DE69911438T2

DE69911438T2 - Schnelle tieftemperatur-drucksterilisation und impfstoffherstellung

Info

Publication number: DE69911438T2
Application number: DE69911438T
Authority: DE
Inventors: A. James LAUGHARN; W. David BRADLEY; A. Robert HESS
Original assignee: BBI BioSeq Inc Woburn; BBI BioSeq Inc
Current assignee: Pressure Biosciences Inc
Priority date: 1999-06-15
Filing date: 1999-06-15
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2019-06-16
Also published as: DE69911438D1; JP4556067B2; ATE249847T1; JP2002537024A

Description

Verweis auf verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der US-Seriennummer 09/0997,852, eingereicht am 15. Juni 1998, und von der US-Seriennummer 09/165,829, eingereicht am 2. Oktober 1998, die beide hier durch Referenz in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind.
Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Sterilisierung von Materialien und zur Herstellung von Vakzinen (Impfstoffen).
Es gibt verschiedene Verfahren und Vorrichtungen zur Sterilisierung, Dekontamination oder Desinfektion von biologischen und nicht biologischen Materialien. Diese Verfahren schließen thermale Zerstörung (z. B. Verbrennen), Hitzesterilisierung, Bestrahlung (z. B. ultraviolette oder ionisierende Bestrahlung), Gassterilisierung (z. B. Verwendung von Ethylenoxid), Fotosensibilisierung, Membransterilisierung und die Verwendung von chemischen Desinfektionsmitteln (z. B. Formaldehyd, Glutaraldehyd, Alkohole, Quecksilberverbindungen, vierwertige Ammoniumverbindungen, halogenierte Verbindungen, Lösungsmittel/ Detergenzien -Systeme oder Peroxide) ein.
Hitzesterilisierung (z. B. Autoklavieren) wird häufig verwendet, beispielsweise zur Sterilisierung von medizinischen Lösungen vor ihrer Verwendung in einem Patienten. Hitzesterilisierung erfordert typischerweise das Erhitzen einer Lösung auf 121°C für mindestens 15 Minuten unter Druck in einem Autoklaven, Aufrechterhalten der Hitze- und Druckbedingungen für einen Zeitraum, der ausreicht, um Bakterien, Pilze und Protisten und inaktive Viren in der Lösung zu töten.
Viele wieder verwendbare medizinische Artikel und Materialien sind nicht geeignet zur Desinfektion oder Sterilisierung in einem Autoklaven. Beispielsweise werden Plastikteile auf medizinischen Vorrichtungen, Blutdialysierungsgeräten und Faseroptikvorrichtungen normalerweise durch chemische Germizid-Behandlung sterilisiert. Im Allgemeinen benötigen Germizide bis zu mehreren Stunden Behandlung zur Inaktivierung von Mikroorganismen.
Um in der pharmazeutischen Herstellung Sterilität sicher zu stellen, wird häufig Gassterilisierung eingesetzt. Allerdings kann die Gassterilisierung (z. B. unter Verwendung von Ethylenoxid) zeitraubend sein, vorheriges Anfeuchten erfordern, Heizen und das Evakuieren der Probenkammer, gefolgt von der Behandlung mit hohen Konzentrationen des Gases für jeweils bis zu 20 Stunden.
Richtig angewendet können herkömmliche Desinfektionsmittel vegetative Bakterien, bestimmte Pilze und lipophile Viren oder Viren mittlerer Größe inaktivieren. Allerdings hemmen diese Desinfektionsmittel häufig nicht Tuberkelbazillen, sporenbildende Bakterien oder nicht-lipophile Viren oder Viren geringer Größe.
Ein weiteres Verfahren zur Lyse von Zellen wodurch Sterilisierung einer Probe erreicht wird, wird beschrieben in Microbiology (Davis et al., Harper & Row, Hagerstown, MD, 1980). Man nimmt an, dass dieses Verfahren des Einfrierens und Auftauens der Probe seine Wirkung durch die Bildung von winzigen Eistaschen in den Zellen entfaltet, wenn die Bakteriensuspension eingefroren wird. Die Eiskristalle und die hohen, örtlich begrenzten Konzentrationen der Salze verursachen beide Schaden an den Bakterien. Ein einzelnes Einfrierungsereignis ist generell ausreichend, um nur einige der Bakterien zu töten, jedoch resultieren wiederholte Einfrierungs-/Auftauzyklen in einer fortschreitenden Verringerung der Lebensfähigkeit. Die Letalität ist mit langsamem Einfrieren und schnellem Auftauen korreliert.
Herkömmliche Einfrier-/Auftauverfahren sind in der Geschwindigkeit von Einfrier/Auftauzyklen durch die Zeit begrenzt, die benötigt wird, um Hitze zu und aus dem Zentrum der Proben zu bringen, um Phasenveränderungen zu bewirken. Die Gleichgewichtsquote ist insbesondere im Fall von Proben mit großem Volumen (z. B. etwa 100 ml oder größer) langsam. Die Sterilisierungseffizienz dieser herkömmlichen Verfahren ist dadurch begrenzt, dass es unmöglich ist, eine große Anzahl von Einfrier-/Auftauzyklen mit diesen Verfahren durchzuführen.
Herkömmliche Verfahren der Nahrungskonservierung schließen Pasteurisierung ein, in der ein Nahrungsmittel für einen Zeitraum bei einer erhöhten Temperatur gehalten wird.
US-Patent Nr. 3,445,568 offenbart ein elektro-hydraulisches Verfahren, in dem Mikroorganismen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, einer oder mehreren heftigen Druck- oder Schockwellen ausgesetzt werden, um die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen zu zerstören, ohne ihre Antigenität zu zerstören. Weiterhin wird offenbart, dass einige Kombinationen von Chemikalien, UV-Bestrahlung, Hitze, Druckschock und Verwirbelung Mikroorganismen zerstören können. US-Patent Nr. 5,316,745 beschreibt eine Ultrahochdruck-Sterilisierungsvorrichtung und ein Verfahren, zur Sterilisierung eines Materials, wobei das Material hohen Druckniveaus und reduzierten Druckniveaus ausgesetzt wird. Hashizume C. et al. (Biosci. Biotech. and Biochem., 59 (8), 1455–1458, 1995) haben gezeigt, dass Hochdruckbehandlung, die auf Nahrungssterilisierung bei geringeren Temperaturen angewendet wird, mit geringerem Druck eine größere Wirkung hat, ohne den ursprünglichen Geschmack und Geruch zu zerstören. Darüber hinaus, dass Sterilisierung stattfindet, wenn hoher Druck die natürlichen Strukturen von biologischen Makromolekülen zerstört, d. h. Proteine und Lipide von Mikroorganismen.
Es besteht ein anhaltender Bedarf an der Entwicklung von verbesserten Verfahren zur Sterilisierung, insbesondere zur Inaktivierung von Viren und anderen Mikroben in Materialien, die auch Proteine enthalten, die eine Aktivität besitzen, die man aufrecht erhalten will, wie Blutgerinnungsfaktoren, Antikörper, Blutenzyme (z. B. Lipasen, Phosphatasen) und Wachstumsfaktoren. Die Entwicklung von Verfahren zur Inaktivierung von nicht-verkapselten Viren ist eine besondere Herausforderung, da die äußeren Hüllen solcher Viren normalerweise Proteine einschließen, die den Proteinen ähnlich sind, die man bewahren möchte.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass biologische und nicht biologische Materialien sterilisiert, dekontaminiert oder desinfiziert werden können durch wiederholte Zyklen zwischen relativ hohen und niedrigen Drücken. Druckzyklisierung kann bei geringen Temperaturen, bei Raumtemperatur oder bei erhöhten Temperaturen (z. B. von etwa –40°C bis etwa 95°C) durchgeführt werden. Neue Verfahren, die auf dieser Entdeckung beruhen, können in beispielsweise der Herstellung von Vakzinen, der Sterilisierung von Blutplasma oder -serum, der Dekontamination von militärischen Vorrichtungen, in der Nahrungsmittel- und Getränkeproduktion und in der Desinfektion von medizinischer Ausrüstung Anwendung finden. Die neuen Verfahren können auch in Produktionsverfahren oder Forschungsverfahren eingebaut werden.
Generell bietet die Erfindung ein Verfahren zur Sterilisierung eines Materials. Das Verfahren schließt die Schritte der zur Verfügungsstellung eines Materials bei einem Anfangsdruck (z. B. 1 atm) und Temperatur (z. B. 25°C, geringere Temperaturen wie 0°C, –5°C, –25°C, – 40°C oder geringer) ein; Kühlen des Materials auf eine Temperatur Te, wobei Te –40°C bis 10°C ist; Steigern des Drucks auf einen erhöhten hydrostatischen Druck, der ausreichend ist, um wenigstens einige (z. B. wenigstens etwa 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 99% oder auch im Wesentlichen alle) Mikroben, die in dem Material enthalten sind, zu inaktivieren (z. B. in einem Bereich von etwa 5.000 psi [34,5 MPa] bis etwa 95.000 psi [655,0 MPa] oder in dem Bereich von etwa 10.000 psi [68,9 MPa] bis etwa 75.000 psi [517,1 MPa] oder im Bereich von etwa 95.000 psi [655 MPa] bis etwa 150.000 psi [1.034,5 MPa]; und nachfolgend Verringern des Drucks auf einen reduzierten Druck, der in etwa der gleiche sein kann wie der Anfangsdruck, weniger oder größer als der Anfangsdruck (z. B. um 1 atm), und wiederholtes zyklisches Durchlaufen des Drucks zwischen einem erhöhten Druck und einem reduzierten Druck, um ein sterilisiertes Material zur Verfügung zu stellen (d. h. ein Material, das einen reduzierten Mikroben-Titer besitzt).
In einigen Fällen schließt das Material ein Protein ein. In solchen Fällen kann es wünschenswert sein, dass der erhöhte Druck nicht ausreicht, um Proteine während der Zeit, in der der Druck auf einem erhöhten Niveau ist, irreversible zu denaturieren. Der Fachmann versteht, dass „Denaturierung eines Proteins" die Denaturierung einer ausreichenden Menge des Proteins bedeutet, um die Nützlichkeit des Proteins für eine bestimmte Anwendung zu reduzieren oder zu zerstören. Typischerweise macht die irreversible Denaturierung von mehr als etwa 50% des Proteinmoleküls in einer Probe die Probe zu einer unzufriedenstellenden Quelle des Proteins. In einigen Fällen ist jedoch ein Zurückbleiben von nur 10% oder weniger der Proteinaktivität ausreichend.
Das Material kann auf Temperaturen unter null Grad abgekühlt werden (z. B. von etwa –40°C bis etwa 0°C, besonders zwischen etwa –20°C und etwa 5) entweder vor oder nachdem der Druck erhöht wird. Die Temperatur kann nachfolgend erhöht werden, entweder vor oder nachdem der Druck verringert wird.
Der Druck wird wiederholt zyklisiert (z. B. 2, 3, 5, 10 oder sogar 100 Mal oder mehrmals) zwischen dem erhöhten Druck und dem Anfangsdruck. Diese Zyklisierung kann bei der Anfangstemperatur durchgeführt werden, bei einer geringen Temperatur (z. B. Temperaturen unter Null, wie zwischen –40°C und 0°C oder zwischen –20°C und –5°C), oder während das Material auf eine niedrige Temperatur abgekühlt wird. Die Zeitsteuerung der Zyklen kann so erfolgen, dass es der Temperatur des Materials ermöglicht wird vor jedem Zyklus, zu equilibrieren (z. B. auf die Temperatur der Wände eines Reaktionsgefäßes, in dem das Verfahren durchgeführt wird).
In einigen Fällen kann ein Material bei geringerer Temperatur in einem festen (d. h. gefroren) Zustand bei dem Anfangsdruck sein, jedoch in dem flüssigen (d. h. geschmolzen oder getaut) Zustand bei dem erhöhten Druck. In einigen Fällen verursacht Druckzyklisierung begleitende Einfrier-/Auftauzyklisierung. Die zeitlichen Muster der Pulsation können optional verändert werden. Während jedes Zyklus wird der Druck abwechselnd gesteigert und dann verringert. Das Verhältnis der Zeit bei hohem Druck zu der Zeit bei geringem Druck wird als „Pulsationsmuster-Verhältnis" bezeichnet. Ein Pulsationsmuster-Verhältnis größer als 1 : 1 (z. B. 2 : 1 oder mehr) kann in den meisten Fällen eine optimale Inaktivierung von Kontaminanten erzeugen, wohingegen ein Pulsationsverhältnis von weniger als 1 : 1 eine größere Menge an zurückbleibenden richtig gefalteten sensitiven Proteinen ergeben kann.
