DE60017243T2

DE60017243T2 - Verfahren zur inaktivierung von pathogenen mittels breitspektrum-pulslicht

Info

Publication number: DE60017243T2
Application number: DE60017243T
Authority: DE
Inventors: William H. Cover; M. Jeffrey BOEGER; J. Catriona MCDONALD; Sean Maloy; Hugh Andrew BUSHNELL; Randall James COOPER
Original assignee: PurePulse Technologies Inc
Current assignee: PurePulse Technologies Inc
Priority date: 1999-02-13
Filing date: 2000-02-11
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2020-02-12
Also published as: DE60017243D1; NO20013918D0; CN1344170A; KR20010108199A; EP1152773B1; BR0008211A; ATE286407T1; JP2002536424A; RU2001125094A; CA2360131A1; NO20013918L; KR100630520B1; WO2000047240A1; AU779193B2; AU3229100A; EP1152773A1; MXPA01008170A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Verwendung biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen in der wissenschaftlichen Forschung und bei der Herstellung von pharmazeutischen/therapeutischen Substanzen ist weltweit verbreitet. Das menschliche Blut wird routinemäßig als Quelle für Proteinmittel für die Behandlung verschiedener Erkrankungen und Störungen verwendet; z.B. wird Blutplasma fraktioniert, um Faktor VIII, Faktor IX, Antithrombin, Transferrin, Albumin, Immunglobuline und Thrombocyten, wie auch andere Therapeutika bereitzustellen. Gewebekulturverfahren werden allgemein für die Herstellung vielfältiger pharmazeutischer/therapeutischer Mittel und verwandter Zusammensetzungen verwendet, wie z.B. rekombinanter DNA und/oder rekombinantem Protein aus gentechnisch verarbeiteten Zelllinien, viralen Vektoren, Aminosäuren, Peptonen, Insulin und monoklonalen Antikörpern. Auf ähnliche Weise werden von Tieren abgeleitete Reagenzien, wie z.B. Rinderserumalbumin (BSA) und Schafsblutbestandteile routinemäßig in der Forschung und der Herstellung verwendet.
Da diese Zusammensetzungen von lebenden Organismen, einschließlich den Menschen, Tieren und Pflanzen abstammen, können sie mit einem oder mehreren Viren, Bakterien oder anderen Pathogenen kontaminiert sein. Sollte ein Mensch oder ein anderes Tier in Kontakt mit einem solchen kontaminierten Produkt kommen, können sich daraus eine Infektion, eine Erkrankung und selbst der Tod des Individuums ergeben. Dieses Infektionsrisiko ist dann besonders von Interesse, wenn das Individuum routinemäßig über eine längere Zeitspanne mit einer Zusammensetzung behandelt werden muss; einige Bluterkranke werden z.B. regelmäßig mit von Blut abgeleiteten Zusammensetzungen behandelt, und zwar über ihre gesamte Lebenszeit. Auf ähnliche Weise sind Personen, die ein schwer beeinträchtigtes Immunsystem aufweisen, wie z.B., solche, die an dem erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS) leiden, dem besonderen Risiko einer Infektion durch Aussetzen gegenüber kontaminierenden Pathogenen in biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen ausgesetzt. Tiere, die mit veterinärmedizinischen Pharmazeutika behandelt werden, haben ebenfalls das Risiko kontaminierter Zusammensetzungen. Zusätzlich zu dem Risiko einer Infektion für das Individuum, das eine biologisch abgeleitete Zusammensetzung erhält, kann auch die Wirksamkeit der Zusammensetzung selbst durch die Gegenwart viraler, bakterieller oder anderer pathogener Kontaminanten beeinträchtigt sein.
Biologisch abgeleitete Zusammensetzungen werden nicht nur für die Produktion von pharmazeutischen/therapeutischen Substanzen verwendet, sondern solche Produkte werden auch häufig als Reagenzien (oder zur Erzeugung von Reagenzien) für die biologische Forschung verwendet. Wenn ein biologisch abgeleitetes Reagenz mit einem Virus, einem Bakterium oder einem anderen Pathogen kontaminiert ist, kann das Forschungsprojekt, für das es verwendet wird, nutzlos oder unschlüssig werden oder noch schlimmer in die falsche Richtung führen. Blutprodukte, die häufig bei der Herstellung und der Forschung verwendet werden, beinhalten BSA und menschliche Blutplasmaproteine.
Rekombinante DNA und Proteine, monoklonale Antikörper, virale Vektoren und verwandte Zusammensetzungen sind ebenfalls Beispiele für biologisch abgeleitete Zusammensetzungen, die sowohl in der Forschung als auch in Herstellungsverfahren verwendet werden. Während diese Produkte weniger wahrscheinlich durch Viren, Bakterien und/oder andere Pathogene kontaminiert sind, ist eine solche Kontamination nichtsdestotrotz möglich. Wenn solche Zusammensetzungen als Mittel in der Forschung verwendet werden, können sie zudem, falls sie kontaminiert werden, ein signifikantes Risiko für eine solche Forschung darstellen, was die Kontamination auch hier zu einem Gesichtspunkt macht.
Daher benötigen biologisch abgeleitete Zusammensetzungen, insbesondere diejenigen von menschlichem oder tierischem Ursprung, einschließlich z.B. Zelllinien, Blut und/oder Plasma, eine stringente virale Sicherheitsüberprüfung vor der Vermarktung. Gängige Ansätze zur Bereitstellung einer solchen Sicherheit beinhalten die Überprüfung von Ausgangsmaterialien und dem Produkt im Hinblick auf Viren, Bakterien und/oder Pathogene auf spezifischen Herstellungsstufen, unter Verwendung von Infektionsassays oder anderen diagnostischen Tests. Die Wirksamkeit der Überprüfung von Materialien wird durch das zur Verfügung stehende Testverfahren begrenzt, durch die Assayempfindlichkeit sowie durch die Möglichkeit eines nicht nachweisbaren unbekannten oder mutierten Pathogens, insbesondere eines Virus. Daher sind bei der Entwicklung von Herstellungsverfahren Verfahrensschritte enthalten, die so entworfen sind, dass die Viren und/oder Pathogene aus solchen biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen entfernt oder inaktiviert werden. Diese Verfahren werden im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Entfernung oder Inaktivierung von Viren auf ein Niveau einer Sicherheit überprüft, das benötigt ist oder am geeignetsten erscheint. Die Summe der logarithmischen Reduktionen für jeden Verfahrensschritt bestimmt die Gesamteffektivität der viralen Clearance. Z.B. ist mindestens eine log-Reduktion im viralen Gehalt in jedem Verfahrensschritt nötig.
Z.Z. stehen etliche Verfahren für eine Dekontaminierung oder Sterilisierung biolgisch abgeleiteter Zusammensetzungen zur Verfügung. Im allgemeinen beinhalten diese Behandlungsverfahren physikalische Verfahren, chemische Verfahren, Hitzeverfahren, Bestrahlungsverfahren und vorzugsweise eine Kombination davon. Eine verlängerte Erwärmung biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen; die Behandlung solcher Zusammensetzungen mit ein oder mehr Chemikalien, kombiniert mit einer Erwärmung oder Bestrahlung und die Verwendung von Lösungsmittel-Detergens-Verfahren der viralen Inaktivierung sind drei der am häufigsten verwendeten Verfahren einer Dekontaminierung biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen. Es hat sich jedoch kein einzelnes Verfahren einer Deaktivierung von Pathogenen, insbesondere Viren, in biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen als erfolgreich gegenüber einem breiten Spektrum darauffolgend pathogener Mittel erwiesen. Außerdem benötigen die meisten dieser Verfahren eine weitere Verarbeitung der biologischen Zusammensetzung, um die verwendeten Chemikalien für die Deaktivierung der Viren, der Bakterien und/oder anderer Pathogene, zu entfernen. Häufig beinhalten diese zusätzlichen Verarbeitungsschritte einen oder mehr Extraktionsschritte und/oder Chromatografieschritte, was die Herstellungskosten des Endprodukts dramatisch erhöht und daher den Verkaufspreis des Produkts an den Verbraucher erhöht.
Beispielhafte physikalische Verfahren, die zur Verfügung stehen, um Viren und/oder andere Kontaminanten zu entfernen oder zu inaktivieren, beinhalten hochspezialisierte Filtrationsverfahren, eine Affinitätschromatographie, eine Ionenaustauschchromatographie und eine Polyethylenglycolfraktionierung. Diesen physikalischen Verfahren sind jedoch viele Begrenzungen auferlegt, insbesondere weil viele Zusammensetzungen nicht so gefiltert werden können. Auf diese Weise stehen Filtration, Chromatographie und andere physikalische Verfahren, soweit sie verwendet werden, häufig als ein Teil in einer Reihe von Dekontaminierungsverfahren. Um z.B. relativ reine Lösungen aus Faktor VIII, Faktor IX oder Immunglobulin herzustellen, kann Blutplasma zunächst einem Lösungsmittel-Detergensbehandlungsprotokoll unterzogen werden, dann chromatographisch behandelt und schließlich weiter gefiltert werden, um das gewünschte Endprodukt zu ergeben. Eine Ultrafiltration kann verwendet werden, um Parvovirus aus Blut oder Blutprodukten zu eliminieren, jedoch ist dieses Verfahren nur teilweise effektiv. Es kann z.B. auf Faktor IX-Konzentrate, jedoch nicht auf Faktor VIII angewendet werden.
Andere wohl bekannte Verfahren zur Entfernung oder Inaktivierung von Viren, Bakterien und/oder anderen Pathogenen, die biologisch abgeleitete Zusammensetzungen kontaminieren, werden z.B. in dem US-Patent Nr. 4,540,573 (Neurath, et al.), US-Patent Nr. 4,946,648 (Dichtelmüller et al.), US Nr. 5,418,130 (Platz, et al.), US-Patent Nr. 5,527,704 (Wolf, Jr., et al.), US-Patent Nr. 5,663,043 (Zepp, et al.) und US-Patent Nr. 5,866,316 (Kempf, et al.) beschrieben. Diese Patente beschreiben die Kombinationsbehandlungen biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen, insbesondere von Säugerblutprodukten, wie z.B. Plasma, Plasmafraktionen oder Blutzellstoffen (Erythrocyten, Thrombocyten oder Proteinfraktionen), um virale und/oder bakterielle Kontaminanten zu inaktivieren. Weiterhin beinhalten alle beschriebenen Verfahren die Verwendung von mindestens einer Chemikalie, um den kontaminierenden Organismus entweder direkt abzubauen oder ihn gegenüber einem Abbau durch eine andere Chemikalie oder Wärme oder Bestrahlung empfindlich zu machen.
