50mM至约100mM、约60mM至约100mM、约75mM至约100mM、约10mM至约75mM、约25mM至约75mM、约40mM至约75mM、约50mM至约75mM、约60mM至约75mM、约10mM至约60mM、约25mM至约60mM、约40mM至约60mM、约50mM至约60mM、约10mM至约50mM、约25mM至约50mM、约40mM至约50mM、约10mM至约40mM、约25mM至约40mM或约10mM至约25mM。在一些实施方案中，所述第二溶液包含浓度为约10mM至约50mM或约10mM至约500mM的缓冲液。
在一些实施方案中，所述第二溶液包含浓度为约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM中的任一个的缓冲液。可替换地，所述第二溶液包含浓度为约150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM中的任一个的缓冲液。在一些实施方案中，所述第二溶液包含浓度为约500mM的缓冲液。在一些实施方案中，所述第二溶液包含浓度为约50mM的缓冲液。
在一些实施方案中，所述第二溶液包含磷酸盐缓冲液(例如，磷酸钠)。在一些实施方案中，所述第二溶液包含磷酸盐缓冲剂液(例如，磷酸钠)，并具有约7.0的pH。在一些实施方案中，所述第二溶液包含浓度为约50mM的磷酸盐缓冲液(例如，磷酸钠)。在一些实施方案中，所述第二溶液包含浓度为约50mM的磷酸盐缓冲液(例如，磷酸钠)，并具有约7.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的方法涉及用洗涤溶液洗涤蛋白A基质，并且不包括用第一溶液(在洗涤溶液之前)或第二溶液(在洗涤溶液之后)洗涤基质的步骤。在一些实施方案中，本公开的方法涉及用第一溶液洗涤蛋白A基质，然后用洗涤溶液洗涤基质，并且不包括用第二溶液(在洗涤溶液之后)洗涤基质的步骤。在一些实施方案中，本公开的方法涉及用洗涤溶液洗涤蛋白A基质，然后用第二溶液洗涤基质，并且不包括用第一溶液(在洗涤溶液之前)洗涤基质的步骤。在一些实施方案中，本公开的方法涉及用第一溶液洗涤蛋白A基质，然后用洗涤溶液洗涤基质，并且然后用第二溶液洗涤基质。
在一些实施方案中，在一个或多个洗涤步骤之后，使蛋白A基质与洗脱溶液接触一次或多次(例如，一次或多次、两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、五次或更多次等)。在一些实施方案中，使所述基质与洗脱溶液接触一次。适用于洗脱与蛋白A基质结合的多肽的本领域已知的任何溶液均可用作本公开的方法中的洗脱溶液(例如，包含40mM乙酸钠、具有约3.1的pH的洗脱溶液)。在一些实施方案中，所述洗脱溶液进一步包含一种或多种额外的组分(例如，本文所述的任何浓度的精氨酸)。在一些实施方案中，在使所述基质与洗脱物接触之后收集包括含有Fc区的多肽的洗脱物。在一些实施方案中，在使所述基质与洗脱溶液接触两次或更多次之后，收集包括含有Fc区的多肽的两种或更多种洗脱物。在一些实施方案中，在洗脱后组合所述两种或更多种洗脱物。在一些实施方案中，过滤所述一种或多种洗脱物。可使用本领域已知的过滤洗脱物的任何合适方法，包括例如经由深层过滤。在一些实施方案中，经由深层过滤来过滤所述一种或多种洗脱物。
在一些实施方案中，可进一步加工和/或纯化(例如，使用额外的色谱和/或过滤步骤(如，通过使用一种或多种离子交换色谱、混合模式色谱、亲和色谱、疏水性相互作用色谱、固定化金属亲和色谱、尺寸排阻色谱、渗滤、超滤和/或病毒去除过滤))、和/或配制(例如，制备适合向有需要的受试者(如人受试者)施用的药物制剂)来自如本文所述的蛋白A基质的洗脱物。
前述书面描述被认为足以使本领域技术人员能够实践本公开。提供以下实施例仅出于说明性目的，并不旨在以任何方式限制本公开的范围。实际上，除了本文中显示和描述的那些之外，根据前面的描述，本公开的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见，并且落入所附权利要求书的范围内。
实施例
实施例1：用于在抗体纯化期间改善或增强杂质的去除的洗涤溶液
以下实施例描述了在中间洗涤溶液中使用苯甲酸钠和苯甲醇的各种组合以在蛋白A色谱法期间改善/增强杂质去除。
