DE69829408T3

DE69829408T3 - Herstellungsverfahren einer virusfreien faktor viii-lösung durch filtration

Info

Publication number: DE69829408T3
Application number: DE69829408.4T
Authority: DE
Inventors: Abdessatar (Sami) CHTOUROU; Michel Nogre; Pierre Porte
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 1997-12-15
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 2015-11-12
Anticipated expiration: 2018-12-15
Also published as: JP4312381B2; ES2237854T3; ES2237854T5; PT1037923E; DE69829408D1; FR2772381B1; EP1037923B9; EP1037923A1; AU1568199A; DE69829408T8; EP1037923B2; WO1999031138A1; US6967239B1; AU752271B2; DE69829408T2; EP1037923B1; FR2772381A1; CA2314610A1; ATE291034T1; JP2002508396A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Faktor VIII-Lösung, die bezüglich Viren sicher und im wesentlichen frei von von Willebrand-Faktor (vWF) mit hohem Molekulargewicht ist, durch Filtration aus einer Faktor VIII-Lösung hoher oder sehr hoher Reinheit, die Faktor VIII-vWF-Komplexe mit hohem Molekulargewicht enthält.
Der Faktor VIII ist eine Proteinkomponente des Blutes, die seit vielen Jahren zur Behandlung von Menschen verwendet wird, die an Hämophilie A leiden, einer angeborenen Krankheit, die durch einen Mangel oder ein Fehlen von Faktor VIII im Blut verursacht wird. Lange wurden zur Behandlung der Patienten Plasmakonzentrate verwendet, die mit Faktor VIII angereichert waren.
Kryopräzipitat und die aus dem Kryopräzipitat gewonnenen gereinigten Konzentrate waren die am häufigsten verwendeten Konzentrate. Gewöhnlich wird als Kryopräzipitat ein Präzipitat bezeichnet, das aus gefrorenem Humanplasma durch eine Plasmafraktionierungstechnik bei niedriger Temperatur gewonnen wird. Das gefrorene Plasma wird bei einer Temperatur von ungefähr –5°C bis –15°C aufgeweicht und dann bei einer Temperatur, die 3°C nicht überschreitet, unter Rühren langsam erwärmt. Unter diesen Bedingungen schmilzt das gefrorene Plasma teilweise und liefert eine flüssige Phase und eine feste Phase, wobei die feste Phase dann durch Zentrifugation gesammelt wird, um das Kryopräzipitat zu liefern, welches dann gereinigt werden sollte, um ausreichend reine Faktor VIII-Präparate zu erhalten. Diese kryogefällte Fraktion besteht im wesentlichen aus Fibrinogen, Fibronektin, Faktor VIII und von Willebrand-Faktor (vWF).
In dieser kryogefällten Fraktion ist der Faktor VIII im allgemeinen mit dem vWF assoziiert, der den Faktor VIII durch Komplexbildung stabilisiert.
Lange zielten die Reinigungsschritte im wesentlichen darauf ab, den Faktor VIII von unerwünschten Proteinen, wie insbesondere Fibrinogen und Fibronektin, abzutrennen.
Man weiß jedoch nunmehr, daß eines der wesentlichen Probleme, die mit der Herstellung von Faktor VIII aus Plasma einhergehen, in dem Erfordernis besteht, ursprünglich im Blut enthaltene Viren mit zufriedenstellenden Wirkungsgraden zu inaktivieren/eliminieren.
Obwohl es schwierig ist, eine erschöpfende Liste dieser Viren zu erstellen, kann man insbesondere die unterschiedlichen Hepatitisviren, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis G oder auch die verschiedenen Formen des Aidsvirus (HIV) nennen.
Zahlreiche Techniken der Virusinaktivierung wurden daher entwickelt, wie die Trockenerhitzung, die Pasteurisierung, die Lösungsmittel-Detergens-Behandlung. Alle diese Techniken sind relativ wirksam gegenüber umhüllten Viren, aber die Inaktivierung oder die Eliminierung von nackten Viren, insbesondere von kleinen Viren, wie dem Parvovirus B19 oder dem Hepatitis A-Virus, bleibt eines der Hauptprobleme.