Das sterilisierte Material kann beispielsweise eine biologische Probe, Blutplasma, vom Blutplasma abgeleitete therapeutische und/oder diagnostische Produkte, biologische Flüssigkeiten, medizinische Flüssigkeiten, Medikamente, Forschungslösungen und Reagenzien, Serum, lebendes Gewebe, medizinische oder militärische Ausrüstung, ein Nahrungsmittel, eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Vakzin sein. Das sterilisierte Material kann anfänglich beispielsweise mit einem Bakterium oder mehreren Bakterien, einem Virus, einem Pilz, einem Protsten, einem Sporenbildner, einem Protozoen Parasit, mit Malaria-induzierenden Organismen, mit Giardia oder mit viral infizierten Zellen infiziert sein, kontaminiert sein oder sie auf andere Weise enthalten.
Die Erfindung bietet auch ein Verfahren zur Inaktivierung eines Virus in einem Material. Das Verfahren schließt ein die Schritte: zur Verfügung stellen eines Materials bei einem Anfangsdruck und Temperatur; und Aussetzen des Materials gegenüber wiederholten Druckzyklen (z. B. 2 bis 100 Zyklen, mehr als etwa 3, 10, 50, 100, 1.000 oder 10.000 Zyklen). Jeder Druckzyklus schließt die Schritte des Steigerns des Drucks auf einen erhöhten Druck (z. B. zwischen etwa 10.000 psi [86,9 MPa] und etwa 120.000 psi [827,4 MPa], zwischen etwa 40.000 psi [275,8 MPa] und etwa 100.000 psi [689,5 MPa] oder zwischen etwa 70.000 psi [482,6 MPa] und etwa 90.000 psi [620,5 MPa] ein, Aufrechterhalten eines erhöhten Drucks für einen Zeitraum T_e, Verringern des Drucks auf einen reduzierten Druck und Halten des Materials bei einem reduzierten Druck (z. B. einem Druck, der geringer ist, als der erhöhte Druck und geringer als, gleich oder größer als der anfängliche Druck), für einen Zeitraum t_i. Der erhöhte Druck ist ausreichend, so dass jeder Zyklus wenigstens einige (z. B. wenigstens etwa 1%, 5%, 10%, 25%, 50% oder mehr) der Viren in dem Material inaktiviert, wenn der erhöhte Druck für eine Zeit T_e (z. B. zwischen etwa 0,5 und etwa 300 Sekunden, oder zwischen etwa 10 und etwa 30 Sekunden) aufrecht erhalten wird.
In einigen Fällen schließt das Material ein Protein ein. In solchen Fällen kann der erhöhte Druck ein Druck sein, der ausreichen würde, um im Wesentlichen alle (z. B. 50%, 75%, 90%, 95% oder mehr) Proteine irreversibel zu denaturieren, wenn der erhöhte Druck für eine Zeit im Wesentlichen länger als T_e (z. B. 2, 3, 5, 10, oder 100-fach T_e oder mehr) aufrecht erhalten wird, aber er ist nicht ausreichend ist, um das Protein irreversibel zu denaturieren, wenn der erhöhte Druck nur für einen Zeitraum T_e oder weniger aufrecht erhalten wird.
Das Protein kann beispielsweise ein Blutgerinnungsfaktor (z. B. Faktor VII, VIII, IX, XI und oder XIII) sein, ein Immunglobulin (z. B. IgG, IgM), ein monomeres Protein, ein multimeres Protein oder ein Gemisch von Proteinen sein.
Das Virus kann ein verkapseltes oder nicht verkapseltes Virus sein (z. B. humanes Parvovirus B19, Schweineparvovirus, Rinderparvovirus, humanes Immundefizienzvirus, Herpes-simplex-Virus, Hepatitis-A-Virus, Bakteriophage MS2 oder transfusionsübertragenes Virus).
Das Verfahren kann auch den Schritt des Abkühlens des Materials auf eine Temperatur T_e einschließen (z. B. etwa –40°C bis etwa 10°C, oder etwa –25°C bis etwa –10°C), vor Aussetzen des Materials gegenüber einem erhöhten Druck.
Jedes der neuen, vorstehend beschriebenen Verfahren kann auch verwendet werden, um Vakzine gegen spezifische Mikroben zu erzeugen. Beispielsweise kann eine Suspension mikrobieller Zellen erhalten werden, sterilisiert werden durch eines der neuen Verfahren (z. B. das Verfahren, das Druckzyklisierung einschließt und potentiell Einfrier-/Auftauzyklisierung bei Temperaturen unter null) und kombiniert werden mit einem Adjuvans zum Virus, Herpessimplex-Virus, Hepatitis-A-Virus, Bakteriophage MS2 oder transfusionsübertragens Virus).
Das Verfahren kann auch den Schritt des Abkühlens des Materials auf eine Temperatur T_e (z. B. etwa –40°C bis etwa 10°C, oder etwa –25°C bis etwa –10°C) vor dem Aussetzen des Materials gegenüber einem erhöhten Druck einschließen.
Jedes der neuen, vorstehend beschriebenen Verfahren kann auch verwendet werden, um Vakzine gegen spezifische Mikroben zu erzeugen. Beispielsweise kann eine Suspension mikrobieller Zellen erhalten werden, sterilisiert werden durch eines der neuen Verfahren (z. B. das Verfahren, das Druckzyklisierung einschließt und potentiell Einfrier-/Auftauzyklisierung bei Temperaturen unter Null) und kombiniert werden mit einem Adjuvans, um ein Vakzin zu produzieren. Liegen Toxine in der Suspension vor, können diese entfernt werden (z. B. nach dem Sterilisationsschritt).
In einigen Fällen kann es nützlich sein, Additive einzuschließen, wie einen Phasenwechselkatalysator (z. B. Glaspartikel), ein proteinstabilisierendes Agens (z. B. einen Zucker, Glyzerin, ein hydrophiles Polymer, ein Zyklodextrin, ein Caprylat, Acetylfryptophanoat, Polyethylenglykol, Antioxidanz oder einen proteinspezifischen Liganden) oder eine Nukleinsäure-bindende Verbindung (z. B. einen Fotosensibilisator, wie ein Psoralen) in Verbindung mit dem Material, das sterilisiert werden soll. Einige dieser Zusätze können nachfolgend durch Zentrifugation oder Filtration, falls notwendig, entfernt werden.
In einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung eine Vorrichtung zur Sterilisierung eines Materials. Die Vorrichtung schließt ein Druckausgleichgefäß ein, das eingerichtet ist, um einen externen Druck auf ein Material in ihm zu übertragen. Das Gefäß muss in der Lage sein, einem erhöhten Druck zu widerstehen (z. B. Drücken, denen in der Praxis von einem der neuen Verfahren, die vorstehend beschrieben sind, begegnet wird), muss in der Lage sein, in eine Druckzyklisierungsvorrichtung zu passen (z. B. wie psi); aufgrund der kurzen Dauer der Druckzyklen (z. B. zwischen etwa 1 s und etwa 300 s) und in einigen Fällen den geringen Temperaturen (z. B. zwischen etwa –10°C und etwa –40°C), jedoch verhindern die neuen Verfahren, die Verursachung von exzessiver, irreversibler Denaturierung der Proteine in den Materialien, die dadurch sterilisiert werden.
In noch einer anderen Ausführungsform bietet die Erfindung ein weiteres Verfahren zur Sterilisierung eines Materials, das Proteine einschließt. Das Verfahren schließt die Schritte des zur Verfügung stellens des Materials bei einem Anfangsdruck; des Zusetzen von einem oder mehreren proteinstabilisierenden Reagenzien (z. B. Zucker wie Glukose; Glyzerin; ein hydrophiles Polymer; ein Zyklodextrin; ein Caprylat; Acetyltryptophanoat; Polyethylenglykol; ein Antioxidanz; oder einen proteinspezifischen Liganden) zu dem Material; des Steigerns des Drucks auf einen erhöhten Druck (z. B. etwa 10.000 [68,9 MPa] bis 70.000–80.000 psi [482,6–552 MPa], abhängig von der Stabilität des Proteins); des Inkubierens des Materials für eine Zeit, die ausreichend ist, damit Sterilisation auftritt ohne einen wesentlichen Verlust der Proteinfunktion; und des Wiederherstellens des Drucks auf den anfänglichen Druck ein, um ein sterilisiertes Material zur Verfügung zu stellen. Wieder kann der Druck wiederholt zyklisiert werden.
In jedem der vorstehenden Verfahren kann das zu sterilisierende Material in seiner Endverpackung zur Verfügung gestellt werden, die Verpackung ist in der Lage, Druck zu übertragen, ohne zu zerreißen. Beispielsweise kann die Verpackung hermetisch in flexiblem Plastik (z. B. PVC oder Polyethylen) abgeschlossen sein.
Alternativ kann die Verpackung eine Spritze sein und der Druck kann über einen Kolben übertragen werden.
Die Erfindung bietet auch ein Verfahren zur Druckbehandlung von infektiösem Material. Das Verfahren schließt die Schritte des Verpackens des Materials in einen Container ein, der angepasst ist, um einen externen Druck auf das Material zu übertragen; Untertauchen des Containers in eine sterilisierende, chemische Lösung (z. B. enthaltend ein oxidierendes Agens, einen Alkohol, Harnstoff, ein Guanidiniumsalz, eine Säure oder eine Base); und Druckbehandeln des Materials in dem Container.
In jedem der vorstehenden Verfahren kann der pH des Materials, das sterilisiert werden soll, optional auf mehr als etwa 10 (z. B. zwischen 10 und 14 oder zwischen 11 und 12) oder auf weniger als etwa 4 (z. B. zwischen 0 und 4, oder zwischen 2 und 3) eingestellt werden, bevor der Druck gesteigert wird. Solche pH-Einstellungen können nützlich sein für beispielsweise die Inaktivierung von pH-sensitiven Mikroben (z. B. Parvovirus) oder Mikroben in Materialien, die Proteine einschließen, die resistent gegen pH-Extreme sind (z. B. IgG), sie können die Sterilisierungsverfahren beschleunigen und können es in einigen Fällen ermöglichen, das Verfahren insgesamt bei geringeren Drücken durchzuführen.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „Temperaturen unter Null" eine Temperatur weniger als 0°C (z. B. –1°C, –5°C, –10°C, –20°C und weniger). Alle Temperaturen hier sind in Grad Celsius, wenn nicht anders angegeben ist, und werden nur durch „°C" angegeben. Die Einheiten des Drucks werden hier in Pfund pro Quadratzoll (psi) oder in Atmosphären. (atm) angegeben. 1 atm ist etwa 14,5 psi, 1 bar oder 101,3 Kilopascal.
Ein Tieftemperatur-Druckverfahren („cryobares Verfahren") ist ein Verfahren, das wenigstens eine Druckveränderung einschließt, die bei einer Temperatur unter Null durchgeführte werden. In einigen Tieftemperatur-Druckverfahren wird der Druck zwischen zwei Drücken zyklisiert (z. B. etwa 14,5 psi [0,1 MPa] bis etwa 5.000 psi [34,5 MPa], 35.000 psi [241,5 MPa], 70.000 psi [483 MPa], 80.000 psi [552 MPa], 100.000 psi [689,5 MPa] und höher), während die Temperatur entweder auf einer Temperatur unter null Grad aufrecht erhalten wird oder in einem Temperaturbereich unter null Grad variiert wird.
Die Ausdrücke „sterilisieren", „desinfizieren", „inaktivieren" und „dekontaminieren" werden hier abwechselnd verwendet, wenn es nicht anders vom Zusammenhang gefordert wird. Es sollte beachtet werden, dass „Sterilisierung" (Töten aller Organismen) in bestimmten Verfahren nicht synonym mit „Dekontamination" sein kann, wenn die Kontaminante nicht lebend ist, wie ein Protein oder Prion.