材料和方法
样品制备
如下制备两种分开的人单克隆抗体收获物材料用于蛋白A色谱法：在经工程化以组成性表达所述抗体中的任一种的重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的悬浮培养物中生成收获物。将重组产物分泌到培养基中，然后将该培养基离心并通过深层过滤澄清用于下游加工。澄清的收获物材料在加载到蛋白A柱上之前用0.22μm聚醚砜(PES)过滤器过滤。
蛋白A色谱法
如下制备蛋白A树脂/柱：经由重力沉降使MabSelect Sure LX蛋白A色谱树脂(GEHealthcare Life Sciences；目录号17-5474)与0.5M氯化钠溶液交换。使用用(A)直径为1.0cm的柱(Essential Life Solutions 10/250Snap Column；目录号S10/250-PPSL-OE-FP10)或(B)直径为0.66cm的柱(OmnifitTM6.6/100；目录号006BCC0610FF)的AKTA Pure或AKTA Avant(GE Healthcare Life Sciences)装填柱。对于柱(A)，将树脂填充至床高为20cm±10％，对于柱(B)，将树脂填充至床高为5cm±10％。使用1.0M氯化钠溶液的1％柱体积注射到在0.1M氯化钠溶液中平衡的柱上进行柱定性，并使用Unicorn Evaluation软件分析电导率迹线。柱的效率需要每米至少775个理论塔板，并且需要证明其不对称性为0.8-1.8。
在装载收获物材料之前，用反渗透去离子水冲洗柱，以去除20％乙醇的存储缓冲液。随后，在平衡前用0.5M乙酸冲洗柱以确保去除任何结合的实体。用具有0.5M氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液平衡柱，直至柱的pH为>6.5。
然后将制备的样品装载到蛋白A柱上。用mAb A(IgG1亚型或mAb B(IgG4亚型)将柱装载至40g/L树脂的靶标。如上所述，用含有50mM磷酸盐和0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液洗涤装载的柱。接下来，用测试洗涤液洗涤柱，然后用pH 7的缓冲溶液进行无盐洗涤。最后，使用含有40mM乙酸钠、pH为3.1的溶液从柱洗脱抗体。下表1提供了示例性色谱过程。
表1：柱色谱过程描述
宿主细胞蛋白检测
洗脱后，使用第三代CHO HCP ELISA试剂盒(Cygnus Technologies)根据制造商的方案测试抗体样品中宿主细胞蛋白(HCP)杂质的存在。在1:400-1:800的稀释度进行HCPELISA，并使用Spectramax Plus 384酶标仪在450/600nm处读取吸光度。
特定的“HCP-A”检测
使用市售的仓鼠(CHO)ELISA试剂盒(ICL Labs)根据制造商的流程对洗脱的抗体样品中特定HCP(HCP-A)的浓度进行定量。在1:100-1:800的稀释度进行HCP-A ELISA，并使用Spectramax Plus 384酶标仪在450nm处读取吸光度。
结果
已显示宿主细胞蛋白(HCP)与单克隆抗体(mAb)共洗脱，这对于这些抗体的下游应用可能会产生问题。为了鉴定能够减少与感兴趣的mAb共洗脱的污染物HCP的量的潜在洗涤添加剂，用从CHO细胞收获的包含分泌的IgG1人单克隆抗体(mAb A)的样品装载1.7mL蛋白A色谱柱，所述样品在下游加工之前已经被离心并通过深层过滤澄清(参见表1)。首先用磷酸盐缓冲溶液洗涤柱。接下来，用许多含有50mM磷酸盐和单独的或作为与苯甲酸钠、苯甲醇和精氨酸的组合(pH 7.0)的添加剂的测试洗涤溶液中的一种来洗涤柱(图1)。对照运行没有并入任何添加剂洗涤液。在测试洗涤之后，用无盐的50mM磷酸盐(pH 7.0)洗涤柱。最后，从柱上洗脱单克隆抗体，并使用2M Tris碱将pH调节至6.0的pH。调节后，使用0.22μm PES过滤器过滤洗脱物池，并测试HCP杂质的存在(图1)。有趣的是，含有2％苯甲醇和/或0.5M苯甲酸钠的洗涤液有效降低洗脱的抗体样品中的污染性HCP的水平。还观察到洗涤液中包含精氨酸以改善HCP清除。
接下来，在从蛋白A柱洗脱的抗体中检查到HCP-A的具体存在。下表2中指示了此该实验中使用的测试和对照洗涤溶液。
