JPH07196531A - 血液凝固因子の感染性夾雑ウイルス不活化法 - Google Patents
血液凝固因子の感染性夾雑ウイルス不活化法Info
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- JPH07196531A JPH07196531A JP5350153A JP35015393A JPH07196531A JP H07196531 A JPH07196531 A JP H07196531A JP 5350153 A JP5350153 A JP 5350153A JP 35015393 A JP35015393 A JP 35015393A JP H07196531 A JPH07196531 A JP H07196531A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血液凝固因子製剤中に存在する可能性のある
感染性夾雑ウイルスを不活化する方法を提供する。 【構成】 高純度血液凝固因子を含有する溶液に対し
て、実質的に紫外線照射処理を行ない感染性夾雑ウイル
スの不活化をはかる。
感染性夾雑ウイルスを不活化する方法を提供する。 【構成】 高純度血液凝固因子を含有する溶液に対し
て、実質的に紫外線照射処理を行ない感染性夾雑ウイル
スの不活化をはかる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血液凝固因子製剤に関す
る。さらに詳細には、血液凝固因子とりわけ、血液凝固
第VII、活性型第VII因子もしくは第IX因子を含有する溶
液に紫外線を照射することにより感染性夾雑ウイルスを
不活化する方法に関するものである。
る。さらに詳細には、血液凝固因子とりわけ、血液凝固
第VII、活性型第VII因子もしくは第IX因子を含有する溶
液に紫外線を照射することにより感染性夾雑ウイルスを
不活化する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術並びに発明が解決しようとする課題】血液
凝固因子の不足欠損による凝血障害の治療のためには、
その血液凝固因子を補充する治療が行なわれている。ま
た、凝固因子に対するインヒビターが生じた場合には、
活性型血液凝固因子による治療も行なわれる。これらの
血液凝固因子は、一般的に多くのヒト血漿を大量にプー
ルしたものから精製して得られるが、近年、血漿プール
へのウイルスを含む血漿の混入により、ウイルス性肝炎
やＨＩＶによるＡＩＤＳの発生が報告され、血液凝固因
子製剤を介しての病因ウイルスの感染の問題が生じた経
緯がある。現在では原料血漿のスクリーニングおよびウ
イルスを失活させる処理が施されており、これらのウイ
ルス感染の問題に対応している。しかし、血漿を原料と
して調製される凝固因子製剤の供給に際しては、ウイル
スの混入の危険性は依然として留意されるべきであり、
常に正面から対峙しておく重要な事項である。
凝固因子の不足欠損による凝血障害の治療のためには、
その血液凝固因子を補充する治療が行なわれている。ま
た、凝固因子に対するインヒビターが生じた場合には、
活性型血液凝固因子による治療も行なわれる。これらの
血液凝固因子は、一般的に多くのヒト血漿を大量にプー
ルしたものから精製して得られるが、近年、血漿プール
へのウイルスを含む血漿の混入により、ウイルス性肝炎
やＨＩＶによるＡＩＤＳの発生が報告され、血液凝固因
子製剤を介しての病因ウイルスの感染の問題が生じた経
緯がある。現在では原料血漿のスクリーニングおよびウ
イルスを失活させる処理が施されており、これらのウイ
ルス感染の問題に対応している。しかし、血漿を原料と
して調製される凝固因子製剤の供給に際しては、ウイル
スの混入の危険性は依然として留意されるべきであり、
常に正面から対峙しておく重要な事項である。
【０００３】ところで、原料血漿のスクリーニングは特
定のある種のウイルスに関しては有用であり、これらの
ウイルスの血漿プールへの混入の危険性はほぼ消失した
と考えられるが、全てのウイルスについてのスクリーニ
ングが可能という訳では無い。例えば、ヒトパルボウイ
ルス等まだその検出方法が確立されていないウイルスや
未知のウイルスに対しては、その混入を排除することは
できない。
定のある種のウイルスに関しては有用であり、これらの
ウイルスの血漿プールへの混入の危険性はほぼ消失した
と考えられるが、全てのウイルスについてのスクリーニ
ングが可能という訳では無い。例えば、ヒトパルボウイ
ルス等まだその検出方法が確立されていないウイルスや
未知のウイルスに対しては、その混入を排除することは
できない。
【０００４】一方、血漿プールから混入してきたウイル
スを失活させる手段として、主として加熱処理、化学処
理が従来より行なわれてきた。しかし、加熱処理の場合
はウイルスの失活と同時に目的とする凝固因子自体の失
活をも生じてしまう。一方、界面活性剤等の化学処理で
はエンベロープを持つウイルスには有効であるが、エン
ベロープを持たないウイルスには効果が弱く、二つの方
法ともになお克服するべき問題点を抱えている。
スを失活させる手段として、主として加熱処理、化学処
理が従来より行なわれてきた。しかし、加熱処理の場合
はウイルスの失活と同時に目的とする凝固因子自体の失