Die neuen Verfahren stellen verschiedene Vorteile zur Verfügung Beispielsweise können die Verfahren bei Temperaturen unter null Grad ausgeführt werden (z. B. zwischen etwa –40°C und 0°C). Druckzyklisierung, die bei Temperaturen unter null Grad durchgeführt wird, kann Vorteilhafterweise Oszillation zwischen verschiedenen Phasen des Wassers in oder außerhalb der Zellen oder Vesikel von biologischen Kontaminanten induzieren. Der Übergang zwischen den festen und flüssigen Zuständen kann physikalischen Stress auf Membranen, Wände und Vesikel ausüben, wodurch der beabsichtigte Verfahren erleichtert wird. Der Bereich von Temperaturen unter null, der generell in den neuen Verfahren verwendet wird, wird leicht mit relativ kostengünstiger Ausstattung erreicht (z. B. kommerzielle Kühlvorrichtungen), die bereits in einer Auswahl von Formen und Größen erhältlich sind, um einen spezifischen Bedarf zu erfüllen. Ähnlich kann der Bereich der erforderlichen Drücke für eine Standardoperation der Verfahren (z. B. von etwa 14,5 psi [0,1 MPa] bis etwa 30.000 psi [206,8 MPa], 70.000 psi [482,6 MPa], 80.000 psi [552 MPa], 100.000 psi [690 MPa] oder höher) durch Vorrichtungen erzeugt werden, wie sie in PCT US97/03232 beschrieben sind.
Eine Vorrichtung zur Sterilisation eines Materials durch ein Tieftemperatur-Druckverfahren wird generell eine Kammer einschließen, um das Material zu enthalten, die Kammer ist in der Lage, einen ausgewählten erhöhten Druck durchzuführen und ein System einschließen zur Kontrolle, Veränderung oder Regulation der Temperatur und des Drucks in der Kammer. Die Vorrichtung kann schnelles Steigern und Verringern des Drucks ermöglichen, der ausreichend ist, um Denaturierung von Proteinen während der Druckregelungs- und – entregelungsschritte der Druckzyklen zu verhindern Die optimale Geschwindigkeit ist beispielsweise abhängig von der Temperatur, die in dem Verfahren verwendet wird; generell werden höhere Raten bei höherer Temperatur benötigt. Die Vorrichtung stellt auch Systeme zur Entfernung eines sterilisierten Materials auf antiseptische Weise aus der Kammer zur Verfügung. Zusätzlich kann eine typische Sterilisationsvorrichtung zur Verwendung in den neuen Verfahren eine Vielzahl von Kontrollen, Regulatoren und Temperatur und/oder Drucksensoren einschließen. Das Druckmedium kann beispielsweise eine Wasser-/ Ethylenglykollösung oder andere nicht-gefrierende Lösungen oder ein Festmaterial, wie gepuderter Talk, sein.
Die Vorrichtungen, die notwendig sind, um die neuen Verfahren durchzuführen, können leicht angepasst werden, um die Erfordernisse bestimmter Anwendungen zu erfüllen. Beispielsweise kann eine kleine, tragbare Vorrichtung erhalten werden, wodurch Sterilisations- oder Dekontaminationsverfahren auf dem Feld durchgeführt werden können (z. B. durch Sanitäter oder medizinisches Militärpersonal).
Temperaturvariationen können auch zur Lyse von Mikroben beitragen. Temperatur, Druck, Zyklusanzahl oder Zyklusfrequenz kann variiert werden, um die Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrenes zu maximieren.
Die neuen Verfahren sind sehr schnell. Beispielsweise kann der Druck bei einer Frequenz von etwa 1 MHz bis etwa 10 Hz zyklisiert werden, was es typischerweise ermöglicht, den gesamten Sterilisationsverfahren innerhalb von Minuten zu vervollständigen.
Die neuen Verfahren ermöglichen es, pathogene Organismen in einem Material zu neutralisieren, ohne die begleitende Denaturierung von Proteinen. Die neuen Verfahren können Denaturierung verhindern, die häufig nach Sterilisation von biologischen Materialien auftritt.
Schnelle und ökonomische Sterilisation ist erreichbar mit einem Minimum an Proteinzerstörung oder Denaturierung. Die neuen Verfahren können somit vorteilhaft zur Produktion von hochaktiven Vakzinen verwendet werden. Diese Vakzine können Vakzinen, die bei höheren Temperaturen erzeugt wurden, überlegen sein, da höhere Temperatur Zerstörung von sowohl kovalenten als auch nicht-kovalenten Bindungen in Proteinen verursachen können und zu einem größerem Grad der irreversiblen Denaturierung führen als die hier beanspruchten Verfahren. Hohe Temperaturen können auch zu kovalenten Bindungen von Proteinen an kleine Moleküle, wie oxidierter Glukose, führen. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass sie verwendet werden kann, um Viren und Bakterien in Patientenproben vor der Analyse zu inaktivieren. Laboranten können dem Risiko unterworfen sein, eine Infektion zu bekommen (z. B. von Viren wie dem humanen Immundefizienzvirus und Hepatitis B Virus), wenn sie Gewebeproben, Zellen oder Flüssigkeiten, die von dem Patienten zur Analyse entnommen wurden, handhaben. Um dieses Risiko zu verhindern, können solche Proben in einem Container gesammelt werden, der konstruiert wurde, um in eine Druckzyklisierungsvorrichtung inseriert zu werden. Ein geeigneter Behälter sollte komprimierbar sein oder sollte einen Kolben oder Stempel haben, um den Druck zu übertragen. Die erfindungsgemäßen Verfahren können dann mit einer Probe in dem Container durchgeführt werden, ohne die Probe vor der pathogenen Inaktivierung freizusetzen. In einem Beispiel wird gesammeltes Blut in einer Spritze verschlossen und die verschlossenen Spritze wird dann in eine Druckkammer, gefüllt mit einem Medium, das den Sterilisierungsdruck überträgt, wie 70% Ethanol, gebracht. Die Probe wird dann mit einem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt und zur Analyse entnommen.
Andere Vorteile der neuen Verfahren schließen die Verhinderung oder Reduktion des Bedarfs chemischen Zusätze zu Blutfraktionen zuzusetzen; die Skalierbarkeit des Verfahrens von einzelnen Einheiten bis zu großen, vereinigten Proben oder zu kontinuierlichen Online-Verfahren; und Eliminierung von Nebenwirkungen der Hitzeinaktivierungsverfahren auf Proteinbestandteile ein.
Falls nicht anderweitig definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die gleiche Bedeutung, wie sie normalerweise von dem Fachmann auf dem Gebiet , zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden. Obwohl Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleich den hier beschriebenen sind, in der Praxis oder dem Ausprobieren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind geeignete Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. Alle Publikationen, Patentanmeldungen, Patente und andere Referenzen, die hier erwähnt sind, sind in ihrer Gesamtheit durch Referenz eingeschlossen. Im Falle eines Konflikts geht die vorliegende Beschreibung einschließlich Definitionen vor. Zusätzlich sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur zur Veranschaulichung und nicht dazu gedacht, einzuschränken.
Weitere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung und durch die Ansprüche ersichtlich.
Detaillierte Beschreibung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, durch das ein Material sterilisiert oder dekontaminiert werden kann durch hohen Druck im Bereich von etwa 5.000 [34,5 MPa] bis 95.000 psi [655 MPa], vorzugsweise in dem Bereich von 30.000 [206,8 MPa] bis 75.000 psi [517,1 MPa]. Das Material wird entweder vor oder nach der Druckbehandlung auf eine bestimmte Temperatur eingestellt, die sowohl mit der Erhaltung der gewünschten Eigenschaften des Materials als auch mit der Zerstörung der Kontaminanten kompatibel ist.
Obwohl die Temperatur, der Druck, die Anzahl und die Dauer der Zyklen und die relative zeitliche Planung des Drucks und der Temperaturveränderung variieren kann, werden die neuen Verfahren generell gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt: Ein Material wird bei einem Anfangsdruck (z. B. Atmosphärendruck, 14,5 psi) und Temperatur (z. B. Raumtemperatur, 25°C, oder einer gekühlten Temperatur, wie 0°C bis 4°C oder eine Gefriertemperatur, wie –80°C bis –20°C) zur Verfügung gestellt. Das Material wird dann bis zu einem erhöhten Druck unter Druck gesetzt. Der Druck kann dann wiederholt zwischen dem erhöhten Druck und dem Außendruck zyklisiert werden. Das Material kann in einem gefrorenen Zustand nach der letzten Druckentlassung produziert werden oder kann auf 0°C oder mehr aufgewärmt werden, bevor der Druck entlassen wird, um ein nicht gefrorenes, sterilisiertes Produkt zu produzieren.
Die vorstehenden Verfahren können auch in Verbindung mit Verfahren verwendet werden, in denen ein bekannter statischer Druck und/oder ein bestimmter Druck für einen gegebenen Zeitraum aufrecht erhalten wird. In einigen Fällen kann der Druck auf einem stark erhöhten Niveau für einen Zeitraum aufrecht erhalten werden, der ausreichend ist zur Inaktivierung vom Mikroben, der jedoch nicht ausreicht, um Proteine irreversibel zu denaturieren.
Ist ein Phasenwechsel in einem Sterilisationsverfahren involviert, kann ein Katalysator zugegeben werden, um den Wechsel zu beschleunigen. Beispielsweise kann die Anwesenheit von fein zerteiltem Glas oder anderen Materialien Nukleationsstellen zum Frieren einer Probe oder eines Materials zur Verfügung stellen.
Allgemein
Anwendungen dieser neuen Verfahren schließen die Sterilisation von Materialien, wie Blutplasma von Spendern (z. B. zur Verwendung in Transfusionen), die Sterilisierung von gereinigten oder teilweise gereinigten therapeutischen und diagnostischen Proteinen, die von Blut abgeleitet sind, medizinischen Proben (Blut, Urin, Fäkalien, Haar, Biopsie oder anderen Gewebeproben), Arzneimitteln (z. B. biosynthetische Antisense-Arzneimittel), Bioarzneimitteln und transgen erzeugten Proteinen ein. Die neuen Verfahren können verwendet werden, um die Proliferation von Viren in inkubierten Materialien zu hemmen oder solche Materialien zu sterilisieren. Die neuen Verfahren können auch verwendet werden, um die Sterilität von Kosmetika, Pharmazeutika und industriellen Produkten sicher zu stellen.
Beispiele für Mikroben, die durch die neuen Verfahren inaktiviert werden, schließen sowohl hydrophile als auch lipophile Viren ein; nahezu jedes Bakterium, einschließlich z. B. Staphylokokken, Mikrokokken, pyrogene Streptokokken, Diphteroide (z. B. lipophile, nichtlipophile, anaerobe Diphteroide, wie Propiobakterium, gram-negative Enterobazillen (z. B. Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Serratia), Neisseria, aerobe Sporenbildner, Mycobakterien; Pilze, einschließlich z. B. Hefe, Pityrosporum ovale, Pityrosporum orbiculare, Candida albicans, Candida parapsilosis, Torulopsis glabarata und filamentöse Dermatophytenspezies; Protisten und niedere multizelluläre Organismen, einschließlich Protozon-Parasiten; und Darmwurmparasiten; Malaria induzierende Organismen; Giardien; und viral infizierte Zellen.
Beispiele für Viren, die durch die neuen Verfahren inaktiviert werden können, schließen sowohl DNA- als auch RNA-Viren ein, wie das humane Parvovirus B19 („B19"), Schweine-Parvovirus („PPV"), Bakteriophage MS2 („MS2") und Hepatitis A Virus (HAV). Sowohl B19 als auch HAV sind klein (etwa 15–30 nm) und besitzen keine äußere Hülle, die aus Lipiden besteht (nicht umhüllt), sind resistent gegenüber Hitze und chemischer Behandlung und sind schwierig durch Nanofiltration zu entfernen. PPV und MS2 sind ähnlich resistente Viren, die als Forschungsmodelle für die Humanpathogenen B19 und HAV dienen können. Umhüllte Viren (z. B. humanes Immundefizienzvirus, Hepatitis B Virus und Hepatitis C Virus) sind auch potentielle Ziele der neuen Verfahren. Zurzeit uncharakterisierte Viren, wie einige neu erkannte Formen von Hepatitis-Virus und transfusionsübertragene Viren können auch verletzlich durch die neuen Verfahren sein.
