JP3735137B2 - 生物学的活性なタンパク質の溶液における殺ウイルス剤としてのアゾールの使用 - Google Patents
生物学的活性なタンパク質の溶液における殺ウイルス剤としてのアゾールの使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3735137B2 JP3735137B2 JP10784395A JP10784395A JP3735137B2 JP 3735137 B2 JP3735137 B2 JP 3735137B2 JP 10784395 A JP10784395 A JP 10784395A JP 10784395 A JP10784395 A JP 10784395A JP 3735137 B2 JP3735137 B2 JP 3735137B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- virus
- protein
- imidazole
- biologically active
- azole
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
- A61L2/0082—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using chemical substances
- A61L2/0088—Liquid substances
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12061—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2720/12063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20261—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2760/20263—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32661—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/32663—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Apparatus For Disinfection Or Sterilisation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、一般に、生物学的に活性なタンパク質の溶液でウイルスを不活化する方法、特に、生物学的に活性な治療用タンパク質の水溶液でウイルスを不活化するためのアゾールの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
治療用製品によるウイルスの感染性を除くことの重要性は、長い間認識されて来た。このことは、ヒト血液から、または最近では、バイオテクノロジーの生産物（例えば、組み換えＤＮＡ生産物およびモノクローナル抗体）を作製するのに使用される細胞培養物から得られる生物学的に活性な製品の場合に、特にあてはまる。
【０００３】
生物学的に活性なタンパク質に対する殺ウイルス剤を考える上で、主要な目標は、そのタンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼさずに、完全な殺ウイルス作用を確保することである。これらの目標達成には、タンパク質自体、その活性および／または活性部位の性質、殺ウイルス剤、その重要性および／または使用後の除去の容易さのような変化要因、そして時間、温度および濃度のような処理自体の変化要因、の考慮を必要とする。
【０００４】
熱処理単独でも、ある種のタンパク質の殺ウイルス処理に使用できる（例えば、６０℃における低温殺菌）。しかしながら、多くの場合、熱のみを使用する時には生物学的活性またはユーティリティーの損失を避けることは困難である。
【０００５】
熱単独の使用によるある種の不利益もしくは活性損失を避けるために、種々の化学薬剤が、生物学的に活性なタンパク質の殺ウイルス剤として、使用され、また提案されてきた。例えば、特定の条件下でのアルコールの使用について開示しているG.Dove, M. Dobkin and M. Shearerに対する米国特許第５，０７１，６５０号を参照のこと。
【０００６】
ウイルスワクチンの調製に関して、そしてごく最近では、ヒト血漿から得られる生物学的製剤の調製における内在性ウイルスの不活化に関して、爆発性のない有機溶媒／界面活性剤混合液を利用することは、使用条件（例えば、ｐＨ）によって限定されてきた。中性ｐＨにおいて生物学的に活性なタンパク質とともに使用される一つの殺ウイルス性化合物は、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴＮＢＰ）である。例えば、脂質エンベロープウイルスを不活化するためにＴＮＢＰの使用について開示しているA. Neurath and B. Horowitzに対する米国特許第４，５４０，５７３号を参照されたい。また、調節されたｐＨ、伝導率およびタンパク質濃度の下で、殺ウイルス剤としてＴＮＢＰの使用を開示しているG.Tsayに対する米国特許第５，１１０，９１０号を参照されたい。不幸にも、今日の殺ウイルス剤は、主として、脂質エンベロープウイルスを特異的に不活化するが、脂質エンベロープを欠くｈａｒｄｉｅｒ ｃｌａｓｓのウイルスに対して有効性を、示さなかった。
【０００７】
種々のアゾール化合物は、殺真菌剤として使用されてきたが、生物学的に活性なタンパク質の溶液において、特に脂質を含まないウイルスに対する殺ウイルス剤として、それらを使用するという示唆については、何も知られていない。本発明者らは、アゾール類が、免疫グロブリンのようなタンパク質の生物学的活性を維持しながら、水溶液中でエンベロープおよび非エンベロープウイルスの両方を不活化する独特の能力を備えていることを初めて見出だした。本方法の詳細は、以下に記述される。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