活をも生じてしまう。一方、界面活性剤等の化学処理で
はエンベロープを持つウイルスには有効であるが、エン
ベロープを持たないウイルスには効果が弱く、二つの方
法ともになお克服するべき問題点を抱えている。
【０００５】上述の状況のもと、ヒト血漿を低温で処理
する方法がログリッポ(LoGrippo)により提案されている
(ジー.エイ.ログリッポ(G.A.LoGrippo)等「血漿滅菌の
ための化学的方法および他方法との組合せ方法」(Chemi
cal and Combined Methods For Plasma Sterilizatio
n)、ビブル.ヘマトル(Ｂｉｂｌ.Ｈａｅｍａｔｏｌ.)７,
ｐ.２２５〜２３０,(１９５８))。この方法は、ヒト血
漿をβ-プロピオラクトンで処理し、さらに紫外線を照
射するという工程からなる。この方法によるウイルスの
不活化効果は、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、およ
びエンベロープの有無に関わらず有効であったが、β-
プロピオラクトンと紫外線照射の組合せによると血漿蛋
白へも非常に強く作用し、例えば、血液凝固第VIII因子
は２mW／cm2×minの紫外線照射量で70％もの活性の損失
を招くことを上記報告の著者は示している。
する方法がログリッポ(LoGrippo)により提案されている
(ジー.エイ.ログリッポ(G.A.LoGrippo)等「血漿滅菌の
ための化学的方法および他方法との組合せ方法」(Chemi
cal and Combined Methods For Plasma Sterilizatio
n)、ビブル.ヘマトル(Ｂｉｂｌ.Ｈａｅｍａｔｏｌ.)７,
ｐ.２２５〜２３０,(１９５８))。この方法は、ヒト血
漿をβ-プロピオラクトンで処理し、さらに紫外線を照
射するという工程からなる。この方法によるウイルスの
不活化効果は、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、およ
びエンベロープの有無に関わらず有効であったが、β-
プロピオラクトンと紫外線照射の組合せによると血漿蛋
白へも非常に強く作用し、例えば、血液凝固第VIII因子
は２mW／cm2×minの紫外線照射量で70％もの活性の損失
を招くことを上記報告の著者は示している。
【０００６】また、精製したフィブリノゲン画分のβ-
プロピオラクトンと紫外線照射による処理ではフィブリ
ノゲンは変性し、凝固不可能なものへと変化するという
報告もある(R.Kotitscheke & W.Stephan. Proteinsおよ
びRelated Subjects,Vol.28,Protides of Biological F
luids. Peeters H.,28th Colloqulum,1980,Oxford,New
York,Toronto, Paris, Pergamon Press,333-37; H.Bru
nner et al.,Verhandlungen der Deutsh.Gesellsch.fur
Inn.Med.79(1983),1130-34;およびW.Doleschel & W.Au
ersvald, Pharmacolgy 2(1969),1)。以上のようにβ-
プロピオラクトンと紫外線照射との組合せによる処理
は、ウイルス不活化効果と同時に凝固因子に対する影響
も大きく、これらの成分の変性、不活性化をもたらすと
いう大きな問題点がある。
プロピオラクトンと紫外線照射による処理ではフィブリ
ノゲンは変性し、凝固不可能なものへと変化するという
報告もある(R.Kotitscheke & W.Stephan. Proteinsおよ
びRelated Subjects,Vol.28,Protides of Biological F
luids. Peeters H.,28th Colloqulum,1980,Oxford,New
York,Toronto, Paris, Pergamon Press,333-37; H.Bru
nner et al.,Verhandlungen der Deutsh.Gesellsch.fur
Inn.Med.79(1983),1130-34;およびW.Doleschel & W.Au
ersvald, Pharmacolgy 2(1969),1)。以上のようにβ-
プロピオラクトンと紫外線照射との組合せによる処理
は、ウイルス不活化効果と同時に凝固因子に対する影響
も大きく、これらの成分の変性、不活性化をもたらすと
いう大きな問題点がある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、前述の従来の
技術が抱える課題を解決するべく、本願発明者の鋭意研
究の結果達成されたもので、モノクローナル抗体を用い
たアフィニティークロマトグラフィー等の手段により高
純度に精製した血液凝固因子、とりわけ第VII因子、活
性型第VII因子もしくは第IX因子を含有するｐＨ６.５〜
８.０の溶液を、照射量が上述の従来の条件の１／１０
程度の紫外線照射のみで処理し、所望の凝固因子への変
性、不活性化が少ない条件で感染性夾雑ウイルスの不活
化をはかるという技術思想に基づいている。
技術が抱える課題を解決するべく、本願発明者の鋭意研
究の結果達成されたもので、モノクローナル抗体を用い