Plasmasammlungen enthalten häufig Hepatitis C Virus (HCV). Verfahren zur Erzeugung von Blutprodukten können somit von einem Verfahren profitieren, das HCV und andere Viren inaktiviert. Humaner Parvovirus B19 (B19) ist eine weitere gängige Kontaminante von Plasma. Hepatitis A Virus (HAV) Kontaminanten sind weniger gängig, jedoch immer noch störend. Sowohl B19 als auch HAV sind klein (etwa 15–30 nm), besitzen keine äußere Hülle, zusammengesetzt aus Lipiden (nicht umgehüllt), sind resistent gegenüber Hitze und chemischer Behandlung und sind schwer durch Nanofiltration zu entfernen. Umhüllte Viren (z. B. HIV, HBV, HCV) sind auch potentielle Ziele der neuen Verfahren. Zurzeit uncharakterisierte Viren, wie einige neu erkannte Formen von Hepatitis-Virus und das transfusionsübertragne Virus (TTV) können auch durch diese neuen Verfahren verletzlich sein. Zusätzlich sind prion-basierte infektiöse Mittel, wie übertragbare spongiforme Enzephalopathie, schwierig zu screenen und zu inaktivieren. Da jedoch die erfindungsgemäßen Verfahren unter geeigneten Bedingungen Proteinentfaltung induzieren können, kann es möglich sein, solche Mittel durch die erfindungsgemäßen Verfahren zu inaktivieren.
Aufgrund der Möglichkeit, dass zerstörte Viruspartikel sich nach der Druckbehandlung wieder zusammenbauen können, kann es wünschenswert sein, die Nukleinsäuren, die in dem Virus enthalten sind, irreversible abzubauen. Gemäßigt hohe Drücke (z. B. 20.000 psi [138 MPa] bis 60.000 psi [414 MPa] können Komplexe von Nukleasen und ihren endogenen Inhibitoren zerstören. Die aktivierten Nukleasen können dazu dienen, Nukleinsäuren abzubauen und dadurch die irreversible Inaktivierung von Viren zu verstärken. Zusätzlich kann gemäßigter Druck die Aktivierung von nicht-inhibierten Enzymen beschleunigen. Das Verfahren kann verstärkt werden durch den Zusatz von Nukleasen. In einigen Fällen ist es wünschenswert, eine magnesium-unabhängige Nuklease zuzusetzen, wie bei der Behandlung von zitriertem Plasma, da das Zitrat Magnesiumionen binden kann und somit magnesiumabhängige Nukleasen inhibiert.
Alternativ können wesentlich höhere Drücke (z. B. 50.000 psi bis 150.000 psi [345 –1035 MPa]) zur Sterilisation von Materialien, die druckstabil sind, wie kleine Moleküle, Arzneimittel oder thermostabile Proteine verwendet werden. Ein Druckzyklus-Einfrier-/Auftau-Sterilisationsverfahren (z. B. ein Verfahren, das Vorteil aus der zyklischen Bildung von Hochdruck-Eis wie Eis III, Eis IV, Eis V oder Eis VI zieht) kann verwendet werden.
Sind die biologischen Kontaminanten verhältnismäßig druckstabil und enthält das Material labile Proteine, die zurückbehalten werden sollen, kann eine Abwandlung dieses Verfahrens verwendet werden. In dieser Abwandlung wird der Druck schnell gesteigert (z. B. in weniger als 5 Sekunden oder weniger als 1 Sekunde) auf einen sehr hohen Maximaldruck (z. B. 100.000 psi [690 MPa] oder höher) und nur kurz auf einem hohen Druck gehalten (z. B. weniger als 5 Sekunden). Der Druck und die Zeit sind gewählt, um einen hohen Grad der Mikrobeninaktivierung zur Verfügung zu stellen, allerdings ist die Zeit kurz genug, dass Proteine, die durch die erhöhten Druckbedingungen denaturiert wurden, keine Zeit haben, um zu einem ausreichenden Maß in irreversible Komplexe zu aggregieren, bevor sie sich in ihre natürliche Form zurückfalten. Der Druck wird dann schnell entlassen (z. B. in weniger als 5 Sekunden oder weniger als 1 Sekunde). Die Inaktivierung von Mikroben, wie Viren, kann zu einem wesentlich größerem Maß fortschreiten als die irreversible Aggregation oder Denaturierung von Proteinmolekülen.
Die Durchführung der Druckzyklisierung bei geringer Temperatur kann weiterhin die Zurückbehaltung von aktiven Proteinen verbessern, durch Verlangsamung der Aggregationsrate und Steigern der Proteinrückfaltungsrate. Unter bestimmten Bedingungen bei hohem Druck und geringen Temperatur (z. B. 100.000 psi [690 MPa] und –20°C) kann sich Hochdruck-Eis (d. h. Eis V oder Eis VI) bilden. Proteine, die in der Gitterstruktur von Hochdruck-Eis gefangen sind, können weniger wahrscheinlich aggregieren. Das Hochdruck-Eis benötigt eine bestimmte Zeit, um zu schmelzen, dies kann für die Proteine in dem Material ausreichend sein, um zurückzufalten, während sie in der Festphase gefangen sind. Der Zusatz von Glukose kann auch die Proteinfaltungsrate steigern.
Es wurde auch gezeigt, dass Druck die Aktivität von zahlreichen Enzymen steigert. Beispielsweise wird Rnase-Aktivität durch erhöhten hydrostatischen Druck beschleunigt. Diese Wirkung kann in Verbindung mit den neuen Verfahren zur Inaktivierung von Viren ausgenutzt werden. RNA-Viren sind nach Hochdruckbehandlung leicht abzubauen.
Bluttransfusion
Die neuen Verfahren können verwendet werden, um die Sicherheit von Bluttransfusionen zu verbessern. Plasmaproteinprodukte, wie intravenöses Immunglobulin („IVIg"), Faktoren VII, VIII, IX, XI und XIII, Albumin, von Willebrand-Faktor, Fibrinogen, Antithrombin III, Protein C, C1-Inhibitor, Alpha-1-Antitrypsin und Fibrinabdichtungsstoffe werden beispielsweise von Blutern, Krebspatienten und Nierendialysepatienten benötigt. Allerdings können Viren, die in Blutprodukten vorliegen, ein Risiko für Patienten darstellen, die solcher Produkte bedürfen. Auch bei Verwendung von neuen Filtrationstechniken, die viele Zellen eliminieren, können bestimmte Bakterien und Viren in den Produkten verbleiben.
Herkömmliches Blutplasma wird isoliert durch Erhalten einer Blutprobe (z. B. gesammelt in einem Röhrchen, das ein Antikoagulanz enthält), Zentrifugieren der Probe in einem Plasmatrennungsröhrchen und Dekantieren des Plasma von dem Prezipitat in dem Röhrchen. Obwohl dieses Verfahren das Plasma von der Hauptmasse der Zellen befreit, bleiben einige Zellen unweigerlich indem Plasma. Wenn die zurückbleibenden Zellen beispielsweise Bakterien oder Viren einschließen, können Krankheiten durch Transfusion verbreitet werden. Die neuen Verfahren können mit dem Plasma, das durch das vorstehend beschriebene Dekantierungsverfahren erhalten wurde, durchgeführt werden. Die Kontaminanten, die im Plasma zurückbleiben, können durch die neuen Verfahren inaktiviert werden.
Sterilisation von Reagenzien und Medien
Die neuen Verfahren können auch verwendet werden, um industrielle Produkte zu sterilisieren. Beispielsweise wird häufig Rinderserum in molekularbiologischen Laboratorien für Zellkulturen verwendet. Mikrobielle Kontamination von Quellen-Lagermaterial der Versorger tritt selten auf; wenn es jedoch passiert, können die ökonomischen Kosten und die zeitlichen Verzögerungen häufig erheblich sein. Die gegenwärtigen Verfahren zur Sterilisation von fötalem Kälberserum (z. B. Hitze oder Filtration) können funktionell wichtige Proteine (z. B. Wachstumshormone) inaktivieren und auch Schwankungen von Lieferung zu Lieferung verursachen. Darüber hinaus, auch wenn das Quellen-Lagermaterial ursprünglich steril ist, kann es versehentlich nach Öffnen in dem Labor kontaminiert werden. Die neuen Verfahren können entweder in einem Produktionsverfahren (z. B. Charge oder kontinuierlich) verwendet werden oder in individuellen Laboren zur Vorbehandlung von Serum oder anderen Medien vor dem Begin eines Experiments.
Vakzin Produktion
Vakzine werden typischerweise durch Durchführung einer Inaktivierungsbehandlung einer Lösung kultivierten Viren hergestellt (z. B. Erhitzen, oder Zusetzen und Entfernen von chemischen Denaturierungsmitteln).
Ein erfolgreiches Vakzin-Herstellungsverfahren sollte Idealerweise in einem hohem Grad der viralen Inaktivierung resultieren, sollte es jedoch dem Produkt erlauben, seine Fähigkeit, eine schützende Immunantwort in dem Patienten zu stimulieren, beizubehalten. Hochdruckverfahren sind gut geeignet, um die Kriterien zu erfüllen, die für eine erfolgreiche Vakzinproduktion benötigt werden: Da kalte, druck-denaturierte Proteine eine Struktur beibehalten, die der nativen Struktur ähnlicher ist, als erhitzte oder chemisch denaturierte Proteine, könne druckinaktivierte Viren somit immunogener sein. Druckdenaturierte Proteine aggregieren auch weniger wahrscheinlich, wodurch höhere Erträge des Vakzins zur Verfügung gestellt werden. Das hier beschriebene Druckinaktivierungsverfahren kann ökonomisch in einem großen Maßstab durchgeführt werden, da es im Wesentlichen keine Chemikalien zuzusetzen oder zu entfernen gibt und im Gegensatz zur Hitze kann Druck schnell durch eine große Probe übertragen werden.
Die spezifischen Bedingungen, die zur Vakzinproduktion notwendig sind, können variieren abhängig von der bestimmten Mikrobe, die inaktiviert werden soll. Beispielsweise kann im Fall von sporenbildenden Organismen optional eine Vorbehandlung mit geringem Druck und gemäßigter Temperatur (z. B. 10.000 psi [86,9 MPa] und 40°C) angewendet werden, um die Sporen zu veranlassen, zu keimen. Die gekeimten Sporen können dann durch die erfindungsgemäßen Verfahren inaktiviert werden.
Druckverstärkte Fotosensibilisierung von Nukleinsäuren:
Es wurde ein Verfahren zur Sterilisation beschrieben, wobei das Produkt, das sterilisiert werden soll, mit einem chemischen Agens gemischt wird, das vorzugsweise an DNA oder RNA bindet und mit der Nukleinsäure reagiert (Radosevich, „Seminars in Thrombosis and Hemostasis," Bd. 24, Nr. 2, Seiten 157–161, 1998). In einigen Fällen wird Licht verwendet, um die chemische Gruppe zu aktivieren. Nachteile eines solchen Verfahrens können begleitenden Schaden an den gewünschten molekularen Bestandteilen des zu sterilisierenden Produkts einschließen (z. B. durch nicht-spezifische Reaktion mit Chemikalien oder durch Bestrahlung oder durch unvollständige oder langsame Penetration der inaktivierenden Chemikalie in das Innere der Mikrobe). Die Anwendung von erhöhten Drücken kann im Wesentlichen diese Problem überwinden durch Permeabilisierung von Zellen und Viren, um den Eintritt von inaktivierenden Chemikalien zu ermöglichen. Erhöhte Drücke können auch die Affinität und Selektivität der Moleküle für Nukleinsäuren erhöhen, wodurch die Verwendung von geringeren chemischen Konzentrationen und geringeren Mengen der Bestrahlung ermöglicht wird. Somit wird ein schnelleres, weniger teures und effizienteres Verfahren erhalten.