表2：测试洗涤溶液
已经证明了苯甲醇和苯甲酸钠的组合去除HCP杂质的能力，因此测试了额外配制剂以靶向HCP-A的去除。具有已知高HCP-A表达的IgG4抗体(mAb B)用于特异性增加柱上的HCP-A负荷。表1提供纯化过程期间进行的步骤的总结。简单地，在到达装载pH和电导率平衡后，用含有在下游加工之前经由离心和通过深层过滤来澄清而从CHO细胞中收获的分泌型人单克隆抗体的样品装载15.7mL蛋白A色谱柱。一旦达到40g/L(的树脂)装载量，就使用磷酸盐缓冲溶液重新平衡柱。然后，以2个柱体积(CV)应用表2所示的洗涤液中的一种(测试溶液1、2和7)，紧接着是3个CV的pH 7.0的无盐磷酸盐缓冲溶液。用40mM乙酸钠洗脱后，使用2MTris碱将洗脱物池调节至pH 5.5。然后用0.22μm PES过滤器或Millipore C0HC深层过滤器过滤洗脱物池，并通过ELISA测试洗脱物池的HCP-A含量(图2A)。相对于对照(294ppm)，所有三种洗涤条件(测试溶液1、2和7)均能够清除额外的HCP-A。结果还表明，HCP-A去除的效果是累积的，因为相对于对照，苯甲醇、苯甲酸钠和精氨酸的组合去除几乎90％的HCP-A。此外，深层过滤为洗涤液条件洗脱物提供随后15-25％的额外HCP-A去除。
按照如上所述的类似程序，接下来通过在9.0或10.0的pH下洗涤柱来测试高pH洗涤液的有效性。在已知高HCP-A表达的细胞系中产生IgG4抗体(mAb B)，以特异性增加蛋白A柱上的HCP-A负荷。表1提供纯化过程期间进行的步骤的总结。简单地，在到达装载pH和电导率的平衡后，用含有从CHO细胞中收获的分泌型人单克隆抗体的样品装载15.7mL蛋白A色谱柱，该CHO细胞在下游加工之前经由离心和通过深层过滤澄清来收获。一旦达到60g/L(的树脂)装载量，使用磷酸盐缓冲溶液重新平衡柱。应用两个CV的测试溶液8或9中的任一种(表2)，紧接着应用三个CV的pH 7.0的无盐磷酸盐缓冲溶液。用40mM乙酸钠洗脱后，使用2MTris碱将洗脱物池调节至pH 5.5。然后用0.22μm PES过滤器过滤洗脱物池。如图2B所示，相对于对照，具有pH 10.0的缓冲盐的0.5M苯甲酸钠在去除HCP-A方面是高效的(减少92％)。而且，苯甲醇和精氨酸的添加又是互补的，并且在pH 9.0增加HCP-A的清除。总之，图2A-B中所示的结果显示pH的稳固范围允许HCP-A的显著清除。
最后，筛选额外的添加剂以进一步增强2％苯甲醇和0.5M苯甲酸钠的洗涤。在1.7mL规模的柱上使用了相同的IgG4 mAb(mAb B)。表1提供纯化过程期间进行的步骤的总结。简单地，平衡后将柱上样至40g/L。然后将表2中所示的四种洗涤液之一(测试溶液3-6)应用到柱上。然后，用2M Tris碱将洗脱样品调节至pH 5.5，并使用0.22μm PES过滤器进行过滤。然后，使用HCP-A特异性ELISA测量HCP-A含量(图3)。与2％苯甲醇和0.5M苯甲酸钠组合(201.3ppm)相比，用测试溶液的洗涤证明了由于精氨酸、辛酸、苯磺酸和己二醇的添加所致的HCP-A去除的累积响应。含有2％苯甲醇、0.5M苯甲酸钠和选自己二醇、苯磺酸钠、辛酸或精氨酸的组分的洗涤液在去除HCP-A方面是高效的。
总之，此实施例中提供的数据显示，含有苯甲酸钠和/或苯甲醇的中间洗涤步骤能够在人单克隆抗体的蛋白A纯化期间提供宿主细胞蛋白质杂质的优异的清除。而且，在洗涤溶液中包含选自苯磺酸盐、辛酸、己二醇和/或精氨酸的一种或多种添加剂进一步改善了在靶单克隆抗体的蛋白A纯化期间的宿主细胞蛋白杂质的清除。
实施例2：蛋白A色谱法后存在的特定宿主细胞蛋白的鉴定，用于改善或提高抗体纯化期间杂质去除的洗涤溶液的开发，以及推定的磷脂酶B样2与人单克隆抗体的相互作用的评估
以下实施例描述了在蛋白A色谱法后纯化的抗体洗脱物中特定宿主细胞蛋白(HCP)的鉴定。该实施例进一步描述了在中间洗涤溶液中使用苯甲酸钠和苯甲醇以在蛋白A色谱法期间改善/提高HCP包括推定的磷脂酶B样2(PLBL2)的去除。最后，该实施例描述了装载条件对蛋白A色谱效率的影响。
材料和方法
样品制备
如实施例1中所述，制备用于蛋白A色谱的人单克隆抗体收获材料。简单地，收获物是在重组CHO细胞的悬浮培养物中生成的，该重组CHO细胞经工程化以组成型表达人单克隆抗体之一。重组产物被分泌到培养基中，然后将该培养基离心并通过深层过滤澄清用于下游加工。澄清的收获物材料在装载到蛋白A柱上之前用0.22μm聚醚砜(PES)过滤器过滤。