生物学的に活性な、治療用タンパク質の水溶液中のエンベロープおよび非エンベロープウイルスの両方を不活化する本方法は、前記タンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼすことなしに（すなわち、活性の回収率が５０％を超える）、両種類のウイルスの実質的な減少（各種類について対数２ないしそれ以上のウイルス力価の減少）を保証するに十分な条件下で、その溶液を、アゾールと接触させることを含んでなる。殺ウイルス活性は、界面活性剤の存在によって向上させることができる。不活化に寄与する主要な官能基は、５員のアゾール環であり、この環は、環についての変化または環に結合される付加的な官能基によって修飾することができる。好適なアゾールは、好ましくは、後述されるように界面活性剤とともに使用されるイミダゾールである。
【０００９】
【具体的な態様】
アゾール類は、以下に例示するように、エンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスの両者に対して殺ウイルス活性を示すことが発見された。本明細書で使用される場合、用語アゾールまたはアゾール類似体もしくはアゾール誘導体は、５員のアゾール環を有し、治療用タンパク質のような興味あるタンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼさない温度、ｐＨおよび濃度の条件下で、殺ウイルス活性をもつ化合物を意味する。
【００１０】
材料および方法
化学薬剤
使用されるアゾールは、イミダゾール、α−アミノ−１Ｈ−イミダゾール−４−プロパン酸（ヒスチジン）、２−イミダゾリジノン（エチレン尿素）、１Ｈ−イミダゾール−４−エタンアミン（Ｉ４ＥＡ）であった。アゾール、界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、およびバッファー塩は、試薬級であり、Sigma Chemicals, St. Louis, Mo. から得た。
【００１１】
ウイルス
エンベロープウイルス：
Finnish Red Crossから得た水泡性口内炎ウイルス[Vesicular stomatitis virus（ＶＳＶ）］、Ｉｎｄｉａｎａ株は、ラブドウイルス（ＲＮＡ）である。ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、Ｌｅｄｅｒｌｅ株、ＡＴＣＣ ＶＲ−１１８は、ポックスウイルス（ＤＮＡ）]である。シンドビス(Sindbis)は、トガウイルス[Togavirus（ＲＮＡ）]である。単純ヘルペスウイルス１型[Herpes Simplex virus type 1（ＨＳＶ−１）]は、ヘルペスウイルス（ＤＮＡ）である。
【００１２】
非エンベロープウイルス：
脳心筋炎ウイルス[Encephalomyocaritis virus（ＥＭＣ）]は、ネズミ・ピコルナウイルス（ＲＮＡ）である。ポリオウイルス２型は、ヒト・ピコルナウイルス（ＲＮＡ）である。レオウイルス３型(Reovirus type ３)は、レオウイルス（ＲＮＡ）である。ウイルスの誘導は、以前に報告された（Lembach, et al., Current Studies in Hematology and Blood Transfusion. Basel, Karger, 1989; 56:97-108，参照）。
【００１３】
ウイルス検定
シンドビスを除く全てのウイルスは、２４穴プレートにおいて生育されたＶＥＲＯ細胞のモノレアー上で、希釈当たり４穴を用いて標準条件下で力価測定された。力価は、１ｍＬ当たり５０％エンドポイント（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）として組織培養感染用量で表示される。シンドビスウイルスは、細胞変性効果を評価する標準条件下で、ＢＨＫ−２１細胞のモノレアーに対して同様の方法で力価測定された。
【００１４】
タンパク質
血友病患者に投与される凝固因子であるＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、懸濁培養で生育される組み換え新生児ハムスター腎細胞から得られた。この組み換えＦＶＩＩＩ産物（ｒＦＶＩＩＩ）は、D.J. Capon, et al.名義の欧州特許第１６０，４５７号に記載されている。
【００１５】
クラスＧのモノクローナル抗体（ヒト）（ｍ−ＩｇＧ、抗腫瘍壊死因子、細胞系ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９７３６は、懸濁培養で生育されるエプスタイン・バールウイルスで形質転換されたヒトＢリンパ球から得られた。ＩｇＧは、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによって９８％を超えるまで精製された。これらの抗体は、H. Kuo名義の欧州特許第３５１，７８９号に記載されている。
【００１６】
フィブリノーゲンは、Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法によってヒト血漿から精製された（画分Ｖ）。例えば、Cohn, E.J., L.E. Strong, W.L. Hughes, D.J.Mulford, J.N. Ashworth, M. Melin and H.L. Taylor. “Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins. IV. A System for the Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids." J. Am. Chem. Soc. 68, 459 (1946)参照のこと。
【００１７】
タンパク質回収率は、Ａ２８０、放射状免疫拡散法およびＦＰＬＣ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（Pharmacia fast proten liquid chromatography by size exclusion）によって評価された。ＦＶＩＩＩは、活性化された部分トロンボプラスチン凝固時間（ＡＰＴＴ）に基づくＬａｎｇｄｅｌｌの変法（Langdell, R.D., Wagner, R.H., Brinkhouse, A. “Effect of anti-hemophiliac Facter on One-Stage clotting Test," J. Lab. Clin. Med. 41: 637-647, 1953）によって検定された。
【００１８】
処理プロトコール