Eine Vorrichtung zur Ausführung des fotochemischen Verfahrens kann ein Hochdruck-Durchflusssystem, wie beschrieben in PCT-Anmeldung US96/03232, einschließen, das eine Reaktionskammer hat, die wenigstens ein druckbeständiges Fenster einschließt, das aus einem Material, wie Quarz oder Saphir, hergestellt sein kann, und eine Vorrichtung zur Bestrahlung des Materials durch das Fenster. Der Flüssigkeitsfluss ist so, dass das ganze Material den bestrahlten Bereich passiert. Das Material kann dann antiseptisch gesammelt werden. Das Material kann in einer Reaktionskammer eingeführt werden bei Hochdruck oder bei geringem Druck und dann vor der Bestrahlung druckbehandelt werden.
Chemische Inaktivierung von Viren
Eine Vielzahl von Chemikalien (z. B. Jod, Ethylenimin, Ascorbinsäure, Thiophosphoamid, Kongorot, Paraformaldehyd) kann verwendet werden, um Lösungen, die labile Proteine enthalten, zu sterilisieren. Allerdings kann die Verwendung dieser Chemikalien negative Wirkungen haben, einschließlich langsamer Inaktivierung, einem Potential für Proteinschädigung, oder die Unfähigkeit von Verbindungen, in das Innere der Mikrobe zu gelangen. Erhöhter Druck kann die Sterilisierungsaktivität dieser Chemikalien erhöhen, ohne die negativen Wirkungen zu verschlimmern (z. B. durch Steigern der Wirksamkeit der Chemikalien gegen hitzestabile, nicht-verkapselte Viren, wie das Parvovirus und Hepatitis A Virus).
Stabilisierung von Proteinen und Enzymen
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, eine Lösung zu sterilisieren oder ein anderes Material, das ein unstabiles Protein enthält, das irreversibel denaturiert werden würde bei dem Druck, der notwendig ist, um das vorstehend beschriebene Sterilisationsverfahren durchzuführen. In diesen Fällen kann ein Stabilisierungsagens (z. B. Aminosäuren, wie Glycin oder spezifische Liganden von Proteinen in dem Gemisch, Liganden der Proteine, die gewonnen werden sollen oder Zucker, wie Glyzerin, Xylose oder Glukose) zu dem Material vor der Druckbehandlung zugesetzt werden. Beispielsweise können die Stabilisatoren des humanen Serumalbumins Caprylat und Acetyltryptophanoat Blutplasmaproben zugesetzt werden und die Plasmaproben können dann dem Tieftemperatur-Drucksterilisationsverfahren ohne übermäßige Destabilisierung von spezifischen Plasmaproteinen unterworfen werden. Der Stabilisator kann dann durch Standardverfahren (z. B. Dialyse, Filtration, Chromatographie) entfernt werden.
Druckbehandlung von infektiösen Materialien
Hydrostatischer oder pulsierender Druck kann ein nützliches Werkzeug zur Sterilisierung, Zell- und Viruszerstörung und Nukleaseinaktivierung sein für Materialien, die potentiell Agenzien infektiöser Erkrankungen enthalten. Vielmehr rufen allgemeine Sicherheitsüberlegungen nach der Verhinderung von Infektionen der Personen, die das Material handhaben und der Verhinderung von Kontamination von anderen Materialien. Ein Weg, um solche Kontamination zu verhindern, ist die Verwendung einer Sterilisierungslösung (z. B. 10% CLOROX^®-Bleiche; 70% Ethanol; konzentrierter Harnstoff; oder ein Guanidinumsalz) oder ein oxidierendes Agens als Druckbehandlungsmedium.
Beispielsweise kann das Material in einen geschlossenen und flexiblen Behälter gebracht werden, der dann in die chemische Sterilisierungslösung untergetaucht werden kann. Die Lösung kann dann innerhalb eines zweiten, chemisch inerten Behälters verschlossen sein (d. h., um es vom Kontakt mit Metallteilen auf der Innenseite einer Druckkammer abzuhalten). Das inerte Druckbehandlungsmedium kann dann verwendet werden, um das Volumen zwischen der Innenseite der Druckbehandlungskammer und dem Behälter, der das Material und die sterilisierende Lösung hält, zu füllen. Der Container, der die Sterilisierungslösung hält, kann beispielsweise ein Plastikbeutel, ein Schraubverschluss-Plastikbehälter, eine verschlossene Spritze oder eine Schrumpfverpackung sein.
Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben, die den Rahmen der Erfindung, die in den Ansprüchen beschrieben wird, nicht einschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Deaktivierung des Lambda Phagen durch Tieftemperatur-Druckverfahren
Für jeweils 4 Proben wurde 2,5 μl Lambda Phagen Stock (5 × 10₁₁ pfu/ml) 100-fach durch Zusatz von etwa 248 μl Kälberserum verdünnt. Ein Fünftel der 2,5 μl Lambda Phagen Stock Probe wurde 100-fach in Suspensionsmedium verdünnt. Zwei Phagen Serum Proben (250 μl) wurden gefroren durch Untertauchen von Röhrchen in einem ethanol-trockenen Eisbad; drei andere Proben wurden auf Eis gebracht.
Eine der gefrorenen Phagen Serum Proben wurde zyklisiert zwischen 36.000 psi [248,4 MPa] (30 Sekunden) und 14,7 psi [0,101 MPa] (30 Sekunden) für 5 Minuten. Während der Druckbehandlung wurde die Temperatur dieser Probe bei –10°C gehalten. Die zurückbleibende gefrorene Probe wurde bei 14,7 psi [0,101 MPa] während des Experiments als Kontrolle gehalten. Bei der Wiederholung dieses Experiments wurde eine Trockeneisprobe auf –10°C für 5 Minuten erwärmt. Eine dritte Phagen Serum Probe wurde unter Druckgesetzt auf 36.000 psi [248,4 MPa] für 10 Minuten bei 23°C. Die zwei zurückbleibenden Proben, die als Positivkontrollen verwendet wurden, waren eine Phagen Serum Probe, inkubiert bei 23°C für 10 Minuten ohne Druckbehandlung und ein Phagen Suspensionsmedium (d. h. 0,0496 M Natriumchlorid, 4,06 mM Magnesiumsulfat, 50 mM Tris Cl pH 7,5 und 1,0 g/l Gelatine) mit jeweils weder Druck- noch Temperaturbehandlung. Nach der Druckbehandlung wurden 10²-, 10⁴- und 10⁶-fach Verdünnungen von Phagenproben in Suspensionsmedium hergestellt.
Eine Kultur von Ampicillin-resistenten E. coli wurde bis zur Sättigung in Lambda Broth (d. h. 10 g/l Trypton, 0,042 M Natriumchlorid), 0,2% Maltose und 10 mM Magnesiumsulfat (Current Protocols in Molecular Biology, Seite 1.11.1) wachsen gelassen.
Um Infektion zu induzieren, wurden 100 μl der Phagenprobe 300 μl der E. coli-Kultur, die vorstehend präpariert wurde, zugesetzt, und die Kultur wurde für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. 2,5 ml Lambda Top Agar (d. h. 10 g/l Trypton, 42 mM Natriumchlorid, 7 g/l Agar) wurde jedem Phagen-E.-coli Gemisch zugesetzt, gevortext und sofort auf Lambda-Platten ausgebreitet (d. h. 10 g/l Typton, 0,042 M Natriumchlorid, 10.0 g/l Agar in 90 mm Petrischalen).
Nach Inkubation der Platten für 16 Stunden bei 37°C wurden die Lambda-Plaques entweder gezählt oder, für Platten mit hoher Konfluenz, der gesamte Oberflächenbereich, der mit Plaques bedeckt war, eingeschätzt. Die plaquebildenden Einheiten pro Milliliter (pfu/ml) wurden berechnet durch Multiplizieren des Verdünnungsfaktors mit der Anzahl der Plaques, die auf jeder Platte erschienen.
Die plaquebildende Aktivität von Lamda-Phage wurde um 5 Größenordnungen reduziert durch abwechselnden hydrostatischen Druck bei –10°C. Man fand, dass die Dichte der gefrorenen, druck-zyklisierten Probe 9,4 × 10⁵ pfu/ml war, während die der gefrorenen, nicht-druckbehandelten Kontrolle 3,2 × 10¹¹ pfu/ml war. In einem zweiten Experiment wurde die plaquebildende Aktivität von 9 × 10¹⁰ pfu/ml auf 6,4 × 10⁴ pfu/ml nach abwechselnder Druckbehandlung reduziert. Im Gegensatz zu den gefrorenen Proben lag dort nur eine 3-fache Verringerung der plaquebildenden Aktivität in den Raumtemperaturproben vor. Die Probe, die bei 36.000 psi für 5 Minuten bei 23°C gehalten wurde, erreichte 1,2 × 10¹¹ pfu und die Kontrolle, die bei 14,7 psi gehalten wurde, hatte 3,1 × 10¹¹ pfu.
Serum hatte eine sehr geringe, wenn überhaupt eine Wirkung auf plaquebildende Aktivität. Es waren 50 × 10¹¹ pfu in der Probe, die in Suspensionsmedium verdünnt war und die Probe, die 100-fach in Serum verdünnt war, verringerte nur auf 3,1 × 10¹¹ pfu. Nur einmaliges Einfrieren bei Atmosphärendruck (14,7 psi) hatte offensichtlich keine Wirkung auf die plaquebildende Aktivität. Es waren 3,2 × 10¹¹ pfu in der gefrorenen Probe und 3,1 × 10¹¹ pfu in der Probe, die bei Raumtemperatur inkubiert wurde (23°C).
Beispiel 2: Wirkung von Pulsationsfreguenz auf virale Inaktivierung.
Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkung von Pulsationsfrequenz auf die Inaktivierung von Lambda-Bakteriophage in Serum zu bestimmen.
Eine Serumprobe wurde mit dem Virus inokuliert und wie in Beispiel 1 behandelt, jedoch mit variierenden Frequenzen der Pulsation und einem maximalen Druck von 40.000 psi [275,8 MPa]. Alle Proben wurden bei –6°C behandelt und die Gesamtzeit der Behandlung für alle Proben war 15 Minuten und die Zeit, die bei hohen und geringen Drücken verbracht wurde, war 7,5 Minuten in jedem Experiment. Das Experiment wurde zweifach ausgeführt für jeden Satz der experimentellen Bedingungen. Die viralen Titer wurden wie in Beispiel 1 gemessen.
Ein paralleles Experiment wurde durchgeführt an einem Modell eines therapeutischen Proteins, um zu sehen, ob seine Aktivität aufrecht erhalten wurde. Antifluoreszein-Ziegen-IgG (Chemicon International; Tecuma, CA) wurde hergestellt in einer Konzentration von 4 mg/ml in 5% Glukose und 0,3% NaCl. Die Lösung wurde dann der gleichen Behandlung wie in dem bakteriophagen Inaktivierungsexperiment unterzogen und untersucht durch Messen der Fähigkeit, die Fluoeszenz einer 50 nM Lösung Fluoeszein zu quenschen. Die folgenden Daten wurden erhalten:
Dieses Experiment zeigt, dass die Pulsation von Druck bei geringer Temperatur eine signifikante Wirkung auf die Rate der viralen Inaktivierung haben kann und nützlich sein kann in der Produktion von therapeutischen und diagnostischen Blutprodukten. Das Verfahren kann unter Bedingungen des Drucks und der Temperatur arbeiten, die in Übereinstimmung sind mit hoher Rückgewinnung und richtig gefalteten therapeutischen Proteinen und kann wirksam gegen viele Typen von Viren sein.
Beispiel 3: Beschleunigung der Nukleaseaktivität in einem hyperbarischen Sterilisationsverfahren
Adultes Rinderserum wird auf 50% (v/v) mit Wasser verdünnt und auf 0°C abgekühlt. Vier Aliquots des Serums werden in 250 μl Mikrozentrifugenröhrchen verteilt, so dass 25 μl Luft in jedem Röhrchen vorliegen. Die Röhrchen werden auf Eis gehalten bis zur Verwendung. 2 μg pUC19-Plasmid-DNA und 2 μg Hefe Gesamt RNA (Sigma) in 5 μl 50 mM Tis-Puffer, pH 8,0, werden jeder Probe zugesetzt zu geeigneter Zeit. 5 μl Wasser werden vor der Druckbehandlung zu Probe #4 gegeben. Die Reaktionen werden durch Zusatz von 10 mM Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexen gestoppt und durch Platzieren der Proben auf Eis. Die Behandlung dieser Proben ist wie folgt:

Probe #1: Kontrollprobe (d. h. nur Nukleinsäuren). In dieser Probe werden die Vanadylribonukleoside vor den Nukleinsäuren zugesetzt.