蛋白A色谱法
如实施例1中所述制备蛋白A树脂/柱。简单地，经由重力沉降使MabSelect SureLX蛋白A色谱树脂(GE Healthcare Life Sciences；目录号17-5474)与0.5M氯化钠溶液交换。使用用(A)直径为1.0cm的柱(Essential Life Solutions 10/250Snap Column；目录号S10/250-PPSL-OE-FP10)或(B)直径为0.66cm的柱(OmnifitTM 6.6/100；目录号006BCC0610FF)使用AKTA Pure或AKTA Avant(GE Healthcare Life Sciences)填充柱。对于柱(A)，将树脂填充至床高为20cm±10％，或对于柱(B)，将树脂填充至床高为5cm±10％。使用1.0M氯化钠溶液的1％柱体积注射到0.1M氯化钠溶液中平衡的柱上进行柱定性，并使用Unicorn Evaluation软件分析电导率迹线。柱的效率需要为每米至少775个理论塔板，并且需要证明0.8-1.8的不对称性。
在装载收获物材料之前，用反渗透去离子水冲洗柱，以去除20％乙醇的存储缓冲液。随后，在平衡前用0.5M乙酸冲洗柱以确保去除任何结合的实体。用具有0.5M氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液平衡柱，直至柱的pH>6.5。
然后，将制备的样品装载到蛋白A柱上。通常，用人单克隆抗体A(IgG1亚型或人单克隆抗体B(IgG4亚型))将柱装载至40g/L树脂的目标。如上所述，用含有50mM磷酸盐和0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲溶液洗涤装载的柱。接下来，用测试洗涤溶液洗涤柱，然后在pH 7用具有缓冲溶液的无盐洗涤液洗涤。然而，未用测试洗涤液洗涤对照处理。最后，使用含有40mM乙酸钠、pH为3.1的溶液从柱洗脱抗体。表1提供了示例性色谱过程。
通过质谱进行HCP检测
在标准条件下进行蛋白A柱纯化和洗脱后，通过质谱分析人单克隆抗体洗脱物以确定每种HCP的相对量。具体而言，在蛋白A纯化的人单克隆抗体样品中鉴定了丛生蛋白和推定的磷脂酶B样2(PLBL2)的相对量。使用Acquity H-Class Xevo G2-XS Q-Tof和2.1x150mm ACQUITY UPLC柱1.7μm CSH C18进行质谱分析。首先使用在50mM碳酸氢铵中的0.05％Rapigest变性样品，然后使用20mM DTT(二硫苏糖醇)和40mM IAA(碘乙酰胺)还原和烷基化。通过2％LysC过夜然后用4％胰蛋白酶3小时进行酶消化。通过离心去除Rapigest，并使用甲酸酸化样品。然后添加2.5fmol/ul的ClpB大肠杆菌的加标(spike-in)内部标准，以比较HCP和PLBL2的相对量。在785.8426m/z左右进行锁定质量校准。MSE用于分析离子数据并鉴定HCP。
通过ELISA进行HCP检测
洗脱后，如实施例1中所述评估人单克隆抗体样品中通用HCP的存在。简单地，使用第三代CHO HCP ELISA试剂盒(Cygnus Technologies)根据制造商的流程测试抗体样品的HCP杂质的存在。在1:400-1:800的稀释度进行HCP ELISA，并使用Spectramax Plus 384酶标仪在450/600nm处读取吸光度。
通过ELISA进行PLBL2检测
使用市售的仓鼠(CHO)ELISA试剂盒(ICL Labs,E-65PLB)根据制造商的方案对洗脱的抗体样品中PLBL2的浓度进行定量。在1:100-1:800的稀释度进行PLBL2 ELISA，并使用Spectramax Plus 384酶标仪在450nm处读取吸光度。
结果
通过质谱进行HCP检测