タンパク質溶液には、ウイルスを含む培地の影響を最小にするために、保存ウイルスの１／１００希釈が接種された。アゾール溶液の一定容量を添加して最終要求濃度とした。処理および対照サンプルは、特定の条件（時間、温度）下で断続的なゆっくりした撹拌によりインキュベートされた。サンプルは、適当な間隔で採取され、直ちに、残存感染性ウイルスの力価が測定された。
【００１９】
結果
研究は、殺ウイルス活性を示すアゾールの種類を決定するために実施された。表１に見られるように、多種多用なアゾールが、ＶＳＶ力価を減少させるのに有効である。ウイルスを不活化する主要な官能基は、５員のアゾール環であり、この環は、環についての変化または環に結合された付加的な官能基によって修飾されていてもよい。
【００２０】
【表１】
【００２１】
研究は、アゾールによる不活化に感受性のウイルス型を決定するために実施された。表２には、種々のエンベロープおよび非エンベロープウイルスについて、実質的なウイルスの減少（対数２以上の減少）を起こすのに必要な条件を挙げる。
【００２２】
【表２】
【００２３】
界面活性剤は、殺ウイルス活性を高めることもある。表３には、活性を増加するか、またはその作用を欠如する特定の条件を現す数例を挙げる。
【００２４】
【表３】
【００２５】
水溶液中の種々のタンパク質は、アゾールでの処理によって実質的に影響を受けない。回収率は、そのタンパク質に因り異なる。例えば、ＦＶＩＩＩは、非常に大きく不安定なタンパク質である。活性の損失なしに実質的なウイルスの不活化を起こす条件は普遍的ではない。表４は、ＦＶＩＩＩに関する動力学を定義する。
【００２６】
【表４】
【００２７】
イミダゾールの作用について次のように解することができる：
各ビリオンは、多数のタンパク質サブユニットのクラスターをもつタンパク質コートからなる。サブユニットは、溶液中では金属イオンによって安定化され、その金属濃度が低下する時には解離することもある。タンパク質サブユニットの金属イオンへの結合は、ヒスチジンのような残基の電子供与側鎖によって促進される。複合体は、金属イオンと、タンパク質におけるヒスチジン残基のイミダゾール環からのε−窒素との間で形成される。ウイルスを含む溶液においては、遊離のイミダゾールは、タンパク質サブユニットのイミダゾールと競合する。金属イオンが、遊離のイミダゾールと結合するので、そのタンパク質サブユニットは、不安定になり、ウイルスコートが開かれ、その結果ビリオンのもとの構造が破壊する。その現象は、また、溶液中のタンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ）の濃度に依存し、さらに、溶液中のイミダゾールが、タンパク質のイミダゾールと競合するということを支持する。
【００２８】
上記開示があれば、種々の改変が、当業者によって生じるであろうと考えられる。したがって、上記実施例は、例示として解釈されるべきである。
【００２９】
本発明の特徴および態様は以下のとおりである。
【００３０】
１． 治療用の生物学的に活性なタンパク質に実質的な逆効果を及ぼすことなしに、実質的なウイルスの不活化を起こすのに十分な条件下で、前記タンパク質の水性溶液を、アゾールと接触させる段階を含んでなる、前記タンパク質溶液中のウイルスの不活化方法。
【００３１】
２． 該アゾールが、イミダゾール、ヒスチジン、２−イミダゾリジノン、１Ｈ−イミダゾール−４−エタンアミンからなる群より選ばれる、第１項の方法。
３． 該アゾールが、イミダゾールである、第２項の方法。
【００３２】
４． 該アゾールが、イミダゾールの同族体である、第３項の方法。
【００３３】
５． 界面活性剤を含有する付加的段階を含む、第１項の方法。
【００３４】
６． 該界面活性剤が、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００である、第５項の方法。
【００３５】
７． 該タンパク質が、凝固因子および抗体からなる群より選ばれる、第１項の方法。
【００３６】
８． ウイルスの減少が、少なくとも対数２である、第１項の方法。
【００３７】
９． 該タンパク質の生物学的活性の回収率が、５０％を超える、第１項の方法。
【産業上の利用分野】
本発明は、一般に、生物学的に活性なタンパク質の溶液でウイルスを不活化する方法、特に、生物学的に活性な治療用タンパク質の水溶液でウイルスを不活化するためのアゾールの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
治療用製品によるウイルスの感染性を除くことの重要性は、長い間認識されて来た。このことは、ヒト血液から、または最近では、バイオテクノロジーの生産物（例えば、組み換えＤＮＡ生産物およびモノクローナル抗体）を作製するのに使用される細胞培養物から得られる生物学的に活性な製品の場合に、特にあてはまる。
【０００３】
生物学的に活性なタンパク質に対する殺ウイルス剤を考える上で、主要な目標は、そのタンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼさずに、完全な殺ウイルス作用を確保することである。これらの目標達成には、タンパク質自体、その活性および／または活性部位の性質、殺ウイルス剤、その重要性および／または使用後の除去の容易さのような変化要因、そして時間、温度および濃度のような処理自体の変化要因、の考慮を必要とする。
【０００４】
熱処理単独でも、ある種のタンパク質の殺ウイルス処理に使用できる（例えば、６０℃における低温殺菌）。しかしながら、多くの場合、熱のみを使用する時には生物学的活性またはユーティリティーの損失を避けることは困難である。
【０００５】
熱単独の使用によるある種の不利益もしくは活性損失を避けるために、種々の化学薬剤が、生物学的に活性なタンパク質の殺ウイルス剤として、使用され、また提案されてきた。例えば、特定の条件下でのアルコールの使用について開示しているG.Dove, M. Dobkin and M. Shearerに対する米国特許第５，０７１，６５０号を参照のこと。
【０００６】
ウイルスワクチンの調製に関して、そしてごく最近では、ヒト血漿から得られる生物学的製剤の調製における内在性ウイルスの不活化に関して、爆発性のない有機溶媒／界面活性剤混合液を利用することは、使用条件（例えば、ｐＨ）によって限定されてきた。中性ｐＨにおいて生物学的に活性なタンパク質とともに使用される一つの殺ウイルス性化合物は、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴＮＢＰ）である。例えば、脂質エンベロープウイルスを不活化するためにＴＮＢＰの使用について開示しているA. Neurath and B. Horowitzに対する米国特許第４，５４０，５７３号を参照されたい。また、調節されたｐＨ、伝導率およびタンパク質濃度の下で、殺ウイルス剤としてＴＮＢＰの使用を開示しているG.Tsayに対する米国特許第５，１１０，９１０号を参照されたい。不幸にも、今日の殺ウイルス剤は、主として、脂質エンベロープウイルスを特異的に不活化するが、脂質エンベロープを欠くｈａｒｄｉｅｒ ｃｌａｓｓのウイルスに対して有効性を、示さなかった。