たアフィニティークロマトグラフィー等の手段により高
純度に精製した血液凝固因子、とりわけ第VII因子、活
性型第VII因子もしくは第IX因子を含有するｐＨ６.５〜
８.０の溶液を、照射量が上述の従来の条件の１／１０
程度の紫外線照射のみで処理し、所望の凝固因子への変
性、不活性化が少ない条件で感染性夾雑ウイルスの不活
化をはかるという技術思想に基づいている。
【０００８】本発明による夾雑ウイルスの不活化方法
は、モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマ
トグラフィー等の手段によって精製した高純度血液凝固
因子、とりわけ第VII、活性型第VII因子もしくは第IX因
子含有溶液に対して実施される。所望の血液凝固因子の
精製について、出発原料、精製方法に関する特別の制約
はなく、例えばクリオプレシピテートの上清を出発原料
として、通常の生化学的精製手段である塩析、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニテークロマトグラフィ
ー等を組み合わせて精製することができる。
は、モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマ
トグラフィー等の手段によって精製した高純度血液凝固
因子、とりわけ第VII、活性型第VII因子もしくは第IX因
子含有溶液に対して実施される。所望の血液凝固因子の
精製について、出発原料、精製方法に関する特別の制約
はなく、例えばクリオプレシピテートの上清を出発原料
として、通常の生化学的精製手段である塩析、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニテークロマトグラフィ
ー等を組み合わせて精製することができる。
【０００９】紫外線の照射は、目的の高純度凝固因子を
１０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で含有する凝固因子含有溶液
に対して、ｐＨ値は６.５〜８.０、温度は凝固因子の失
活を防ぐため高温を避け１０〜２５℃の間で行なう。照
射に際して、効率的な紫外線照射を考慮した場合、薄く
均一に凝固因子を含む溶液が分布される円筒状の回転す
る筒を有するいわゆる円筒回転貫流型紫外線放出-照射
装置を用いることが好ましい。その原理は、回転する筒
の内壁にポンプを用いて３００ｍｌ／分程度の流速で凝
固因子を含む液体を注入することで液体は０.１ｍｍと
いう薄膜を形成し、かつ均一性をもって内壁に拡散し、
円筒の中心に位置する紫外線管より円筒の内壁に向い紫
外線が照射されるという装置である。凝固因子に対して
照射される紫外線量は、凝固因子を含む液体が筒の内壁
を通過する時間によって増減され、筒の角度を変化させ
ることで通過時間も変わり、照射量を６００〜９０００
ergs／mm2と変化させることが可能である。本願発明に
おいて、照射は波長２５４μｍの紫外線を総照射量約９
００〜１５００ergs／mm2となるように実施する。な
お、紫外線の照射量は適当な紫外線照射計、例えばＵＶ
Ｐ,ＩＮＣ.社製 BLAK-RAY ULTRAVIOLETMETERにより測定
できる。
１０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で含有する凝固因子含有溶液
に対して、ｐＨ値は６.５〜８.０、温度は凝固因子の失
活を防ぐため高温を避け１０〜２５℃の間で行なう。照
射に際して、効率的な紫外線照射を考慮した場合、薄く
均一に凝固因子を含む溶液が分布される円筒状の回転す
る筒を有するいわゆる円筒回転貫流型紫外線放出-照射
装置を用いることが好ましい。その原理は、回転する筒
の内壁にポンプを用いて３００ｍｌ／分程度の流速で凝
固因子を含む液体を注入することで液体は０.１ｍｍと
いう薄膜を形成し、かつ均一性をもって内壁に拡散し、
円筒の中心に位置する紫外線管より円筒の内壁に向い紫
外線が照射されるという装置である。凝固因子に対して
照射される紫外線量は、凝固因子を含む液体が筒の内壁
を通過する時間によって増減され、筒の角度を変化させ
ることで通過時間も変わり、照射量を６００〜９０００
ergs／mm2と変化させることが可能である。本願発明に
おいて、照射は波長２５４μｍの紫外線を総照射量約９
００〜１５００ergs／mm2となるように実施する。な
お、紫外線の照射量は適当な紫外線照射計、例えばＵＶ
Ｐ,ＩＮＣ.社製 BLAK-RAY ULTRAVIOLETMETERにより測定
できる。
【００１０】本願発明の不活性化の対象となるウイルス
は、感染性でかつ重篤な疾患を引き起こす病因ウイル
ス、例えばＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型
肝炎ウイルスあるいはヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)等
が考慮されるが、本願発明においては、ウイルス不活性
化のモデルとして種々の形態を有するいくつかのウイル
スを選択して効果を確認した。
は、感染性でかつ重篤な疾患を引き起こす病因ウイル
ス、例えばＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型
