CN112827217A - 一种层析柱清洗液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种层析柱清洗液，清洗液包括HEPES或者柠檬酸‑柠檬酸钠溶液、氨基酸、盐酸胍、吐温、醇、盐以及水；其中，柠檬酸‑柠檬酸钠溶液的pH为6.0~7.0，在清洗液中，HEPES的浓度为5~15mmol/L、柠檬酸‑柠檬酸钠的浓度为100~200mmol/L、氨基酸的浓度为40~580mmol/L、盐酸胍的浓度为2~6mol/L、吐温的体积百分浓度为0.1~0.6%、醇的质量百分浓度为5~20%、盐的浓度为0.1~1mol/L。本发明的清洗液能够去除层析柱中的杂蛋白，适用于一些能够特异性吸附的介质的清洗，并且，该清洗液具有快速去除和灭活指示病毒的能力，从而能够避免层析柱中的病毒引入到下一次产物中。
Description
技术领域
本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种层析柱清洗液及其应用。
背景技术
层析技术是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术，在生物医药领域具有广泛应用。层析柱在每次使用后，可能会对下次使用造成污染，如引入包括肉毒素等外来污染物或将上一次未清洗干净的蛋白引入到下次产物中。在病毒去除/灭活验证试验中，还可能有病毒残留污染。现有的清洗方法主要是用缓冲液、酸、碱等溶液进行浸泡冲洗，但对某些特异吸附的介质不适用，并且，目前的清洗方法清洗速度慢，清洗效果差，尤其对病毒去除和灭活的效果差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种清洗效果好、清洗速度快、能够去除和灭活指示病毒的层析柱清洗液及其应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明的一方面提供一种层析柱清洗液，所述清洗液包括HEPES或者柠檬酸-柠檬酸钠溶液、氨基酸、盐酸胍、吐温、醇、盐以及水；其中，所述柠檬酸-柠檬酸钠溶液的pH为6.0~7.0，在所述清洗液中，所述HEPES的浓度为5~15mmol/L、所述柠檬酸-柠檬酸钠的浓度为100~200mmol/L、所述氨基酸的浓度为40~580mmol/L、所述盐酸胍的浓度为2~6mol/L、所述吐温的体积百分浓度为0.1~0.6%、所述醇的质量百分浓度为5~20%、所述盐的浓度为0.1~1mol/L。
本发明中的柠檬酸-柠檬酸钠溶液中的柠檬酸可以为柠檬酸或者水合柠檬酸，其中水合柠檬酸可以为一水合柠檬酸；柠檬酸钠可以为柠檬酸钠或水合柠檬酸钠，其中水合柠檬酸钠可以为二水合柠檬酸钠。
本发明中的清洗液，通过HEPES或者柠檬酸-柠檬酸钠溶液、氨基酸、盐酸胍、吐温、醇和盐的协同配合，能够溶解蛋白质，破坏细胞结构，并干扰病毒与细胞表面极性分子的结合，有效灭活和去除病毒。
优选地，HEPES的浓度为8~12mmol/L，更优选为8~10mmol/L。
优选地，所述柠檬酸-柠檬酸钠的浓度130~180mmol/L，更优选为130~150mmol/L。
本发明的一些具体且优选地实施方式，所述氨基酸为L-精氨酸和/或L-组氨酸。
优选地，所述氨基酸为L-精氨酸和L-组氨酸。
进一步优选地，所述L-精氨酸的浓度为100~500mmol/L，优选为400~500mmol/L，更优选为440~460mmol/L。
进一步优选地，所述L-组氨酸的浓度为40~80mmol/L，优选为40~60mmol/L，更优选为40~50mmol/L。
本发明的一些具体且优选地实施方式，所述吐温在所述清洗液中的体积百分比浓度为0.3~0.5%。
优选地，所述吐温为吐温-80和/或吐温-40。
本发明的一些具体且优选地实施方式，所述醇为2-丁氧乙醇和/或丙二醇。
本发明的一些具体且优选地实施方式，所述盐在所述清洗液中的的浓度为0.3~1mol/L，更优选为0.4~1mol/L。
优选地，所述盐为氯化钠和/或氯化钙。
本发明的第二个方面提供一种层析柱的冲洗方法，使用如上所述的清洗液对层析柱进行冲洗。
优选地，冲洗时，所述清洗液的流速为0.5~2ml/min，优选为1~2ml/min。
进一步优选地，所述冲洗的时间为10~50min，优选为20~40min。
本发明中，所述层析柱中的介质为葡聚糖凝胶。
优选地，所述层析柱为Sephadex 系列中的任一种。
本发明的第三个方面使用如上所述的清洗液去除和灭活狂犬病毒和/或脑心肌炎病毒。
优选地，所述清洗液与所述伪狂犬病毒和/或脑心肌炎病毒的体积比为8~10:1。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明的清洗液能够去除层析柱中的杂蛋白，能够适用于一些能够特异性吸附的介质的清洗，并且，该清洗液具有快速去除和灭活指示病毒的能力，从而能够避免层析柱中的病毒引入到下一次产物中。
附图说明
图1为阴性ST细胞的在显微镜下的示意图；
图2为本发明实施例1的溶液处理前指示病毒PRV引起ST细胞病变的显微镜下的示意图；
图3为本发明实施例1的病毒滴度随时间的变化趋势图；
图4为阴性Vero细胞的显微镜图；
图5为本发明实施例2的溶液处理前指示病毒EMCV引起Vero细胞病变的显微镜下的示意图；
图6为本发明实施例2的病毒滴度随时间的变化趋势图；