【０００７】
種々のアゾール化合物は、殺真菌剤として使用されてきたが、生物学的に活性なタンパク質の溶液において、特に脂質を含まないウイルスに対する殺ウイルス剤として、それらを使用するという示唆については、何も知られていない。本発明者らは、アゾール類が、免疫グロブリンのようなタンパク質の生物学的活性を維持しながら、水溶液中でエンベロープおよび非エンベロープウイルスの両方を不活化する独特の能力を備えていることを初めて見出だした。本方法の詳細は、以下に記述される。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
生物学的に活性な、治療用タンパク質の水溶液中のエンベロープおよび非エンベロープウイルスの両方を不活化する本方法は、前記タンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼすことなしに（すなわち、活性の回収率が５０％を超える）、両種類のウイルスの実質的な減少（各種類について対数２ないしそれ以上のウイルス力価の減少）を保証するに十分な条件下で、その溶液を、アゾールと接触させることを含んでなる。殺ウイルス活性は、界面活性剤の存在によって向上させることができる。不活化に寄与する主要な官能基は、５員のアゾール環であり、この環は、環についての変化または環に結合される付加的な官能基によって修飾することができる。好適なアゾールは、好ましくは、後述されるように界面活性剤とともに使用されるイミダゾールである。
【０００９】
【具体的な態様】
アゾール類は、以下に例示するように、エンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスの両者に対して殺ウイルス活性を示すことが発見された。本明細書で使用される場合、用語アゾールまたはアゾール類似体もしくはアゾール誘導体は、５員のアゾール環を有し、治療用タンパク質のような興味あるタンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼさない温度、ｐＨおよび濃度の条件下で、殺ウイルス活性をもつ化合物を意味する。
【００１０】
材料および方法
化学薬剤
使用されるアゾールは、イミダゾール、α−アミノ−１Ｈ−イミダゾール−４−プロパン酸（ヒスチジン）、２−イミダゾリジノン（エチレン尿素）、１Ｈ−イミダゾール−４−エタンアミン（Ｉ４ＥＡ）であった。アゾール、界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、およびバッファー塩は、試薬級であり、Sigma Chemicals, St. Louis, Mo. から得た。
【００１１】
ウイルス
エンベロープウイルス：
Finnish Red Crossから得た水泡性口内炎ウイルス[Vesicular stomatitis virus（ＶＳＶ）］、Ｉｎｄｉａｎａ株は、ラブドウイルス（ＲＮＡ）である。ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、Ｌｅｄｅｒｌｅ株、ＡＴＣＣ ＶＲ−１１８は、ポックスウイルス（ＤＮＡ）]である。シンドビス(Sindbis)は、トガウイルス[Togavirus（ＲＮＡ）]である。単純ヘルペスウイルス１型[Herpes Simplex virus type 1（ＨＳＶ−１）]は、ヘルペスウイルス（ＤＮＡ）である。
【００１２】
非エンベロープウイルス：
脳心筋炎ウイルス[Encephalomyocaritis virus（ＥＭＣ）]は、ネズミ・ピコルナウイルス（ＲＮＡ）である。ポリオウイルス２型は、ヒト・ピコルナウイルス（ＲＮＡ）である。レオウイルス３型(Reovirus type ３)は、レオウイルス（ＲＮＡ）である。ウイルスの誘導は、以前に報告された（Lembach, et al., Current Studies in Hematology and Blood Transfusion. Basel, Karger, 1989; 56:97-108，参照）。
【００１３】
ウイルス検定
シンドビスを除く全てのウイルスは、２４穴プレートにおいて生育されたＶＥＲＯ細胞のモノレアー上で、希釈当たり４穴を用いて標準条件下で力価測定された。力価は、１ｍＬ当たり５０％エンドポイント（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）として組織培養感染用量で表示される。シンドビスウイルスは、細胞変性効果を評価する標準条件下で、ＢＨＫ−２１細胞のモノレアーに対して同様の方法で力価測定された。
【００１４】
タンパク質
血友病患者に投与される凝固因子であるＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、懸濁培養で生育される組み換え新生児ハムスター腎細胞から得られた。この組み換えＦＶＩＩＩ産物（ｒＦＶＩＩＩ）は、D.J. Capon, et al.名義の欧州特許第１６０，４５７号に記載されている。
【００１５】
クラスＧのモノクローナル抗体（ヒト）（ｍ−ＩｇＧ、抗腫瘍壊死因子、細胞系ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９７３６は、懸濁培養で生育されるエプスタイン・バールウイルスで形質転換されたヒトＢリンパ球から得られた。ＩｇＧは、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによって９８％を超えるまで精製された。これらの抗体は、H. Kuo名義の欧州特許第３５１，７８９号に記載されている。
【００１６】
フィブリノーゲンは、Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法によってヒト血漿から精製された（画分Ｖ）。例えば、Cohn, E.J., L.E. Strong, W.L. Hughes, D.J.Mulford, J.N. Ashworth, M. Melin and H.L. Taylor. “Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins. IV. A System for the Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids." J. Am. Chem. Soc. 68, 459 (1946)参照のこと。