肝炎ウイルスあるいはヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)等
が考慮されるが、本願発明においては、ウイルス不活性
化のモデルとして種々の形態を有するいくつかのウイル
スを選択して効果を確認した。
【００１１】以下、本願発明を実施例として採用したウ
イルス不活性化のモデル評価系にそって概説する。ウイ
ルス不活化の検討には、一本鎖ＤＮＡウイルスでエンベ
ロープを持たないブタパルボウイルス、一本鎖ＲＮＡウ
イルスでエンベロープを持たないポリオウイルス、さら
に一本鎖ＲＮＡウイルスでエンベロープを有するシンド
ビスウイルスの３種を用いた。すなわち、ＤＮＡウイル
ス、ＲＮＡウイルス、ＳＤ処理耐性のエンベロープのな
いウイルス、粒子の非常に小さいウイルス等タイプの異
なるものを評価に使用した。
イルス不活性化のモデル評価系にそって概説する。ウイ
ルス不活化の検討には、一本鎖ＤＮＡウイルスでエンベ
ロープを持たないブタパルボウイルス、一本鎖ＲＮＡウ
イルスでエンベロープを持たないポリオウイルス、さら
に一本鎖ＲＮＡウイルスでエンベロープを有するシンド
ビスウイルスの３種を用いた。すなわち、ＤＮＡウイル
ス、ＲＮＡウイルス、ＳＤ処理耐性のエンベロープのな
いウイルス、粒子の非常に小さいウイルス等タイプの異
なるものを評価に使用した。
【００１２】所定のウイルス含量を有するそれぞれのウ
イルス浮遊液を血液凝固第VIIまたは第IX因子を含むｐ
Ｈ６.５〜８.０溶液に１／１０〜１／１００量添加し、
紫外線の照射量を数ポイント取り、上述の装置を通過さ
せた。紫外線を照射した後のウイルス不活化の測定は、
ポリオ、シンドビスウイルスに対してはＶｅｒｏ細胞、
ブタパルボウイルスに対してはＥＳＫ細胞を用いて、５
０％感染価(ＴＣＩＤ50)を指標として行なった。また、
凝固因子の活性はプロトロンビン時間(ＰＴ)、もしくは
活性化部分トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ)の測定に
より評価した。
イルス浮遊液を血液凝固第VIIまたは第IX因子を含むｐ
Ｈ６.５〜８.０溶液に１／１０〜１／１００量添加し、
紫外線の照射量を数ポイント取り、上述の装置を通過さ
せた。紫外線を照射した後のウイルス不活化の測定は、
ポリオ、シンドビスウイルスに対してはＶｅｒｏ細胞、
ブタパルボウイルスに対してはＥＳＫ細胞を用いて、５
０％感染価(ＴＣＩＤ50)を指標として行なった。また、
凝固因子の活性はプロトロンビン時間(ＰＴ)、もしくは
活性化部分トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ)の測定に
より評価した。
【００１３】この方法によれば、ログリッポの報告及び
特許公開公報昭和５７年第８０３２３号に記載の２００
０μＷ／cm2×ｍｉｎ＝１２０００ergs／mm2の条件の
１／１０量である紫外線量３５００μＷ／cm2×３.４４
sec＝１２０４ergs／mm2で、ブタパルボウイルス(１０
5.5 ＴＣＩＤ50／ｍｌ)は検出されなくなり、感染性の
消失が確認された。ブタパルボウイルスはエンベロープ
のないウイルスであり、これまではＳＤ処理での不活化
ができず、また熱に抵抗性のウイルスでもあるので凍結
乾燥状態での６５℃９６時間の加熱処理や、溶液状態で
の６０℃１０時間の加熱処理でも、１０2程度の感染性
の低減が認められるのみであった(SatohT.et al., Pro
c.4th.Int.Symp.H.T., p.117-124(1984))。また、ポリ
オウイルスやシンドビスウイルスでも１０4以上の不活
化効果が認められた。この時、紫外線照射後の血液凝固
第VII因子の活性は約８０％、凝固第IX因子の活性は約
９０％維持されていた。
特許公開公報昭和５７年第８０３２３号に記載の２００
０μＷ／cm2×ｍｉｎ＝１２０００ergs／mm2の条件の
１／１０量である紫外線量３５００μＷ／cm2×３.４４
sec＝１２０４ergs／mm2で、ブタパルボウイルス(１０
5.5 ＴＣＩＤ50／ｍｌ)は検出されなくなり、感染性の
消失が確認された。ブタパルボウイルスはエンベロープ
のないウイルスであり、これまではＳＤ処理での不活化
ができず、また熱に抵抗性のウイルスでもあるので凍結
乾燥状態での６５℃９６時間の加熱処理や、溶液状態で
の６０℃１０時間の加熱処理でも、１０2程度の感染性
の低減が認められるのみであった(SatohT.et al., Pro
c.4th.Int.Symp.H.T., p.117-124(1984))。また、ポリ
オウイルスやシンドビスウイルスでも１０4以上の不活
化効果が認められた。この時、紫外線照射後の血液凝固
第VII因子の活性は約８０％、凝固第IX因子の活性は約
９０％維持されていた。
【００１４】さらにＳＤ処理、加熱処理に耐性のブタパ
ルボウイルスに対し、６０２ergs／mm2という紫外線量
においても、感染性の消失が確認された。ブタパルボウ
イルスでのこのような結果はエンベロープを持たない化
学処理に耐性のウイルスにも紫外線照射が効果的である
ことの証明となり、ポリオウイルス、シンドビスウイル
スについての上記の失活についても製剤の製造工程に混
入したウイルスを完全に不活化するに十分な結果であ