图7为本发明实施例3的溶液清洗后流出液的ST细胞的显微镜下的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中，下述实施例中的病毒滴度的测量方法如下：
将各取样点样品进行10倍梯度稀释，取0.1ml接种至各指示细胞，每个稀释度接种8孔，置于37℃、5% CO2培养箱中培养（PRV用ST细胞培养3d；EMCV用Vero细胞培养3d），在倒置显微镜下观察指示细胞的病变情况。按Karber法计算样品中病毒滴度及95%置信区间：以半数细胞感染剂量TCID50表示，log10TCID50=L-d（S-0.5），其中L=最高稀释度的对数，d=稀释对数之间的差，S=阳性孔比率总和。
实施例1
1、 配制清洗液：分别将2.38g HEPES、87.1g L-精氨酸和7.75g L-组氨酸加入至无菌水中，充分溶解混匀后定容至1L，配制成溶液Ⅰ；依次向溶液Ⅰ中加入4ml吐温-80、4mol盐酸胍、100ml 2-丁氧乙醇和0.5mol氯化钠，混合均匀后即得清洗液。
2、 按清洗液与伪狂犬病毒 (PRV)的体积比为9:1比例向清洗液中加入PRV，2~8℃静置 60min，在计时至0min，15min，30min，45min和60min时分别从中取样按照微量滴定法测定病毒滴度。以培养基做阴性对照（指示细胞的显微镜图片见图1），以PRV病毒在培养基中的滴度作为阳性对照（PRV引起的细胞病变显微镜图片见图2）。60min 内PRV病毒滴度下降趋势见图3。由图3可见，PRV的病毒滴度（log10TCID50/0.1ml）在60min内下降至1以下。
实施例2
1、 配制清洗液：分别将2.38g HEPES、87.1g L-精氨酸和7.75g L-组氨酸加入至无菌水中，充分溶解混匀后定容至1L，配制成溶液Ⅰ；依次向溶液Ⅰ中加入5ml吐温-80、6mol盐酸胍、100ml 2-丁氧乙醇和1mol氯化钠，混合均匀后即得清洗液。
2、 按清洗液与脑心肌炎病毒 (EMCV)的体积比为9:1比例向清洗液中加入EMCV，室温静置 60min，在计时至0min，15min，30min，45min和60min时分别从中取样按照微量滴定法测定病毒滴度。以培养基做阴性对照（指示细胞的显微镜图片见图4），以EMCV病毒在培养基中的滴度作为阳性对照（EMCV引起的细胞病变显微镜图片见图5）。60min 内EMCV病毒滴度下降趋势见图6。由图6可见，EMCV的病毒滴度（log10TCID50/0.1ml）在60min内下降至1以下。
实施例3
1、配制清洗液：分别将2.38g HEPES、87.1g L-精氨酸和7.75g L-组氨酸加入至无菌水中，充分溶解混匀后定容至1L，配制成溶液Ⅰ；依次向溶液Ⅰ中加入2ml吐温-80、4mol盐酸胍、50ml 2-丁氧乙醇和1mol氯化钠，混合均匀后即得清洗液。
2、将浓度为2%的指示病毒PRV上样至VIII Select层析柱，上样结束后再用清洗液以1ml/min的流速冲洗20min，收集流出液，从中取样按照微量滴定法测定病毒滴度。流出液的ST细胞的显微镜图见图7。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种层析柱清洗液，其特征在于：所述清洗液包括HEPES或者柠檬酸-柠檬酸钠溶液、氨基酸、盐酸胍、吐温、醇、盐以及水；其中，所述柠檬酸-柠檬酸钠溶液的pH为6.0~7.0，在所述清洗液中，所述HEPES的浓度为5~15mmol/L、所述柠檬酸-柠檬酸钠的浓度为100~200mmol/L、所述氨基酸的浓度为40~580mmol/L、所述盐酸胍的浓度为2~6mol/L、所述吐温的体积百分浓度为0.1~0.6%、所述醇的质量百分浓度为5~20%、所述盐的浓度为0.1~1mol/L。
2.根据权利要求1所述的层析柱清洗液，其特征在于：所述氨基酸为L-精氨酸和/或L-组氨酸；其中，所述L-精氨酸的浓度为100~500mmol/L，所述L-组氨酸的浓度为40~80mmol/L。
3.根据权利要求1所述的层析柱清洗液，其特征在于：所述吐温为吐温-80和/或吐温-40。
4.根据权利要求1所述的层析柱清洗液，其特征在于：所述醇为2-丁氧乙醇和/或丙二醇。
5.根据权利要求1所述的层析柱清洗液，其特征在于：所述盐为氯化钠和/或氯化钙。
6.一种层析柱的清洗方法，其特征在于：使用如权利要求1至5任一项所述的清洗液对层析柱进行冲洗。
7.根据权利要求6所述的层析柱的清洗方法，其特征在于：冲洗时，所述清洗液的流速为0.5~2ml/min，所述冲洗的时间为10~50min。
8.根据权利要求7所述的层析柱的清洗方法，其特征在于：所述层析柱中的介质为葡聚糖凝胶。
9.根据权利要求8所述的层析柱的清洗方法，其特征在于：所述层析柱为Sephadex 系列中的任一种。
10.如权利要求1至5中任一项所述的清洗液在去除和灭活狂犬病毒和/或脑心肌炎病毒中的应用，其特征在于：所述清洗液与所述伪狂犬病毒和/或脑心肌炎病毒的体积比为8~10:1。
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2020
- 2020-12-29 CN CN202011596840.0A patent/CN112827217A/zh active Pending
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