【００１７】
タンパク質回収率は、Ａ２８０、放射状免疫拡散法およびＦＰＬＣ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（Pharmacia fast proten liquid chromatography by size exclusion）によって評価された。ＦＶＩＩＩは、活性化された部分トロンボプラスチン凝固時間（ＡＰＴＴ）に基づくＬａｎｇｄｅｌｌの変法（Langdell, R.D., Wagner, R.H., Brinkhouse, A. “Effect of anti-hemophiliac Facter on One-Stage clotting Test," J. Lab. Clin. Med. 41: 637-647, 1953）によって検定された。
【００１８】
処理プロトコール
タンパク質溶液には、ウイルスを含む培地の影響を最小にするために、保存ウイルスの１／１００希釈が接種された。アゾール溶液の一定容量を添加して最終要求濃度とした。処理および対照サンプルは、特定の条件（時間、温度）下で断続的なゆっくりした撹拌によりインキュベートされた。サンプルは、適当な間隔で採取され、直ちに、残存感染性ウイルスの力価が測定された。
【００１９】
結果
研究は、殺ウイルス活性を示すアゾールの種類を決定するために実施された。表１に見られるように、多種多用なアゾールが、ＶＳＶ力価を減少させるのに有効である。ウイルスを不活化する主要な官能基は、５員のアゾール環であり、この環は、環についての変化または環に結合された付加的な官能基によって修飾されていてもよい。
【００２０】
【表１】
研究は、アゾールによる不活化に感受性のウイルス型を決定するために実施された。表２には、種々のエンベロープおよび非エンベロープウイルスについて、実質的なウイルスの減少（対数２以上の減少）を起こすのに必要な条件を挙げる。
【００２２】
【表２】
界面活性剤は、殺ウイルス活性を高めることもある。表３には、活性を増加するか、またはその作用を欠如する特定の条件を現す数例を挙げる。
【００２４】
【表３】
水溶液中の種々のタンパク質は、アゾールでの処理によって実質的に影響を受けない。回収率は、そのタンパク質に因り異なる。例えば、ＦＶＩＩＩは、非常に大きく不安定なタンパク質である。活性の損失なしに実質的なウイルスの不活化を起こす条件は普遍的ではない。表４は、ＦＶＩＩＩに関する動力学を定義する。
【００２６】
【表４】
イミダゾールの作用について次のように解することができる：
各ビリオンは、多数のタンパク質サブユニットのクラスターをもつタンパク質コートからなる。サブユニットは、溶液中では金属イオンによって安定化され、その金属濃度が低下する時には解離することもある。タンパク質サブユニットの金属イオンへの結合は、ヒスチジンのような残基の電子供与側鎖によって促進される。複合体は、金属イオンと、タンパク質におけるヒスチジン残基のイミダゾール環からのε−窒素との間で形成される。ウイルスを含む溶液においては、遊離のイミダゾールは、タンパク質サブユニットのイミダゾールと競合する。金属イオンが、遊離のイミダゾールと結合するので、そのタンパク質サブユニットは、不安定になり、ウイルスコートが開かれ、その結果ビリオンのもとの構造が破壊する。その現象は、また、溶液中のタンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ）の濃度に依存し、さらに、溶液中のイミダゾールが、タンパク質のイミダゾールと競合するということを支持する。
【００２８】
上記開示があれば、種々の改変が、当業者によって生じるであろうと考えられる。したがって、上記実施例は、例示として解釈されるべきである。
【００２９】
本発明の特徴および態様は以下のとおりである。
【００３０】
１． 治療用の生物学的に活性なタンパク質に実質的な逆効果を及ぼすことなしに、実質的なウイルスの不活化を起こすのに十分な条件下で、前記タンパク質の水性溶液を、アゾールと接触させる段階を含んでなる、前記タンパク質溶液中のウイルスの不活化方法。
【００３１】
２． 該アゾールが、イミダゾール、ヒスチジン、２−イミダゾリジノン、１Ｈ−イミダゾール−４−エタンアミンからなる群より選ばれる、第１項の方法。
３． 該アゾールが、イミダゾールである、第２項の方法。
【００３２】
４． 該アゾールが、イミダゾールの同族体である、第３項の方法。
【００３３】
５． 界面活性剤を含有する付加的段階を含む、第１項の方法。
【００３４】
６． 該界面活性剤が、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００である、第５項の方法。
【００３５】
７． 該タンパク質が、凝固因子および抗体からなる群より選ばれる、第１項の方法。
【００３６】
８． ウイルスの減少が、少なくとも対数２である、第１項の方法。
【００３７】
９． 該タンパク質の生物学的活性の回収率が、５０％を超える、第１項の方法。
Claims (9)
- 治療用の生物学的に活性なタンパク質に実質的な悪影響を及ぼすことなしに、実質的なウイルスの不活化を起こすのに十分な条件下で、前記タンパク質のウイルス含有水性溶液を、イミダゾール、ヒスチジン、２−イミダゾリジノン、１Ｈ−イミダゾール−４−エタンアミンからなる群より選ばれるアゾールと接触させる段階を含んでなる、治療用の生物学的に活性なタンパク質のウイルス含有タンパク質水性溶液中のウイルスの不活化方法。
- アゾールが、イミダゾールである、請求項 1 記載の方法。
- 治療用の生物学的に活性なタンパク質のウイルス含有タンパク質水性溶液を、界面活性剤の存在下でアゾールと接触させる請求項 1 記載の方法。
- ウイルスの減少が、少なくとも対数２のウイルス力価およびタンパク質の生物学的活性の５０％を超える回収率をもたらす請求項 1 記載の方法。
- タンパク質が第ＶＩＩＩまたはフイブリノーゲンである請求項 1 記載の方法。
- 治療用の生物学的に活性なタンパク質に実質的な悪影響を及ぼすことなしに、実質的なウイルスの不活化を起こすのに十分な条件下で、前記タンパク質のウイルス含有水性溶液中のウイルスを不活化するための作用剤であって、イミダゾール、ヒスチジン、２−イミダゾリジノン、１Ｈ−イミダゾール−４−エタンアミンからなる群より選ばれるアゾールを含有することを特徴とする作用剤。