Die Verwendung solcher kombinierter Behandlungsverfahren ist effektiver und verlässlicher im Hinblick auf einige Viren als die Behandlung mit einer einzelnen Chemikalie. Experimente haben z.B. gezeigt, dass eine kalte Behandlung mit β-Propionolacton allein nur eine 0–3 log Inaktivierung von HIV und SV40 in Plasma bereitstellte (Scheidler et al., 1998) und dass die Behandlung mit Blutplasma mit einer UV-Bestrahlung allein ein Schutz gegenüber einer Hepatitisinfektion für nur ungefähr 40 % der Empfänger. bereitstellte; während demgegenüber sich eine Infektionsrate von null aus der Verwendung von Plasma ergab, das mit sowohl β-Propionolacton als auch einer UV-Bestrahlung behandelt worden war. (Lo Grippo, et al., "Human Plasma Treated With Ultraviolet and Propiolactone - Six year Clinical Evaluation." JAMA 1987:722–726 (1964).) Verständlicherweise wird die Verwendung einer einzelnen Chemikalie allein zur Inaktivierung viraler Kontaminanten in biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen daher immer weniger bevorzugt.
Die US-Patent Nrn. 4,726,949, 4,866,282 und 4,952,812, an Miripol, et al. (hiernach gemeinsam als Miripol-Patente bezeichnet) beschreiben die Bestrahlung einer dünner Schicht weißer Blutzellen mit einer UV-Bestrahlung, vorwiegend in einer Wellenlänge von 280 bis 320 nm für ungefähr 0,25 bis 15 Minuten, um die weißen Blutzellen dazu zu bringen, ihre Fähigkeit einer Immunreaktion in einem alloimmunisierten Patienten im wesentlichen zu verlieren. Die Miripol-Patente lehren, dass Ultraviolettbirnen, die eine signifikante Energie bei einer Wellenlänge von 254 nm emittieren, bei der Durchführung der beschriebenen Verfahren zu vermeiden sind, da Licht bei einer solchen Wellenlänge Schäden an den Blutzellen auslöst.
Ähnlich wird der UV-A-Bereich (ungefähr 365 nm) als unerwünscht identifiziert, da er keine gute Reduktion der Lymphocyten-Alloimmunisierungswirkung bereitstellt. Obwohl die Miripol-Patente ein Verfahren zur Bestrahlung eines Blutprodukts (nämlich weißer Blutzellen) mit UV-Bestrahlung beschreiben, gibt es keinen Hinweis darauf, dass solche Verfahren für die Dekontaminierung biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen durch das Inaktivieren von Viren, Bakterien und/oder anderen Pathogenen nützlich wären, noch gibt es einen Hinweis, dass Lichtpulse mit einem breiten Spektrum, was notwendigerweise Licht sowohl im Bereich von 254 als auch 365 nm umfasst, eine verbesserte Dekontaminierung im Vergleich zu der UV-Bestrahlung allein bereitstellen könnte.
WO-A-9600091 beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Virusinaktivierung bei Proben mit biologisch aktiven Komponenten, abgeleitet von potentiell Virus-infizierten Quellen durch differentielle Bestrahlung der Probe oder Quellen mit elektromagnetischer Bestrahlung, erzeugt durch eine einstellbare Laservorrichtung für eine Inaktivierung des Virus, jedoch nicht der Aktivität der biologisch aktiven Komponenten. Die Laserbestrahlung hat eine Wellenlänge im Bereich von 300 bis 370 nm.
Während verschiedene Verfahren einer Dekontaminierung biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen bekannt sind und verwendet werden, wurde noch kein Verfahren entwickelt, das in verlässlicher Weise gegen die meisten pathogenen Mikroorganismen wirkt und das in sicherer Weise an biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen, einschließlich therapeutischen Proteinen und/oder anderen Biomolekülen verwendet werden kann. Wärmebehandlungen machen in der Regel eine große Menge Zeit notwendig und können gegenüber den Proteinen oder dem anderen Mittel, das gewonnen werden soll, nachteilig sein; Plasmaproteinfraktionen und Humanalbumin benötigen z.B. eine Erwärmung auf 60°C für 10 bis 11 Stunden zur Inaktivierung von Viren. Parvovirus, Hepatitis A und andere nicht Lipid umhüllte Viren haben sich als resistent gegenüber Lösungsmittel/Detergensbehandlungen erwiesen und Parvovirus hat sich auch als resistent gegenüber einer Hitzeinaktivierung erwiesen.
Unter Einbeziehung der Bevorzugung von Dekontaminierungsverfahren durch Zugabe von Chemikalien zu der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung wurde eine Anzahl von Verfahren für die Entfernung oder Deaktivierung dieser Zusammensetzungen nach einer solchen Dekontaminierungsbehandlung entwickelt. Die US-Patent Nrn. 4,540,573 (Neurath, et al.), 4,789,545 (Woods, et al.) und 5,817,765 (Isaksson, et al.) beschreiben z.B. unterschiedliche Verfahren für eine Abtrennung von einem biologisch abgeleiteten Endprodukt von den darin vorliegenden chemischen Kontaminanten als Ergebnis von Behandlungen zur Deaktivierung pathogener Determinanten. Offensichtlich ist der Bedarf zur Durchführung zusätzlicher Verarbeitungsschritte, um vorher zugefügte Chemikalien aus einer biologisch abgeleiteten Zusammensetzung zu entfernen, nicht wünschenswert.
Während Bakterien und andere pathogene Kontaminanten bei der Herstellung und Verwendung biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen von Interesse sind, sind Viren häufig von noch größerem Interesse. Die Viren werden häufig aufgrund ihres Genoms gruppiert, d.h. DNA- oder RNA-Viren und/oder gemäß den physikalischen Eigenschaften, nämlich ob sie umhüllt oder nicht umhüllt sind. Weiterhin werden individuelle Viren allgemein in eine Familie von Viren kategorisiert, mit denen sie bestimmte evolutionäre Eigenschaften sich teilen. Viren in der Herpesvirusfamilie (Herpesviridae) sind z.B. umhüllte DNA-Viren und Viren in der Adenoviridae-Familie sind nicht umhüllte DNA-Viren. Beispiele für umhüllte und nicht-umhüllte RNA-Virus-Familien sind jeweils die Flaviviridae-Familie (die Gelbfiebervirus, Hepatitis C-Virus und Rinder-Diarrhoe-Virus beinhaltet) und die Picornaviridae-Familie (die Poliovirus, Rhinovirus und Hepatitis A-Virus beinhaltet). Natürlich sind diejenigen Viren, die gegenüber Menschen besonders virulent sind und/oder in biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen besonders häufig vorliegen, bei der Entwicklung und Implementierung von Dekontaminierungsverfahren besonders zu bedenken. Solche Viren beinhalten z.B. Parvovirus, Simian Virus (SV40), menschlichen Immundefizienz-Virus (HIV), Hepatitis-Viren und das Virus der bovinen viralen Diarrhoe (BVDV).
Parvovirus ist ein nicht-umhüllter DNA-Virus. Die Infektion mit menschlichem B19-Parvovirus kann zu einer Fehlgeburt oder einer persistenten Anämie bei mit HIV Infizierten führen. Parvovirus kann durch Blut oder Blutprodukte übertragen werden und ist resistent sowohl gegenüber einer Wärmebehandlung als auch gegenüber einer Lösungsmittel/Detergensbehandlung. Es wurde sogar mit Zusammensetzungen übertragen, die durch eine Kombination von zwei Inaktivierungsverfahren behandelt wurden. Kaninchen-Parvovirus (CPV) ist in der Umgebung ubiquitär und ist ein schwerwiegendes veterinärmedizinisches Pathogen, gegen das Impfstoffe nötig sind. Signifikanterweise haben sich Fotoinaktivierungsverfahren, die sich als fähig zur Inaktivierung von HIV erwiesen haben, als nicht effektiv gegenüber CPV erwiesen (Hirayama et al., 1997).
Das Simian Virus (SV40) ist ein nicht-umhülltes DNA-Virus. Eine nicht-beabsichtigte menschliche Aussetzung gegenüber SV40 trat in den 50ern und frühen 60ern des 20. Jahrhunderts auf, als Polio- und Adenovirusvaccine, hergestellt in Rhesusaffenzellen, die SV40 enthielten, verwendet wurden, Shah, K., et al., Am. J. Epidemiology, 103:1–12 (1976). Während epidemiologische Untersuchungen keine erkennbare Beziehung zwischen einer Aussetzung gegenüber SV40 und der Entwicklung von Tumoren gefunden haben (insbesondere keine Assoziation zwischen der Aussetzung gegenüber SV40-kontaminierten Poliovaccinen und der Inzidenz von Tumoren des Gehirns und Ovarien), wurden kürzlich DNA-Sequenzen, die mit SV40 in Beziehung stehen, in einer Vielzahl menschlicher Gewebe nachgewiesen. SV40-verwandte DNA wurde in z.B. Choroid-Plexus-Tumoren, Ependymom, Mesotheliom und Osteosarcomen gefunden. Siehe z.B. Bersagel, et al., NEJ Med., 326:988–93 (1992); Carbone, et al., Oncogene 9:1781–90 (1994); Cristando, et al., J. Environ. Pathol Toxicol Oncol., 14:29–34 (1995); und Martini, et al., Cancer Res., 56:4820–25 (1996). Weiterhin wurde infektiöses SV40 aus einem Choroid-Plexus-Tumor isoliert; Lednecky, et al., Virology, 212:710–717 (1995). Es ist unklar, unter welchen Umständen und in welchem Ausmaß SV40 Kontaminanten in biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen Empfänger eines solchen Produkts infizieren können. Es ist daher vorteilhaft, sich zu bemühen, SV40, das in biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen vorliegt, vor der Verabreichung derselben zu entfernen oder zu inaktivieren.