Probe #2: Serum und Nukleinsäuregemisch, inkubiert bei 25°C für 10 Minuten. Die Reaktion wird sofort, wie vorstehend beschrieben, gestoppt.
Probe #3: Serum und Nukleinsäuregemisch, druckbehandelt auf 60.000 psi bei 25°C für 10 Minuten. Die Reaktion wird, wie vorstehend beschrieben, gestoppt.
Probe #4: Serum, druckbehandelt auf 60.000 psi bei 25°C für 10 Minuten; die Nukleinsäuren werden zugesetzt, das Gemisch wird für 10 Minuten inkubiert und die Reaktion wird, wie vorstehend beschrieben, gestoppt.

Alle Proben werden mit einem gleichen Volumen Phenol-/Chloroform-/Isoamyl-Alkoholgemisch extrahiert, um Proteine zu entfernen, gefolgt von Präzipitation der Nukleinsäuren in 70% Ethanol. Das Nukleinsäurepellet wird dann wieder gelöst in 20 μl TE-Puffer. 10 μl der resultierenden Lösung wird auf ein 0,8%-iges Agarosegel zur Elektrophorese geladen. Nach der Elektrophorese wird DNA durch Ethidiumbromidfluoreszenz sichtbar gemacht. 5 μl der zurückbleibenden Probe werden quantifiziert unter Verwendung von PicoGreen- und Ribogreen-Farbstoffen (Molecular Probes).
Proben #3 und #4 zeigten beide gesteigerte Degradation im Vergleich zu Probe #2. Die Nukleinsäuren in Probe #4 werden mehr degradiert als die Nukleinsäuren in Probe #3. Diese Ergebnisse zeigen, dass Druck Blutnukleasen sowohl durch direkte Stimulierungsaktivität als auch durch Entlassungsinhibitoren beschleunigen kann.
Beispiel 4: Druck- und temperaturinduzierte Inaktivierung von Saccaromyces cerevisiae
Saccaromyces cerevisiae wurde in YPD-Flüssigmedium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Dextrose) wachsen gelassen, bis die Kulturen eine Dichte von 2 × 10⁶ Zellen/ml erreichten. Die S.-cerevisiae-Proben wurden dann 1 : 10 in Kälberserum verdünnt und dann verschiedenen Drücken und Temperaturen unterworfen.
Zunächst wurde die Temperatur während eines Druckbehandlungsverfahrens konstant bei 23,8°C gehalten. Eine Probe wurde bei 36.000 psi (248,4 MPa] für 10 Minuten bei 23,°C gehalten. Eine zweite Probe wurde zwischen 36.000 psi [248,4 MPa] und 14,7 psi [0,101 MPa] zyklisiert bei 30 Sekundenintervallen für 10 Minuten bei 23,8°C. Der Druck und die Temperatur wurden jeweils konstant gehalten bei 14,7 psi [0,101 [MPa] und 23,8°C für eine dritte Probe als Positivkontrolle.
Bei den nächsten drei Proben wurde die Temperatur reduziert, während gleiche Druckbehandlungen durchgeführt wurden. Somit wurde eine vierte Probe auf –3,6°C abgekühlt und dann bei 36.000 psi [248,4 MPa] für 10 Minuten druckbehandelt. Eine fünfte Probe wurde auch auf –3,6°C abgekühlt und dann 10 Zyklen des Drucks abwechselnd zwischen 36.000 psi [248,4 MPa] und 14,7 psi [0,101 [MPa] bei 30 Sekundenintervallen unterworfen. Als eine positive Kontrolle wurde eine sechste Probe auf –3,6°C abgekühlt, wurde jedoch nicht der Druckbehandlung unterworfen.
Nach den notwendigen Druck- und Temperaturbehandlungen wurden alle Proben um die Faktoren 10, 100 und 1.000 verdünnt, verteilt auf LPD-Platten (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Dextrose, 1,5% Agar) und wachsen gelassen bei 32°C für 24 Stunden. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (cfu) wurde berechnet durch Multiplizieren der Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor.
Eine ausgeprägte Inaktivierung von Saccaromyces cerevisiae durch Druckbehandlungen wurde sowohl bei 23,8°C als auch bei –3,6°C beobachtet. Die koloniebildende Aktivität der druckbehandelten Probe lag im Bereich von 1 × 10² cfu bis 5,6 × 10³ cfu bei den druckbehandelten Proben. Die positiven Kontrollen lagen in der koloniebildenden Aktivität von 1,1 × 10⁵ cfu bis 9,2 × 10⁵ cfu. Somit wurde die koloniebildende Fähigkeit von Saccaromyces cerevisiae um etwa 2 bis 3 Größenordnungen verringert.
Beispiel 5: Druck- und temperaturinduzierte Inaktivierung des Moloney Murine Leukämie-Virus
Ein retroviraler Vektor, pLNCX, enthaltend Phi+ (das verlängerte virale Verpackungssignal) und einen Neomycin-Resistenzmarken (Neo^r), jedoch ohne virale Strukturgene, wurde in Verbindung mit einer Verpackungszelllinie, NIH-Cyt2, verwendet. Die NIH-Cyt2-Zellen exprimierten die gag-, pol- und env-viralen Strukturgene, die notwendig sind für Partikelbildung und Replikation, jedoch nicht das RNA-Verpackungssignal Phi+. Somit erzeugten der pLNCX-Vektor und die NIH-Cyt2-Zelllinie zusammen infektiöse, replikationsinkompetente Partikel, die strukturell identisch zum Moloney Murine Leukämie-Virus (MMLV) sind. Diese infektiösen MMLV-Partikel enthalten RNA, die den pLNCX-Vektor kodiert.
MMLV-infektiöse Partikel, suspendiert in DMEM mit 10% Kälberserum (CS) werden bei 4°C und 14,7 psi gehalten mit Ausnahme während der Druck- und Temperaturbehandlungen, die nachstehend beschrieben sind. Hydrostatischer Druck für eine Probe wird zwischen 35.000 psi [241,5 MPa] und 14,7 psi [0,1 MPa] bei 30 Sekunden in Intervallen zyklisiert, während die Temperatur bei 2°C gehalten wird. Als eine positive Kontrolle wird die Temperatur einer zweiten Probe bei 2°C für 10 Minuten bei 14,7 psi [0,1 MPa] gehalten. Eine dritte Probe wird zwischen 35.000 psi [241,5 MPa] und 14,7 psi [0,1 MPa] bei 30 Sekundenintervallen bei – 10°C zyklisiert. Eine vierte Probe wird bei 35.000 psi (241,5 MPa] für 5 Minuten bei –10°C gehalten. Als eine positive Kontrolle wird eine fünfte Probe in Trockeneis eingefroren und dann auf –10°C für 5 Minuten erwärmt.
Die Proben werden Schälchen mit NIH-Cyt2-Zellen zugesetzt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, um die Zellen mit dem retroviralen Vektor pLNCX zu transfizieren. Als eine Negativkontrolle wird eine Platte der Zellen pseudotransfiziert (mock-transfected) mit viral freiem DMEM-CS. Die Zellen werden DMEM mit 10% Kälberserum und in G418 wachsen gelassen, was es nur Zellen mit Neo^r erlaubt, zu wachsen und somit auf stabile Transformanden selektiert. Nach einem Zeitraum von 10 Tagen werden die Schälchen mit PBS gespült, mit Methylen blau gefärbt, wieder mit PBS gefärbt und dann werden die Kolonien gezählt. Der virale Titer, exprimiert in koloniebildenden Einheiten (cfu) wird berechnet durch Multiplizieren des Verdünnungsfaktors mit der Anzahl der Kolonien.
Beispiel 6: Druckzyklisierungsinaktivierung von Escherichia coli-inokuliertem Serum
Eine Kultur eines Ampicillin-resistenten E.-coli-Stamms in LB/amp-Medium (Luria broth, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin) wurde bis zur Sättigung wachsen gelassen. Eine Probe adultes Rinderserum (Sigma) wurde mit 30 μl E.-coli-Lösung pro ml Serum inokuliert. Aliquots (280 μl jeweils) des inokulierten Serums wurden in neun Mikrozentrifugenröhrchen gebracht. Die Proben in den neun Röhrchen wurden den folgenden experimentellen Bedingungen unterworfen:
Probe 1 wurde unbehandelt gelassen als Kontrolle.
Probe 2 wurde bei Umgebungsdruck gehalten (d. h. etwa 14,7 psi [0,101 MPa], während die Temperatur zwanzig Mal zwischen etwa –17°C und Raumtemperatur zyklisiert wurde (d. h. etwa 25°C) über 20 Minuten.
Proben 3–6 wurden auf –15°C bei Atmosphärendruck abgekühlt. Die Proben wurden für 2 Minuten stehengelassen, um sicherzustellen, dass sich ein thermales Gleichgewicht einstellt. Die Proben wurden dann Druckzyklen bei einer Rate von etwa 30 Sekunden/Zyklus oder 2 Hz unterworfen. Probe 3 wurde zehnmal zwischen etwa 14,7 psi (0,101 MPa] und etwa 15.000 psi (103,5 MPa] über 5 Minuten zyklisiert; Probe 4 wurde 10 zehnmal zwischen etwa 14,7 psi [0,1 MPa] und etwa 35.000 psi [241,5 MPa] über 5 Minuten zyklisiert; Proben 5 und 6 wurden zwanzig Mal zwischen etwa 14,7 psi [0,1 MPa] und etwa 35.000 psi [241,5 MPa] über 10 Minuten zyklisiert.
Probe 7 wurde zwanzig Mal zwischen etwa 14,7 psi [0,1 MPa] und etwa 35.000 psi [241,5 MPa] bei Raumtemperatur über 6 Minuten 40 Sekunden zyklisiert.
Proben 8 und 9 wurden statischer Druckbehandlung für 2,5 Minuten unterzogen; Probe 8 wurde bei Raumtemperatur druckbehandelt und Probe 9 wurde bei –15°C druckbehandelt.
Verdünnungen der Proben wurden in LB/ amp-Medium hergestellt und die Proben wurden plattiert. Koloniebildende Einheiten pro Milliliter (CFU/ml) sind nachstehend gezeigt zusammen mit Log-Reduktionen (d. h. im Verhältnis zur Kontrolle):
Somit war die wirksamste Behandlung gemäß Probe #7, Zyklisieren auf 35.000 psi bei etwa 25°C. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Zyklisieren wirksamer war als statische Druckbehandlung bei der gleichen Temperatur (vgl. Probe #8).
Beispiel 7: Sterilisation von E.-coli-kontaminierten Nadeln
Zwei 20G-Nadeln wurden abgeschnitten, was 3 mm des Metallschafts an der Plastikbefestigung zurückließ. Es wurden Röhrchen konstruiert durch Abschneiden der Enden des Plastikschafts von einer 3 ml Spritze und Verstopfen jedes Endes mit den Gummianteilen von zwei Kolben. Ein ml einer Über-Nacht-Kultur von E. coli wurde durch jede Nadel gegeben. Jede Nadel wurde in ein Röhrchen mit 1 ml Luria-Broth-(LB)-Medium gegeben. Es blieben etwa 0,2 ml Luft oben in jedem Röhrchen.
Ein Röhrchen wurde 10 Zyklen der Druckbehandlung (jeder Zyklus schloss 30 Sekunden bei 37.000 psi [255,3 MPa] ein, gefolgt von 30 Sekunden bei 14, psi [0,101 MPa]) bei 22,2°C unterworfen. Das zweite Röhrchen wurde in die Druckkammer für 10 Minuten bei 22,2°C gegeben, wurde jedoch nicht der Druckbehandlung unterzogen.