在蛋白A纯化后，已显示HCP与人单克隆抗体共洗脱，这对于这些抗体的下游应用可能有问题。为了鉴定蛋白A纯化后纯化的人单克隆抗体溶液中存在的特定HCP，用含有从CHO细胞中收获的分泌的IgG1人单克隆抗体(mAb A)的样品装载1.7mL蛋白A色谱柱，所述样品在进行下游加工之前已被离心和通过深层过滤澄清(参见表1)。首先用磷酸盐缓冲溶液洗涤柱。接下来，用无盐的50mM磷酸盐(pH 7.0)洗涤柱。最后，从柱上洗脱单克隆抗体，并使用2M Tris碱将pH调节至6.0的pH。调节后，使用0.22μm PES过滤器过滤洗脱物池，并通过质谱分析以鉴定HCP的相对量。值得注意的是，丛生蛋白和PLBL2是人单克隆抗体洗脱物中存在的两种最丰富的HCP。
鉴定中间洗涤条件以改善HCP/PLBL2去除。
上面详述的质谱分析提供了进一步的证据，即蛋白A纯化后，与人单克隆抗体共洗脱的HCP包括PLBL2。接下来，开发了ELISA筛选以鉴定可用于进一步改善和增强HCP和PLBL2去除的中间洗涤溶液(图4A和4B)。有趣的是，包含4％苯甲醇或0.5M苯甲酸钠的中间洗涤液有效降低抗体洗脱物样品中污染的HCP和PLBL2的水平。仅含有0.5M精氨酸的洗涤液不会降低一般HCP的水平，但确实降低污染的PLBL2的水平。
PLBL2 ELISA筛选进一步显示，深层过滤与中间洗涤组合高效去除蛋白A纯化期间的PLBL2，所述中间洗涤包括：1)2％苯甲醇和0.5M精氨酸，pH 5.0，2)2％苯甲醇和0.5M苯甲酸钠，pH 7.0，或3)2％苯甲醇、0.5M苯甲酸钠，0.5M精氨酸，pH 6.0。此外，pH水平升高的洗涤液(0.5M苯甲酸钠和50mM碳酸氢钠，pH 10.0或2％苯甲醇、0.5M苯甲酸钠、0.5M精氨酸和50mM磷酸钠，pH 9.0)在蛋白A纯化期间高效去除PLBL2。实际上，与对照处理相比，具有50mM碳酸氢钠pH 10.0的苯甲酸钠洗涤液能够去除多于92％的PLBL2。最后，与对照洗涤液相比，包含如下的洗涤液表现出稳固的去除PLBL2的能力：1)0.5M苯甲酸钠、2％苯甲醇和0.5M苯磺酸(盐)，pH 7.0，2)0.5M苯甲酸钠、50mM辛酸、0.5M精氨酸和0.5M氯化钠，pH7.0，3)0.5M苯甲酸钠，2％苯甲醇和10％己二醇，pH 7.0，或4)0.5M苯甲酸钠、2％苯甲醇和0.5M的精氨酸pH 6.0。
此外，实验洗涤液和对照洗涤液后抗体洗脱物的目测比较揭示，相对于对照洗涤的样品，用2％苯甲醇和0.5M苯甲酸钠洗涤的样品具有改善的澄清度(图5)。
以上详述的PLBL2 ELISA证明，含有苯甲醇和苯甲酸钠的中间洗涤液可有效降低蛋白A纯化的抗体洗脱物中的PLBL2的水平。接下来，通过质谱进一步正交地确认了此结果。质谱结果显示，相对于对照处理，测试洗涤液0.5M苯甲酸钠、0.5M精氨酸、50mM辛酸、0.5MNaCl pH 9.0从洗脱物中去除了几乎93％的PLBL2。
评估柱装载对收率(Yield)和PLBL2去除的影响
以上实验证明宿主细胞蛋白PLBL2存在于蛋白A纯化的抗体洗脱物中，并且可使用含有苯甲醇和苯甲酸钠的中间洗涤溶液来有效去除。接下来，评估了蛋白A柱装载水平对柱外收率(off-column yield)和PLBL2去除的影响。为了鉴定理想的装载条件以最大化柱外收率和PLBL2去除，以40-60g/L的范围装载蛋白A柱(图6A和6B)。结果证明，增加柱装载超过40g/L降低柱外收率和PLBL2去除。
总之，此实施例中提供的数据显示，PLBL2是在蛋白A纯化后与人单克隆抗体共洗脱的宿主细胞蛋白质之一。而且，该数据证明，含有苯甲酸钠和/或苯甲醇的中间洗涤步骤能够在人单克隆抗体的蛋白A纯化期间提供优异的宿主细胞蛋白质杂质和PLBL2的清除。此外，该数据显示，蛋白A树脂柱过载(overload)可降低柱外收率和PLBL2去除。
实施例3：评估包含抗体的收获物的pH和苯甲酸盐浓度对抗体纯化期间的杂质去除的影响。
以下实施例描述了这样的实验：进行该实验以确定调节包含单克隆抗体的收获物的苯甲酸钠浓度和pH是否改善或增强抗体纯化期间杂质的去除。
如实施例1所述制备人单克隆抗体收获物。将澄清和深层过滤的收获物调节至不同的pH和添加剂浓度，并筛选对HCP和PLBL2清除的影响。先前显示出对于作为额外洗涤步骤的一部分的PLBL2去除有效的苯甲酸钠作为固体添加，其量足以对于给定体积的收获物达到靶最终浓度。添加后，通过添加2M Tris碱达到靶pH。向第一收获物补充苯甲酸钠以实现最终浓度为0.5M苯甲酸钠，并调节至7.2的pH。向第二收获物补充苯甲酸钠以实现最终浓度为0.5M苯甲酸钠，并调节至9的pH。将第三收获物调节至9的pH(不添加苯甲酸钠)。参见表3：
表3.