る。以上のことから、本願発明の紫外線照射処理は、血
液凝固第VII因子、活性型第VII因子、もしくは第IX因子
の活性を保持しつつ、ウイルス感染の危険性を十分に排
除し得る条件であると結論できる。
ルボウイルスに対し、６０２ergs／mm2という紫外線量
においても、感染性の消失が確認された。ブタパルボウ
イルスでのこのような結果はエンベロープを持たない化
学処理に耐性のウイルスにも紫外線照射が効果的である
ことの証明となり、ポリオウイルス、シンドビスウイル
スについての上記の失活についても製剤の製造工程に混
入したウイルスを完全に不活化するに十分な結果であ
る。以上のことから、本願発明の紫外線照射処理は、血
液凝固第VII因子、活性型第VII因子、もしくは第IX因子
の活性を保持しつつ、ウイルス感染の危険性を十分に排
除し得る条件であると結論できる。
【００１５】
【発明の作用並びに効果】本発明は高純度の血液凝固因
子に対して紫外線を照射するため、血漿段階で照射する
のと比較してタンパク濃度が６〜６００分の１と低いた
め、紫外線の透過効率が良く、少量の紫外線の照射で効
率良くウイルスの失活が起こる。さらに、紫外線量を低
く抑えていることで凝固因子に対するダメージが抑えら
れ、活性の失活を低く抑えることができる。また、血漿
段階での紫外線照射と比較し、通常２〜３段階のクロマ
トグラフィー工程を経ているため、混入するウイルス粒
子数も圧倒的に少なく、より完全にウイルスを失活させ
ることが可能である。
子に対して紫外線を照射するため、血漿段階で照射する
のと比較してタンパク濃度が６〜６００分の１と低いた
め、紫外線の透過効率が良く、少量の紫外線の照射で効
率良くウイルスの失活が起こる。さらに、紫外線量を低
く抑えていることで凝固因子に対するダメージが抑えら
れ、活性の失活を低く抑えることができる。また、血漿
段階での紫外線照射と比較し、通常２〜３段階のクロマ
トグラフィー工程を経ているため、混入するウイルス粒
子数も圧倒的に少なく、より完全にウイルスを失活させ
ることが可能である。
【００１６】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に
説明するが、本発明はこれらの例に何等限定されるもの
ではない。
説明するが、本発明はこれらの例に何等限定されるもの
ではない。
【００１７】
【実施例】調製例１ (血液凝固第VII因子の調製)本発明に用いられる第VII因
子は、George J.Broze等の方法に準じて調製した(Ｊ.Ｂ
ｉｏｌ.Ｃｈｅｍ. 255 ｐ.1242-1247(1980))。すなわ
ち、ヒト血漿を出発原料として、ビタミンＫ依存性の凝
固因子をバリウムに吸着させ、さらにQAE-Sephadex(製
品名: ファルマシア社)を用いて、プロトロンビン、第I
X因子、第Ｘ因子を除去した。次に塩化カルシウムを添
加して、再度QAE-Sephadexを用いて精製し、さらに、残
りの不純物を除去する目的でSephadex G-100(製品名:
ファルマシア社)で分離し高純度の第VII因子を得ること
ができた。この時の第VII因子の純度は比活性で１６０
０Ｕ／ｍｇであった。
子は、George J.Broze等の方法に準じて調製した(Ｊ.Ｂ
ｉｏｌ.Ｃｈｅｍ. 255 ｐ.1242-1247(1980))。すなわ
ち、ヒト血漿を出発原料として、ビタミンＫ依存性の凝
固因子をバリウムに吸着させ、さらにQAE-Sephadex(製
品名: ファルマシア社)を用いて、プロトロンビン、第I
X因子、第Ｘ因子を除去した。次に塩化カルシウムを添
加して、再度QAE-Sephadexを用いて精製し、さらに、残
りの不純物を除去する目的でSephadex G-100(製品名:
ファルマシア社)で分離し高純度の第VII因子を得ること
ができた。この時の第VII因子の純度は比活性で１６０
０Ｕ／ｍｇであった。
【００１８】調製例２ (血液凝固第IX因子の調製)本発明に用いられる第IX因子
は、Y.Akimoto等の方法によって調製した(Production a
nd Properties of Immunoaffinity Purified FactorIX;
Proc. 6th. ISHTTokyo, Japan 1990 ｐ.117-130)。ま
ず、クリオプレシピテートの上清から、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーによりＰＣＣを回収し、さらに高純度
の第IX因子を得る為、モノクローナル抗体を用いたイム
ノアフィニティークロマトグラフィーを行なった。こう
して得られた第IX因子の純度は比活性で２００Ｕ／ｍｇ
であった。
は、Y.Akimoto等の方法によって調製した(Production a
nd Properties of Immunoaffinity Purified FactorIX;
Proc. 6th. ISHTTokyo, Japan 1990 ｐ.117-130)。ま
ず、クリオプレシピテートの上清から、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーによりＰＣＣを回収し、さらに高純度
の第IX因子を得る為、モノクローナル抗体を用いたイム
ノアフィニティークロマトグラフィーを行なった。こう