Neuere Technologien verwenden die Rückhaltevermögen von Membranen mit geringer Porengröße für Viren. Diese Technologien zeigen tatsächlich eine bedeutende Wirksamkeit gegenüber kleinen Viren, wie den Parvoviren B19 oder dem Hepatitis A-Virus, und können auf Proteine mit niedrigem Molekulargewicht angewandt werden. Jedoch erlauben es die verwendeten Trenngrenzen, die unter 900 kDa liegen, nicht, die Filtration von Proteinen oder Proteinkomplexen mit hohem Molekulargewicht, wie dem Faktor VIII, ohne bedeutende Einbußen in der Ausbeute in Erwägung zu ziehen.
So beschreibt beispielsweise die Patentveröffentlichung WO 96/00237 ein Verfahren zur Verbesserung der Filtrierbarkeit von Proteinen in einer Lösung, die mindestens ein Makromolekül enthält, welches darin besteht, eine Lösung zu verwenden, in welcher der Gesamtsalzgehalt von 0,2 M bis zur Sättigung der Lösung mit dem betreffenden Salz variiert. Josic et al; J. Chromatogr. B. Biomed. Appl.; Bd. 662, Nr. 2, 1994 beschreibt die Verwendung von Ca²⁺ zur Abtrennung des Faktors VIII vom Faktor vWF. Dieser hohe Salzgehalt bewirkt eine Erhöhung der Filtrationsausbeuten. Der Filtrationsschritt wird vorzugsweise zu einem Zeitpunkt durchgeführt, an dem die spezifische Aktivität des interessierenden Makromoleküls bereits sehr hoch ist, so daß es möglich ist, einen Filter mit sehr feiner Struktur zu verwenden und sehr kleine Viren zu eliminieren.
Dieses Dokument zieht jedoch keineswegs die Filtration von Lösungen in Erwägung, die Moleküle mit sehr hohem Molekulargewicht enthalten, wie den Faktor VIII und insbesondere den Faktor VIII plasmatischen Ursprungs, der im allgemeinen mit vWF assoziiert ist und so Komplexe mit hohem Molekulargewicht bildet. Dieses Dokument zitiert das Beispiel einer deletierten Form des rekombinanten Faktor VIII mit einem mittleren Molekulargewicht in der Größenordnung von 170 kDa, die völlig frei von vWF ist. Alle Beispiele beziehen sich auf den Faktor IX, dessen mittleres Molekulargewicht in der Größenordnung von 55 kDa liegt, und dieses Dokument unterstreicht, daß das beschriebene Verfahren besonders für diese Molekülgröße geeignet ist, wobei die Trenngrenze des Filters darüberhinaus leicht über der Größe des zu filtrierenden Moleküls liegen muß. So hat der für den Faktor IX verwendete Filter eine Trenngrenze von 70 kDa.
Nun kann der Faktor VIII, wie weiter oben erwähnt, je nach seiner Herkunft in einer Komplexform vorliegen, die ihm eine bedeutende Größe verleiht, welche 20000 kDa im Hinblick auf das Molekulargewicht und einige zehn Nanometer im Hinblick auf die Partikelgröße erreichen kann (> 106 nm für die Molekülhauptachse, Eppel et al., Langmuir 1993, 9, 2281–88, American Chemical Society). Derzeit ist kein Mittel verfügbar, um Moleküle dieser Art zufriedenstellend zu filtrieren und gleichzeitig kleine Viren, wie zum Beispiel Parvoviren B19, die eine Größe von ungefähr 18 bis 20 nm aufweisen, zu eliminieren.
Die Erfinder haben nun überraschend gefunden, daß es möglich ist, aus einer Lösung, die Faktor VIII von hoher oder sehr hoher Reinheit und Faktor VIII-vWF-Komplexe mit hohem Molekulargewicht enthält, durch Filtration eine Faktor VIII-Lösung zu erhalten, die bezüglich Viren sicher und im wesentlichen frei von hochmolekularem vWF ist.
Aus diesem Grund hat die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Faktor VIII-Lösung durch Filtration zum Gegenstand, die bezüglich Viren sicher ist, gemäß welchem:

– man eine Lösung hoher oder sehr hoher Reinheit herstellt, die Faktor VIII-vWF-Proteinkomplex umfasst;
– man einen Schritt a) durchführt, welcher die Dissoziation von Faktor VIII-vWF-Komplexen mit hohem Molekulargewicht mittels eines chaotropen Ions in einer ausreichenden Menge, um die Dissoziation zu ermöglichen, und den Erhalt einer Lösung gestattet, die im Wesentlichen frei von Faktor VIII ist, der mit vWF mit hohem Molekulargewicht assoziert ist,
– man einen Schritt b) der Filtration der Lösung auf einem hydrophilen Filter mit einer Porosität von 15 nm durchführt.

Die Herstellung einer Faktor VIII-Lösung durch Filtration erlaubt es vorteilhafterweise, eine Lösung zu erhalten, die im wesentlichen frei von vWF mit hohem Molekulargewicht, insbesondere vWF mit einem Polymerisationsgrad größer oder gleich 15, ist, das heißt, in welcher vWF qualitativ und zugleich quantitativ kontrolliert wird. Das Verfahren gemäß der Erfindung erlaubt außerdem dank der Verringerung der Menge an Proteinkomplexen mit hohem Molekulargewicht eine signifikante Erhöhung der Filtrationsausbeuten sowie den Erhalt einer Lösung mit einem zufriedenstellenden Reinheitsgrad bei gleichzeitiger Gewährleistung der Eliminierung pathogener menschlicher Viren von einer Größe ≥ 15 nm.
Die Dissoziation des FVIII-vWF-Komplexes wird mittels mindestens eines chaotropen Ions bewirkt, das in ausreichender Menge vorliegt, um die Dissoziation zu ermöglichen. Alle Ionen, die bekanntermaßen eine chaotrope Aktivität besitzen, können verwendet werden.
Es handelt sich vorzugsweise um zweiwertige Ionen, die der Faktor VIII-Lösung in Form einer Salzlösung von 0,2 M bis zur Sättigung der Salze zugesetzt werden.
Als nicht-einschränkendes Beispiel kann CaCl₂ oder auch MgCl₂ genannt werden. Es wird vorzugsweise eine CaCl₂-Lösung verwendet. Die Konzentration der Lösung beträgt vorzugsweise etwa 0,35 M.
Es wurde festgestellt, daß neben den filtrationsspezifischen Bedingungen auch die für die Dissoziation verwendeten Bedingungen einen Einfluß auf die Ausbeute der späteren Filtration haben. Die Parameter, welche die Gesamtheit dieser Bedingungen definieren, sind beim Dissoziationsschritt die Natur der Salze und ihre Konzentration und beim Filtrationsschritt der Druck und die Temperatur.
Überraschenderweise sind die Filtrationsausbeuten erheblich verbessert, wenn der Transmembrandruck bei der Filtration auf sehr geringe Werte, unter die vom Filterlieferant empfohlenen Richtgrenzen, herabgesetzt wird.
Die Temperatur hat auch einen nicht zu vernachlässigenden Einfluß auf die Filtrationsausbeuten, zu hohe oder zu niedrige Temperaturwerte bewirken eine Erhöhung der Anzahl der Multimerformen des vWF. Vorteilhafterweise wird eine Temperatur in der Größenordnung von 35 ± 5°C gewählt.
Unter den kommerziell erhältlichen oder in Entwicklung befindlichen Virusfiltern ist zum Beispiel die von der Firma Asahi Chemical Industry vermarktete Planova^® 15 N-Membran zu nennen. In diesem Fall wird der Filter vorzugsweise bei einem Druck unterhalb von 0,3 Bar, vorteilhafterweise unterhalb von 0,2 Bar verwendet.
Es können unterschiedliche Filtrationstechniken eingesetzt werden. Die gängigsten Techniken sind die Techniken der Querstromfiltration oder der Frontalfiltration, die mit den gleichen Filtertypen durchgeführt werden können.
Die zuvor gereinigte Faktor VIII-Ausgangslösung kann auf verschiedene Weise, zum Beispiel aus einer Plasmafraktion, wie der kryogefällten Fraktion des Plasmas, oder auch rekombinant hergestellt werden. Alle dem Fachmann bekannten Herstellungsbedingungen können verwendet werden. Es können auf nicht-beschränkende Weise folgende Reinigungsverfahren genannt werden, die den Erhalt einer vorgereinigten, für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbaren Faktor VIII-Lösung erlauben:

– Ionenaustauschchromatographie beispielsweise gemäß einer der Ausführungsformen, die in den Patenten EP-B-359 593 , EP 0 343 275 , US 4 743 680 , WO 97/17370 und EP 0 173 242 beschrieben sind.
– Immunoaffinitätschromatographie beispielsweise gemäß einer der Ausführungsformen, die in den Veröffentlichungen der Patentanmeldungen WO 97/39033 , EP 0 286 323 oder in dem Dokument Zimmerman und Fulcher, Thrombosis Res., Beil. VII, S. 58, 1987; Berntorp und Nilson, Thrombosis Res., Beil. VII, S. 60, 1987 beschrieben sind.
– Gelfiltrationschromatographie in Medium, das dissoziierend wirkt oder nicht, wie von P. J. Fay beschrieben (P. J. Fay et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Bd. 79, S. 7200–7204, 1982).
– Affinitätschromatographie an immobilisiertem Heparin, wie in der Veröffentlichung der Patentanmeldung WO 93/22337 beschrieben.