Unglücklicherweise hat sich SV40 als relativ wärmeresistent und nur inkonsistent durch β-Propionolactonbehandlung inaktiviert erwiesen. Siehe Lelie, et al., J. Med. Virol., 23(3):297301 (Nov. 1987) und Scheilder, et al. Biologicals, 26(2):135–144 (Juni 1998).
Menschlicher Immundefizienzvirus (HIV) ist ein wohl bekanntes nicht-umhülltes RNA-Virus, das zur Erkrankung und Tod beim Menschen führt. Unter den geeigneten Bedingungen kann HIV durch gamma-Bestrahlung inaktiviert werden (Salai et al., Ann. Transplant, 2(1):55–56, 1997) sowie durch einige Chemikalien (Dewilde et al., Biol. Chem., 379(1):1377–79, 1998, Arthur et al., AIDS Res. Human Retroviruses, 14 (Suppl. 13):5311–19 (Okt. 1998). HIV-2 zeigt jedoch nur eine begrenzte Inaktivierung durch β-Propionolacton (Scheidler et al., Biologicals, 26(2):135–44 (Juni 1998). Ähnlich hat sich die Wärmebehandlung von HIV als nur bei einigen Zusammensetzungen als effektiv erwiesen (Azari et al., Artif. Cells Blood Substit. Immobil Biotech, 26(5–6):577-82 (Nov. 1998)); während sowohl HIV-1 als auch -2 durch ein geeignetes Lösungsmittel/Detergens innerhalb einiger Minuten inaktiviert werden können (Biesert, at al. Vox Sang 74 (Suppl 1):207–212 (1998). Es wurde ebenfalls berichtet, dass HIV durch eine Kombinationsbehandlung von sichtbarem Licht und dem Farbstoff Methylen-blau inaktiviert werden kann (Muller-Breitkreutz und Mohr, 1998).
Das Virus der bovinen viralen Diarrhoe (BVDV) ist ein umhülltes RNA-Virus der Flavivirus-Familie, das zu schweren Erkrankungen bei Rindern führt. Da dieses Virus in der Lage ist, die Plazenta zu überqueren und den Rinderfötus zu infizieren wird geschätzt, dass zwischen 10 und 75 % der kommerziellen Produkte von fötalem Rinderserum mit BVDV kontaminiert sind. Während unklar ist ob, unter welchen Umständen und in welchem Ausmaß BVDV Menschen infizieren kann, ist seine Gegenwart mit einer infantilen Gastroenteritis und Mikorcephalie beim Menschen verbunden (Harasawa, 1997). Zusätzlich sollte bedacht werden, dass nicht-cytopathische Stämme von BVDV Wirtszell-RNA in ihre Genome inkorporieren können und dadurch die Frage einer Onkogenizität innerhalb kontinuierlicher Zelllinien, die mit diesem Virus kontaminiert sind, hervorrufen. Eine begrenzte Inaktivierung von BVDV wurde unter Verwendung von Chemikalien erreicht, wie z.B. β-Propionolacton (Scheidler et al., Biologicals, 26(2):135–144 (Juni 1998). Zusätzlich hat sich eine Wärmebehandlung bei 74°C für 90 Minuten als effektiv zur Bewirkung einer 7 log-Reduktion von BVDV erwiesen (Azari et al., Actif. Cells Blood Substit. Imobil. Biotech. 26(5-6):577–82 (Nov. 1998). Offensichtlich ist eine solch heftige und verlängerte Wärmebehandlung für viele kontaminierte Zusammensetzungen nicht geeignet.
Lichtpulse mit breitem Spektrum (BPL) stellen einen Ansatz zur Deaktivierung von Mikroorganismen unter Verwendung von hoch-intensiven Lichtpulsen von kurzer Dauer von inkohärentem, polychromatischem Licht mit einem breiten Spektrum bereit. BPL unterscheidet sich von dem kontinuierlichen Nicht-Puls-UV-Licht in mehreren Punkten. Das Spektrum von BPL enthält UV-Licht, enthält jedoch auch ein breiteres Lichtspektrum, insbesondere zwischen ungefähr 180 und ungefähr 2.600 nm. Das Spektrum von BPL ist ähnlich demjenigen des Sonnenlichts auf Seeniveau, obwohl es 90.000-fach intensiver ist und beinhaltet UV-Wellenlängen zwischen 200 und 300 nm, die normalerweise durch die Atmosphäre der Erde gefiltert werden. BPL wird in Lichtpulsen kurzer Dauer mit relativ hoher Energie angewandt im Vergleich mit den längeren Aussetzungszeiten und der niedrigen Energie von nicht-gepulstem UV-Licht. Siehe z.B. US-Patente Nr. 5,034,235 (Dunn et al.), 5,498,442 (Dunn et al.), 5,768,853 (Bushnell et al.) und 5,786,598 (Clark et al.).
BPL wurde verwendet, um verschiedene Zielobjekte zu dekontaminieren und/oder zu sterilisieren, wie z.B. Nahrungsprodukte, Verpackungen, Wasser und andere flüssige, halbflüssige und feste Objekte. Vorrangig wird dieses bewirkt, indem das Zielobjekt in eine BPL-Sterilisationskammer platziert wird oder indem das Zielobjekt durch diese geführt wird und indem das Objekt einer geeigneten Anzahl von BPL-Blitzen mit einem geeigneten Energieniveau ausgesetzt wird. Siehe z.B. die obigen vier Patente und 5,900,211 (Dunn, et al.). Es ist jedoch wichtig, dass die Verwendung von BPL zur Dekontamination von biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen bis jetzt weder beschrieben noch betrachtet wurde. Während demonstriert wurde, dass BPL für die Deaktivierung verschiedener Mikroorganismen auf der Oberfläche fester Objekte und/oder in bestimmten relativ transparenten Flüssigkeiten nützlich ist, gab es keine Vorschläge, dass BPL für die Dekontamination biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen, enthaltend Proteine und/oder andere Biomoleküle von Interesse, nützlich sein könnte. Da biologisch abgeleitete therapeutische und pharmazeutische Zusammensetzungen häufig intravenös verabreicht werden und jedenfalls in konzentrierter Form ist die vollständige Entfernung kontaminierender Mikroorganismen für die Sicherstellung der Sicherheit kritisch. Ähnlich muss ein Dekontaminierungsverfahren gewählt werden, das die biologisch abgeleitete Zusammensetzung effektiv und verlässlich dekontaminiert ohne die Effektivität des Endprodukts in nachteiliger Weise zu beeinflussen.
BPL stellt biologische Effekte bereit, die sich von denen von nicht-gepulstem UV-Licht unterscheiden. Pigmentierte Bakterien, wie z.B. Aspergillus niger, sind bekanntlicherweise gegenüber einer UV-Bestrahlung resistenter als Bazillussporen. In Studien unter Verwendung von BPL war jedoch Aspergillus niger auf trockenen Oberflächen gegenüber BPL empfindlicher als drei unterschiedliche Bazillussporen: Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus pumilus. Weiterhin verletzt konventionelle UV-Behandlung DNA durch Mechanismen, die unter bestimmten experimentellen Bedingungen umgekehrt werden können, und die als entweder "dunkel-enzymatische Reparatur" oder "Licht-enzymatische Reparatur" klassifiziert sind (Block, S., Disinfection, Serilization and Preservation, 4. Ausgabe, Williams und Wilkins, USA (1991)). Diese Fotoreaktivierung durch entweder Dunkel- oder Lichtenzyme tritt nicht auf, wenn BPL verwendet wird um dieselben Mikroorganismen zu behandeln (wie z.B. Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Aspergillus niger, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis und Pseudomonas aeruginosa). (Furukawa, et al., "Brand New Pulsed Light Sterilization Technology Can Sterilize Both Injectable Solution and its 2 mL Polyethylene Container", vorgestellt auf dem PDA International Congress, Japan (Feb. 1999). Die Gegenwart von Wellenlängen im sichtbaren Bereich differenziert BPL weiterhin von UV-Licht wie auch das Mittel zur Erzeugung von zwei unterschiedlichen Lichtarten. UV-Licht wird in der Regel unter Verwendung von Quecksilberlampen erzeugt, die zu einigen Sicherheitsgefahren führen; während BPL durch Lampen erzeugt wird, die ein inertes Gas verwenden, d.h. Xenon.
Was daher notwendig ist, ist ein neues Verfahren zum Inaktivieren von Viren, Bakterien und/oder anderen Pathogenen, enthalten in biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen, das gegen eine Vielzahl von Pathogenen effektiv ist, insbesondere eine Vielzahl von Viren und das auf eine Vielzahl von Zusammensetzungen angewendet werden kann, ohne die Wirksamkeit des Endprodukts in unnötiger Weise zu kompromittieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die obigen und andere Bedürfnisse durch Bereitstellung eines Verfahrens für die Dekontamination biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen unter Verwendung von Lichtpulsen hoher Intensität und kurzer Dauer von inkohärentem, polychromatischem Licht in einem breiten Spektrum.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reduktion des Gehalts eines Pathogens bereit, das in einer auf biologischem Wege erhältlichen Zusammensetzung vorhanden ist, das die Bestrahlung der Zusammensetzung mit mindestens einem inkohärenten polychromatischen Lichtpuls hoher Intensität und kurzer Dauer mit breitem Spektrum umfasst, worin die Lichtintensität mindestens 0,01 J/cm² und die Pulsdauer weniger als 100 ms beträgt und die Lichtwellenlängen zwischen 170 und 2.600 nm liegen, in einer solchen Weise, dass das Pathogen um mindestens einen Faktor 10 verringert wird, worin die auf biologischem Wege erhältliche Zusammensetzung eine Blutplasmazusammensetzung, eine Faktor VIII-Zusammensetzung, eine Faktor IX-Zusammensetzung, eine Antithrombinzusammensetzung, eine Immunoglobulinzusammensetzung, eine Albuminzusammensetzung, eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, eine Viralvektorzusammensetzung, eine Heparinzusammensetzung, eine Kollagenzusammensetzung, eine Insulinzusammensetzung oder eine Blutserumalbuminzusammensetzung ist.