して得られた第IX因子の純度は比活性で２００Ｕ／ｍｇ
であった。
【００１９】実施例１ (紫外線照射による凝固因子の活性変化)調製例１及び２
で得られた血液凝固第VIIもしくは第IX因子を各々２５
０Ｕ／ｍｌ、９２０Ｕ／ｍｌの濃度で含有する溶液(ク
エン酸緩衝液、ｐＨ７.４)各々に対して、被照射液が貫
流する円筒(直径７cm、高さ７２cm)並びに紫外線管を備
えた円筒回転貫流型紫外線放出-照射装置(J.J. DILL CO
MPANY社製: Chemical insecticides equipment)を用い
て、紫外線照射を行ない、溶液中の凝固因子の活性変化
を検討した。照射に際しては凝固因子の失活を防ぐた
め、１０〜２５℃の温度範囲で実施できるように調整し
た。照射量については、適宜照射時間を調整し、総照射
量 ６０２ergs／mm2、１２０４ergs／mm2、１４１２erg
s／mm2の３ポイントについて実施した。凝固因子の活性
は、後述のプロトロンビン時間(ＰＴ)もしくは活性化部
分トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ)の測定に基づいて
評価し、紫外線照射前の活性を１００％とした場合の結
果を表１に示す。
で得られた血液凝固第VIIもしくは第IX因子を各々２５
０Ｕ／ｍｌ、９２０Ｕ／ｍｌの濃度で含有する溶液(ク
エン酸緩衝液、ｐＨ７.４)各々に対して、被照射液が貫
流する円筒(直径７cm、高さ７２cm)並びに紫外線管を備
えた円筒回転貫流型紫外線放出-照射装置(J.J. DILL CO
MPANY社製: Chemical insecticides equipment)を用い
て、紫外線照射を行ない、溶液中の凝固因子の活性変化
を検討した。照射に際しては凝固因子の失活を防ぐた
め、１０〜２５℃の温度範囲で実施できるように調整し
た。照射量については、適宜照射時間を調整し、総照射
量 ６０２ergs／mm2、１２０４ergs／mm2、１４１２erg
s／mm2の３ポイントについて実施した。凝固因子の活性
は、後述のプロトロンビン時間(ＰＴ)もしくは活性化部
分トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ)の測定に基づいて
評価し、紫外線照射前の活性を１００％とした場合の結
果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】従来の紫外線照射によるウイルス不活性化
の際の照射量の約１／１０の照射量である１２０４ergs
／mm2の紫外線照射によって、第VII因子に対しては７
８.４％、第IX因子に対しては８８.７％の活性の保持が
認められた。
の際の照射量の約１／１０の照射量である１２０４ergs
／mm2の紫外線照射によって、第VII因子に対しては７
８.４％、第IX因子に対しては８８.７％の活性の保持が
認められた。
【００２２】本発明における血液凝固因子の活性測定
は、第VII因子はプロトロンビン時間(ＰＴ(秒))、第IX
因子は活性化トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ(秒))の
測定に基づく以下の方法により実施した(Owren,P.A.,Sc
and.J.Clin.Lab.Invest.,1,p.81-83,(1949):Rapaport,
S.I., et al.,New Engl.J.Med.,267, p.125-130(196
2))。 (操作法)第VII因子活性の測定は被検試料をベロナール
緩衝液で希釈し、次に第VII因子欠乏血漿と混合し、２
分間３７℃でインキュベート後、ＰＴ測定用トロンボプ
ラスチンＣ(国際試薬社製)を添加して反応を開始し、凝
固するまでの時間を測定した。第IX因子の活性測定は、
被検試料をベロナール緩衝液で希釈し、第IX因子欠乏血
漿、ＡＰＴＴ試薬(アクチン:国際試薬社製)と混合し、
３分間３７℃でインキュベート後、塩化カルシウムを添
加して反応を開始し、凝固するまでの時間を測定した。 (活性の計算)正常ヒト血漿をコントロールとし希釈倍率
を変えてＰＴ、並びにＡＰＴＴを測定し、それを基に検
量線を作成し、被検試料の活性を算出した。活性単位は
正常人の血中濃度の第VII、第IX因子の活性を１単位と
する。
は、第VII因子はプロトロンビン時間(ＰＴ(秒))、第IX
因子は活性化トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ(秒))の
測定に基づく以下の方法により実施した(Owren,P.A.,Sc
and.J.Clin.Lab.Invest.,1,p.81-83,(1949):Rapaport,
S.I., et al.,New Engl.J.Med.,267, p.125-130(196
2))。 (操作法)第VII因子活性の測定は被検試料をベロナール
緩衝液で希釈し、次に第VII因子欠乏血漿と混合し、２
分間３７℃でインキュベート後、ＰＴ測定用トロンボプ
ラスチンＣ(国際試薬社製)を添加して反応を開始し、凝
固するまでの時間を測定した。第IX因子の活性測定は、
被検試料をベロナール緩衝液で希釈し、第IX因子欠乏血
漿、ＡＰＴＴ試薬(アクチン:国際試薬社製)と混合し、