| 收获物添加剂 | pH |
| 仅Tris碱调节 | 9.0 |
| 0.5M苯甲酸钠 | 7.2 |
| 0.5M苯甲酸钠 | 9.0 |
一旦各收获物被调节并经0.22μm过滤，将三个蛋白A柱各自用经调节的收获物装载至50g/L树脂的靶标。用含有50mM磷酸盐和0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲溶液洗涤装载的柱。接下来，用反渗透去离子(RODI)水洗涤柱。最后，使用含有40mM乙酸钠的溶液在3.1的pH从柱洗脱抗体。下表4提供了示例性色谱过程。
表4.
然后，如实施例1中所述，经由ELISA测试三种蛋白A洗脱物每一种是否存在宿主细胞蛋白(HCP)杂质，并经由定制ELISA测试是否存在PLBL2。如图7所示，0.5M苯甲酸钠、pH9.0显示出最低水平的PLBL2和HCP杂质，且证明了相对于仅pH调节，对数更大的PLBL2清除。当向pH 7.2的收获物添加0.5M苯甲酸钠时，仅改善了HCP清除。对于对PLBL2的作用，对收获物进行pH和苯甲酸钠调节两者都是需要的。HMW不受调节的影响(未显示)。与在蛋白A步骤期间仅进行RODI洗涤的未调节的收获物相比，HCP降低65％，而PLBL2降低大约79％。
接下来，向收获物补充苯甲酸钠以实现0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或0.5M的最终浓度，并在蛋白A纯化之前调节至9的pH，如上所述。参见表5。
表5.
| 收获物添加剂 | pH |
| 0.1M苯甲酸钠 | 9.0 |
| 0.2M苯甲酸钠 | 9.0 |
| 0.3M苯甲酸钠 | 9.0 |
| 0.4M苯甲酸钠 | 9.0 |
| 0.5M苯甲酸钠 | 9.0 |
然后通过定制ELISA测试每种蛋白A洗脱物是否存在PLBL2，并评估每种洗脱物中抗体的收率。图8显示PLBL2含量与苯甲酸钠浓度之间的关系为近似为S形。对于浓度超过0.4M苯甲酸钠，观察到PLBL2的清除的增加有所减少。抗体收率随苯甲酸钠浓度的增加而略微下降。从0.1M到0.5M苯甲酸钠，抗体收率从94.8％降低到89.4％。在蛋白A纯化之前将收获物调节至0.4M苯甲酸钠和pH 9.0时，观察到最高收率和最高PLBL2清除。增加苯甲酸钠浓度超过0.4M导致清除增加的降低，代价为抗体收率略微降低。所有0.1M苯甲酸钠样品均具有可比较的HCP清除，约为250ppm。在0.1M苯甲酸钠及以下时，HCP约为500ppm。0.2M-0.5M的苯甲酸钠浓度不影响电荷变化概貌，并且所有洗脱物均在规定的限度内。
总之，这些数据表明溶液中苯甲酸钠的存在使得宿主细胞杂质与mAb的缔合在高pH值下非常不利。这些条件可通过单克隆抗体已与蛋白A树脂结合后的单独洗涤步骤或在柱装载阶段之前或期间的溶液中实现。这为蛋白A纯化步骤的操作提供了更大的灵活性，并进一步支持了苯甲酸钠作为洗涤添加剂的独特性质。
尽管出于清楚和理解的目的已经通过说明和实施例的方式详细地描述了前述公开内容，但是描述和实施例不应被解释为限制本公开的范围。
Claims (95)
1.一种纯化包含Fc区的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在所述包含Fc区的多肽结合蛋白A的条件下，使蛋白A色谱基质与包含(i)所述包含Fc区的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品接触；和
(b)用洗涤溶液洗涤所述基质，其中所述洗涤溶液包含(i)浓度为约0.1M至约1.0M的苯甲酸盐和(ii)浓度为约0.5％至约4％体积/体积(v/v)的苯甲醇中的一或两者，并且其中所述洗涤溶液具有约4.0至约10.0的pH。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤溶液包括：1)苯甲酸盐；2)苯甲醇；或3)苯甲酸盐和苯甲醇。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述苯甲酸盐的浓度为约0.1M至约0.5M。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述苯甲酸盐是苯甲酸碱金属盐。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述苯甲酸盐是苯甲酸钠。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述苯甲酸钠的浓度为约0.1M至约0.3M。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述苯甲酸钠的浓度为约0.3M。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述苯甲酸钠的浓度为约0.5M。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述苯甲醇的浓度为约1％至约4％(v/v)。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述苯甲醇的浓度为约1％至约2％(v/v)。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述苯甲醇的浓度为约2％(v/v)至约4％(v/v)。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液进一步包含缓冲剂。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述缓冲剂选自下组：磷酸盐、Tris、精氨酸、乙酸盐和柠檬酸盐。
14.根据权利要求11或权利要求13所述的方法，其中所述缓冲剂的浓度为约10mM至约500mM。
15.根据权利要求11或权利要求13所述的方法，其中所述缓冲剂的浓度为约50mM或500mM。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液具有约5.0至约10.0的pH。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液具有约5.0至约9.0的pH。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液具有约5.0、约6.0、约7.0、约9.0或约10.0的pH。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液进一步包含苯磺酸钠。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述苯磺酸钠的浓度为约0.1M至约0.5M。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液进一步包含辛酸。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述辛酸的浓度为约10mM至约50mM。