Vorzugsweise ist in diesem Verfahren das Pathogen ein Virus, Bakterium, Pyrogen, Toxin, Pilz oder ein Prion. In dem Fall, dass das Pathogen ein Virus ist, ist es vorzugsweise gewählt aus humanem Immunschwächevirus (HIV)-1, HIV-2, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, HTLV-I, HTLV-II, Cytomegalovirus, Simian Virus 40, vitalem Rinder-Diarrhoe-Virus und Hundeparvovirus.
Es wird bevorzugt, dass der Beleuchtungsschritt eine Beleuchtung der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung mit mindestens zwei hoch intensiven Lichtpulsen kurzer Dauer von inkohärentem polychromatischem Licht mit einem breiten Spektrum umfasst.
Es wird weiter bevorzugt, dass die biologisch abgeleitete Zusammensetzung ein Biomolekül von Interesse umfasst, das durch den Beleuchtungsschritt nicht zerstört wird.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung umfasst das Verfahren weiterhin die folgenden Schritte:

Bereitstellung einer gepulsten Breitbandbeleuchtungsvorrichtung, die eine Behandlungszone, die mindestens eine Blitzlampe und zwei einander gegenüberliegende durchlässige Platten einschließt, umfasst; und
Bewirken des Flusses der auf biologischem Wege erhaltenen Zusammensetzung zwischen den einander gegenüberliegenden durchlässigen Platten; worin die Bestrahlung der auf biologischem Wege erhaltenen Zusammensetzung durchgeführt wird, während sie zwischen den einander gegenüberliegenden durchlässigen Platten befindlich ist.

Vorzugsweise ist die biologisch abgeleitete Zusammensetzung Rinderserum, Schafsblut, Rinderinsulin, Rindertransferrin, Rinderheparin, Collagen, Aminosäuren, Peptone, Peptide oder monoklonale Antikörper oder Proteine aus einer gentechnisch bearbeiteten Säugerzelllinie. In diesem Aspekt wird es weiterhin bevorzugt, dass das Pathogen ein Virus ist und die biologisch abgeleitete Zusammensetzung Rinderserum, Schafsblut, Rinderinsulin, Rindertransferrin, Rinderheparin, Collagen, Aminosäuren, Peptone, Peptide oder monoklonale Antikörper.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung führt vorzugsweise zu mindestens einer log-Reduktion, noch bevorzugter mindestens zwei log-Reduktionen, in dem aktiven Pathogengehalt der ursprünglichen biologisch abgeleiteten Zusammensetzung.
Insbesondere verlieren Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäure, Lipide, Antikörper und andere Biomoleküle von Interesse, die in der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung vorliegen, nicht ihre für ihre beabsichtigte Verwendung essentiellen Eigenschaften, d.h., dass die Biomoleküle von Interesse nicht irreversibel verändert werden, z.B., so dass sie ihre erwünschte Bioaktivität nicht länger ausüben könnten, durch die Aussetzung gegenüber dem Lichtpuls mit breitem Spektrum. Daher benötigt die biologisch abgeleitete Zusammensetzung in vorteilhafter Weise nur wenige, falls überhaupt, zusätzliche Verarbeitungsschritte als Ergebnis der Lichtpulsbehandlung mit breitem Spektrum.
Daher werden hier schnelle, effiziente und verlässliche Verfahren zur Inaktivierung von Vieren, wie z.B. HIV-1 oder -2, Hepatitis A, B oder C, HTLV-I oder II oder Cytomegalievirus, die in biologisch abgeleiteten Produkten, wie z.B. Blutplasma, vorliegen, durch Aussetzung des Produkts gegenüber mindestens einem Lichtpuls mit hoher Intensität und kurzer Dauer, d.h. inkohärentem, polychromatischem Licht mit einem breiten Spektrum bereitgestellt. In einem weitere Aspekt wird hier ein ähnliches schnelles, effizientes und verlässliches Verfahren für die Inaktivierung von Viren bereitgestellt, wie z.B. SV40 und/oder verwandten Blut-ständigen Viren, die in einer von Tierblut abgeleiteten Zusammensetzung vorliegen, durch Aussetzung der Zusammensetzung gegenüber BPL.
Gemäß dem bevorzugten Aspekt umfasst das Verfahren der Erfindung weiterhin die folgenden Schritte:

Verdünnung der auf biologischem Wege erhaltenen Zusammensetzung vor dem Bestrahlungsschritt; und
Einengung der auf biologischem Wege erhaltenen Zusammensetzung nach dem Bestrahlungsschritt.

In diesem Aspekt ist die vorliegende Erfindung für die Dekontaminierung biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen nützlich, die gegenüber Licht mit breitem Spektrum ein weniger transmissiv sind und daher nicht ausreichend dekontaminiert werden würden, wenn sie nicht zunächst verdünnt werden würden. Wenn der Proteingehalt der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung zudem besonders hoch ist, z.B. mehr als ungefähr 10 %, kann es wünschenswert sein, die Zusammensetzung vor der Bestrahlung derselben mit BPL zu verdünnen, um die Wirkungen von BPL auf die Proteine und um die Inaktivierung der Pathogene, die in der Zusammensetzung vorliegen, besser zu kontrollieren.
Weiterhin werden hier Verfahren für die Inaktivierung einer Vielzahl von kontaminierenden Mikroorganismen bereitgestellt, die in biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen vorliegen, wobei die Mikroorganismen mindestens zwei beinhalten, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Viren, Bakterien, Pilzen und Prionen und wobei Proteine, Peptide und/oder andere Biomoleküle von Interesse in der Zusammensetzung nicht irreversibel verändert werden und so effektiv für ihren beabsichtigten Zweck verbleiben, wobei das Verfahren das Aussetzen der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung gegenüber mindestens einem Lichtpuls mit einem breiten Spektrum umfasst.
In noch einem weiteren Aspekt werden hier Verfahren zur Inaktivierung von mindestens einem Mikroorganismus bereitgestellt, der in einer biologisch abgeleiteten Zusammensetzung vorliegt, durch Aussetzung der Zusammensetzung gegenüber Lichtpulsen hoher Intensität (d.h., 0,01 J/cm² bis 50 J/cm², z.B. 0,05 J/cm² bis 1,0 J/cm², wobei die Energiedichte an der Oberfläche des Zielobjekts gemessen wird), von kurzer Dauer (d.h., 10 ns bis 100 ms, z.B. 0,3 ms), Pulsen eines inkohärenten, polychromatischen Lichts mit einem breiten Spektrum (d.h., 170 nm bis 2.600 nm; 1,8 × 10¹⁵ Hz bis 1,2 × 10¹⁴ Hz). Allgemein werden 1 bis 5 Pulse verwendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Ansicht der Behandlungszone eines beispielhaften Pulslichtverarbeitungsapparats, der zum Dekontaminieren biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wobei der Apparat dünne, eng beabstandete Platten verwendet, in denen die Zusammensetzung, wenn sie behandelt wird, vorliegt;
2 ist eine schematische Ansicht eines anderen beispielhaften und hier nützlichen Pulslichtverarbeitungsapparats, wobei der Apparat biologisch abgeleitete Zusammensetzungen behandelt, die logitudinal durch ein Gehäuse fließen, dass eine elongierte, inkohärente Pulslichtquelle umgibt, die Lichtpulse mit hoher Intensität und kurzer Dauer von polychromatischem Licht in einem breiten Spektrum bereitstellt.
3 ist eine schematische Ansicht von noch einem weiteren beispielhaften Pulslichtverarbeitungsapparat, wobei die biologisch abgeleitete Zusammensetzung in einer parallelen Richtung zu ein oder mehr elongierten inkohärenten Lichtquellen fließt, innerhalb eines elliptischen Reflektors und wobei sie mit Lichtpulsen hoher Intensität und kurzer Dauer von polychromatischem Licht mit einem breiten Spektrum behandelt wird; und
4 ist ein Flussdiagramm, das einige von etlichen Schritten illustriert, die bei der Herstellung einer biologisch abgeleiteten Zusammensetzung für die Dekontamination mit Pulslicht verwendet werden können, wobei eine solche Zusammensetzung gegenüber dem gepulsten Licht ausgesetzt und danach die dekontaminierte Zusammensetzung verarbeitet wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur schnellen, verlässlichen und effizienten Inaktivierung von Pathogenen bereit, die in biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen vorliegen. Es wurde festgestellt, dass Lichtpulse hoher Intensität und kurzer Dauer von inkohärentem polychromatischem Licht in einem breiten Spektrum verwendet werden können, um Viren, Bakterien und andere Pathogene zu inaktivieren (die zum Zwecke dieser Anmeldung Pyrogene, Toxine, Pilze und Prionen beinhalten sollen), die in einer biologisch abgeleiteten Zusammensetzung, wie z.B. von Blut abstammenden Zusammensetzungen, von gentechnisch bearbeiteten Zelllinien abstammenden Zusammensetzungen, durch Gewebskulturverfahren abgeleitete Zusammensetzungen und verwandte Produkte vorliegen, allgemein ohne Zerstörung erwünschter biologischer Eigenschaften der Biomoleküle von Interesse, wie z.B. der Proteine, Polysaccharide, Antikörper, Nukleinsäuren, Lipide, Aminosäuren und/oder Peptone in der Zusammensetzung.
Insbesondere wird eine biologisch abgeleitete Zusammensetzung in einen Pulslichtbehandlungsapparat mit breitem Spektrum platziert und/oder durch diesen fließen gelassen. Innerhalb einer Behandlungszone des Apparats wird die Zusammensetzung durch mindestens einen, vorzugsweise zwei und besonders bevorzugt drei Pulse kurzer Dauer (z.B. weniger als ungefähr 100 ms, vorzugsweise ungefähr 0,3 ms) mit hoher Intensität (z.B. 0,01 J/cm² bis 50 J/cm², z.B. 0,05 J/cm² bis 1,0 J/cm², gemessen an der Oberfläche der Zusammensetzung) von inkohärentem polychromatischem Licht mit einem breiten Spektrum (z.B. 170 nm bis 2.600 nm; d.h., 1,8 × 10¹⁵ Hz bis 1,2 × 10¹⁴ Hz) bestrahlt. Insgesamt wird vorhergesagt, dass kommerzielle Verfahren 1 bis 5 kurze Lichtpulse verwenden können. Als Ergebnis einer solchen Bestrahlung wird der Gehalt des aktiven Pathogens innerhalb der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung um mindestens ein log (d.h., einen Faktor 10) und vorzugsweise um mehr als zwei log (d.h., einen Faktor 100) reduziert. In besonders vorteilhafter Weise kann dieses Verfahren einfach und schnell auf unterschiedlichen Stufen während der Verarbeitung der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung angewandt werden, wodurch eine weitere Absicherung einer vollständigen oder fast vollständigen Inaktivierung von Pathogenen in der Zusammensetzung bereitgestellt wird.
Verschiedene Apparate können für die Durchführung dieser Pathogen-reduzierenden Verfahren verwendet werden. Apparate, die entworfen wurden, um Lichtpulse mit hoher Intensität und kurzer Dauer mit inkohärentem polychromatischem Licht mit einem breiten Spektrum bereitzustellen, werden z.B. in dem '235-Patent, '442-Patent, '853-Patent, '442-Patent, '853-Patent, '598-Patent und Patent Nr. 5,900,211 beschrieben. Diesen verwendeten Apparaten ist es gemein, dass sie eine Pulslichtbehandlung mit einem breiten Spektrum bereitstellen und dass die Behandlungskammer lichtdicht ist; eine Blitzlampe(-lampen) werden innerhalb des Apparats positioniert, so dass das daraus emittierte Licht optimal auf das Zielobjekt gerichtet ist; reflektierendes Material wird vorzugsweise verwendet, um das auf das Zielobjekt gerichtete gepulste Licht weiter zu maximieren; und transmittierende Materialien (d.h., Quarz, Saphir oder ähnliche Materialien) werden verwendet, wo Material zwischen den Blitzlampen und dem Zielobjekt benötigt ist (wie z.B. Stückstrukturen für das Zielobjekt in der Kammer), so dass eine Interferenz mit BPL minimiert wird.
Von besonderer Bedeutung für den Entwurf oder die Auswahl des Apparats für die BPL-Behandlung ist die Konfiguration für die Behandlungszone des Apparats, d.h., der Bereich innerhalb des Apparats, in dem das Zielobjekt mit dem gepulsten Licht bestrahlt wird. Da das gepulste Licht alle Oberflächen des Zielobjekts bestrahlen muss, wird die Behandlungszone im allgemeinen so entworfen werden, dass sie das gepulste Licht, das auf das Zielobjekt gerichtet ist, maximiert. Wenn z.B. mehr als eine Blitzlampe simultan zum Dekontaminieren des Zielobjekts verwendet wird, wird die Behandlungszone vorzugsweise so entworfen sein, dass das Zielobjekt sich in ungefähr gleichen Abständen von jeder Blitzlampe befindet und die Blitzlampen sind vorzugsweise so positioniert, dass sie das Zielobjekt umgeben. Um sicherzustellen, dass das gepulste Licht die Gesamtheit des Zielobjekts bestrahlt, werden Strukturen, die verwendet werden um das Zielobjekt in der Behandlungszone zu stützen, vorzugsweise aus einem Material gebildet, das mindestens ungefähr 1 %, vorzugsweise mindestens ungefähr 10 %, noch bevorzugter mindestens ungefähr 50 % und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 85 % gegenüber BPL durchlässig ist. Die folgenden Beschreibungen stellen beispielhafte Apparate dar, die für die Sterilisierung oder Dekontaminierung von biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
1 zeigt eine schematische Ansicht einer Behandlungszone eines bevorzugten beispielhaften Apparats zur Verwendung bei der Behandlung biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen mit BPL. Bei diesem bevorzugten Apparat sind zwei dünne (d.h., weniger als ungefähr 5 mm, z.B. ungefähr 2 mm) transmittierende Platten 110, 112 im allgemeinen parallel zueinander und in sehr enger Beabstandung positioniert (d.h., weniger als ungefähr 5 mm Abstand, z.B. ungefähr 1 mm), um eine Passage oder eine Leitung 100 bereitzustellen, durch die die zu behandelnde Zusammensetzung passieren kann. Auf jeder Seite der Platten 110, 112 sind zwei Blitzlichtsysteme 102, 104 angeordnet, die jeweils einen Reflektor 106 beinhalten, der ein Blitzlicht 108 teilweise umgibt. Solche Blitzlichtsysteme sind z.B. von PurePulse Technologies, San Diego, Californien als PUREBRIGHT-Modell Nr. PBS-1 kommerziell erhältlich.
Die Blitzlichter 108 sind vorzugsweise länglich und der Fluss der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung (durch den Pfeil 114 in 1 angezeigt) verläuft vorzugsweise parallel zu den länglichen Blitzlichtern. Die Platten 110, 112 sind vorzugsweise aneinander entlang den beiden gegenüberliegenden Kanten fixiert, die sich parallel zum Blitzlicht befinden, so dass eine Zusammensetzung, die dadurch passiert, dadurch enthalten ist. Ein geeignetes transmittierendes Gel, wie z.B. Agarose, kann verwendet werden. Anstelle von parallelen Platten kann eine im allgemeinen rechteckige transmittierende Leitung (z.B. Quarz oder Saphir) verwendet werden, um die Zusammensetzung durch die illustrierte Behandlungszone zu transportieren. Während nur zwei Blitzlichtsysteme 102, 104 illustriert sind, können zusätzliche Systeme verwendet werden; die Leitung 100 kann z.B. von Pulslichtquellen umgeben sein. In jedem Fall wird das Licht, das aus dem Blitzlichtsystem 116 emittiert wird, auf die biologisch abgeleitete Zusammensetzung gerichtet, wenn sie durch die Leitung 100 geführt wird (oder darin vorliegt), wodurch Viren und/oder andere Mikroorganismen, die darin enthalten sind, inaktiviert werden. Vorteilhafterweise wird die Zusammensetzung, in dem die Platten 110, 112 der Leitung 100 eng beabstandet sind, in eine dünne Schicht verteilt, wodurch das Aussetzen der Gesamtheit der Zusammensetzung gegenüber dem gepulsten Licht erleichtert wird, selbst wenn die Zusammensetzung relativ untransparent und/oder unverdünnt vorliegt.
2 zeigt eine schematische Ansicht eines anderen beispielhaften Apparats 50, der verwendet werden kann, um Viren und/oder andere kontaminierende Mikroorganismen in der Zusammensetzung zu inaktivieren. Der Apparat 50 umfasst eine reflektierende zylindrische Umhüllung, die eine Behandlungskammer 202 definiert, durch die die Zusammensetzung fließt, umgebend eine Pulslichtquelle 204. Die Pulslichtquelle ist eine Xenon-Blitzlichtlampe mit hoher Energie, die mit einer geeigneten Energiequelle (nicht dargestellt) gemäß der konventionellen Praxis für Blitzlichtbetrieb verbunden ist.
Eine Flüssigkeits-Zirkulationspumpe 208 kontrolliert die Flussrate der Zusammensetzung durch die Behandlungskammer 202 in bezug auf die Pulswiederholungsrate der Pulslichtquelle 204, so dass während der Zeit, in der die Zusammensetzung in der Behandlungskammer 202 vorliegt, das gesamte Produkt, das dadurch passiert, gegenüber einer vorher bestimmten Anzahl von Lichtpulsen hoher Intensität und kurzer Dauer von inkohärentem polychromatischem Licht mit einem Breitspektrum ausgesetzt wird. Sehr allgemein gesprochen, wird die Zusammensetzung, die behandelt werden soll, durch die Kammer mit einer Flussrate von ungefähr 1 bis 4 l/min gepumpt. Die Zusammensetzung, die aus der Behandlungskammer 202 austritt ist daher dekontaminiert und im allgemeinen nicht infektiös.
Die Produktbehandlungskammer 202 kann so angeordnet sein, dass sie von der Pulslichtquelle 204 getrennt ist, um zu verhindern, dass die Zusammensetzung die Lichtquelle 204 kontaktiert. Dies kann z.B. durch Verwendung eines Quarzgehäuses (oder Quarzzylinders) um die Lichtquelle 204 erreicht werden, wobei die Zusammensetzung, die behandelt werden soll, außerhalb des Quarzgehäuses passiert. Kühlwasser kann zwischen der Lichtquelle 204 und dem Quarzgehäuse zirkuliert werden.
Der Durchmesser der Behandlungskammer wird abhängig von vielen Faktoren variieren, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf die spezifischen Absorptionscharakteristika der zu behandelnden Zusammensetzung, die physikalischen und Betriebscharakteristika der Lichtquelle 204, d.h., der Blitzlichter, und den Grad der Produktvermischung zwischen den Pulsen, d.h., Blitzen des Lichts. Die Behandlungskammer 202 kann eine Reflektoranordnung beinhalten, und zwar als Außenwand oder als externen Reflektor, um die Bestrahlung, die die Zusammensetzung durchquert, zurück zu dem Flussweg der Zusammensetzung zu führen. Wenn ein externer Reflektor verwendet wird, kann die Reflektoranordnung einen Quarz (oder ein anderes transmittierendes Material) -Zylinder (oder -Rohr) beinhalten, innerhalb dessen die Zusammensetzung zirkuliert wird und an dessen Außenseite der externe Reflektor positioniert ist.
Es wird festgehalten, dass einige biologisch abgeleitete Flüssigkeiten, entweder natürlich oder folgend auf eine Verdünnung relativ transparent gegenüber Licht sind, einschließlich signifikanten Anteilen des UV-Spektrums. Daher gibt es relativ wenig Abschwächung durch Absorption bei solchen Zusammensetzungen, wobei sich die Flussdichte deutlich nur als Funktion der Entfernung von der Lichtquelle vermindert. Für andere Zusammensetzungen, die eine signifikante Absorption aufweisen, wird sich die Flussdichte jedoch als Funktion sowohl von der Entfernung von dem Blitzlicht als auch von der Absorption der Zusammensetzung vermindern. In jedem Fall sollte eine erwünschte minimale Flussdichte, z.B. 0,4 oder 0,5 J/cm² (oder selbst so niedrig wie 0,1 oder 0,2 J/cm² abhängig von den bestimmten zu deaktivierenden Mikroorganismen) in der gesamten Behandlungszone aufrechterhalten werden. Alternativ oder zusätzlich sollte eine Vermischung stattfinden, um sicherzustellen, dass die gesamte zu behandelnde Flüssigkeit einer geeigneten Flussintensität und Anzahl von Pulsen ausgesetzt wird, um den gewünschten Grad oder das gewünschte Niveau einer Inaktivierung zu erreichen, d.h., einer Abtötung oder Sterilisation.
Während das Blitzlicht 204 innerhalb der Behandlungskammer 202 in dem Apparat 50 von 2 lokalisiert ist, zeigt 3, dass ein oder mehr Blitzlichter 256 alternativ (oder zusätzlich) extern in einer Behandlungskammer 252 lokalisiert sein können. Es wird ein bevorzugtes Design dargestellt, worin die zu behandelnde Zusammensetzung durch eine Behandlungskammer 252 geführt wird, wobei eine transmittierende Behandlungsleitung (z.B. ein Quarzrohr) 252 verwendet wird. Die Behandlungskammer 252 ist entlang einem Fokus eines elliptischen Reflektors 254 positioniert. Ein Blitzlicht 256 ist entlang einem anderen Fokus des elliptischen Reflektors 254 positioniert. Das Blitzlicht 256 kann optimalerweise mit einem Gehäuse in einem Quarzrohr zu dessen Wasserkühlung lokalisiert sein. Da die Lichtpulse durch den elliptischen Reflektor 254 zum Zentrum der Behandlungskammer 252 fokussiert werden, wird eine Kompensation im Hinblick auf die Lichtabsorption der Zusammensetzung, die behandelt werden soll, bereitgestellt, so dass die gesamte Zusammensetzung einer einheitlichen Lichtbehandlung unterzogen wird. Bei einer Variation (nicht dargestellt) der dargestellten Ausführungsform können viele elliptische Reflektoren, die jeweils ein Blitzlicht an einem Fokus aufweisen und die Behandlungskammer 252 im anderen Fokus, falls gewünscht, verwendet werden.
Während verschiedene Apparate, die für die Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beschrieben wurden, wird der Fachmann erkennen, dass verschiedene andere Apparate, einschließlich Kombinationen der oben beschriebenen Apparate, alternativ für diese Zwecke verwendet werden können und daher in ähnlicher Weise hier betrachtet werden. Ein kleiner Pulslichtsterilisator könnte z.B. zur Behandlung intravenöser Lösungen, enthaltend biologisch abgeleitete Zusammensetzungen, verwendet werden, der z.B. intravenöse Schläuche in einer Einlassmündung aufnimmt, die Lösung durch die Pulslichtkammer führt und aus einer Auslassmündung heraus und dann durch den verbleibenden intravenösen Schlauch und in den Patienten.
Bei einem solchen Behandlungsapparat wird BPL zum Bestrahlen und Behandeln einer biologisch abgeleiteten Zusammensetzung verwendet, um den Gehalt an Pathogenen, z.B. Viren und/oder Bakterien, um mindestens einen Faktor zehn zu reduzieren. Vorzugsweise umfasst das Behandlungsverfahren die Bestrahlung der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung mit gepulstem Licht mit einer Intensität von mindestens ungefähr 0,01 J/cm², vorzugsweise ungefähr 0,02 J/cm² bis ungefähr 50 J/cm² und besonders bevorzugt ungefähr 0,05 J/cm² bis 1,0 J/cm², wobei die Energieintensität an der Oberfläche der zu bestrahlenden Zusammensetzung gemessen wird. Die Lichtpulse sind vorzugsweise von sehr kurzer Dauer. Eine Pulsdauer von weniger als ungefähr 100 ms wird bevorzugt; eine Dauer zwischen ungefähr 10 ns und 100 ms, z.B. ungefähr 0,3 ms, wird besonders bevorzugt. Zusätzlich dazu, dass das gepulste Licht eine hohe Intensität und kurze Dauer aufweist, sollte es als inkohärentes, polychromatisches Licht mit einem breiten Spektrum charakterisiert sein. Vorzugsweise beinhaltet das Licht Wellenlängen von ungefähr 170 nm bis ungefähr 2.600 nm (d.h., Frequenzen von ungefähr 1,8 × 10¹⁵ Hz bis ungefähr 1,2 × 10¹⁴ Hz). Da die Zeit zwischen den Pulsen sehr kurz sein kann, z.B. weniger als ungefähr 100 ms, kann eine einzelne, Multi-Puls-Inaktivierungsbehandlung in weniger als einer Minute für jede Behandlung vervollständigt sein. Wenn die Behandlung für ein fließendes Produkt durchgeführt wird, das gepumpt oder anders zirkuliert wird (gegenüber eine Chargenbehandlung) kann es wünschenswert sein, eine Vielzahl von Blitzlichtern bereitzustellen, die entlang dem Flussweg beabstandet sind, um eine schnellere Flussrate zu ermöglichen. Diese Behandlungsart steht im scharfen Kontrast zu bis jetzt bekannten Verfahren zur Reduktion des Gehalts an Pathogenen in biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen, die Stunden benötigen können, um vollständig zu sein.
Um biologisch abgeleitete Zusammensetzungen gemäß den hier beschriebenen Verfahren besonders effizient und verlässlich zu behandeln, sollte die Zusammensetzung so vollständig wie möglich durch das gepulste Licht mit breitem Spektrum bestrahlt werden. Es ist daher wichtig, dass die zu behandelnde Zusammensetzung mindestens während der Behandlung in Material enthalten ist, das ausreichend durchlässig, z.B. mindestens 1 % durchlässig, gegenüber einem solchen gepulsten Licht mit breitem Spektrum ist, so dass die Inaktivierung auf verlässliche Weise erreichbar ist. Beispiele für geeignete Materialien beinhalten z.B. Polyolefine; wie z.B. Polyethylen und Polypropylen, Nylon, Quarz und Saphir; das '598-Patent diskutiert verschiedene Polymere, die zur Verwendung bei Behandlungsapparaten mit Lichtpulsen geeignet sind.
Unterschiedliche Materialien können zur Bildung des Materials, das die Zusammensetzung hält, bevorzugt werden, abhängig von der besonderen Konfiguration des Pulslichtbehandlungsapparats zur Verwendung. Wenn der Behandlungsapparat z.B. eng beabstandete dünne Platten verwendet, durch die die biologisch abgeleitete Zusammensetzung geführt wird, können solche Platten vorzugsweise aus einem relativ harten transmittierenden Material, wie z.B. Quarz oder Saphir gebildet werden. Dem gegenüber wird in dem Fall, in dem die Behandlungszone ein intravenöser Schlauch ist, ein biegungsfähiges Polymermaterial bevorzugt werden.
Zusätzlich zu der Betrachtung, welcher Pulslichtbehandlungsapparat zu verwenden ist und in welchem Material eine biologisch abgeleitete zu behandelnde Zusammensetzung enthalten sein soll, sollten bestimmte Eigenschaften der Zusammensetzung selbst mit in die Betrachtung einbezogen werden. Die Transmissivität der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung ist z.B. wichtig um sicherzustellen, dass sie vollständig mit dem gepulsten Licht mit breitem Spektrum bestrahlt wird. Verschiedene Komponenten einer biologisch abgeleiteten Zusammensetzung können zu einer reduzierten Transmissivität der Zusammensetzung gegenüber Lichtpulsen mit breitem Spektrum beitragen. Die Gegenwart ganzer Zellen, hohe Konzentrationen an Proteinen und/oder große Mengen an Lipiden und anderen Makromolekülen können z.B. in die Transmission von Lichtpulsen mit breitem Spektrum durch und/oder innerhalb einer biologisch abgeleiteten Zusammensetzung eingreifen.
Glücklicherweise kann die Transmissivität einer biologisch abgeleiteten Zusammensetzung allgemein ohne permanenten Schaden an der Zusammensetzung durch einfache Verdünnung eingestellt werden, die häufig bei der Verarbeitung solcher Zusammensetzungen angewandt wird, so dass geeignete Techniken hierfür wohl bekannt sind. Falls es gewünscht wird, die Transmissivität von Blutplasma zu verbessern, z.B. gegenüber BPL um eine Behandlung gemäß den hier beschriebenen Verfahren zu optimieren, kann das Plasma zunächst z.B. mit einer geeigneten Salzlösung verdünnt werden, dann mit BPL behandelt werden und folgend auf die Behandlung rekonzentriert oder weiter zur Bereitstellung des gewünschten Endprodukts verarbeitet werden. Da ganze Zellen, die in einer biologisch abgeleiteten Zusammensetzung vorliegen, durch eine Behandlung mit gepulstem Licht gemäß den vorliegenden Verfahren irreparabel beschädigt werden können, sind diese Verfahren am besten für die Behandlung biologisch abgeleiteter Zusammensetzungen geeignet, die entweder keine ganzen Zellen enthalten oder die keine Wiedergewinnung intakter ganzer Zellen, folgend auf die Behandlung mit BPL, benötigen.
Wie vorher festgehalten, können diese Verfahren in vorteilhafter Weise zum Inaktivieren von Pathogenen verwendet werden, die in einer biologisch abgeleiteten Zusammensetzung vorliegen, im allgemeinen ohne Zerstörung der therapeutischen, pharmazeutischen, Ernährungs- und/oder anderer erwünschter Eigenschaften des Biomoleküls (der Biomoleküle) von Interesse innerhalb der Zusammensetzung. Während die Effektivität einiger Biomoleküle von Interesse sich als Ergebnis einer Behandlung mit einem gepulsten Licht mit breitem Spektrum leicht vermindern kann, wird in vielen Fällen die verbleibende Aktivität immer noch akzeptabel sein. Weiterhin kann die Effektivität einiger Biomoleküle von Interesse in einigen Fällen durch die Behandlung mit BPL erhöht werden, was zu verbesserten oder selbst neuen Therapien führen kann.
4 ist ein Flussdiagramm, worin einige der verschiedenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren illustriert sind. Eine nicht-verdünnte Probe 300 einer biologisch abgeleiteten zu behandelnden Zusammensetzung kann zu einer verdünnten Zusammensetzung 302 verdünnt werden oder kann ohne Verdünnung behandelt werden. Drei bevorzugte beispielhafte Verfahren zur Einführung der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung in die Behandlungszone des Pulslichtbehandlungsapparats werden dargestellt: ein röhrenförmiges Flussverfahren 304, ein Chargenbehandlungsverfahren 306 und eine Plattenflussbehandlung 308. Spezifische Ausführungsformen des Röhrenflusses 304 wurden im Hinblick auf die 2 und 3 beschrieben. Gemäß dieser ersten Alternative wird die Zusammensetzung in die Behandlungszone der Behandlungskammer durch ein Rohr oder einen ähnlich verlängerten Apparat eingeführt. Dies beinhaltet z.B. die Behandlung in einem elliptischen Behandlungsapparat, die Behandlung durch einen intravenösen Schlauch und verwandte Verfahren. Vorzugsweise weist das Rohr, mindestens an dem Punkt, an dem die Zusammensetzung durch das Pulslicht bestrahlt wird, einen gering genügenden Durchmesser auf, so dass die Gesamtheit der Zusammensetzung bestrahlt wird.
Eine zweite Alternative zur Einführung der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung in die Behandlungszone der Behandlungskammer ist die chargenweise Behandlung der Zusammensetzung 306. Bei dieser Alternative kann die Zusammensetzung z.B. in relativ kleine Mengen aufgeteilt werden und in einem oder mehreren geeigneten transmittierenden Behältern platziert und mit dem gepulsten Licht bestrahlt werden. Das chargenweise Verfahren der Behandlung ist insbesondere für eine Pulslichtbehandlung von Mediumsbestandteilen günstig, wie z.B. fötalem Rinderserum, das sehr schnell und effektiv in kleinen Mengen unter Verwendung des Chargenverfahrens behandelt werden kann. Eine dritte in 4 dargestellte Option ist der Plattenflussapparat 308. Wie im Detail oben beschrieben, umfasst der Plattenfluss Apparate 308 zwei eng beabstandete dünne Platten, durch die die zu behandelnde Zusammensetzung fließen kann. Vorteilhafterweise ermöglicht diese besondere Option die Behandlung eines signifikanten Volumens einer Zusammensetzung zu einem Zeitpunkt durch Verteilung der Zusammensetzung in eine dünne breite Schicht. Alternative Mittel zur Einführung der biologisch abgeleiteten Zusammensetzung in die Behandlungszone der Pulslichtbehandlungskammer werden dem Fachmann deutlich sein.
Es folgen einige Beispiele einer Inaktivierung spezifischer Pathogene unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren. Insbesondere werden die Inaktivierung von HIV-1 und BVDV illustriert, die in biologisch abgeleiteten Zusammensetzungen vorliegen. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass der Gehalt von jedem der vier überprüften Viren nach der Behandlung mit nur drei Lichtpulsen hoher Intensität und kurzer Dauer von inkohärentem polychromatischem Licht mit einem breiten Spektrum signifikant reduziert war. In signifikanter Weise wurde eine Reduktion des viralen Gehalts von mehr als drei (3) log für sowohl HIV-1 als auch CPV nach Bestrahlung mit nur einem einzelnen Puls von Licht mit breitem Spektrum demonstriert. Ein fünftes Beispiel illustriert im folgenden die Inaktivierung eines Bakteriums, E. coli, das in fötalem Rinderblutserum vorliegt.
BEISPIEL 1: INAKTIVIERUNG VON SV40
Nierenzellen von afrikanischen grünen Meerkatzen (AGMK) werden mit Simian Virus 40 (SV40, ATCC VR-305) inokuliert. Das Virus wird geerntet, wenn 75 bis 100 % der Zellen cytopathische Wirkungen zeigen (CPE). Lagerlösungen des Virus werden gefroren und bei –60°C in einem Medium, enthaltend 10 bis 15 % fötales Rinderserum (FBS) gelagert.
AGMK-Zellen werden für die Titrierung der Proben, enthaltend SV40, verwendet. Das für das Wachstum und den Erhalt der AGMK-Zellen verwendete Medium ist Eagles-Minimal-Essential-Medium (E-MEM) mit 5 bis 10 % wärmeinaktiviertem FBS, 10 mg/ml Gentamicin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 2,5 mg/ml Fungizon.
Die Zellkulturen werden bei 36 bis 38°C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 bis 7 % CO₂ inkubiert.
Ein 0,2 ml Volumen SV40 in E-MEM mit 10 % wärmeinaktiviertem FBS wird zu sterilen Polyethylenprobenbehältern zugefügt. Zwölf Replikatproben werden hergestellt. Neun von diesen Proben werden mit BPL behandelt. Von diesen werden drei Proben mit einem einzelnen Lichtpuls, drei Proben mit zwei Pulsen und drei Proben mit drei Pulsen behandelt. Drei unbehandelte Proben dienen als Kontrolle.
Nach der Belichtung wird eine Titration durch Herstellung von 10-fachen Verdünnungen von jeder Virusprobe in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, ausgesät mit AGMK, durchgeführt. SV40 lässt man 1 bis 2 Stunden adsorbieren, dann wird es aus den Vertiefungen entfernt, und durch frisches Kulturmedium ersetzt. Eine Titration von RPMI (ohne Phenolrot) wird als Kontrolle durchgeführt. Alle Titrationen werden vierfach plattiert, 10 Tage im Hinblick auf die Gegenwart von CPE und/oder im Hinblick auf Cytotoxizität überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
TABELLE 1: Behandlung von SV40 mit BPL
Titrationen nach der Aussetzung gegenüber den Pulsen werden mit der Titration vor der Aussetzung verglichen, um zu bestimmen, ob die virale Infektivität durch Aussetzen gegenüber BPL reduziert war. Beispiel 1 zeigt eine 2 bis 3 log Reduktion von SV40. Der höchste zur Verfügung stehende Titer wurde in diesem Beispiel verwendet. Eine größere Reduktion von Viren wird angenommen, wenn höhere Ausgangstiter verwendet werden, mehr Pulse verwendet werden oder wenn das Medium auf eine niedrigere Proteinkonzentration verdünnt wird.
BEISPIEL 2: INAKTIVIERUNG VON HIV-1
CCRF-CEM-Zellen werden mit HIV-Typ I-Stamm HTLVIIIB (Vanderbilt University, Nashville, TN) inokuliert. HIV-1 wird geerntet, wenn die Infektivität ein Minimum von 80 erreicht, bestimmt durch einen Immunfluoreszenzassay (IFA). Lagerlösungen des Virus werden eingefroren und bei –60°C in einem Medium, enthaltend 10 bis 15 % FBS, gelagert.
MT-2-Zellen (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Katalognummer 237) werden für die Titration für die Proben, die HIV-1 enthalten, verwendet. Das für das Wachstum und den Erhalt von MT-2-Zellen verwendete Medium ist RPMI 1640 (mit Phenolrot), supplementiert mit 2 mM L-Glutamin, 25 mM Hepes, 2 g/l NaHCO₃, 15 % wärmeinaktiviertem FBS und 50 mg/ml Gentamicin. Die Zellkulturen werden bei 36 bis 38°C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5 bis 7 % CO₂ inkubiert.
Ein 0,2 ml Volumen von HIV in RPMI mit 15 % wärmeinaktiviertem FBS wird zu sterilen Polyethylenprobenbehältern zugefügt. Zwölf Replikatproben werden hergestellt. Neun von diesen Proben werden mit BPL behandelt. Von diesen werden drei mit einem einzelnen Puls, drei mit zwei Pulsen und drei mit drei Pulsen behandelt. Drei unbehandelte Proben dienen als Kontrollen.
Nach der Belichtung wird eine Titration durch Herstellung von 10-fachen Verdünnungen von jeder Virusprobe in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, ausgesät mit MT-2-Zellen, durchgeführt. HIV-1-Verdünnungen bleiben während der Titrationsperiode in den Vertiefungen. Eine Titration von RPMI (ohne Phenolrot) wird als Kontrolle durchgeführt. Alle Titrationen werden vierfach plattiert, 10 Tage im Hinblick auf die Gegenwart von CPE und/oder im Hinblick auf Cytotoxizität überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
TABELLE 2: Behandlung von HIV-1 mit BPL
Titrationen nach der Aussetzung werden mit den Titrationen vor der Aussetzung verglichen, um zu bestimmen, ob die virale Infektivität durch Aussetzen gegenüber BPL reduziert war. Beispiel 2 zeigt, dass eine 5 bis 6 log-Reduktion von HIV-1 unter Verwendung von BPL auftrat.
Der höchste zur Verfügung stehende Titer wurde in diesem Beispiel verwendet. Eine größere Reduktion von Viren wird erwartet, wenn höhere Ausgangstiter verwendet werden, mehr Pulse angewandt werden oder das Medium auf eine geringere Proteinkonzentration verdünnt wird.
BEISPIEL 3: INAKTIVIERUNG VON CPV
A-72-Zellen (ATCC CRL 1542) werden mit CPV (ATCCVR-2017) inokuliert. Das Virus wird geerntet, wenn 75 bis 100 % der Zellen cytopathische Wirkungen (CPE) zeigen. Lagerlösungen des Virus werden eingefroren und bei –60°C in einem Medium, enthaltend 10 bis 15 % FBS, gelagert.
A-72-Zellen werden für die Titration für die Proben, enthaltend CPV, verwendet. Das für das Wachstum und den Erhalt von A-72-Zellen verwendete Medium ist E-MEM, supplementiert mit 5 bis 10%igem wärmeinaktiviertem FBS, 10 mg/ml Gentamicin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 2,5 mg/ml Fungizon. Die Zellkulturen werden bei 36 bis 38°C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5 bis 7 % CO₂ inkubiert.
