DE69513226T2 - Verwendung von Azolen als Virustötende Substanzen in Lösungen von biologisch aktiven Proteinen - Google Patents
Verwendung von Azolen als Virustötende Substanzen in Lösungen von biologisch aktiven ProteinenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren in Lösungen biologisch aktiver Proteine, und zwar insbesondere unter der Verwendung von Azolen, um Viren in einer wässrigen Lösung biologisch aktiver therapeutischer Produkte zu inaktivieren.
- Die Wichtigkeit der Beseitigung viraler Infektivität in therapeutischen Produkten ist seit langem erkannt worden. Dies ist insbesondere wahr im Fall biologisch aktiver Produkte, die aus menschlichem Blut oder, seit kürzerer Zeit, aus Zellkulturen abgeleitet sind, die eingesetzt werden, um Produkte der Biotechnologie (z. B. rekombinante DNA- Produkte und monoklonale Antikörper) herzustellen.
- Bezüglich viruzider Mittel für biologisch aktive Proteine sind die Primärziele, eine vollständige viruzide Wirkung sicherzustellen, ohne die biologische Aktivität des Proteins gegenläufig zu beeinflussen. Zum Erreichen dieser Ziele bedarf es Überlegungen im Hinblick auf solche Variablen wie das Protein selbst, die Natur seiner Aktivität und/oder Aktivitätsstelle, das viruzide Mittel, die Bedeutung und/oder Leichtigkeit seiner Beseitigung nach der Verwendung und Variablen der Behandlung selbst, wie der Zeit, Temperatur und Konzentration.
- Hitzebehandlung allein kann zur viruziden Behandlung einiger Proteine angewandt werden (z. B. Pasteurisierung bei 60ºC). Allerdings ist es in einigen Fällen schwierig, einen Verlust an biologischer Aktivität oder Einsatzfähigkeit zu vermeiden, wenn Hitze alleine angewandt wird.
- Zur Vermeidung einiger der Nachteile oder von Aktivitätsverlusten, die sich aus der Anwendung von Hitze alleine ergeben, sind verschiedene chemische Mittel als viruzide Mittel für biologisch aktive Proteine verwendet oder vorgeschlagen worden. Siehe, z. B., US 5,071,650 von G. Dove, M. Dobkin und M. Shearer, worin die Verwendung von Alkoholen unter spezifischen Bedingungen offenbart ist.
- Die Anwendbarkeit nicht-explosiver organischer Lösemittel/Detergens- Mischungen zur Herstellung viraler Impfstoffe und, seit kürzerer Zeit, zur Inaktivierung endogener Viren in Zubereitungen biologischer Produkte, die aus Humanplasma abgeleitet sind, ist durch die Einsatzbedingungen (z. B. den pH-Wert) eingeschränkt geblieben. Eine viruzide Verbindung, die bei biologisch aktiven Proteinen bei neutralem pH-Wert angewandt wird, ist Trin-butylphosphat (TNBP). Siehe, z. B., US 4,540,573 von A. Neurath und B. Horowitz, worin die Anwendung von TNBP offenbart ist, um Lipid-umhüllte Viren zu inaktivieren. Siehe auch US 5,110,910 von G. Tsay, worin die Verwendung von TNBP als ein Viruzid unter gesteuerten Bedingungen des pH- Wertes, der Leitfähigkeit und Protein-Konzentration offenbart ist. Leider inaktivieren übliche Viruzide in typischer Weise hauptsächlich Lipid- umhüllte Viren und haben sich nicht als wirksam gegen eine härtere Klasse von Viren erwiesen, denen die Lipid-Umhüllungen fehlen.
- Verschiedene Azolverbindungen sind als Fungizide verwendet worden (siehe z. B. US 5,006,513 von Hector et al), es gibt jedoch weder einen Hinweis noch Vermutungen, diese als Viruzide in Lösungen biologisch aktiver Proteine, insbesondere gegen nicht-lipidhaltige Viren, zu verwenden. Es ist nun herausgefunden worden, daß Azole eine einzigartige Befähigung ergeben und bereitstellen, sowohl umhüllte als auch nicht-umhüllte Viren in wässrigen Lösungen zu inaktivieren, und zwar unter Beibehaltung der biologischen Aktivität von Proteinen wie von Immunoglobulinen. Details des entwickelten Verfahrens werden nun beschrieben.
- Das entwickelte Verfahren zur Inaktivierung von sowohl umhüllten als auch nicht-umhüllten Viren in einer wässrigen Lösung biologisch aktiver, therapeutischer Proteine umfaßt Stufen, in denen die Lösung mit einem Azol unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die hinreichen, die substantielle Verringerung beider Klassen von Viren (zwei oder mehr log- Werte an Virustiterverringerung für jede Klasse) zu gewährleisten, ohne die biologische Aktivität der Proteine gegenläufig zu beeinflussen (d. h. mehr als 50%-ige Rückgewinnung bzw. Beibehaltung der Aktivität). Die viruzide Aktivität kann durch das Vorliegen bzw. Vorhandensein von Detergentien gesteigert werden. Die primäre funktionelle Gruppe, die für die Inaktivierung verantwortlich ist, ist der pentamere Azolring, der durch Veränderungen am Ring oder durch zusätzliche funktionelle Gruppen moduliert sein kann, die an den Ring gebunden sind. Ein bevorzugtes Azol ist Imidazol, das bevorzugt mit einem Detergens angewandt wird, wie unten beschrieben.
- Azole haben sich als Substanzen erwiesen, die viruzide Aktivität mit sowohl umhüllten als auch nicht-umhüllten Viren zeigen und ergeben, wie unten dargelegt und erläutert. Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe Azol oder Azol-Analoge oder Azol-Derivate auf Verbindungen mit einem pentameren Azolring, die eine viruzide Aktivität unter den jeweiligen Bedingungen von Temperatur, pH-Wert und Konzentration aufweisen und die biologische Aktivität eines Proteins von Interesse wie eines therapeutischen Proteins nicht gegenläufig beeinflussen.
- Chemische Agentien:
- Eingesetzte Azole waren: Imidazol, α-Amino-1H-Imidazol-4-propansäure (Histidin), 2-Imidazolidinon (Ethylenharnstoff), 1H-Imidazol-4-ethanamin (I4EA). Azole, Detergentien (z. B. Polysorbat 80, Triton X-100) und Puffersalze wiesen Reagensgrad-Reinheit auf und kamen von Sigma Chemicals, St. Louis, Mo.
- Virus:
- Umhüllt:
- Vesikularer Stomatitis-Virus (VSV), Indiana-Stamm, erhalten vom Finnischen Roten Kreuz, ist ein Rhabdovirus (RNA). Vaccinia-Virus, Lederle- Stamm, ATCC VR-118, ist ein Poxvirus (DNA). Sindbis ist ein Togavirus (RNA). Herpes simplex Virus Typ 1 (HSV-1) ist ein Herpesvirus (DNA).
- Nicht-umhüllt:
- Encephalomyocarditis-Virus (EMC) ist ein Maus-Picornavirus (RNA) Poliovirus Typ 2 ist ein Human-Picornavirus (RNA)l. Reovirus Typ 3-Virus ist ein Reovirus (RNA). Über die Ableitung von Viren wurde bereits früher berichtet (siehe Lembach et al. Current Studies in Hematology and Blood Transfusion, Basel, Karger, 1989, 56: 97 bis 108).
- Virus-Assay:
- Alle Viren mit Ausnahme von Sindbis wurden unter Standard-Bedingungen auf Monoschichten von VERO-Zellen, welche in Platten mit 24 Vertiefungen gewachsen waren, unter Anwendungen von 4 Vertiefungen pro Verdünnung bezüglich des Titer festgelegt. Die Titer sind, bezogen auf Gewebekultur- infektiöse Dosismengen, als ein 50%-Endpunkt pro ml (TCID&sub5;&sub0;/ml) ausgedrückt. Sindbis-Virus wurde in ähnlicher Weise auf Monoschichten von BHK-21-Zellen unter Standard-Bedingungen unter Bewertung zytopathischer Effekte bezüglich des Titer festgelegt.
- Protein:
- Faktor VIII (F VIII), ein Koagulationsfaktor, verabreicht an Hämophile (Bluter), war aus rekombinanten Babyhamster-Nierenzellen abgeleitet, die in einer Suspensionskultur gewachsen waren. Dieses rekombinante F VIII-Produkt (rF VIII) ist in EP 160,457 im Namen von D. J. Capron et al beschrieben. Monoklonale Antikörper (vom Mensch) der Klasse G (m-IgG, anti-Tumornekrosefaktor, Zellinien ATCC-Hinterlegungsnummer HB 9736, wurden aus Epstein-Barr-Virustransformierten Human B-Lymphozyten abgeleitet, die in einer Suspensionskultur gewachsen waren. IgG wurde auf mehr als 98% durch Ionenaustausch- und Größenausschlußchromatographie gereinigt. Diese Antikörper sind in EP 351,789 im Namen von H. Kuo beschrieben.
- Fibrinogen wurde aus Humanplasma durch das Cohn-Oncley-Verfahren gereinigt. Humanserumalbumin wurde aus Humanplasma durch das Cohn-Oncley- Verfahren gereinigt (Fraktion V). Siehe, z. B. Cohn E. J., L. E. Strong, W. L. Hughes, D. J. Mulford, J. N. Ashworth, M. Melin und H. L. Taylor, "Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins, IV. A System for the Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids", J. Am. Chem. Soc. 68, 459, (1946).
- Die Protein-Rückgewinnung wurde durch A 280, Radialimmunodiffusion, und FPLC-Superose 6 (Pharmacia-Schnell-Protein-Flüssigchromatographie durch Größenausschluß) bewertet. F VIII wurde mit einem modifizierten Verfahren von Langdell (Langdell R. D., Wagner R. H., Brinkhouse A., "Effect of antihemophiliac Factor on One-Stage clotting Test", J. Lab. Clin. Med. 41: 637- 647, 1953) auf Basis der aktivierten Partialthromboplastin-Zeit (APTT) einem Assayverfahren unterzogen.
- Behandlungsprotokoll:
- Protein-Lösungen wurden mit einer 1/100-Verdünnung von Vorrats-Virus geimpft, um die Effekte von Virus-haltigem Medium zu minimieren. Ein Volumen von Azol-Lösung wurde zugefügt, um eine endgültige gewünschte Konzentration zu ergeben. Behandelte und Vergleichsproben wurden unter intermittierender schwacher Vermischung unter den spezifizierten Bedingungen (Zeit, Temperatur) inkubiert. Proben wurden in geeigneten Zeitabständen entnommen, und es wurde sofort restliches infektiöses Virus bezüglich des Titer bestimmt.
- Ergebnisse:
- Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Typen von Azolen zu ermitteln und zu bestimmen, die viruzide Aktivität zeigen und ergeben. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, ist eine breite Vielzahl von Azolen wirksam bei der Herabsetzung des VSV-Titer. Die primäre funktionelle Gruppe, die zur Virus-Inaktivität führt, ist der pentamere Azolring, der durch Änderungen am Ring oder durch zusätzliche funktionelle Gruppen moduliert sein kann, die an den Ring gebunden sind. Tabelle 1 Inaktivierungskinetiken von VSV in F VIII, enthaltend verschiedene Azole bei 40ºC
- (): unbehandelt
- *: LOG&sub1;&sub0;TCID&sub5;&sub0;/ml
- nicht getestet
- Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Typen von Viren zu ermitteln und zu bestimmen, die einer Inaktivierung durch Azole zugänglich sind. In Tabelle 2 sind Bedingungen aufgelistet, die notwendig sind, um eine substantielle Virus-Verringerung (2 oder mehr log-Einheiten an Verringerung) für verschiedene umhüllte und nicht-umhüllte Viren zu ergeben. Tabelle 2 Inaktivierungsparameter für verschiedene umhüllte und nicht-umhüllte Viren in F VIII
- *: LOG&sub1;&sub0;TCID&sub5;&sub0;/ml
- Detergentien können die viruzide Aktivität steigern. In Tabelle 3 sind verschiedene Beispiele aufgelistet, die spezifische Bedingungen einer erhöhten Aktivität oder ein entsprechendes Fehlen belegen. Tabelle 3 Wirkung von Detergentien und der Temperatur auf die viruzide Aktivität von Imidazol
- *: LOG&sub1;&sub0;TCID&sub5;&sub0;/ml
- --: nicht getestet
- Eine Vielzahl von Proteinen in wässrigen Lösungen wird nicht wesentlich durch Behandlung mit Azolen beeinflußt. Die Rückgewinnungsrate kann schwanken, in Abhängigkeit vom Protein. Beispielsweise ist F VIII ein sehr großes, labiles Protein. Bedingungen, die substantielle Virus- Inaktivierung ohne Wirksamkeitsverlust ermöglichen, sind ungewöhnlich. Tabelle 4 definiert Kinetiken für F VIII. Tabelle 4 Protein-Rückgewinnung in der Gegenwart von Imidazol unter verschiedenen Bedingungen
- Es werden nun Betrachtungen angestellt, wie Imidazol funktionieren könnte:
- Jedes Virion besteht aus einem Proteinüberzug, der viele Kluster aus Protein-Untereinheiten aufweist. Die Untereinheiten werden in Lösung durch Metallionen stabilisiert und können dissoziieren, wenn die Metall- Konzentration verringert ist. Die Bindung von Protein-Untereinheitan mit Metallionen wird durch die Elektron-abgebenden Seitenketten von Resten wie von Histidin erleichtert. Es wird ein Komplex zwischen einem Metallion und dem epsilon-Stickstoff aus dem Imidazolring eines Histidin-Restes am Protein gebildet. In Virus-haltiger Lösung konkurriert freies Imidazol mit dem Imidazol an den Protein-Untereinheiten. In dem Maße, wie Metallionen an das freie Imidazol gebunden werden, werden die Protein-Untereinheiten instabil und der Virusüberzug geöffnet, wodurch die native Struktur des Virion zerstört wird. Das Phänomen ist auch von der Konzentration an Protein (z. B. von F VIII) in Lösung abhängig, was ferner dazu beiträgt, das Imidazol in Lösung mit dem Imidazol am Protein konkurriert.
- Im Hinblick auf die oben dargelegte Beschreibung ist davon auszugehen, daß für den auf dem einschlägigen Gebiet tätigen Fachmann entsprechende Variationen unmittelbar und ohne weiteres erkennbar sind. Somit sollten die obigen Beispiele lediglich beschreibend und erläuternd sein, und es sollte die hier offenbarte Erfindung nur auf die folgenden Ansprüche eingeschränkt sein.
Claims (3)
1. Verfahren zur Inaktivierung von sowohl umhüllten als auch
nicht-umhüllten Viren in einer wässrigen Lösung therapeutischer, biologisch
aktiver Proteine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
Koagulationsfaktoren und Antikörpern, wobei das Verfahren die Stufe umfaßt,
in der die Lösung mit einem Azol in Kontakt gebracht wird, das aus der
Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Imidazol, Histidin und
2-Imidazolidinon, um eine Verringerung um mindestens 2 log-Werte Virus-Titer und eine
Rückgewinnung von mehr als 50% biologischer Aktivität der Proteine zu
ergeben.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, umfassend die zusätzlichen Stufen
eines Einschlusses von Detergens.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Detergens Triton X-100
ist.
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