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液进一步包含己二醇。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述己二醇的浓度为约1％至约10％(v/v)。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液进一步包含肌酸。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述肌酸的浓度为约10mM至约100mM。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液进一步包含精氨酸。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述精氨酸的浓度为约0.1M至约1.0M。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述精氨酸的浓度为约0.5M。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述精氨酸是精氨酸-HCl。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述包含精氨酸的洗涤溶液具有约4.0至约6.0的pH。
32.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述包含精氨酸的洗涤溶液具有约8.0至约10.0的pH。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液进一步包含一种或多种非缓冲盐。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述一种或多种非缓冲盐选自下组：氯化钠、溴化钠、氯化钾、溴化钾、氯化镁、溴化镁、氯化钙、溴化钙及其任何组合。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述一种或多种非缓冲盐是氯化钠和/或氯化钾。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述一种或多种非缓冲盐的浓度为约0.1M至约1.0M。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液是选自下组的溶液：
(i)包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠和浓度为约50mM的碳酸氢钠、具有约10.0的pH的溶液；
(ii)包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％的苯甲醇、浓度为0.5M的精氨酸、和浓度为50mM的磷酸钠、具有约9.0的pH的溶液；
(iii)包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠和浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、具有约7.0的pH的溶液；
(iv)包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，和浓度为0.5M的氯化钠、具有约7.0的pH的溶液；
(v)包含浓度为约10％(v/v)的己二醇、浓度为约0.5M的苯甲酸钠和浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、具有约7.0的pH的溶液；
(vi)包含浓度为约0.5M的苯磺酸盐、浓度为约0.5M的苯甲酸钠、和浓度为约2％(v/v)的苯甲醇、具有约7.0的pH的溶液；
(vii)包含浓度为约50mM的辛酸、浓度为0.5M的苯甲酸钠、浓度为约0.5M的精氨酸，和浓度为约0.5M的氯化钠、具有约7.0的pH的溶液；
(viii)包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，和浓度为约0.5M的精氨酸、具有约6.0的pH的溶液；
(ix)包含浓度为约0.5M的苯甲酸钠、浓度为约2％(v/v)的苯甲醇，和浓度为约0.5M的精氨酸、具有约5.0的pH的溶液；和
(x)包含浓度为约2％(v/v)的苯甲醇和浓度为约0.5M的精氨酸、具有约5.0的pH的溶液。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其进一步包括在用权利要求1中的步骤(b)的洗涤溶液洗涤所述基质之前，用第一溶液洗涤所述基质的步骤。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述第一溶液包含选自下组的缓冲液：磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及其任何组合。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述第一溶液包含浓度为约10mM至约100mM的缓冲液。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述第一溶液是磷酸盐缓冲液。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其进一步包括在用权利要求1中的步骤(b)的洗涤溶液洗涤所述基质之后，用第二溶液洗涤所述基质的步骤。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第二溶液包含选自下组的缓冲液：磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及其任何组合。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述第二溶液包含浓度为约10mM至约100mM的缓冲液。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述第二溶液具有约5.0至约7.0的pH。
46.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述第二溶液包含相当低的盐或不包含盐。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其进一步包括在一个或多个洗涤步骤之后使所述蛋白A色谱基质与洗脱溶液接触的步骤。
48.根据权利要求47所述的方法，其进一步包括收集洗脱物的步骤，所述洗脱物包含所述包含Fc区的多肽。