- アゾールがイミダゾールである請求項６記載の作用剤。
- 界面活性剤をさらに含む請求項６記載の作用剤。
- 界面活性剤がポリソルベート８０またはオクトキシノールである請求項８記載の作用剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/226,593 US5514781A (en) | 1994-04-11 | 1994-04-11 | Use of azoles as virucidal agents in solutions of biologically active proteins |
| US226593 | 1994-04-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08175908A JPH08175908A (ja) | 1996-07-09 |
| JP3735137B2 true JP3735137B2 (ja) | 2006-01-18 |
Family
ID=22849553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10784395A Expired - Lifetime JP3735137B2 (ja) | 1994-04-11 | 1995-04-10 | 生物学的活性なタンパク質の溶液における殺ウイルス剤としてのアゾールの使用 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5514781A (ja) |
| EP (1) | EP0686694B1 (ja) |
| JP (1) | JP3735137B2 (ja) |
| CN (1) | CN1129139A (ja) |
| AT (1) | ATE186567T1 (ja) |
| AU (1) | AU687153B2 (ja) |
| CA (1) | CA2144674C (ja) |
| DE (1) | DE69513226T2 (ja) |
| DK (1) | DK0686694T3 (ja) |
| ES (1) | ES2139769T3 (ja) |
| GR (1) | GR3032546T3 (ja) |
| SI (1) | SI0686694T1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1115411C (zh) * | 1998-01-26 | 2003-07-23 | 邹方霖 | 一种新型的灭活病毒的方法 |
| AUPP751298A0 (en) * | 1998-12-04 | 1999-01-07 | Csl Limited | Inactivation of non-enveloped viruses |
| CA2362927C (en) | 1999-02-22 | 2011-07-12 | University Of Connecticut | Novel albumin-free factor viii formulations |
| DE102004015007A1 (de) * | 2004-03-26 | 2005-10-13 | Bayer Healthcare Ag | Substituierte Imidazole |
| JP5779780B2 (ja) | 2008-11-07 | 2015-09-16 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ | 第ｖｉｉｉ因子製剤 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56113713A (en) * | 1980-02-14 | 1981-09-07 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Preparation of immunoglobulin with high content of monomer |
| DE3315808A1 (de) * | 1983-04-30 | 1984-10-31 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Antivirale mittel |
| US4861791A (en) * | 1983-08-29 | 1989-08-29 | Sterling Drug Inc. | Dihydro-oxazolyl substituted-phenyl-aliphatic lower alkyl and their use as antiviral agents |
| US4675385A (en) * | 1985-03-27 | 1987-06-23 | Alpha Therapeutic Corporation | Isolation of human plasma procoagulant protein factor VIII from biological factors |
| US4661493A (en) * | 1985-03-29 | 1987-04-28 | Pfizer Inc. | Tioconazole and related compounds for control of Herpes simplex virus |
| DE3511411A1 (de) * | 1985-03-29 | 1986-10-02 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | Verwendung von azolylmethyloxiranen zur bekaempfung von viralen erkrankungen |
| CA1280753C (en) * | 1985-07-02 | 1991-02-26 | Philip Michael Carabateas | Process for preparing heterocyclic substituted- phenoxyalkyl isoxazoles and-furans |
| JPS6419023A (en) * | 1987-04-21 | 1989-01-23 | Green Cross Corp | Heat treatment of fibrinogen and fibrinogen preparation |