３分間３７℃でインキュベート後、塩化カルシウムを添
加して反応を開始し、凝固するまでの時間を測定した。 (活性の計算)正常ヒト血漿をコントロールとし希釈倍率
を変えてＰＴ、並びにＡＰＴＴを測定し、それを基に検
量線を作成し、被検試料の活性を算出した。活性単位は
正常人の血中濃度の第VII、第IX因子の活性を１単位と
する。
【００２３】実施例２ (紫外線照射による凝固因子存在下でのウイルス不活性
化)実施例１で使用した凝固第VII、第IX因子を含有する
溶液の各々に、ブタパルボウイルス、ポリオウイルス及
びシンドビスウイルスをそれぞれ最終感染価１０5.5、
１０5.8及び１０5.5ＴＣＩＤ50／ｍｌとなるように含有
させ、実施例１と同様にいくつかの紫外線照射量におけ
る溶液中のウイルスの不活性化効果を検討した。 ウイ
ルスの不活性化はブタパルボウイルスに対してＥＳＫ細
胞、ポリオウイルス並びにシンドビスウイルスに対して
Ｖｅｒｏ細胞を使用した感染価(ＴＣＩＤ50)を測定する
ことによって評価した。結果を図１〜図３に示す。実施
例１によって明らかとなった第VII因子に対して約８０
％、第IX因子に対して約９０％の活性の保持が認められ
る１２０４ergs／mm2の紫外線照射によって、ＴＣＩＤ
50でブタパルボウイルスは１０5以上、ポリオウイルス
は１０4.5以上、シンドビスウイルスは１０4.2以上の不
活化効果が確認された。
化)実施例１で使用した凝固第VII、第IX因子を含有する
溶液の各々に、ブタパルボウイルス、ポリオウイルス及
びシンドビスウイルスをそれぞれ最終感染価１０5.5、
１０5.8及び１０5.5ＴＣＩＤ50／ｍｌとなるように含有
させ、実施例１と同様にいくつかの紫外線照射量におけ
る溶液中のウイルスの不活性化効果を検討した。 ウイ
ルスの不活性化はブタパルボウイルスに対してＥＳＫ細
胞、ポリオウイルス並びにシンドビスウイルスに対して
Ｖｅｒｏ細胞を使用した感染価(ＴＣＩＤ50)を測定する
ことによって評価した。結果を図１〜図３に示す。実施
例１によって明らかとなった第VII因子に対して約８０
％、第IX因子に対して約９０％の活性の保持が認められ
る１２０４ergs／mm2の紫外線照射によって、ＴＣＩＤ
50でブタパルボウイルスは１０5以上、ポリオウイルス
は１０4.5以上、シンドビスウイルスは１０4.2以上の不
活化効果が確認された。
【００２４】ウイルス感染価の測定は以下の操作により
実施した。ブタパルボウイルスの感染価測定に際して、
先ず、ＥＳＫ細胞をＵ底フラスコ(Ｎｕｎｃ社製)に蒔
き、被検試料をEagle ＭＥＭ培地で１０0〜１０7まで希
釈してフラスコのｗｅｌｌ中に添加した。５日間、３７
℃で培養した後、培地を交換してさらに５日間培養を続
けた。培養終了後、０.５％のニワトリ血球を０.１ｍｌ
／ｗｅｌｌ添加し、室温で１.５〜２.０時間靜置後、凝
集反応を観察して５０％感染価を判定した。
実施した。ブタパルボウイルスの感染価測定に際して、
先ず、ＥＳＫ細胞をＵ底フラスコ(Ｎｕｎｃ社製)に蒔
き、被検試料をEagle ＭＥＭ培地で１０0〜１０7まで希
釈してフラスコのｗｅｌｌ中に添加した。５日間、３７
℃で培養した後、培地を交換してさらに５日間培養を続
けた。培養終了後、０.５％のニワトリ血球を０.１ｍｌ
／ｗｅｌｌ添加し、室温で１.５〜２.０時間靜置後、凝
集反応を観察して５０％感染価を判定した。
【００２５】ポリオウイルス並びにシンドビスウイルス
の感染価測定に際しては、Ｖｅｒｏ細胞をＭＥＭ培地中
で平底フラスコ(Ｎｕｎｃ社製)で培養し、培養後、培地
を除去して細胞表面をリン酸緩衝液で洗浄した。被検試
料をＭＥＭ培地で１０0〜１０7まで希釈してフラスコの
ｗｅｌｌ中に添加した。３日間、３７℃で培養した後、
細胞の形態変化を指標として感染価を判定した。
の感染価測定に際しては、Ｖｅｒｏ細胞をＭＥＭ培地中
で平底フラスコ(Ｎｕｎｃ社製)で培養し、培養後、培地
を除去して細胞表面をリン酸緩衝液で洗浄した。被検試
料をＭＥＭ培地で１０0〜１０7まで希釈してフラスコの
ｗｅｌｌ中に添加した。３日間、３７℃で培養した後、
細胞の形態変化を指標として感染価を判定した。
【図１】 紫外線照射による、凝固因子存在下でのブタ
パルボウイルスの不活性化を示す図である。
パルボウイルスの不活性化を示す図である。
【図２】 紫外線照射による、凝固因子存在下でのポリ
オウイルスの不活性化を示す図である。
オウイルスの不活性化を示す図である。
【図３】 紫外線照射による、凝固因子存在下でのシン
ドビスウイルスの不活性化を示す図である。
ドビスウイルスの不活性化を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 精製した血液凝固因子を含有する溶液に
対して、実質的に紫外線を照射する処理よりなる感染性
夾雑ウイルス不活化法。 - 【請求項２】 該血液凝固因子が、血液凝固第VII因
子、活性型血液凝固第VII因子もしくは血液凝固第IX因
子である請求項１記載の感染性夾雑ウイルス不活化法。 - 【請求項３】 紫外線総照射量が９００〜１５００ergs
／mm2の範囲にある請求項１または２に記載の感染性夾
雑ウイルス不活化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5350153A JPH07196531A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 血液凝固因子の感染性夾雑ウイルス不活化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5350153A JPH07196531A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 血液凝固因子の感染性夾雑ウイルス不活化法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07196531A true JPH07196531A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=18408590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5350153A Pending JPH07196531A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 血液凝固因子の感染性夾雑ウイルス不活化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07196531A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6190608B1 (en) * | 1995-07-14 | 2001-02-20 | Croix-Rouge De Beligique Departement Central De Fractionnement | Method and apparatus for inactivating contaminants in blood products |
| JP2013529897A (ja) * | 2010-05-03 | 2013-07-25 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 新規な方法 |
| CN104073477A (zh) * | 2013-03-29 | 2014-10-01 | 宿松县春润食品有限公司 | 一种低成本、工业化分离猪凝血酶原的方法 |
| US8986607B2 (en) | 2003-02-27 | 2015-03-24 | Baxter International Inc. | Method for the validatable inactivation of pathogens in a biological fluid by irradiation |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP5350153A patent/JPH07196531A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6190608B1 (en) * | 1995-07-14 | 2001-02-20 | Croix-Rouge De Beligique Departement Central De Fractionnement | Method and apparatus for inactivating contaminants in blood products |
| US6833108B2 (en) | 1995-07-14 | 2004-12-21 | Department Central De Fractionnement De La Croix-Rouge Scrl | Method and apparatus for inactivating contaminants in blood products |
| US8986607B2 (en) | 2003-02-27 | 2015-03-24 | Baxter International Inc. | Method for the validatable inactivation of pathogens in a biological fluid by irradiation |
| JP2013529897A (ja) * | 2010-05-03 | 2013-07-25 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 新規な方法 |
| CN104073477A (zh) * | 2013-03-29 | 2014-10-01 | 宿松县春润食品有限公司 | 一种低成本、工业化分离猪凝血酶原的方法 |
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|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040817 |
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| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041018 |
|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20041221 |