Typischerweise umfaßt die Reinigung mittels Ionenaustauschchromatographie ausgehend von einer Plasmafraktion, wie der kryogefällten Fraktion des Plasmas, einen Schritt der Virusinaktivierung, der die Inaktivierung umhüllter Viren erlaubt. Es können unterschiedliche chromatographische Systeme verwendet werden, wobei die Bedingungen der Adsorption und dann Elution der bezüglich Faktor VIII konzentrierten Fraktion dann einen Einfluß auf die späteren Ausbeuten des Verfahrens haben können. Die Natur der Matrix und des Ionenaustauschers können variiert werden. So kann ein chromatographisches System für den Austausch schwacher Ionen, wie zum Beispiel das Gel Toso Haas Toyopearl-DEAE 650 M, oder auch ein chromatographisches System für den Austausch starker Ionen, wie zum Beispiel das Gel Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech), eingesetzt werden. Wird die Ausgangslösung durch Reinigung mittels Ionenaustausch hergestellt, so enthält sie eine signifikante Menge an mit vWF hohen Molekulargewichtes assoziiertem Faktor VIII, und der Schritt a) ist unbedingt erforderlich.
Die Dissoziation des Schrittes a) kann zur gleichen Zeit wie die Elution oder, gemäß einem anderen Aspekt, nach der Elution vorgenommen werden. Eine in Gegenwart eines chaotropen Salzes vorgenommene Elution bewirkt im Vergleich zu einer in Gegenwart eines Salzes wie NaCl vorgenommenen Elution eine Erhöhung der Elutionsausbeute bei gleichzeitiger Gewährleistung der zur Durchführung des späteren Filtrationsschrittes unter den erforderlichen Bedingungen unerläßlichen Dissoziation.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die konzentrierte Faktor VIII-Lösung, die am Ende der Reinigung mittels Ionenaustauschchromatographie erhalten wird, unter den dissoziierenden Bedingungen des Schrittes a), das heißt in Gegenwart eines chaotropen Ions, eluiert.
Die vorherige Reinigung der Faktor VIII-Ausgangslösung kann auch durch eine Heparinpräzipitationstechnik erreicht werden. In diesem Fall adsorbiert man zum Beispiel in Gegenwart von Heparin eine kryogefällte Fraktion des Plasmas an einem Aluminiumhydroxidgel unter Kühlung auf eine Temperatur von ungefähr 14°C bis ungefähr 19°C und Zentrifugation. Ein erster, am Fällungsüberstand durchgeführter Virusinaktivierungsschritt kann vorteilhafterweise durch eine Lösungsmittel-Detergens-Behandlung ausgeführt werden, wie in der europäischen Patentveröffentlichung EP-A-0343275 beschrieben. Vor dem Chromatographieschritt durch Ionenaustausch werden pH-Wert und Osmolalität des Fällungsüberstandes eingestellt.
Schließlich kann auch in Erwägung gezogen werden, von einer Lösung von rekombinantem Faktor VIII auszugehen, die einen zusätzlichen Virusinaktivierungsschritt erfordern kann. Die Durchführung des Schrittes a) ist nicht erforderlich.
Die Faktor VIII-Ausgangslösung hat vorzugsweise eine spezifische Aktivität von mindestens gleich 50 IE/mg, vorzugsweise mindestens gleich 100 IE/mg, wobei die Filtrierbarkeit der Lösung mit der spezifischen Aktivität des Faktors VIII steigt.
Die angegebene spezifische Aktivität ist vor einer eventuellen Zugabe von Albumin zur Stabilisierung des Faktors VIII zu verstehen.
Insbesondere wird eine Ausgangslösung verwendet, in welcher die Konzentration an Faktor VIII: K etwa 2 bis etwa 100 E/ml, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 50 E/ml beträgt.
Der Proteingehalt der Faktor VIII-Ausgangslösung beträgt vorteilhafterweise etwa 0,05 bis etwa 0,5 mg/ml, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 0,5 mg/ml.
Der Proteingehalt wird durch die Bradford-Proteinbestimmungstechnik bestimmt (von der Firma Pierce vermarkteter Kit zur quantitativen Bestimmung).
Nach durchgeführter Filtration und Eliminierung der Dissoziationsmittel, zum Beispiel durch Dialyse, werden die filtrierten Faktoren VIII und von Willebrand in Form von Komplexen reassoziiert, und die formulierte Faktor VIII-Lösung wird, gegebenenfalls nach einem Lyophilisierungsschritt, für den kommerziellen Gebrauch gewonnen.
Die Erfindung hat auch eine bezüglich Viren sichere und im wesentlichen von vWF hohen Molekulargewichtes freie Faktor VIII-Lösung zum Gegenstand, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist.
Die Erfindung betrifft schließlich Lösungen, die gemäß der Erfindung erhalten wurden, als Medikament, insbesondere zur Behandlung von Hämophilie A.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele ausführlicher beschrieben, welche die Erfindung veranschaulichen, ohne jedoch deren Bereich einzuschränken. Die Beispiele werden von der 1 begleitet, die veranschaulicht:
1: Kurve, welche die Änderung der Filtrierbarkeit des Faktors VIII über eine Planova^® 15 N-Membran in Abhängigkeit von dem auf das System angewandten Druck verdeutlicht. Auf der Abszisse ist der Druck in Bar aufgetragen, und auf der Ordinate ist die Filtrationsausbeute in Prozent (Verhältnis zwischen der FVIIIK-Aktivität in IE/ml des Filtrats und der des Ausgangsproduktes) aufgetragen.
BEISPIEL 1: Herstellung einer Faktor VIII-Lösung aus einer kryogefällten Plasmafraktion durch Filtration.
Die Herstellung der Faktor VIII-Ausgangslösung wird entsprechend der Lehre des Patents FR 2 632 309 vorgenommen, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
835 g Kryopräzipitat, die 113,5 Litern Plasma entsprechen, werden durch 30-minütiges Rühren bei Umgebungstemperatur in einer heparinisierten Wasserlösung (3 IE/ml) erneut in Lösung gebracht. 4217 ml einer Lösung, die reich an Faktor VIII und Proteinen ist, werden durch Adsorption an 90 g Aluminiumhydroxidgel und durch saure Fällung (pH 6,50) und Senkung der Temperatur auf 15 bis 19°C geklärt. Ein an Fibrinogen und Fibronektin angereicherter Niederschlag wird durch Zentrifugation abgetrennt, was den Erhalt einer klaren Faktor VIII-Lösung von mittlerer Reinheit erlaubt, in welcher die umhüllten Viren durch Zugabe von Polysorbat 80 und Tri-n-butylphosphat (ad 1% beziehungsweise 0,3% in Lösung) für mindestens 6 Stunden bei pH 7,1 inaktiviert werden.
5172 ml Faktor VIII-Lösung, die bezüglich umhüllter Viren virusinaktiviert wurde, werden an 560 ml Chromatographie-Gel für den Austausch schwacher Anionen (Toso Haas Toyopearl-DEAE 650 M) adsorbiert, das zuvor in einer gepufferten Salzlösung äquilibriert wurde. Nach zwei Stunden Adsorption wird das Gel mit einer Salzlösung gewaschen, die eine Osmolalität von 390 mOsm/kg aufweist und auf pH 7,00 gepuffert ist. Die nicht am Gel adsorbierte Fraktion ist reich an Fibrinogen. Von dem Gel wird dann durch Erhöhung der Osmolalität auf 452 mOsm/kg eine mit von Willebrand-Faktor angereicherte Fraktion eluiert. Die konzentrierte Faktor VIII-Fraktion sehr hoher Reinheit wird dann durch Veränderung des pH auf 6,0 und Erhöhung der Ionenstärke eluiert. Die eluierte Fraktion wird dann auf eine CaCl₂-Konzentration von 0,35 M und eine Osmolalität von 1300 ± 100 mOsm/kg eingestellt. Diese Fraktion besteht wegen der Einwirkung des hohen Calciumgehaltes aus einer Mischung aus Faktor VIII und von Willebrand-Faktor in dissoziierter Form.
1260 ml Lösung, die bei +4°C stabil ist, werden extemporan auf 35°C erwärmt, um einem Viruseliminierungsschritt durch Filtration mittels eines BMM Planova^® 15 N-Filters mit einer Porositätsgrenze von 15 Nanometern und einer Oberfläche von 0,12 m² unterzogen zu werden. Der Durchfluß wird im Laufe der Filtration so gehalten, daß der Transmembrandruck stets unter 0,2 Bar liegt. Nach Filtration des Faktors VIII werden 210 ml gepufferte Salzlösung mit einer Osmolalität von 1300 mOsm/kg über die Membran filtriert, wodurch man 1470 ml Faktor VIII-Lösung gewinnt, die frei von pathogenen Viren ist. Die Pufferlösung erlaubt es, die Filter bezüglich Osmolalität und pH zu äquilibrieren und dient zum Spülen der Filter nach Filtration des Faktors VIII. Die erhaltene Faktor VIII-Lösung enthält wenig von Willebrand-Faktor mit sehr hohem Polymerisationsgrad (≥ 15), enthält aber ausreichend von Willebrand-Faktor mit einem Polymerisationsgrad ≥ 5 und ≥ 10, um nach Dialyse erneut den Faktor VIII zu komplexieren.
Ergebnisse:

Die Tabelle 1 gibt für die verschiedenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens die erhaltenen Mengen an Faktor VIII sowie die spezifische Aktivität (SA), den Proteingehalt und die Ausbeute des betreffenden Schrittes an. TABELLE 1

	Volumen (ml)	FVIII:K (IE/ml)	Proteine mg/ml	Gesamt-FVIII (IE)	SA (IE/mg)	Ausbeute (%)
Eluierte Lösung aus der Chromatographie	1260	22	0,32	27720	69	100
Bei 15 nm filtrierte Faktor VIII-Lösung	1470	12	0,14	17640	86	64
Dialysierte und konzentrierte Lösung	149	108	1,13	16092	95	58,1

BEISPIEL 2:
Die Bedingungen sind identisch mit denen des Beispiels 1, außer daß 10000 g Kryopräzipitat, die 1330 Litern Plasma entsprechen, eingesetzt werden. 13700 ml Faktor VIII-Lösung, die bezüglich umhüllter Viren virusinaktiviert wurde, werden filtriert. Nach Filtration des Faktors VIII werden 2 Liter Pufferlösung mit einer Osmolalität von 1300 mOsm/kg filtriert, wodurch man 15700 ml Faktor VIII-Lösung gewinnt, die frei von pathogenen Viren ist. Die verwendete Filtrationsmembran ist eine BMM Planova^® 15 N-Membran mit einer Oberfläche von 1,0 m².

Die nachstehend wiedergegebene Tabelle 2 gibt für eine Filtration von umgerechnet 1330 Litern Plasma über eine BMM Planova^® 15 N-Membran mit einer Oberfläche von 1,0 m² die bei den verschiedenen Schritten des Filtrationsverfahrens erhaltenen Mengen an Faktor VIII sowie die spezifische Aktivität und die Ausbeute des betreffenden Schrittes an. TABELLE 2

	Volumen (ml)	FVIII:K (IE/ml)	Proteine mg/ml	Gesamt-FVIII (IE)	SA (IE/mg)	Ausbeute (%)
Eluierte Lösung aus der Chromatographie	13700	15,0	0,09	205500	167	100
Bei 15 nm filtrierte Faktor VIII-Lösung	15700	7,9	0,045	124030	176	60,3
Dialysierte und konzentrierte Lösung	956	119	0,72	113764	165	55,5

BEISPIEL 3: Herstellung einer Faktor VIII-Lösung durch Filtration ausgehend von einer aus einem Kryopräzipitat des Plasmas stammenden und mittels Heparin-präzipitation vorgereinigten Fraktion.
Die Herstellung der Faktor VIII-Ausgangslösung wird entsprechend der Lehre des US-Patents 4 743 680 vorgenommen, dessen Inhalt durch Bezugnahme aufgenommen wird.
678 g Kryopräzipitat, die 92,2 Litern Plasma entsprechen, werden durch 30-minütiges Rühren bei Umgebungstemperatur in einer heparinisierten Wasserlösung (3 IE/ml) erneut in Lösung gebracht. 3424 ml einer Lösung, die reich an Faktor VIII und Proteinen ist, werden wie in Beispiel 1 geklärt.
4200 ml Faktor VIII-Lösung, die unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 bezüglich umhüllter Viren virusinaktiviert wurde, werden nach Ansäuern auf pH 6,50 an 300 ml Chromatographie-Gel für den Austausch starker Anionen (Pharmacia Biotech Q-Sepharose Fast Flow) adsorbiert, das zuvor in einer gepufferten Salzlösung äquilibriert wurde. Nach 2 Stunden 30 Minuten Adsorption wird das Gel mit einer Salzlösung gewaschen, die eine Osmolalität von 450 mOsm/kg aufweist und auf pH 6,50 gepuffert ist. Die nicht am Gel adsorbierte Fraktion ist reich an Fibrinogen. Von dem Gel wird dann durch Erhöhung der Osmolalität auf 581 mOsm/kg eine mit von Willebrand-Faktor angereicherte Fraktion eluiert. Die konzentrierte Faktor VIII-Fraktion von sehr hoher Reinheit wird dann durch Veränderung des pH auf 6,0 und Erhöhung der Ionenstärke eluiert. Die eluierte Fraktion wird dann auf eine CaCl₂-Konzentration von 0,35 M und eine Osmolalität von 1300 ± 100 mOsm/kg eingestellt. Diese Fraktion besteht wegen der Einwirkung des hohen Calciumgehaltes aus einer Mischung aus Faktor VIII und von Willebrand-Faktor in dissoziierter Form.
1280 ml Lösung, die bei +4°C stabil ist, werden extemporan auf 35°C erwärmt, um wie in Beispiel 1 einem Viruseliminierungsschritt durch Filtration über eine Planova^® 15 N-Membran mit einer Porositätsgrenze von 15 Nanometern und einer Oberfläche von 0,12 m² unterzogen zu werden. Ein Volumen von 180 ml Pufferlösung mit einer Osmolalität von 1300 mOsm/kg wird dann filtriert, wodurch man 1460 ml Faktor VIII-Lösung gewinnt, die frei von pathogenen Viren ist. Diese Faktor VIII-Lösung enthält wenig von Willebrand-Faktor mit sehr hohem Polymerisationsgrad (≥ 15), enthält aber ausreichend von Willebrand-Faktor mit einem Polymerisationsgrad ≥ 5 und ≥ 10, um nach Dialyse erneut den Faktor VIII zu komplexieren.
Ergebnisse:

Die nachstehend wiedergegebene Tabelle 3 gibt für die verschiedenen Schritte des Filtrationsverfahrens die erhaltenen Mengen an Faktor VIII, den Gesamtproteingehalt sowie die spezifische Aktivität (SA) und die Ausbeute des betreffenden Schrittes an. TABELLE 3

	Volumen (ml)	FVIII:K (IE/ml)	Gesamt-FVIII (IE)	Proteine mg/ml	SA (IE/mg)	Ausbeute (%)
Eluierte Lösung aus der Chromatographie	1280	19	24320	0,20	95	100
Bei 15 nm filtrierte Faktor VIII-Lösung	1460	13	18980	0,12	108	78
Dialysierte und konzentrierte Lösung	164	92	15088	0,95	97	62

BEISPIEL 4: Änderung der Filtrierbarkeit einer Faktor VIII-Lösung über eine Planova^® 15 N-Membran in Abhängigkeit von der Natur und der Konzentration der für die Dissoziation verwendeten Salze.
Ergebnisse:
Die nachstehend wiedergegebene Tabelle 4 veranschaulicht die Änderungen der Filtrationsausbeute in Abhängigkeit dieser verschiedenen Parameter, wobei die anderen Verfahrensbedingungen die gleichen bleiben, wie die in Beispiel 1 definierten. TABELLE 4

Dissoziationsmittel (M) Filtrationsausbeute (%)

CaCl₂ 0,35 M 45

NaCl 0,35 M 10

NaCl 1,0 M 26
Die Verwendung von Dissoziationsmitteln erlaubt eine signifikante Erhöhung der Filtrierbarkeit des Faktors VIII. Die Eliminierung dieser Mittel nach Filtration durch Dialyse bewirkt eine Reassoziation der Komplexe zwischen Faktor VIII und von Willebrand-Faktor. Die Analyse der erhaltenen Produkte zeigt eine gute Fähigkeit des von Willebrand-Faktors zur Bindung des Faktors VIII.
BEISPIEL 5: Änderung der Filtrierbarkeit einer Faktor VIII-Lösung über eine Planova^® 15 N-Membran in Abhängigkeit der Temperatur- und Druckparameter.
Die nachstehend wiedergegebene Tabelle 5 gibt die durch Änderung des Drucks und der Temperatur erhaltene Filtrationsausbeute an, wobei das für die Dissoziation verwendete Salz und seine Konzentration unverändert bleiben. Bei Erniedrigung der Temperatur bei einem gegebenen Druck ist eine signifikante Abnahme der Filtrationsausbeute zu beobachten.

1 veranschaulicht außerdem deutlich, daß eine Verringerung des transmembranen Drucks auf sehr niedrige Werte eine bedeutende Verbesserung der Ausbeute erlaubt. TABELLE 5

Dissoziationsmittel	Druck (Bar)	Temperatur (°C)	Filtrationsausbeute (%)
CaCl₂ 0,35 M	≤ 0,10	35 ± 2	70
CaCl₂ 0,35 M	≤ 0,20	35 ± 2	58
CaCl₂ 0,35 M	0,50	35 ± 2	45
CaCl₂ 0,35 M	≤ 0,20	20 ± 2	42

BEISPIEL 6: Untersuchung des Rückhaltevermögens für Viren des Filtrationssystems unter den Filtrationsbedingungen des Beispiels 1.
Als Virusmodell wird der Phage φ X 174 verwendet, dessen Größe auf 25–30 nm geschätzt werden kann. Die Membran und die Verfahrensbedingungen sind die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen.
Ergebnisse:
Die in der nachstehenden Tabelle 6 enthaltenen Ergebnisse zeigen ein durchaus zufriedenstellendes Rückhaltevermögen für Viren. TABELLE 6

Filtrationsfläche (m²) FVIII:K (IE/ml) filtriertes Volumen (l/m²) Viruslast (log) Zurückhaltung von Viren (log)

Beispiel 1 0,01 15 14 8,3 > 6,8

Beispiel 2 0,01 19 15 7,5 > 7,0
BEISPIEL 7: Auswirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf den vWF-Gehalt in der Faktor VIII-Lösung.
Der vWF-Gehalt sowie das Profil der vWF-Multimere vor und nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden an einer Faktor VIII-Lösung der in Beispiel 1 beschriebenen Art verglichen.

Die erzielten Ergebnisse sind in der nachstehende Tabelle 7 eingetragen. TABELLE 7

	Vor Filtration	Nach Filtration
FVIII (IE/ml)	17	7,9
vWF (IE/ml)	5,6	0,39
vWF/FVIII	0,33	0,05
vWF-Multimere ≥ 15	12%	-
vWF-Multimere ≥ 10	32,4%	3,3%
vWF-Multimere ≥ 5	71,5%	35,6%

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt somit durchaus den Erhalt einer Faktor VIII-Lösung, die im wesentlichen frei von vWF mit hohem Molekulargewicht und insbesondere im wesentlichen frei von den multimeren Formen mit einem Polymerisationsgrad ≥ 15 ist.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Faktor VIII-Lösung, die bezüglich Viren sicher ist, durch Filtration, gemäß welchem: – man eine Lösung herstellt, die Faktor VIII-Proteinkomplex umfasst; – man einen Schritt durchführt, welcher die Dissoziation von Faktor VIII-vNF-Komplexen mit hohem Molekulargewicht mittels eines chaotropen Ions in einer ausreichenden Menge, um die Dissoziation zu ermöglichen, gestattet; – man einen Schritt der Filtration der Lösung auf einem hydrophilen Filter mit einer Porosität von höchstens 15 nm durchführt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das chaotrope Ion ein zweiwertiges Ion ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das zweiwertige Ion das Ca²⁺-Ion ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das zweiwertige Ion in Form einer Salzlösung von 0,2 M bis zur Sättigung der Salze zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung eine CaCl₂-Lösung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Ca²⁺-Ion in Form einer CaCl₂-Lösung, 0,35 M bis Sättigung, zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Filter eine Planova^® 15 N-Membran ist, die bei einem Druck unterhalb von 0,3 Bar, bevorzugt unterhalb von 0,2 Bar verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt b) bei einer Temperatur in der Größenordnung von 35 ± 5°C bewirkt wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgangslösung durch Reinigung einer Plasmafraktion, insbesondere der kryogefällten Fraktion des Plasmas, mittels Ionenaustauschchromatographie erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die konzentrierte Faktor VIII-Fraktion, die am Ende der Reinigung mittels Ionenaustauschchromatographie erhalten wird, unter den dissoziierenden Bedingungen des Schritts a) eluiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Faktor VIII-Ausgangslösung durch Vorreinigung einer Plasmafraktion, insbesondere einer kryogefällten Fraktion des Plasmas, mittels Heparin-Fällung erhalten wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Faktor VIII-Ausgangslösung durch eine Lösungsmittel-Detergens-Behandlung teilweise bezüglich Viren inaktiviert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Faktor VIII-Ausgangslösung immungereinigten Faktor VIII umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Faktor VIII-Ausgangslösung rekombinanten Faktor VIII umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgangslösung plasmatischen Ursprungs ist
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Faktor VIII in der Ausgangslösung eine spezifische Aktivität von mindestens gleich 50 IE/mg, vorzugsweise mindestens gleich 100 IE/mg aufweist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Faktor VIII C der Faktor VIII-Ausgangslösung 2 bis 100 E/ml, vorzugsweise 10 bis 50 E/ml beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Proteinen der Faktor VIII-Ausgangslösung etwa 0,05 bis etwa 0,5 mg/ml, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 0,5 mg/ml beträgt.
Faktor VIII-Lösung, die bezüglich Viren sicher gemacht worden ist, erhältlich durch das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18.
Lösung nach Anspruch 19 als Medikament.
Lösung nach Anspruch 20 als Medikament für die Behandlung von Hämophilie A.