| CA1329760C (en) * | 1987-10-29 | 1994-05-24 | Ted C. K. Lee | Plasma and recombinant protein formulations in high ionic strength media |
| US5110907A (en) * | 1989-08-01 | 1992-05-05 | Alpha Therapeutic Corporation | Factor viii complex purification using heparin affinity chromatography |
| ZA908935B (en) * | 1989-11-13 | 1991-08-28 | Merrell Dow Pharma | Prevention of glycoprotein enveloped virus infectivity by pyridinyloxazole-2-ones |
| US5110910A (en) * | 1991-03-25 | 1992-05-05 | Miles Inc. | Virucidal euglobulin precipitation |
| TW235963B (ja) * | 1992-01-16 | 1994-12-11 | Shionogi & Co | |
| US5288853A (en) * | 1992-04-30 | 1994-02-22 | Alpha Therapeutic Corporation | Factor viii purification process |
| CA2099630A1 (en) * | 1992-07-02 | 1994-01-03 | Guy Dominic Diana | Heterocyclyl-phenoxyalkyl-piperidinylpyridazines as antiviral agents |
| EP1016673B1 (en) * | 1992-10-02 | 2006-02-01 | Genetics Institute, LLC | Composition comprising coagulation factor VIII formulation, process for its preparation and use of a surfactant as stabilizer |
-
1994
- 1994-04-11 US US08/226,593 patent/US5514781A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-13 AU AU14772/95A patent/AU687153B2/en not_active Expired
- 1995-03-15 CA CA002144674A patent/CA2144674C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-29 DK DK95104636T patent/DK0686694T3/da active
- 1995-03-29 SI SI9530347T patent/SI0686694T1/xx unknown
- 1995-03-29 DE DE69513226T patent/DE69513226T2/de not_active Revoked
- 1995-03-29 EP EP95104636A patent/EP0686694B1/en not_active Revoked
- 1995-03-29 AT AT95104636T patent/ATE186567T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-03-29 ES ES95104636T patent/ES2139769T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-10 JP JP10784395A patent/JP3735137B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-10 CN CN95105157A patent/CN1129139A/zh active Pending
-
2000
- 2000-02-02 GR GR20000400242T patent/GR3032546T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2139769T3 (es) | 2000-02-16 |
| DK0686694T3 (da) | 2000-05-08 |
| CA2144674A1 (en) | 1995-10-12 |
| AU687153B2 (en) | 1998-02-19 |
| CN1129139A (zh) | 1996-08-21 |
| EP0686694B1 (en) | 1999-11-10 |
| AU1477295A (en) | 1995-10-19 |
| CA2144674C (en) | 2010-01-12 |
| DE69513226D1 (de) | 1999-12-16 |
| ATE186567T1 (de) | 1999-11-15 |
| US5514781A (en) | 1996-05-07 |
| SI0686694T1 (en) | 2000-04-30 |
| DE69513226T2 (de) | 2000-04-13 |
| JPH08175908A (ja) | 1996-07-09 |
| GR3032546T3 (en) | 2000-05-31 |
| EP0686694A1 (en) | 1995-12-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4534972A (en) | Protein compositions substantially free from infectious agents | |
| JPH06102627B2 (ja) | 脂質含有ウイルスを含まない蛋白質含有組成物及びその製造方法 | |
| JP5730211B2 (ja) | ウイルスのアルギニン不活化 | |
| US7879331B2 (en) | Ultra-high yield intravenous immune globulin preparation | |
