DE69227805T2

DE69227805T2 - Verwendung von Tri-n-Butylphosphat bei niedrigem pH in Lösungen von biologisch aktiven Proteinen für eine verbesserte viruzide Wirkung

Info

Publication number: DE69227805T2
Application number: DE69227805T
Authority: DE
Inventors: Milton B Dobkin; George B Dove
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1991-07-05
Filing date: 1992-06-23
Publication date: 1999-04-29
Anticipated expiration: 2012-06-24
Also published as: ATE174383T1; DE69227805D1; JPH05184361A; CA2072797A1; GR3029319T3; EP0523406B1; DK0523406T3; EP0523406A1; CA2072797C; ES2124235T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein Verfahren zur Inaktivierung von Viren in Lösungen therapeutischer biologisch wirksamer Proteine und insbesondere die Verwendung von Tri(n-butyl)phosphat (TNBP), und zwar unter unüblichen Bedingungen, die allerdings hinreichen, die viruzide Wirkung ohne gegenläufige Auswirkung auf die Proteine zu gewährleisten.
Die Verwendbarkeit nicht-explosiver organischer Lösungsmittelgemische zur Herstellung bzw. Zubereitung viraler Impfstoffe sowie, in jüngerer Zeit, zur Inaktivierung endogener Viren in Zubereitungen biologischer Produkte, die aus Humanplasma abgeleitet sind, ist durch die pH- Empfindlichkeit der Proteine von Interesse eingeschränkt gewesen.
Eine von üblichen viruziden Verbindungen, die im Zusammenhang mit biologisch wirksamen Proteinen verwendet werden, ist TNBP, das oft mit einem nicht-ionischen Detergens wie Polysorbat 80 (Tween 80) oder einem anionischen Detergens, wie Cholat, kombiniert wird. Die entsprechende Behandlung wird bei neutralem pH durchgeführt. Siehe z. B. Horowitz et al. Transfusion 1985; 25: 516-622.
In EP-A-0 306 778 ist ein Verfahren zur Sterilisation von Plasma oder Plasma-Fraktionen durch Behandlung dieser Materialien mit Tri(n- butyl)phosphat (TNBP) und Kaliumcholat, zusammen mit β-Propiolacton und/oder UV-Bestrahlung, bei einem pH von 4,5 bis 8,3 beschrieben.
In der Vergangenheit wurden biologisch wirksame Proteine (z. B. erhalten aus Blut) bei neutralem pH (d. h. von 6,8 bis 7,2) zubereitet, und es ist dieser pH-Bereich gewesen, bei dem viruzide Verbindungen angewendet worden sind. Die Entwicklung biologischer Produkte (hauptsächlich aus Antikörpern von IgG- und IgM-Typen) aus sowohl Humanplasma und Hybridoma- Technologie sowie aus rekombinanten DNA-Produkten hat seit kurzem Reinigungsverfahren bei viel niedrigeren pH-Werten möglich gemacht, und zwar ohne nachteilige Auswirkungen.
Es ist nun herausgefunden worden, daß eine neue pH-Abhängigkeit von TNBP zur Inaktivierung Lipid-umhüllter Viren besteht, wobei gleichzeitig die biologische Wirksamkeit von Proteinen wie Immunoglobulinen beibehalten wird. Bezüglich dieser pH-Abhängigkeit ist herausgefunden worden, daß sie in zufälliger Weise damit einhergeht und übereinstimmt, daß auch herausgefunden wurde, daß bestimmte biologisch wirksame Proteine (z. B. Antikörper) bei niedrigeren pH-Werten in vorteilhafter Weise verarbeitet werden können. Details der entsprechenden Erkenntnisse werden nun beschrieben.
Das entwickelte Verfahren zur Gewährleistung der wesentlichen Herabsetzung (virale Inaktivierung) Lipid-umhüllter Viren in einer wässrigen Lösung biologisch wirksamer, therapeutischer Proteine beruht darauf, daß man die Lösung mit TNBP, jedoch ohne UV-Bestrahlung oder β-Propiolacton, bei einem pH-Wert von 3,0 bis 5,0 und vorzugsweise von 4,0 bis 4,85 unter Bedingungen in Kontakt bringt, die hinreichen, die wesentliche Herabsetzung von Viren (Virus-Titer-Herabsetzung um mindestens 2 log-Einheiten) zu gewährleisten, und zwar ohne die biologische Wirksamkeit der Proteine gegenläufig zu beeinflussen (d. h. weniger als 3ß~ Wirksamkeitsverlust).
Fig. 1 ist ein Diagramm, worin die Beziehung des pH-Wertes zur Virus- Inaktivierung unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung dargestellt ist.
Fig. 2 ist ein Diagramm, worin der Effekt des pH-Wertes als Funktion der Zeit auf die Virus-Inaktivierung unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung dargestellt ist.
Der Beleg zur Untersützung der gesteigerten viruziden Wirksamkeit von TNBP bei niedrigem pH-Wert erfolgte gemäß der Darlegung einer ähnlichen pH- Abhängigkeit gesättigter Alkohole und Säuren mit Zwischenproduktkettenlänge zur Inaktivierung Lipid-umhüllter Viren (siehe z. B. Dopkin et al. Biologicals 1991; 19 (im Druck)). Es gibt keine veröffentlichte Literatur, aus der hervorginge, daß TNBP zur Inaktivierung von Viren bei einem pH-Wert unterhalb 6,0 angewandt wird (siehe z. B. Edwards et al. Vox Sanguinis 1987; 52: 53-59).

Materialien und Verfahren

Chemische Agentien

Tri(n-butyl)phosphat und das Detergens Polysorbat 80 (Tween 80) wiesen Reagensgrad-Reinheit auf und wurden von Sigma Chemicals St. Louis, Mo., erhalten. Protein-Lösungen wurden beim angegebenen pH-Wert mit Natriumacetat (J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ.) und TRIS-(hydroxymethyl)aminomethan (Trizma-Base, Sigma) gepuffert.

Virus

Vesicular stomatitis virus (VSV), Indiana-Stamm, erhalten vom Finnischen Roten Kreuz, ist ein Lipid-umhülltes Rhabdovirus. Vaccinia virus, Lederle-Stamm, ATCC VR-118, ist ein Lipid-umhülltes Poxvirus. Sindbis (Togavirus) und Visna (Lentivirus) sind Lipid-umhüllte Viren. Über die Ableitung/Derivation von Viren ist früher berichtet worden (siehe Lembach et al. Current Studies in Hematology and Blood Tranfusion, Basel, Karger, 1989; 56: 97-108).

Virus-Assay

VSV wurde unter Standard-Bedingungen auf Monoschichten von VERO-Zellen abgemessen, die in Platten mit 24 Vertiefungen unter Einsatz von vier Vertiefungen pro Verdünnung gezüchtet wurden. Die entsprechenden Titer sind als Gewebekulturinfektionsdosis-Mengen als ein 50%-End-Punkt pro ml (TCID&sub5;&sub0;/ml) ausgedrückt.
Weitere Viren wurden in ähnlicher Weise auf Monoschichten ihrer jeweiligen Wirtszellen unter Standard-Bedingungen unter Bewertung der zytopathischen Effekte abgemessen.

Proteine

Plasma-stämmiges IgM (pd-IgM) wurde aus Humanplasma mit dem Cohn- Oncley-Verfahren (Fraktion III), modifiziert gemäß Steinbuch, gereinigt. Humanserumalbumin wurde aus Humanplasma mit dem Cohn-Oncley-Verfahren (Fraktion V) gereinigt.
Monoclonaler Antikörper (vom Mensch) der Klasse G (m-IgG, anti- Tumornekrosefaktor, Zellinie mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB9736) stammte aus Epstein-Barr-Virus-transformierten menschlichen B-Lymphozyten, gezüchtet in Suspensionskultur. IgG wurde auf mehr als 98% durch Ionenaustausch- und Größenauschlußchromatographie gereinigt.
Die Protein-Gewinnung wurde mit A280, Radialimmunodiffusion, und FPLC- Superose 6 (Pharmacia-Schnell-Protein-Flüssigchromatographie durch Größenausschluß) bewertet.

Behandlungsprotokoll

Protein-Lösungen wurden mit einer 1/100-Verdünnung von Vorrats-Virus geimpft, um die Effekte von Virus-haltigem Medium zu minimieren. Ein Volumenanteil von TNBP oder von TNBP/Tween 80-Konzentrat wurde zugefügt, um eine Endkonzentration von 0,3% TNBP oder von 0,3% TNBP und 1,0% Tween 80 zu ergeben. Behandelte und Vergleichsproben wurden unter kontinuierlicher milder Vermischung bei 4 oder 24ºC unter den spezifizierten Bedingungen inkubiert. Es wurden in geeigneten Zeitabständen Proben gezogen und sofort bezüglich restlichem Infektionsvirus als Titer gemessen.

Ergebnisse

Wirkung des pH-Wertes auf die viruzide Wirksamkeit

Zur Bestimmung des Einflusses des pH-Wertes auf die Befähigung von TNBP zur Inaktivierung von Viren in einer Modell-Protein-Lösung wurde ein Versuch mit VSV in einer 0,5 mg/ml Lösung von Humanalbumin bei 4ºC 60 Minuten lang durchgeführt. Ausserdem wurde, zur entsprechenden Bewertung der viruziden Wirksamkeit der getrennten Komponenten sowie der Kombination, ei ne entsprechende Behandlung mit 0,3% TNBP, mit 1,0% Tween 80 oder mit einer Mischung aus 0,3% TNBP und 1,0% Tween 80 durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Vergleichsversuche sind in Tabelle 1 angegeben. Die Virus-Verringerung (log&sub1;&sub0;) ist als Funktion des pH-Wertes aufgetragen, wie in Fig. 1 gezeigt. Tabelle 1 Wirkung des pH-Wertes auf die Inaktivierung von VSV in 0,5 mg/ml Humanalbumin, enthaltend verschiedene Kombinationen von 0,3% TNBP und 1,0% Tween 80, bei 4ºC über 60 Minuten
Vergleich (kein TNBP oder TWEEN 80):
*: log&sub1;&sub0;TCID&sub5;&sub0;/ml
Ohne jede Inaktivierungswirkung des pH, per se, auf das Virus, wurde die maximale Virusabtötung mit TNBP, mit oder ohne Tween 80, bei einem pH- Wert von 4,0 bis 4,8 erhalten. Eine umgekehrte Beziehung wurde zwischen steigenden pH-Werten und der viruziden Wirksamkeit ermittelt. Unter den Bedingungen dieses Versuchs ist es klar, daß TNBP die wesentliche viruzide Komponente war, und Tween 80 keine Steigerung bei einem pH-Wert von weniger als 6,0 ergab.
In einem weiteren Versuch wurde die Wirkung des pH-Wertes auf die Inaktivierungskinetik von VSV in einer Lösung von pd-IgM, enthaltend 0,3% TNBP und 1,0% Tween 80 bewertet. Ausser den Proteinen und den viruziden Reagentien waren keine Salze oder weiteren Ionen in dieser Lösung vorhanden. Der pH-Bereich betrug 4,25 bis 5,1, und die Inkubationsbedingungen waren 24ºC 3 h lang.
Die Wirkung des pH-Wertes auf die virale Infektion ist aus Tabelle 2 ersichtlich. Die Virus-Verringerung (log&sub1;&sub0;) in pd-IgM ist als Funktion des pH-Wertes aufgetragen, wie in Fig. 1 gezeigt. Tabelle 2 Inaktivierungskinetik von VSV in pd-IgM bei einem pH von 4,25 bis 5,1, enthaltend 0,3% TNBP und 1,0% Tween 80 oder 0,3% TNBP allein, bei 24ºC 1 und 3 h lang
Vergleich (kein TNBP/Tween):
*: log&sub1;&sub0;TCID&sub5;&sub0;/ml
--: nicht getestet
Konsistent mit den vorherigen Meßergebnissen (Tabelle 1), wurde VSV auf einen Wert unterhalb der Minimalnachweisgrenze bei pH 4,25 und pH 4,4 in weniger als 1 h und bei pH 4,8 nach 3 h Behandlungsdauer herabgesetzt. Beim pH-Wert von 5,1 blieb Virus nach 3 h bei 24ºC nachweisbar, wobei eine Herabsetzung des Titer lediglich um 1,5 log-Einheiten erhalten wurde. Somit blieben, sogar in einer Umgebung niedriger Ionenstärke, 0,3% TNBP und 1,0% Tween 80 hoch viruzid, und zwar unter der Voraussetzung, daß die Behandlung unterhalb eines pH-Wertes von 5,1 durchgeführt wurde. Die letzte Spalte zeigt, daß das Vorhandensein des Polysorbat 80 (Tween 80) nicht erforderlich ist; die Inaktivierung bei niedrigerem pH-Wert war größer ohne das Tween 80.
Eine detaillierte Kinetikuntersuchung bei einem pH von 4,8 bis 4,95 ist in Tabelle 3 angegeben. Die entsprechende Virus-Verringerung ist als Funktion der Zeit in Fig. 2 aufgetragen. Die viruzide Wirksamkeit war viel größer bei pH 4,8, verglichen mit pH 4,95 oder 7,0. Tabelle 3 Inaktivierungskinetik von VSV in pd-IgM bei 24ºC 8 h lang
Vergleich (kein TNBP/Tween):
*: log&sub1;&sub0;TCID&sub5;&sub0;/ml
--: nicht getestet
Es wurden des weiteren Untersuchungen durchgeführt, um zu ermitteln, ob weitere Viren in ähnlicher Weise durch TNBP bei niedrigem pH-Wert inaktiviert wurden. Der Effekt von 0,3% TNBP und 1,0& Tween 80 bei pH 4,85 ist aus Tabelle 4 ersichtlich, die belegt, daß eine Vielzahl von Viren inaktiviert wird. Tabelle 4 Inaktivierungskinetik von VSV in pd-IgM bei pH 4,85, enthaltend 0,3% TNBP und 1,0% Tween 80, bei 24ºC 4 h lang
(): unbehandelt
*: log&sub1;&sub0;TCID&sub5;&sub0;/ml
--: nicht getestet
Die Protein-Gewinnung unter verschiedenen Bedingungen ist in Tabelle 5 angegeben. Die Gewinnung war unter diesen Bedingungen nicht wesentlich beeinflußt. Festzustellen ist, daß die Wirkungen eines niedrigen pH-Wertes allein für spezifische Proteine von Nachteil sein können. Allerdings wurde, im Fall der Antikörper und der weiteren genannten Proteine, kein signifikanter Aktivitätsverlust nach Anwendung der bei niedrigem pH-Wert durchgeführten Verfahren der vorliegenden Erfindung festgestellt. Tabelle 5 Wirkung verschiedener Bedingungen auf die Protein-Gewinnung in gepufferten Lösungen, enthaltend 0,3% TNBP und 1,0% Tween 80, bei 24ºC 8 h lang
Im Lichte der oben offenbarten Beschreibung ist davon auszugehen, daß sich dem Durchschnittsfachmann einschlägige Variationen ohne weiteres und unmittelbar erschließen. Somit sollen die obigen Beispiele lediglich als Erläuterung angegeben und die hier offenbarte Erfindung nur auf die folgenden Ansprüche eingeschränkt sein.

Claims

1. Verfahren zur Inaktivierung von Viren in einer wässrigen Lösung therapeutischer, biologisch wirksamer Proteine, wobei das Verfahren Stufen umfaßt, in denen man die Lösung mit TNBP, jedoch ohne UV-Bestrahlung oder β-Propiolacton, bei einem pH-Wert von 3,0 bis 5,0 unter Bedingungen in Kontakt bringt, die hinreichen, eine wesentliche Herabsetzung der Viren ohne gegenläufige Auswirkung auf die Proteine zu gewährleisten.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Lösung mit TNBP und einem Detergens in Kontakt gebracht wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Detergens Polysorbat 80 ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der pH-Wert ca. 4,0 bis ca. 4,85 beträgt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Proteine Antikörper sind.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die Antikörper vom IgM- oder vom IgG-Typ sind.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Herabsetzung der Viren mehr als 2 log-Einheiten ausmacht.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die gegenläufigen Auswirkungen auf die biologische Wirksamkeit der Proteine weniger als 30% ausmachen.