Nach der Druckbehandlung wurden die Nadeln aus den Röhrchen entfernt und 0,2 ml LB wurde durch jede Nadel gegeben. Die Hälfte der 0,2 LB wurden auf eine LB-Platte verteilt. Die zurückbleibenden 0,1 ml LB wurden verdünnt (1 : 10, 1 : 100, 1 : 1.000 und 1 : 10.000) und auf 4 LB-Platten verteilt. Alle Platten wurden über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Die Kolonien wurden auf jeder Platte gezählt und die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (cfu) in jeder LB-Probe wurde berechnet.
Es wurde ein dramatischer Unterschied in der koloniebildenden Aktivität des LB-Mediums beobachtet, das durch die behandelten und unbehandelten Nadeln gegeben wurde. Es waren 10 cfu in den 0,2 ml, die durch die druckbehandelte Nadel gegeben wurde, wohingegen 9,2 × 10⁵ cfu in dem LB vorlagen, das durch die unbehandelte Nadel gegeben wurde, fast ein 100.000-facher Unterschied.
Beispiel 8: Druckschock-Sterilisierung
Als ein Modell für pathogene Viren wird frisch gefrorenes Plasma mit 10⁸ plaquebildenden Einheiten (pfu) pro ml Lambda-Bakteriophage, stabilisiert mit 10% Glukose und 3 mM Natriumcaprylat, versetzt. Das Plasma wird dann in ein Hochdruckgefäß, das 50% Ethylenglykol als ein Druckübertragungsmedium enthält gegeben und die Temperatur wird auf –10°C eingestellt. Der Druck wird dann auf 150.000 psi über einen Zeitraum von 1 Sekunde gesteigert und bei diesem Druck für 1 zusätzliche Sekunde gehalten. Der Druck wird dann über einen Zeitraum von 2 Sekunden entlassen. Die Plasmaprobe wird entfernt und Verdünnungen werden auf E.-coli Rasen plattiert. Es wurde festgestellt, dass die Plasmaprobe im Wesentlichen frei von infektiösem Virus ist. Die Plasmaproteine werden durch verschiedene Verfahren, einschließlich HPLC, IgG-Antigenbildung, Fluoreszenzverstärkung von Dansylsarkosin durch HSA und Gerinnungsassays (einschließlich dem aktivierten Partikel-Thromboplastin-Zeitassay, APTT) analysiert, um die Integrität des Gerinnungsfaktors einzuschätzen.
Beispiel 9: Druckverstärkte fotochemische Inaktivierung von Viren
Eine Probe Rinderserum wird mit 10⁸ plaquebildenden Einheiten (pfu) pro ml Lambda-Bakteriophage inokuliert. 0,15 mM Psoralen wird zugesetzt. Die Probe wird in drei Aliquots aufgeteilt. Die drei Proben werden wie folgt behandelt:

(1) keine weitere Behandlung
(2) Druckbehandlung auf 30.000 psi [206,8 MPa]
(3) Druckbehandlung auf 30.000 psi [206,8 MPa] und gleichzeitiges Aussetzen gegenüber UV-Licht für 10 Minuten.

Alle Proben werden bei einer Temperatur von 25°C während des Experiments gehalten. Die Behandlung mit Druck und Licht wird erreicht durch Laden der Probe in eine Quarzflasche mit einem Polyethylendeckel. Die Flasche wird in eine Ethanol-gefüllte Hochdruck-Spektroskopiezelle (ISS, Champaign, IL) gegeben und druckbehandelt. Die Proben werden beleuchtet durch Verbinden eines Fensters der Spektroskopiezelle mit einer UVA-Lampe in einer festgelegten Entfernung. Nach der Behandlung wird das Serum serienmäßig verdünnt, mit E. coli gemischt und auf Agar ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C werden die Plaques auf den Platten gezählt, um bei einer relativen Reduktion des viralen Titers aufgrund der Druckbehandlung und der Kombination von Druck und Belichtung anzukommen. Man fand, dass ein signifikant größerer Grad der vitalen Inaktivierung in Probe #3 beobachtet wurde, verglichen mit Proben #1 und #2. Das Experiment wird mit geringeren Konzentrationen Psoralen wiederholt mit dem Ergebnis, dass die Kombination von Druck und UVA-Licht eine Rate der Inaktivierung ergibt ähnlich zu der, die durch UVA-Licht alleine beobachtet wird, wobei sie in weniger Schaden gegenüber therapeutischen Proteinen resultiert. Ähnliche Experimente bestätigen, dass weniger Lichtintensität oder Zeit der Beleuchtung benötigt wird, wenn die Probe druckbehandelt wird. Die Experimente zeigen auch, dass nukleinsäurebindende Farbstoffe, die in Verbindung mit Sauerstoff wirken (z. B. Methylenblau), ähnliche Ergebnisse zu denen ergeben, die mit Psoralenen beobachtet wurden.
Beispiel 10: Druckverstärkte chemische Inaktivierung von Viren
Eine Probe Rinderserum wird mit 10⁸ plaquebildenden Einheiten (pfu) pro ml Lambda-Bakteriophage inokuliert. Die Probe wird in 4 Aliquots aufgeteilt. Die Proben werden wie folgt behandelt:

#1 keine Behandlung
#2 0,1 mM Jod zugesetzt und inkubiert für 10 Minuten
#3 0,1 mM Jod zugesetzt und druckbehandelt auf 30.000 psi für 10 Minuten
#4 Druck von 30.000 psi [206,8 MPa] für 10 Minuten

Alle Proben werden bei einer Temperatur von 25°C während des Experiments gehalten. Nach Behandlung wird die Reaktion mit einem reduzierenden Agens gequenscht und das Serum wird seriell verdünnt, mit E. coli gemischt und auf Agar plattiert. Nach einer Über-Nacht-Inkubation bei 37°C werden die Plaques auf den Platten gezählt , um bei einer relativen Reduktion des viralen Titers aufgrund der Druckbehandlung und der Kombination von Druck und chemischer Behandlung anzukommen. Man fand, dass Probe #3 signifikant größere Reduktion im viralen Titer (wie verglichen mit Probe #1) hatte als die Summe der Reduktionen, die von Probe #2 und #4 beobachtet wurden, was eine synergetische Wirkung von Druck und Jod zeigt. Ähnliche Experimente wurden durchgeführt mit geringeren Konzentrationen chemischer Zusätze und man fand, dass Druck äquivalente virale Inaktivierung mit geringeren Konzentrationen Jod oder mit kürzeren Inkubationszeiten ermöglicht.
Beispiel 11: Wirkungen von Druckzyklisierungsbehandlung auf Gerinnungszeit
Humane Plasmaproben (BBI) wurden mit 10 2-Minuten Druckzyklen bei 40.000 psi [275,8 MPa] und Temperaturen im Bereich von –70°C bis 20°C behandelt und eingefroren bei – 70°C bis zur Verwendung gelagert. Der Assay wurde gestartet durch Zusetzen von 60 μl Plasma, 60 μl APTT-Reagens (Sigma) (37°C) und 60 μl 25 mM CaCl₂ (37°C) in einer 100 μl Küvette. Die Absorption wurde bei 550 nm beobachtet und die Gerinnungszeit wurde aufgezeichnet als Zeit zu einer OD von 0,8 (etwa ½ maximal). Man fand, dass die Verwendung von niedrigeren Temperaturen eine dramatische Verbesserung der Gerinnungsaktivität erzeugte.
Beispiel 12: Integrität von IgG, IgM, HSA und fX in Tieftemperatur-Druckbehandlung
IgG und IgM. Kommerzielle Zusammensetzungen (ACCURUNTM, Boston Biomedica Inc.) humaner Plasmakontrollen für Cytomegalovirus-(CMV) Antikörpertiter wurden behandelt mit der Druckzyklustechnik und die Fähigkeit von IgG und IgM, CMV-Antigen zu binden, wurde gemessen unter Verwendung des Abbott- und Walpole-CMV-Antikörperenzym-Immunassays. Der Assay umfasst Inkubieren der Probe mit Polysterolkügelchen, die mit hitzeinaktivierten CMV-Antigen beschichtet sind. Die Kügelchen werden dann gewaschen und mit Meerrettich-Peroxidase-markiertem antihumanen Immunglobulin gewaschen. Die Kügelchen werden wieder gewaschen und inkubiert mit einem chromogenen Substrat, das Farbe entwickelt in einer Rate, die gebundenen Anti-CMV-Antikörper anzeigt. Verdünnungen des ACCURUN-Materials zeigen an, dass der Assay linear ist, was nahe legt, dass jeder Verlust der Aktivität nachgewiesen worden wäre. 260 μl Proben Accurun wurden equilibriert auf –5°C und mit 10 Druckzyklen, umfassend 1 Minute bei erhöhtem Druck und 1 Minute bei Atmosphärendruck behandelt. Maximaldrücke von etwa 10.000 [68,9 MPa] bis etwa 50.00 psi [345 MPa] wurden verwendet. Die Proben wurden entfernt und Anti-CMV-Spiegel wurden gemessen. Kein signifikanter Verlust von IgG- oder IgM-Aktivität wurde für Drücke bis zu etwa 50.000 psi [345 MPa] beobachtet.
HSA. Die Integrität des humanen Serumalbumins (HSA) wurde bestimmt durch seine Fähigkeit, die Fluoreszenz von Dansylsarkosin zu verstärken. Dieser Assay ist empfindlich gegenüber Veränderungen in der Domäne III des Proteins und gegenüber dem Gesamtniveau der Aggregation. 40 mg/ml HSA wurden Rinderserum zugesetzt, das durch einen Mikron 30 Zentrifugationsfilter gefiltert wurde, um jegliches Rinderalbumin und größere Proteine zu entfernen. Die Proben wurden Druckpulsation unterworfen mit einem Maximaldruck von etwa 34.000 psi [234,6 MPa] für 15 Minuten mit verschiedenen Frequenzen der Pulsation bei –5°C. Proteinaktivität wurde gemessen durch aufeinander folgenden Zusatz von 10 μl Volumen zu einer 3 ml Lösung von überschüssigem Dansylsarkosin in PBS. Die Ergebnisse zeigen an, dass Druckpulsation nützlich für die Proteinintegrität ist.
Faktor X. um die Wirkung des Tieftemperatur-Druckverfahrens auf einen enzymatischen Blutfaktor zu testen, wurde ein chromogener Assay durchgeführt mit humanen ACD-Plasma, behandelt bei verschiedenen Drücken. Die verwendeten Bedingungen waren identisch zu denen in dem IgG-Experiment: –5°C, 10 2-Minuten-Zyklen bei etwa 19.000 psi [131,1 MPa] bis etwa 50.000 psi [345 MPa]. Mehr als 80% der Faktor X Aktivität blieb erhalten.
Schlussfolgerungen:
Diese Daten zeigen, dass Druckzyklisierung in der Lage ist, eine mehr als 10⁷-Reduktion des Titers von nicht-umhülltem Virus in einem 15-Minuten Zeitraum zu reduzieren, sogar IgG-, IgM-, Faktor-X- und HSA-Aktivitäten können gleichzeitig auf akzeptablem Niveau aufrecht erhalten werden. Die Pulsation von Druck scheint die Beibehaltung der Proteinaktivität zu verstärken.
Beispiel 13: Druckzyklisierungsinaktivierung von Schweine-Parvovirus (PPV) in humanem Plasma bei sehr geringer Temperatur
Schweine-Parvovirus (ATCC) wird in Schweinetestikel (PT) Zellen durch Infektion bei einer Vielzahl von Infektionen von 0,1 und Inkubation für 6 Tage vermehrt. Die Zellen werden durch drei Einfrier-/Auftauzyklen lysiert und die Lösung wird dann durch Zentrifugation aufgeklart. Der resultierende PVV-Titer ist etwa 1 × 10¹⁰ Infektionsdosen/ml.
Stock-PPV wird 1 : 100 in humanem Plasma verdünnt und in 260 μl Volumen in zwei flexible Polyethylen-Mikrozentrifugenröhrchen (Cole Parmer) verteilt. Ein Röhrchen wird als „Kontrolle" bezeichnet und das andere als „experimentell". Die Röhrchen werden verschlossen mit Dow Corning Silikon Hochvakuumschmierfett und in PARAFILM^® (American National Can, Menasha, WI) eingewickelt.