| US5733885A (en) | Method of producing a virus-safe biological preparation | |
| JPH0578532B2 (ja) | ||
| JPS61275228A (ja) | 治療用タンパク組成物中のビ−ルスの光動的不活性化 | |
| Chandra et al. | Effectiveness of alternative treatments for reducing potential viral contaminants from plasma-derived products | |
| US4720385A (en) | Protein compositions substantially free from infectious agents | |
| KR100383467B1 (ko) | 아크리딘또는아크리딘유도체보조하의바이러스의불활성화방법 | |
| JP2506370B2 (ja) | 増殖性濾過性病原体の不活化法 | |
| RU2411959C2 (ru) | Способ получения безопасных в вирусном отношении биологических текучих сред | |
| JP3735137B2 (ja) | 生物学的活性なタンパク質の溶液における殺ウイルス剤としてのアゾールの使用 | |
| US8293242B2 (en) | Ultra-high yield of alpha-1-anti-trypsin | |
| EP0523406B1 (en) | Use of tri(n-butyl) phosphate at low pH in solutions of biologically active proteins for enhanced virucidal activity | |
| US6465170B2 (en) | Method for depleting viral and molecular pathogens in a biological material | |
| CA2293401C (en) | A method for depleting viral and molecular pathogens in a biological material | |
| Stephan | Inactivation of hepatitis viruses and HIV in plasma and plasma derivatives by treatment with b-propiolactone/UV irradiation | |
| Kim et al. | Removal and Inactivation of Viruses during Manufacture of a High Purity Antihemophilic Factor VII Concentration from Human Plasma | |
| Burnouf et al. | Strategy of virus removal/inactivation of plasma-derived products: Interest of nanofiltration as a new virus elimination method | |
| Kim et al. | Solvent/detergent inactivation and chromatographic removal of human immunodeficiency virus during the manufacturing of a high purity antihemophilic factor VIII concentrate | |
| Biesert et al. | Virus validation experiments on the production process of OCTAVI SDPlus | |
| AU726999B2 (en) | Process for reducing the concentration of viral and molecular pathogens in a biological material | |
| Willkommen | 1d Virus transmission by virus-inactivated plasma products | |
| Roberts | Virus Safety of Cell‐derived Biological Products |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050315 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20050615 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20050620 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050915 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20051018 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051021 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091028 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091028 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101028 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111028 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121028 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121028 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131028 Year of fee payment: 8 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |