DE69512416T2

DE69512416T2 - Fibrinogenkonzentrate aus blutplasma, verfahren und anlage für ihre herstellung

Info

Publication number: DE69512416T2
Application number: DE69512416T
Authority: DE
Inventors: Luc De Wael; Ruth Laub
Original assignee: CROIX ROUGE DE BELGIQUE BRUESS
Current assignee: CROIX ROUGE DE BELGIQUE BRUESS
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1995-07-14
Publication date: 2000-02-17
Anticipated expiration: 2015-07-15
Also published as: CA2195127C; EP0771324A1; IL122665A0; JP4211894B2; DE69512416D1; US5834420A; WO1996002571A1; IL122665A; CA2195127A1; EP0771324B2; DE69512416T3; JPH10506607A; ATE184884T1; EP0771324B1; ES2139227T3; ES2139227T5

Description

Zweck der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fibrinogenkonzentrat aus menschlichem oder tierischem Blutplasma und sein Herstellungsverfahren sowie eine Einrichtung für die Herstellung des besagten Fibrinogenkonzentrats.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die pharmazeutische und/oder kosmetische Zusammensetzung, die das besagte Fibrinogenkonzentrat enthält.

Technolozischer Hintergrund der Erfindung

Bei Fibrinogen handelt es sich um ein Plasmaprotein, das im Koagulationsprozeß von massgebender Wichtigkeit ist. Seine pharmazeutischen oder kosmetischen Anwendungsfelder erstrecken sich über verschiedene Bereiche (Vernarbung von Wunden, Koagulationsagent, Komponente von biologischen Klebematerialien, Fibrogenemie, Hemmung der operativen und postoperativen Folgen, ...).
Die Bereitstellung von Blutproteinen, wie Fibrinogen, erfordert im Hinblick auf deren Verwendung für therapeutische und nicht therapeutische Zwecke, Reinigungstechniken, die es ermöglichen ein Produkt von hoher Reinheit zu erhalten, das unter anderem vollkommen frei ist von viralen Verunreinigungen (HN, Hepatitis, Parvovirus, ...) oder von biologischen Molekülen, wie Antikörper oder Proteasen (Richtlinie des Europäischen Rates 65/65 EEC, 75/319 EEC und 89/381 EEC).
Aus diesem Grund wurden verschiedene Behandlungsverfahren (Filtration, Ausfällung, Afflnitätschromatographie, ...) vorgeschlagen, um die viralen Verunreinigungen aus dem Plasma und/oder aus den vom Plasma abgeleiteten Derivaten zu beseitigen oder zu inaktivieren (Faktor VIII, Faktor von Willebrand, Fibronectin, ...).
Die Behandlungen für die virale Inaktivierung können in einem thermischen oder chemischen Verfahren bestehen.
Ein chemisches Verfahren kann zum Beispiel in einer viralen Inaktivierung durch Lösungsmittel / Reinigungsmittel bestehen, sowie dies in der Patentanmeldung EP-0 131 740 beschrieben worden ist.
Diese thermischen oder chemischen Behandlungen für die virale Inaktivierung ermöglichen es jedoch nicht einige virale Verunreinigungen gänzlich zu entfernen. Dies gilt insbesondere für verschiedene Viren ohne Hülle, wie zum Beispiel des Parvovirus B19.

Stand der Technik

Die Patentanmeldung PCT/FR89/00050 (WO89/12065) beschreibt eine solche virale Inaktivierung durch Lösungsmittel / Reinigungsmittel in einem Abscheidungsverfahren, durch das die Proteine vom Plasma getrennt werden, ausgehend von einer solubilisierten Fraktion eines kryopräzipitierten Plasmas.
Gemäß diesem Verfahren wird die Fraktion eines im Wasser wieder solubilisierten Plasmakryopräzipitats einer Behandlung für die virale Inaktivierung durch Lösungsmittel 1 Reinigungsmittel unterworfen, dann einer einzigen chromatographischen Trennung auf einem Anionenaustauscherharz, dessen Matrix ein Gel ist, das durch seine porösen und hydrophoben Eigenschaften in der Lage ist den Komplex Faktor VIII - Faktor von Willebrand zurückzuhalten. Anschließend werden durch aufeinanderfolgende Steigerungen der ionischen Kraft des Eluierpuffers alle einzelnen Proteine selektiv aufgefangen.
Das erste Filtrat der Chromatographie enthält hauptsächlich Fibrinogen aber auch Albumin, Immunglobine und Agenten für die virale Inaktivierung (Tween und TNBP).
Ausgehend von dieser Lösung wird das Fibrinogen daraufhin in einer neuen auf einer Heparin-Sepharose Harzkolonne vorgenommenen chromatographischen Stufe gereinigt (Eliminierung der Agenten der viralen Inaktivierung).
Die Fraktion des gewonnenen Fibrinogens wird alsdann über ein System von Kassetten konzentriert und dialysiert. Das konzentrierte Produkt wird in Flaschen abgefüllt und lyophilisiert.
Diese Reinigungstechnik von Fibrinogen hat jedoch den Nachteil, dass sie eine komplexe und kostspielige Reinigungsstufe durch Chromatographie erfordert.
Außerdem ermöglicht diese Reinigungstechnik keine schnelle industrielle Behandlung von umfangreichen Mengen an Fraktionen, die mit Fibrinogen von großer Reinheit angereichert sind. Gleichfalls enthält das durch eine zusätzliche chromatographische Stufe gereinigte Fibrinogen keinen Faktor XIII mehr, was seine Verwendung als biologisches Klebemittel verringern würde.
Die Patente und Patentanmeldungen DE-30 01 435, EP-0 311 950 und PCT/GB86/00121 (WO86/05190) beschreiben Reinigungsverfahren für Blutprodukte, die durch Ausfällung bei saurem pH und in Präsenz einer Aminosäure aus Plasmafraktionen erhalten wurden.
Solche Verfahren können mit einem chemischen Verfahren für die virale Inaktivierung verbunden werden.
Trotzdem sind die durch die verschiedenen angeführten Techniken erhaltenen Produkte nicht ausreichend rein.
Tatsächlich werden die Verunreinigungen wie Proteasen nicht durch diese Techniken beseitigt.
Außerdem kann das erhaltene nicht delipidierte Fibrinogenkonzentrat nur sehr langsam in Lösung gebracht werden.

Ziele der Erfindung

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Darstellung eines Fibrinogenkonzentrats von großer Reinheit, das von viralen Verunreinigungen (Viren mit und/oder ohne Hülle) und von biologischen Molekülen, wie zum Beispiel Proteasen, befreit ist.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Darstellung eines Fibrinogenkonzentrats, das leicht solubilisierbar ist, vorzugsweise in weniger als 10 Minuten. Ein zusätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Darstellung eines Fibrinogenkonzentrats, das nicht von dem Faktor XIII befreit ist, so dass eine Verwendung als biologisches Klebemittel gewährleistet werden kann.
Die vorliegende Erfindung verfolgt ebenfalls das Ziel, ein Herstellungsverfahren für dieses aus Blutplasma abgeleitete Fibrinogenplasma zu entwickeln, das die Nachteile des erwähnten Standes der Technik nicht aufweist, insbesondere wird ein einfaches, schnelles und wenig teures Verfahren angestrebt, das es ermöglicht auf industrielle Weise umfassende Mengen von sehr reinem Fibrinogen zu erzeugen.

Kennzeichnende Elemente der Erfindung

Der Anmelderin ist es gelungen ein Fibrinogenkonzentrat zu isolieren, das von allen viralen Verunreinigungen befreit ist, die bis zu dem heutigen Tag bekannt sind, d. h., die bekannten Viren mit Hülle und die Viren ohne Hülle, insbesondere die Viren der Hepatitis A, der Hepatitis B und der Hepatitis C, die HIV Viren und die Parvoviren (insbesondere der Parvovirus B19).
Außerdem ist das besagte Fibrinogenkonzentrat durch eine besonders hohe Reinheit gekennzeichnet, die mehr als 95% beträgt und sogar über 98% liegen kann. Die bleibende Fraktion in diesem Fibrinogenkonzentrat wird durch den Faktor XIII gebildet (wobei der Anteil des Faktors XIII in der bleibenden Fraktion über 20% liegen kann) und durch Immunglobine.
Außerdem kann in diesem Fibrinogenkonzentrat eine sehr geringe Konzentration an chemischen Zusätzen (Lösungsmittel / Reinigungsmittel) zurückbleiben, die in dem Verfahren für die chemische Inaktivierung dieses Fibrinogenkonzentrats zum Einsatz kamen. Die in dem Endprodukt vorgefundenen Lösungsmittel / Reinigungsmittel sind jedoch nur als Spuren vorhanden und sind nicht giftig.
Auf vorteilhafte Weise ist das besagte Fibrinogenkonzentrat ebenfalls frei von Proteasen.
Auf vorteilhafte Weise ist das besagte Fibrinogenkonzentrat gemäß der Erfindung delipidiert, d. h., es kann schnell und einfach in nur einigen Minuten solubilisiert werden, vorzugsweise in weniger als 15 Minuten, ja sogar in weniger als 10 Minuten.
Außerdem findet keine Koagulation des Fibrinogenkonzentrats statt, wenn dieses mehr als 12 Monate bei 4ºC aufbewahrt wird.
Vorzugsweise enthält das besagte Fibrinogenkonzentrat mehr als 0,001% und noch besser mehr als 0,1% an Faktor XIII.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls das Herstellungsverfahren des Fibrinogenkonzentrats, in dem eine solubilisierte Plasmafraktion, die Fibrinogen enthält, einer chemischen Behandlung für die virale Inaktivierung mit einer oder mehreren Ausfällungsstufen in einer Lösung mit saurem ph, die eine Aminosäure enthält, unterworfen wird [(und möglicherweise einer oder mehreren physischen Behandlungen (Behandlung durch Ultraviolett-Strahlen, insbesondere UV-C) oder einer oder mehreren thermischen viralen Inaktivierungen].
Die Verbindung dieser verschiedenen Stufen ermöglicht es auf unerwartete Weise, durch einen Synergieeffekt, das Fibrinogenkonzentrat gemäß der Erfindung zu erhalten, dessen Reinheit höher ist als 95% und das keine viralen Verunreinigungen enthält. Auf vorteilhafte Weise kann die Stufe der Ausfällung bei saurem pH mit einem pH zwischen 4,0 und 7,0 erfolgen, vorzugsweise zwischen 5,5 und 6,5.
Die Konzentration der Aminosäure (vorzugsweise des Glycins) in der Lösung liegt zwischen 0,1 und 3, 3 molar, vorzugsweise zwischen 0,5 und 1,5 molar.
Außerdem umfaßt das Reinigungsverfahren, und zwar vorzugsweise nach jeder Ausfällungsstufe, eine oder mehrere Stufen für die Filtration des gereinigten Fibrinogens. Vorzugsweise wird diese Stufe für die Filtration auf einem Aktivkohlefilter durchgeführt. Die Kohlefilter AKS-4 oder AKS-7, wie die von der Firma ZEISS gelieferten Filter, sind besonders gut geeignet für das Verfahren der Erfindung.
Gemäß der Erfindung besteht die chemische Behandlung der viralen Inaktivierung in einer Behandlung mit einem Lösungsmittel / Reinigungsmittel, so wie man dieses in der Patentanmeldung EP-0 131 740 beschrieben hat.
Die thermische Stufe für die virale Inaktivierung wird zum Beispiel durch Erhitzen auf eine Temperatur von mehr als 80ºC durchgeführt, dies während einer Dauer von 10 Stunden oder darüber hinaus, vorzugsweise zwischen 24 und 72 Stunden.
Die physische Stufe für die virale Inaktivierung besteht in der Behandlung der solubilisierten Plasmafraktion mit Ultraviolett-C-Strahlen, deren Wellenlänge zwischen 250 und 270 nm beträgt, vorzugsweise in dem Bereich um 254 mn, und deren Bestrahlungsdosen in dem Bereich um 250 Joule/m² liegen.
Gemäß der Erfindung wird die solubilisierte Plasmafraktion aus einer Gruppe ausgewählt, die sich aus der solubilisierten Fraktion eines kryopräzipitierten Plasmas, der FI Fraktion von Cohn und/oder einem Gemisch hiervon zusammensetzt.
Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die solubilisierte Fraktion eines Plasmakryopräzipitats einer vorhergehenden einzigen chromatographischen Stufe auf einem Ionenaustauscherharz unterzogen.
Vorzugsweise enthält das Ionenaustauscherharz eine Matrix aus einem Gel, das durch seine porösen und hydrophoben Eigenschaften in der Lage ist den im Plasma vorhandenen Komplex Faktor VIII - Faktor von Willebrand zurückzuhalten.
Außerdem und gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren ebenfalls eine Stufe, in der die solubilisierte Fraktion eines Plasmakryopräzipitats einer vorhergehenden Behandlung der Vorreinigung unterzogen wird, die eine Behandlung mit Aluminiumhydroxid und/oder eine Ausfällung bei einer Temperatur zwischen 10 und 20ºC enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die pharmazeutische und/oder kosmetische Zusammensetzung mit dem Fibrinogenkonzentrat das der Erfindung entspricht und/oder das durch das Herstellungsverfahren gemäß der Erfindung erhalten worden ist.
Insbesondere ist diese pharmazeutische und/oder kosmetische Zusammensetzung ein biologisches Klebemittel, wie dasselbe in der Patentanmeldung EP-0 305 243 beschrieben worden ist und welches das Fibrinogenkonzentrat gemäß der Erfindung enthält.
Ein letzter Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft die Einrichtung für die Herstellung eines Blutderivats, insbesondere diejenige eines Fibrinogenkonzentrats, eines pharmazeutischen, kosmetischen und/oder eines biologischen Klebemittels gemäß der Erfindung. Die besagte Einrichtung umfaßt eine Vorrichtung, welche die physische virale Inaktivierung der solubilisierten Plasmafraktion gemäß dem Verfahren der Erfindung gewährleistet.
Insbesondere umfaßt die Vorrichtung der Einrichtung gemäß der Erfindung einen Sender für UV-C Strahlen, deren Wellenlänge zwischen 250 und 270 nm liegt, vorzugsweise in dem Bereich um 254 mn, wobei die Strahlungsdosen in dem Bereich um 250 Joule/m² liegen.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 stellt die densimetrische Analyse auf Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) des durch unterschiedliche Verfahren gereinigten Fibrinogens dar.
Abb. 2 bis 5 stellen die zymographische Analyse des durch unterschiedliche Verfahren gereinigten Fibrinogens dar.
Abb. 6 stellt auf schematische Weise eine Einrichtung für die Herstellung des Fibrinogenkonzentrats gemäß der Erfindung dar.
Die vorliegende Erfindung wird genauer in Bezug auf die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Abbildungen erläutert, wobei diese Beispiele zum Zweck der Illustration gegeben werden und nicht als Einschränkung für die Erfindung gelten können.

Beispiel 1

Als Ausgangsmaterial benutzt man ein kryopräzipitiertes Plasma mit einem wieder in Suspension gebrachten Fibrinogen.
Diese Suspension des Kryopräzipitats wird einer Vorreinigung durch eine Behandlung mit Aluminiumhydroxid und einer kalten Ausfällung unterzogen.
Diese gereinigte Lösung wird alsdann einer Behandlung für die virale Inaktivierung durch Lösungsmittel / Reinigungsmittel, wie sie in der europäischen Patentanmeldung EP-0 131 740 beschrieben ist, unterzogen.
Diese solubilisierte Fraktion wird dann einer einzigen Stufe der Chromatographie auf einem Ionenaustauscherharz unterzogen, woraufhin die erste Fraktion selektiv entnommen wird (Eluat + Waschvolumen), und durch eine erste Stufe der Ausfällung unter den nachfolgenden Bedingungen gereinigt wird:
- Temperatur = 25ºC
- Na-Zitrat 0,15 M, NaCl 0,15 M, Glycin 1 M
- pH 6,1 (HCl 1 normal)
- Glycin 1 M
Alsdann bringt man die Temperatur auf 4ºC und führt eine Zentrifugierung durch. Man löst den Niederschlag wieder unter den folgenden Bedingungen auf:
- pH 7,0
- Temperatur = 30ºC
- Na-Zitrat 0,15 M, NaCl 0,15 M, Glycin 1 M
- Filtration AKS-4 - AKS-7
- pH 6,1 (HCl 1 normal)
Anschließend bringt man die Temperatur auf 4ºC und führt eine Zentrifugierung durch. Man löst den Niederschlag wieder unter den folgenden Bedingungen auf:
- Temperatur = 30ºC
- Na-Zitrat 0,05 M, Monodextrose 50 g/l
- NaCl 0,05 M
- pH 7
- Nachfolgend wird der Niederschlag auf einem Kohlefilter des Typs AKS4-EKSP ® (SEITZ) filtriert und dann konzentriert und diafiltriert. Das konzentrierte Produkt wird danach steril filtriert, nachdem ihm ein Stabilisator (Sucrose) zugesetzt worden ist, dann in Flaschen abgefüllt und lyophilisiert.
Die durch das Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Ausbeuten liegen bei 80% und die Reinheit der Produkte erreicht Werte in der Größenordnung von um 98% +/- 2%.

Beispiel 2

Wie in Beispiel 1 wird als Ausgangsmaterial ein kryopräzipitiertes Plasma verwendet, das einer chemischen Behandlung für die virale Inaktivierung mit Lösungsmittel / Reinigungsmittel unterzogen wird, jedoch wird das Kryopräzipitat keiner Vorreinigungsstufe durch Chromatographie unterzogen, wie dies im Beispiel 1 der Fall ist.
Die Reinigung des Fibrinogens erfolgt in einer einzigen Stufe durch Ausfällung. Die erhaltenen Ausbeuten liegen zwischen 70 und 80% und die Reinheit der Produkte erreicht Werte in der Größenordming von uni 75 bis 85%.
Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die Vergleichsdaten der verschiedenen Reinigungsverfahren für Fibrinogen. Tabelle 1
(a) Das Fibrinogen wird ausgehend von der ersten selektiv auf der Basis einer einzigen Chromatographiestufe erhaltenen Fraktion gereinigt, darauf folgen 2 Ausfällungen mit Glycin und eine Filtration auf einem AKS4-EKSP ® Filter (Beispiel 1).
(b) Das Fibrinogen wird ausgehend von einem nicht durch Chromatographie vorbehandelten Plasmakryopräzipitats durch eine einzige Ausfällung gereinigt (Beispiel 2).
(c) Das Verfahren ist mit dem Verfahren unter Punkt (a) identisch, umfaßt jedoch nur eine Ausfällung mit Glycin.
(d) Das Fibrinogen wird gemäß dem in der Patentanmeldung PCT/FR89/00050 beschriebenen Verfahren gereinigt.
(e) Densitometrische Analyse des Polyacrylamidgels (SDS-PAGE), siehe Abb. 1).
(f) Die obere zulässige Grenze der Konzentration von Tween 80 muss geringer als 100 ppm sein.
(g) Die obere zulässige Grenze der Konzentration von TNBP muss geringer als 100 ppm sein.
(h) Die Präsenz von Proteasen wurde durch zymographische Analyse hervorgehoben (siehe Abb. 2).
Die densitometrische Analyse auf dem Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) der Abb. 1 zeigt verschiedene Fibrinogengruppen, die durch verschiedene Verfahren gemäß der Erfindung und gemäß dem derzeitigen Stand der Technik erhalten worden sind.
Materialmenge, die pro Piste abgelagert wurde: 5 ug Proteine
- Pisten 1, 8: Standards für Molekulargewichte BIO-RAD ® < < High range> > .
- Piste 2: Löslichmachen des Kryopräzipitats
- - Piste 3: Standardfibrinogelieliefert von Kordia
- Piste 4: Fibrinogen, das ausgehend von einem Kryopräzipitat hergestellt worden ist (2 Ausfällungen mit Glycin)
- Piste 5: Fibrinogen, das ausgehend von der Spitze A einer Ionenaustauscherkolonne hergestellt worden ist (1 Ausfällung mit Glycin)
- Piste 6: Fibrinogen, das ausgehend von der Spitze A einer Ionenaustauscherkolonne hergestellt worden ist (2 Ausfällungen mit Glycin)
- Piste 7: Fibrinogen, das ausgehend von einer Heparin-Sepharose Kolonne hergestellt worden ist (Pharmacia).
Die Pisten 2, 3, 4, und 7 enthalten einen zusätzlichen Streifen (MW 300.000) Fibronectin.
Die zymographische Analyse, die in den Abb. 2 bis 5 dargestellt wird, zeigt die Analyse von verschiedenen Fibrinogengruppen, die durch verschiedene Verfahren gemäß der Erfindung und gemäß dem derzeitigen Stand der Technik erhalten worden sind [auf Gelatine (Abb. 2), auf Gelatine + EDTA (Abb. 3), auf Kasein (Abb. 4), auf Kasein + EDTA (Abb. 5].
Materialmenge, die pro Piste abgelagert worden ist: 500 ug Proteine
- Pisten 1, 8: Standards für Molekulargewichte BIO-RAD ~ High range ».
- Piste 2: Löslichmachen des Kryopräzipitats
- Piste 3: Standardfbrinogen, geliefert von Kordia ®
- Piste 4: Fibrinogen, das ausgehend von einem Kryopräzipitat hergestellt worden ist (2 Ausfällungen mit Glycin)
- Piste 5: Fibrinogen, das ausgehend von der Spitze A einer Ionenaustauscherkolonne hergestellt worden ist (1 Ausfällung mit Glycin)
- Piste 6: Fibrinogen, das ausgehend von der Spitze A einer Ionenaustauscherkolonne hergestellt worden ist (2 Ausfällungen mit Glycin)
- Piste 7: Fibrinogen, das ausgehend von einer Heparin-Sepharose Kolonne hergestellt worden ist (Pharmacia).
Die Pisten 2 und 7 zeigen deutlich die Anwesenheit von Proteasen.
Beispiel 3: Herstellung eines Fibrinogenkonzentrats ausgehend von der FI Fraktion (Fraktionierung von Cohn)(siehe Tabellen 2 und 3).

Darstellung der FI Fraktion.

50 l Plasma werden bei 0 +/- 2ºC aufgetaut und zentrifugiert um ein Kryopräzipitat zu erhalten. Das pH des Plasmas, das arm an Kryopräzipitat ist, wird mit HCl auf pH 7,2 gebracht, und es erfolgt die Zugabe von Ethanol (9 +/- 1%). Die Temperatur wird auf -2,5ºC gehalten. Nach zwei Stunden Inkubation wird die Suspension zentrifugiert und ein Bodensatz (Fraktion I von Cohn oder FI) wird erhalten (+/- 800 g).
Die Fraktion FI wird erneut in einem Zitratpuffer suspendiert (Na-Zitrat 0,15 M - NaCl 0,15 M - pH 7,0 +/- 0,1) bei 15ºC. Alhydrogel (2% Endkonzentration) wird zugesetzt und die Inkubation wird 20 Minuten bei 22ºC fortgesetzt. Nach der Beseitigung des Bodensatzes, der reich an Proteasen ist, wird das an der Oberfläche schwimmende Material auf einem Klärungsfilter (1 um Pall) mit einer Geschwindigkeit von 1 l/m filtriert. Eine erste virale Inaktivierung wird durch die Zugabe von Lösungsmittel / Reinigungsmittel durchgeführt (8 Stunden in Anwesenheit von Tween 80 1 % und von TNBP 0,3% bei 25ºC).

Erste Ausfällung mit Glycin

Nach der Inaktivierung wird das pH auf 6,1 +/- 0,1 angepasst und die Glycinkonzentration wird auf 1 M gebracht. Nach mindestens 2 Stunden Ausfällung bei 4ºC wird die Suspension zentrifugiert und dekantiert. Der Bodensatz wird in 10 Mal seinem Volumen Zitratpuffer bei 30ºC aufgelöst und das pH wird auf 7,0 +/- 0,1 gebracht.

Beseitigung des Lösungsmittels % Reinigungsmittels durch absorbierende klärende Filtration

Die Suspension wird auf Kohle des Typs AKS-4 oder AKS-7 (3 Platten) und einem Filter des Typs Kieselguhr EKSP (3 Platten) filtriert (Durchsatz 700 ml/min).
Die Beseitigung des Lösungsmittels / Reinigungsmittels ist wirkungsvoller auf den beiden Kohlefiltern AKS-4 oder AKS-7, wie diejenigen die von der Firma ZEISS geliefert werden, als auf den < < delipidierten> > Filtern, wie diejenigen die von der Firma CUNO geliefert werden.

Zweite Ausfällung mit Glycin

Das pH des Filtrates wird auf 6,1 +/- 0,1 gebracht und das Glycin hinzugefügt (Endkonzentration 1 M). Die Ausfällung bei 4ºC dauert mindestens 2,5 Stunden. Der Niederschlag wird nach Zentrifiigierung oder Dekantierung erhalten.

Zweite klärende Filtration

Der Bodensatz wird in einem dreifach verdünnten und filtrierten Zitratpuffer aufgelöst, wie dies bereits vorher beschrieben worden ist.

Konzentration und Diaflitration

Das Filtrat der zweiten Filtration wird durch Ultrafiltration konzentriert (Filtron ®, Millipore) (< < clotting assay> > ) und gegen einen dreifach verdünnten Zitratpuffer diafiltriert.
Zugabe der Stabilisatoren und zweite virale Inaktivierung durch Ultraviolett-Strahlen. Zu dem gereinigten Fibrinogen werden Stabilisatoren zugegeben, das pH wird auf 7,0 +/- 0,1 gebracht und die Fibrinogenlösung kann durch UV-C Strahlen behandelt werden, um unter anderem die Viren ohne Hülle zu inaktivieren (Parvovirus B19, Viren der Hepatitis A und C, ....).

Sterile Filtration

Die Lösung wird steril auf einem Millidisk ® Filter von 0,45 um und 0,22 um (Millipore) filtriert.

Lyophilisation und schwere thermische Behandlung

Nach der Lyophilisation kann das Fibrinogen auf 80ºC während einer Dauer von 10 Stunden oder darüber hinaus erhitzt werden, vorzugsweise während einer Dauer zwischen 24 und 72 Stunden.

Ergebnisse

Das erhalten Produkt ist durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet:
- Ausbeute: 0,4 bis 1 g/l Ausgangsplasma (Fraktion FI)
- Abfall: 0,2 mg/l Plasma
- Reinheit: mehr als 98%
- Hohe Konzentration an Faktor VIII (sogar nach schwerem Trockenerhitzen)
- Abwesenheit von messbaren Proteasen (insbesondere von Proteasen, die von dem Vitamin K abhängen)
- Das Produkt ist in weniger als 10 Minuten löslich
- Das Produkt ist in der Lösung gekennzeichnet durch eine sehr hohe Stabilität: keine Koagulation nach einer Aufbewahrung von mehr als 12 Monaten bei 4ºC.
- Sehr geringe Herstellungskosten
- Geringe Verringerung der Aktivität des Fibrinogens, das drei virale Inaktivierungen durchlaufen hat. Tabelle 2 Tabelle 3

Einrichtung für die Herstellung des Fibrinogenkonzentrats gemäß der Erfindung

Die Abb. 6 im Anhang stellt auf schematische Art und Weise eine Einrichtung für die Herstellung des Fibrinogenkonzentrats gemäß der Erfindung dar.
Diese Einrichtung umfaßt die Vorrichtungen (1 und 2), welche die Ausfällung, die Zentrifugierung / Dekantierung, die Filtration, die Konzentration und die Dialyse des Fibrinogenkonzentrats gemäß der Erfindung gewährleisten, und die durch den Fachmann in Funktion des behandelten Blutderivates angepaßt werden können.
Außerdem umfaßt diese Einrichtung eine Vorrichtung (welche die Referenznummer 3 auf der Abb. 6 im Anhang trägt), die durch eine physische Behandlung eine virale Inaktivierung des Blutderivats gewährleistet.
Die Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung kann demzufolge benutzt werden für eine physische Behandlung zur viralen Inaktivierung von jedem Blutderivat, insbesondere für die Inaktivierung der Koagulationsfaktoren (Faktor VIII, Faktor IX ...), der Immunglobine, des Albumins, des Fibrinogens, ....
Zu dieser Vorrichtung zählt eine UV Desinfektionsröhre, bei welcher mehr als 90% der Emission zwischen 250 und 270 nm erfolgt, vorzugsweise bei 254 mn, und welche in einem widerspiegelnden umschlossenen Raum angeordnet ist, der die Strahlung auf eine Quarzröhre oder ein polymerisiertes und nicht absorbierendes Material in diesem Wellenlängenbereich zurückwirft. Es ist kein Kontakt zwischen dem in der Röhre 4 zirkulierenden Produkt und der UV Lampe 5 möglich.
Ein Turbulenzsystem, wie etwa eine Resonanzwand oder eine Stickstoffinjektion, ermöglicht es einen homogenen Fluß in der Röhre zu gewährleisten. Das Kontrollsystem für die Menge an UV, welche die Röhre bestrahlen, befindet sich auf der entgegengesetzten Seite der Röhre (in Bezug auf die Lampe). Die Aufenthaltsdauer des Produktes kann für die Erzielung einer konstanten Bestrahlungsdosis angepasst werden. Der Durchmesser der Röhre kann an das zu behandelnden Volumen angepasst werden. Genauso wie die Stärke oder die Länge der Desinfektionslampe. Die Temperatur wird sowohl in dem umschlossenen Raum als auch in der Flüssigkeit überwacht und aufgezeichnet.
Das gesamte System besteht aus einem Material, das mit den guten Praktiken der pharmazeutischen Herstellung (GMP) in Einklang steht, wie zum Beispiel Inox 304, Teflon, ..., und kann vor Ort sanitär behandelt werden.
Die Benutzung eines solchen UV Bestrahlungssystems, insbesondere der UV-C Bestrahlung, ermöglicht es die Viren zu inaktivieren, unter anderem die Viren ohne Hülle und insbesondere die einfachen Stabviren wie den Parvovirus Murin (5 bis 6 log an viraler Inaktivierung).
Das System befindet sich im Vorfeld des Verfahrens für die Herstellung von Blutderivat, zum Beispiel vor der sterilen Filtration oder nach der Ultrafiltration.
Die Stärke der UV Lampe liegt zwischen 18 und 132 Watt. Die Aktivität der benutzten Zubereitungen (Faktor VIII, Fibrinogen und IgG) wird wenig beeinträchtigt (5% Verringerung der Aktivität im Durchschnitt).
Die Vorrichtung kann in einem Stück gebaut werden oder aus verschiedenen Modulen zusammengesetzt werden, die aneinander gereiht werden. Die Bestrahlungsdosen variieren zwischen 100 und 2000 Joule/m², oder vorzugsweise
in dem Bereich von 250 Joule/m².
Die UV Desinfektionsvorrichtung, die in der Einrichtung gemäß der Erfindung benutzt wird, ist vom Typ s. p. l. (AQZAFINE , Valencia, CA USA)).

Beispiel 5: Analyse des Fibrinogenkonzentrats gemäß der Erfindung

Die Tabelle 4 zeigt eine Analyse der Eigenschaften des Fibrinogenkonzentrats, das auf der Basis einer solubilisierten Plasmafraktion hergestellt worden ist, welch letztere aus der solubilisierten Fraktion eines kryopräzipitierten Plasmas besteht, die einer einzigen chromatographischen Stufe auf einem Ionenaustauscherharz ausgesetzt worden ist (Chromato Ausfluß), die möglicherweise durch schweres Erhitzen behandelt worden ist (Chromato Ausfluß DH), die durch Behandlung der Fraktion I von Cohn (FI) erhalten worden ist, die möglicherweise durch schweres Erhitzen behandelt worden ist (FI DH).
Diese Analyse zeigt, dass das erhaltene Produkt eine besonders hohe Reinheit aufweist, von mehr als 98%, sehr geringe Anteile an Lösungsmittel/Reinigungsmittel enthält, jedoch eine wichtige Fraktion des Faktors XIII beibehält, welche die Verwendung des Fibrinogenkonzentrats gemäß der Erfindung als biologisches Klebemittel gewährleistet. Tabelle 4

Claims

1. Fibrinogenkonzentrat, dadurch gekennzeichnet, daß es frei von viralen Verunreinigungen ist, daß seine Reinheit größer als 98% ist, und daß es frei von Proteasen ist.

2. Fibrinogenkonzentrat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es von Lipiden befreit ist.

3. Fibrinogenkonzentrat gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Aufbewahrung während mehr als 12 Monaten bei einer Temperatur von 4ºC keine Koagulation erleidet.

4. Verfahren zur Herstellung des Fibrinogenkonzentrats gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine solubilisierte Plasmafraktion, die Fibrinogen enthält, einer chemischen Behandlung zur viralen Inaktivierung unterworfen wird durch Zugabe von Lösungsmittel/Reinigungsmittel bei einem oder mehreren Schritten zur Ausfällung in einer Lösung, die eine Aminosäure, vorzugsweise Glycin, enthält, und bei saurem pH, und einem oder mehreren Schritten zur Filtration des gereinigten Fibrinogens, vorzugsweise auf Aktivkohlefilter.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der Lösung zwischen 4,0 und 7,0, vorzugsweise zwischen 5,5 und 6,5 hegt, und daß die molare Konzentration an Aminosäure in der Lösung zwischen 0,1 und 3,3, vorzugsweise zwischen 0,5 und 1,5 liegt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es einen thermischen Schritt zur viralen Inaktivierung umfaßt, vorzugsweise durch Erhitzen der solubilisierten Plasmafraktion auf eine Temperatur von 80ºC oder darüber während einer Dauer von mindestens 10 Stunden, und/oder einen physikalischen Schritt zur viralen Inaktivierung umfaßt durch Behandlung der solubilisierten Plasmafraktion mit Ultraviolett-C- Strahlen, wo die meiste Strahlung vorzugsweise zwischen 250 und 270 nm emittiert wird, und bei dem die Bestrahlungsdosen vorzugsweise ungefähr 250 Joule/m² betragen.

7. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die solubilisierte Plasmafraktion in der Gruppe gewählt wird, die von der solubilisierten Fraktion eines Plasma-Kryopräzipitats, der FI-Fraktion von Cohn und/oder einem Gemisch davon gebildet wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die solubilisierte Fraktion des Plasma-Kryopräzipitats zuvor einem einzelnen Chromatographieschritt auf einem Ionenaustauscherharz unterworfen wird, das vorzugsweise eine Matrix umfaßt, die aus einem Gel besteht, das aufgrund seiner porösen und hydrophoben Eigenschaften den Komplex Faktor VIII - von Willebrand-Faktor zurückhalten kann.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die solubilisierte Fraktion des Plasma-Kryopräzipitats zuvor einer Vorreinigungsbehandlung unterworfen wird, die eine Behandlung mit Aluminiumhydroxid und/oder eine Ausfüllung bei einer Temperatur zwischen 10 und 20ºC aufweist.

10. Pharmazeutische, kosmetische Zusammensetzung oder biologischer Kleber, die das Fibrinogenkonzentrat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 aufweisen.

11. Anlage zur Herstellung eines Fibrinogenkonzentrats gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, sowie einer pharmazeutischen, kosmetischen Zusammensetzung und/oder eines biologischen Klebers gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Vorrichtung umfaßt, die vorzugsweise UVC-Strahlen emittiert, deren Wellenlänge zwischen 250 und 270 nm, vorzugsweise bei ungefähr 254 nm liegt, bei Bestrahlungsdosen von ungefähr 10250 Joule/m², wodurch eine virale Inaktivierung der solubilisierten Plasmafraktion, die Fibrinogen enthält, gemäß dem Verfähren des Anspruchs 6 sicherstellt wird..