Ein 0,2 ml Volumen CPV in E-MEM mit 5 % wärmeinaktiviertem FBS wird zu sterilen Polyethylenprobenbehältern zugefügt. Zwölf Replikatproben werden hergestellt. Neun von diesen Proben werden mit BPL behandelt. Von diesen werden drei mit einem einzelnen Puls, drei mit zwei Pulsen und drei mit drei Pulsen behandelt. Drei unbehandelte Proben dienen als Kontrollen.
Nach der Belichtung wird eine Titration durch Herstellung von 10-fachen Verdünnungen von jeder Virusprobe in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, ausgesät mit A-72, durchgeführt. CPV lässt man 1 bis 2 Stunden adsorbieren, dann wird es aus den Vertiefungen entfernt und durch frisches Kulturmedium ersetzt. Überstandsproben werden von der CPV-Titrationsplatte auf frische Platten zur Überprüfung von Hämagglutination (HA) übertragen. Eine Titration von RPMI (ohne Phenolrot) wird als Kontrolle durchgeführt. Alle Titrationen werden vierfach plattiert, 10 Tage im Hinblick auf die Gegenwart von CPE und/oder im Hinblick auf Cytotoxizität überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
TABELLE 3: Behandlung von CPV mit BPL
Titrationen nach der Aussetzung werden mit den Titrationen vor der Aussetzung verglichen, um zu bestimmen, ob die virale Infektivität durch Aussetzen gegenüber BPL reduziert war. Beispiel 3 zeigt, dass eine 3 bis 4 log-Reduktion von CPV unter Verwendung von BPL auftrat.
Der höchste zur Verfügung stehende Titer wurde in diesem Beispiel verwendet. Eine größere Reduktion von Viren wird erwartet, wenn höhere Ausgangstiter verwendet werden, mehr Pulse angewandt werden oder das Medium auf eine geringere Proteinkonzentration verdünnt wird.
BEISPIEL 4 INAKTIVIERUNG VON BVDV
Bovine Turbinate (BT)-Zellen (ATCC CRL 1390) werden mit BVDV (ATCC VR-534) inokuliert. Das Virus wird geerntet, wenn 75 bis 100 % der Zellen cytopathische Wirkungen (CPE) zeigen. Lagerlösungen des Virus werden eingefroren und bei –60°C in einem Medium, enthaltend 10 bis 15 % FBS gelagert.
BT-Zellen werden für eine Titration der Proben, enthaltend BVDV, verwendet. Das für das Wachstum und den Erhalt von BT-Zellen verwendete Medium ist E-MEM, supplementiert mit 15 % Pferdeserum.
Die Zellkulturen werden bei 36 bis 38°C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5 bis 7 % CO₂ inkubiert.
Ein 0,2 ml Volumen von BVDV in E-MEM mit 5%igem wärmeinaktiviertem FBS wird zu sterilen Polyethylenprobenbehältern zugefügt. Zwölf Replikatproben werden hergestellt. Neun von diesen Proben werden mit BPL behandelt. Von diesen werden drei mit einem einzelnen Puls, drei mit zwei Pulsen und drei mit drei Pulsen behandelt. Drei unbehandelte Proben dienen als Kontrollen.
Nach der Belichtung wird eine Titration durch Herstellung von 10-fachen Verdünnungen von jeder Virusprobe in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, ausgesät mit A-72, durchgeführt. BVDV lässt man 1 bis 2 Stunden adsorbieren, dann wird es aus den Vertiefungen entfernt und durch frisches Kulturmedium ersetzt. Eine Titration von RPMI (ohne Phenolrot) wird als Kontrolle durchgeführt. Alle Titrationen werden vierfach plattiert, 10 Tage im Hinblick auf die Gegenwart von CPE und/oder im Hinblick auf Cytotoxizität überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
TABELLE 4: Behandlung von BVDV mit BPL
Titrationen nach der Aussetzung werden mit den Titrationen vor der Aussetzung verglichen, um zu bestimmen, ob die virale Infektivität durch Aussetzen gegenüber BPL reduziert war. Beispiel 4 zeigt, dass eine 4 log-Reduktion von BVDV unter Verwendung von BPL auftrat.
Der höchste zur Verfügung stehende Titer wurde in diesem Beispiel verwendet. Eine größere Reduktion von Viren wird erwartet, wenn höhere Ausgangstiter verwendet werden, mehr Pulse angewandt werden oder das Medium auf eine geringere Proteinkonzentration verdünnt wird.
BEISPIEL 5: INAKTIVIERUNG VON E. COLI
Eine Probe von 15%igem FBS wurde mit E. coli (ATCC26) inokuliert und man ließ diesen über Nacht bei 32°C auf eine Endkonzentration von 8,0 × 10⁴ KBE/ml (4,9 log KBE/ml) wachsen. 200 μl des kontaminierten Serums (enthaltend 17.600 KBE, d.h. 4,25 log KBE) wurden dann mit 3 Pulsen von kurzer Dauer mit Breitspektrum-Licht (1,0 J/cm²/Blitz) gemäß den hier beschriebenen Verfahren bestrahlt. Serielle Verdünnungen (10×) der Probe wurden hergestellt (wobei 0,05 M Phosphatpuffer verwendet wurde) und auf Standard-Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden bei 32°C inkubiert und nach 24 und 48 Stunden gezählt.
Nach einer 48-stündigen Inkubationsdauer wurden auf keinen Platten irgendwelche überlebenden E. colis beobachtet. Mit einem Sensibilitätsniveau von 20 KBE (d.h., 1,3 log KBE) demonstrierte dieser Test, dass die Behandlung von E. coli-inokuliertem FBS mit nur 3 Lichtpulsen mit Breitspektrum-Licht zu einer ungefähr 3-log-Reduktion des Bakteriengehalts führte. (4,25 log KBE – 1,3 log KBE = 2,95 log KBE.)
Obwohl die Erfindung, wie hier offenbart, durch spezifische Ausführungsformen und Anwendungen beschrieben wurde, können vielzählige Modifikationen und Variationen durch den Fachmann ohne sich vom Umfang der Erfindung, wie in den folgenden Ansprüchen angegeben, zu entfernen, durchgeführt werden.

Claims

Verfahren zur Verringerung des Gehalts eines Pathogens, das in einer auf biologischem Wege erhältlichen Zusammensetzung vorhanden ist, das die Bestrahlung der Zusammensetzung mit mindestens einem inkohärenten polychromatischen Lichtpuls hoher Intensität und kurzer Dauer mit breitem Spektrum umfasst, worin die Lichtintensität mindestens 0,01 J/cm² und die Pulsdauer weniger als 100 ms beträgt und die Lichtwellenlängen zwischen 170 und 2.600 nm liegen, in einer solchen Weise, dass das Pathogen um mindestens einen Faktor 10 verringert wird, worin die auf biologischem Wege erhältliche Zusammensetzung eine Blutplasmazusammensetzung, eine Faktor VIII-Zusammensetzung, eine Faktor IX-Zusammensetzung, eine Antithrombinzusammensetzung, eine Transferrinzusammensetzung, eine Albuminzusammensetzung, eine Immunoglobulinzusammensetzung, eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, eine Viralvektorzusammensetzung, eine Heparinzusammensetzung, eine Kollagenzusammensetzung, eine Insulinzusammensetzung oder eine Blutserumalbuminzusammensetzung ist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Pathogen ein Virus, ein Bakterium, ein Pyrogen, ein Toxin, ein Pilz oder ein Prion ist.
Verfahren gemäss Anspruch 2, worin das Pathogen ein Virus ist, ausgewählt aus humanem Immunschwächevirus (HIV)-1, HIV-2, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, HTLV-I, HTLV-II, Cytomegalovirus, Simian Virus 40, bovinen viralen Diarrhoe und Hundeparvovirus.
Verfahren gemäss mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Bestrahlungsschritt die Bestrahlung der auf biologischem Wege erhaltenen Zusammensetzung mit mindestens zwei inkohärenten polychromatischen Lichtpulsen hoher Intensität und kurzer Dauer mit einem breiten Spektrum umfasst.
Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die auf biologischem Wege erhältliche Zusammensetzung ein Biomolekül von Interesse umfasst, das durch den Bestrahlungsschritt nicht zerstört wird.
Verfahren gemäss mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner folgende Schritte umfasst: Verdünnung der auf biologischem Wege erhaltenen Zusammensetzung vor dem Bestrahlungsschritt; und Einengung der auf biologischem Wege erhaltenen Zusammensetzung nach dem Bestrahlungsschritt.
Verfahren gemäss mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner folgende Schritte umfasst: Bereitstellung einer gepulsten Breitbandbeleuchtungsvorrichtung, die eine Behandlungszone, die mindestens eine Blitzlampe und zwei einander gegenüberliegende durchlässige Platten einschliesst, umfasst; und Bewirken des Flusses der auf biologischem Wege erhaltenen Zusammensetzung zwischen den einander gegenüberliegenden durchlässigen Platten; worin die Bestrahlung der auf biologischem Wege erhaltenen Zusammensetzung durchgeführt wird, während sie zwischen den einander gegenüberliegenden durchlässigen Platten befindlich ist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, worin die auf biologischem Wege erhältliche Zusammensetzung Rinderserum, Schafsblut, Rinderinsulin, Rindertransferrin, Rinderheparin, Kollagen, Aminosäuren, Peptone, Peptide oder monoklonale Antikörper oder Proteine aus einer genmanipulierten Säugerzelllinie darstellt.
Verfahren gemäss Anspruch 8, worin das Pathogen ein Virus ist, und die auf biologischem Wege erhaltene Zusammensetzung ist Rinderserum, Schafsblut, Rinderinsulin, Rindertransferrin, Rinderheparin, Kollagen, Aminosäuren, Peptone, Peptide oder monoklonale Antikörper.
Verfahren gemäss Anspruch 8 oder 9, worin der Bestrahlungsschritt zu einer mindestens zwei logfachen Reduktion des aktiven Pathogengehalts führt.