49.根据权利要求48所述的方法，其进一步包括经由深层过滤来过滤所述洗脱物的步骤。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的方法，其中所述洗脱物包含小于约百万分之500(ppm)的所述一种或多种杂质。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中与缺乏用所述洗涤溶液洗涤所述基质的步骤的相应方法相比，所述方法导致所述包含Fc区的多肽以更高的程度从一种或多种杂质中纯化出来。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述一种或多种杂质是宿主细胞蛋白(HCP)。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述一种或多种HCP选自下组：磷脂酶、丛生蛋白、丝氨酸蛋白酶、延伸因子及其任何组合。
54.根据权利要求52或权利要求53所述的方法，其中所述HCP是推定的磷脂酶B样2(PLBL2)。
55.根据权利要求52或权利要求53所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述Fc区是人Fc区。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述人Fc区包含人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。
59.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述Fc区是小鼠Fc区。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述小鼠Fc区包含小鼠IgG1、IgG2或IgG3 Fc区。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述包含Fc区的多肽是抗体。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
63.根据权利要求61或权利要求62所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
64.根据权利要求61或权利要求62所述的方法，其中所述抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其进一步包括，在步骤(a)之前，调节包含所述包含Fc区的多肽的收获物，以实现苯甲酸盐的最终浓度为0.1M-约0.5M，且pH为约7.0-约9.0，以产生包含(i)所述包含Fc区的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品。
66.一种纯化包含Fc区的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(A)调节包含所述包含Fc区的多肽的收获物，以实现苯甲酸盐的最终浓度为约0.1M-约0.5M，且pH为约7.0-约9.0，以产生包含(i)所述包含Fc区的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品；和
(B)使所述样品与至少一种色谱基质接触。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其中所述苯甲酸盐是苯甲酸碱金属盐。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述苯甲酸盐是苯甲酸钠。
69.根据权利要求65-68中任一项所述的方法，其中所述收获物中的苯甲酸盐的最终浓度为约0.4M-约0.5M。
70.根据权利要求65-69中任一项所述的方法，其中所述收获物的pH为约7.0-约8.0。
71.根据权利要求65-69中任一项所述的方法，其中所述收获物的pH为约8.0-约9.0。
72.根据权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述收获物是从包含经工程化以表达所述多肽的宿主细胞的培养物生成的。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
75.根据权利要求65-74中任一项所述的方法，其中在所述调节之前澄清所述收获物。
76.根据权利要求65-74中任一项所述的方法，其中在所述调节之后澄清所述收获物。
77.根据权利要求66-76中任一项所述的方法，其中所述至少一种色谱基质包含亲和色谱基质。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述亲和色谱基质是蛋白A色谱基质或蛋白G色谱基质。
79.根据权利要求65-78中任一项所述的方法，其进一步包括使所述至少一种色谱基质与至少一种洗涤溶液接触的步骤。
80.根据权利要求65-79中任一项所述的方法，其进一步包括使所述至少一种色谱基质与洗脱溶液接触的步骤。
81.根据权利要求80所述的方法，其进一步包括收集包含所述包含Fc区的多肽的洗脱物的步骤。
82.根据权利要求81所述的方法，其进一步包括经由深层过滤来过滤所述洗脱物的步骤。
83.根据权利要求81或权利要求82所述的方法，其中所述洗脱物包含小于约百万分之500(ppm)的所述一种或多种杂质。
84.根据权利要求66-83中任一项所述的方法，其中与缺乏调节包含所述包含Fc区的多肽的收获物的步骤的相应方法相比，所述方法导致所述包含Fc区的多肽以更高的程度从所述一种或多种杂质中纯化出来以产生所述样品。
85.根据权利要求66-84中任一项所述的方法，其中所述一种或多种杂质是宿主细胞蛋白(HCP)。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述一种或多种HCP选自下组：磷脂酶、丛生蛋白、丝氨酸蛋白酶、延伸因子及其任何组合。
87.根据权利要求85或权利要求86所述的方法，其中所述HCP是推定的磷脂酶B样2(PLBL2)。
88.根据权利要求66-87中任一项所述的方法，其中所述Fc区是人Fc区。
89.根据权利要求82所述的方法，其中所述人Fc区包含人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。
90.根据权利要求66-89中任一项所述的方法，其中所述Fc区是小鼠Fc区。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述小鼠Fc区包含小鼠IgG1、IgG2或IgG3 Fc区。
92.根据权利要求66-91中任一项所述的方法，其中所述包含Fc区的多肽是抗体。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
94.根据权利要求92或权利要求93所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
95.根据权利要求92或权利要求93所述的方法，其中所述抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。
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