Die Hochdruckreaktionskammer wird mit 70% Ethanol und 0,2% Rhodamin B als Indikator (tracer) gefüllt und auf –40°C abgekühlt. Das experimentelle Röhrchen wird in die Hochdruckreaktionskammer für 6 Minuten gebracht, um an die Temperatur zu equilibrieren und der Druck wird über einen Zeitraum von 5 Sekunden auf einen Druck von 80.000 psi [552 MPa] gesteigert. Der Druck wird für 10 Minuten bei 80.000 psi [552 MPa] gehalten und dann über einen Zeitraum von 2 Sekunden entlassen. Es wird der Temperatur dann für 5 Minuten ermöglicht, zu equilibrieren. Dieses Verfahren wird für insgesamt 20 Zyklen wiederholt. Die Kontrollprobe wird für die gleiche Zeit bei –10°C inkubiert.
Die PPV-Titer der Kontroll- und experimentellen Proben werden bestimmt durch Durchführung einer halb-log seriellen Verdünnung in Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS). Jede Verdünnung wird verwendet, um 6 Vertiefungen einer 96-Vertiefungskulturplate, enthaltend 50% konfluente PT-Zellen, zu inokulieren.
Nach Inkubieren der Zellen für 5 Tage in MEM-Medium, angereichert mit 7,5% fötalem Rinderserum, wird die Anwesenheit des Virus bestimmt durch Fixierung der Platten in 80% Aceton für 20 Minuten und Inkubieren jeder Vertiefung mit 50 μl Fluoreszein-konjugiertem Anti-PVV Antikörper (VMRD Inc., Pullman WA) für 40 Minuten bei 37°C, 3 mal Waschen mit Wasser und Beobachten mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop. TCID50 wird bestimmt durch das Spearman Karber Verfahren. Man fand, dass die experimentelle Probe keinen nachweisbaren Virus hat und die Kontrollprobe hat einen Titer von 10⁸ infektiöse Dosen/ml. Eine Gerinnungszeitanalyse wird durchgeführt durch ein Einzelstadium-aktivierte partielle Thromboplastinzeit-(APTT) Messung und man fand, dass die Gerinnungszeit etwa 30 Sekunden für sowohl die Kontroll- als auch die experimentellen Proben war, was darauf hinweist, dass das Plasma geeignet ist für Reinigung von Blutprodukten und Transfusion.
Beispiel 14: Druckzyklisierungsinaktivierung von Bakterien und Pilzen
Verschiedene Spezies von Bakterien werden Druckzyklisierungsprotokollen unterworfen, um die Rate der Inaktivierung zu bestimmen. Zweihundertfünfzig Mikroliter Volumen jeder Spezies wurden in Cole Plamer Polyethylenröhrchen aliquotiert. Die Röhrchen wurden bei – 70°C eingefroren und eine Schicht Hochvakuum-Schmierfett wurde oben auf die gefrorene flüssige Schicht gegeben. Jedes Röhrchen wurde dann in eine Schicht PARAFILM^® (American National Can, Menasha, WI) eingewickelt.
Die folgenden bakteriellen Spezies wurden getestet: Bacillus cereus ATCC 14579 (ursprünglicher Titer: 6,6 × 10⁸ cfu/ml), Enterococcus feacium ATCC 49032 (3,3 × 10⁸), zwei Proben Echerichia coli ATCC 43894 (8,6 × 10⁹ und 5,4 × 10⁷), Pseudomonas aeruginosa ATCC 14502 bei 9,5 × 10⁷ und Staphylococcus aureus ATCC 9144 bei 9,9 × 10⁷.
Zehn 2-Minuten Druckzyklen (d. h. 1 Minute bei Umgebungsdruck, 1 Minute bei bis zu 50.000 psi [345 MPa] wurden bei –10°C mit jeder Bakterienkultur ausgeführt. Bestimmte Proben jeder Spezies wurden auch einem 10-minütigem statistischen Druck bei sowohl etwa 29.000 [200,1 MPa] und etwa 50.000 psi [345 MPa] unterworfen. Jede Probe wurde an die Kammertemperatur für 5 Minuten vor der Druckbehandlung equilibriert. Die Kammer wurde mit 50% Ethylenglykol in Wasser gefüllt und mit 1% Rhodamin versetzt, um zu bestimmen, ob eine der Kammerflüssigkeiten während der Druckbehandlung in die Probe leckte. Nach dem Druckzyklisierungsverfahren wurden die Proben bei –70°C gelagert, bis sie untersucht wurden.
Die Proben wurden untersucht, um den Titer (cfu/ml) nach dem Druckbehandlungsverfahren zu bestimmen. Serielle Verdünnungen wurden hergestellt von Aliquots jeder Probe. Jede Verdünnung wurde auf 10 ml Festagar plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Der Titer jeder Platte wurde gezählt, um die Rate der Inaktivierung zu bestimmen (Endtiter). Der ursprüngliche Titer wurde dividiert durch den Endtiter, um die Reduktion der Mikroben Anzahl zu bestimmen.
Alle gram-positiven und gram-negativen Bakterien, die untersucht wurden, wurden inaktiviert. Bacillus cereus wurde durch 5 Logs aktiviert, Enterococus faecium durch 6 Logs, E. coli durch 7 Logs, Pseudomonas aeroginosa durch 8 Logs, Staphylococcus aureus durch 6 Logs und Candida albicans durch 5 Logs. Für alle Bakterien war die Druckpulsation effektiver als der statische Druck. Der dramatischste Unterschied wurde mit Enterococcus gesehen, der inaktiviert wurde durch weniger als 1 Log ohne Druckzyklisierung, aber durch etwa 6 Log mit Druckzyklisierung bei 5.000 psi [345 MPa]. Pseudomonas wurde inaktiviert durch etwa 6 Logs mit Druckzyklisierung und 2,5 Logs mit statischem Druck bei etwa 29.000 psi (200,1 MPa]. Die Rate der Pseudomonas-Inaktivierung bei 50.000 psi [345 MPa] mit Druckzyklisierung war größer als 8 Logs, aber mit statischem Druck blieb sie bei 6 Logs. Die Staphylococcus-Probe wurde inaktiviert durch 2 und 6 Logs mit jeweils Druckzyklisierung bei 29.000 psi [200,1 MPa] und 50.000 psi [345 MPa], jedoch nur 1 und 3 Logs mit den gleichen Bedingungen unter statischem Druck. Der Unterschied in der Rate der Inaktivierung von dem geringen Titer E. coli bei 29.000 psi [200,1 MPa] war 67-fach mit Zyklisierung und 6,4-fach mit statischem Druck. Die Rate der Inaktivierung bei 50.000 psi [345 MPa] steigerte sich auf 4 Logs mit Zyklisierung, jedoch nur auf 2 Logs mit statischem Druck. Der E.-coli Stamm mit hohem Titer erreichte eine Steigerung von 4 Logs der Inaktivierung mit Druckzyklisierung, verglichen mit statischem Druck bei sowohl 29.000 psi [200,1 MPa] und 50.000 psi [345 MPa].
Druckpulsation erreichte somit eine Steigerung der Inaktivierung gegenüber statischem Druck für alle Spezies der getesteten Bakterien mit dem Nutzen der Druckzyklisierung, die ausgeprägter bei 50.000 psi [345 MPa] als bei 29.000 psi [200,1 MPa] für alle Spezies war.
Beispiel 15: Inaktivierung von umhüllten Viren
Um die Wirksamkeit von „cryobarer" Behandlung gegen umhüllte Viren zu testen, wurden humanes Immundefizienz Virus (HIV-1) und Herpes simplex Virus (HSV-1) behandelt und ihre Infektiosität gemessen. Bei dem HIV-Experiment bestand die „cryobare" Behandlung aus 5 Minuten Druckzyklen bei –10°C. Jeder Zyklus bestand aus 1 Minute bei hohem Druck und 1 Minute bei Atmosphärendruck. Eine etwa 6 Log-Reduktion der HIV-Infektiosität wurde erreicht, wenn der Druck auf 50.000 psi [345 MPa] erhöht wurde. Herpes simplex 1 wurde auch inaktiviert durch 6 Log bei diesem Druck. Die Behandlung ist kompatibel mit der Beibehaltung der Integrität und Aktivität der meisten therapeutischen Proteine, wie beispielsweise in Beispiel 21 gezeigt.
Beispiel 16: Inaktivierung von MS2: Statische Druckbedingungen
MS2-infizierte Plasmaproben wurden druckbehandelt auf 80.000 psi bei –26°C, dann wurde die Temperatur gesteigert auf –14°C für 5, 10, 15, 30 und 60 Minuten. Zwei Plasmaproben wurden für jedes Experiment behandelt, eine mit Phagen für Inaktivierungsuntersuchungen und eine ohne Phagen zur Faktoranalyse.
Nach der „cryobaren" Behandlung wurde MS2-Infektiosität untersucht gemäß dem folgenden Protokoll. Der Wirt E. coli wurde bis zur Sättigung über Nacht in MS2-Broth (enthaltend 10 g/l Trypton und 42 mM Natriumchlorid), angereichert mit 0,2% Maltose und 10 mM Magnesiumsulfat wachsen gelassen. Nach der Verdünnung des behandelten Phagen, wo es notwendig war, wurden 100 μl Phagenprobe zu 100 μl E. coli gegeben, bei 23°C für 20 Minuten inkubiert, dann bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Das Phagen-E.-coli Gemisch wurde zugesetzt zu 2,5 ml geschmolzenem Top-Agar (10 g/l Trypton, 42 mM Natriumchlorid, 7 g/l Agar, 47°C), gevortext und sofort auf 90 mm Petrischalen, enthaltend 10 g/l Trypton, 42 mM Natriumchlorid und 10 g/l Agar, ausgebreitet. Nach Inkubation für etwa 16 Stunden bei 37°C wurden die Plaques gezählt.
Die Proben für Faktor-VIII Analysen wurden bei –70°C gelagert bis zur Untersuchung. Faktor-VIII Assays wurden durchgeführt mit dem American Diagnostica Chromagenic Assay-Kit (Greenwich, CT):
Die Ergebnisse waren wie folgt, wobei „Inaktivierung" den Titer (in pfu/ml) für die unbehandelte Probe darstellt, geteilt durch den Titer für jede gegebene Probe und „fVIII" den prozentualen Anteil der Faktor-VIII Aktivität, die für jede Probe nach Druckbehandlung übrig blieb (d. h. im Verhältnis zur unbehandelten Probe):
Diese Daten zeigen, dass etwa Kinetiken erster Ordnung für Faktor VIII Verlust beobachtet wurden, wohingegen MS2-Inaktivierung relativ unabhängig von der Inkubationszeit war, was nahe legt, dass die virale Inaktivierung bei dem ursprünglichen Puls auf 80.000 psi [552 MPa] bei –26°C auftrat.
Beispiel 17: Inaktivierung von MS2: Temperaturoptimierung
In einem Experiment zur Bestimmung der Optimumtemperatur für MS2-Inaktivierung wurden die Bedingungen, die in Beispiel 16 angegeben sind, eingesetzt mit der Ausnahme, dass jede Probe für 5 Minuten an die korrespondierende Starttemperatur, die in der Datentabelle nachstehend angegeben ist, equilibriert wurde. Die Proben wurden druckbehandelt auf etwa 80.000 psi [552 MPa] für 2 Minuten, gefolgt von Druckentlassung und Temperaturequilibrierung für 5 Minuten. Der Druckbehandlungszyklus wurde 2 weitere Male wiederholt. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Diese Daten zeigen signifikante (d. h. 3 Log) Inaktivierung von MS2 unter Bedingungen (-20°C), die 50% Wiedergewinnung von fVIII ergeben. Die höheren Temperaturen steigerten die Inaktivierung von MS2, verringerten jedoch die Wiedergewinnung von fVIII.
Beispiel 18: Inaktivierung von MS2: Druckoptimierung
In einem Experiment zur Bestimmung des Optimumdrucks für MS2-Inaktivierung wurden die Bedingungen, die in Beispiel 16 angegeben sind, eingesetzt mit der Ausnahme, dass jede Probe auf –17°C für 5 Minuten equilibriert wurde und die Proben zwischen 60.000 und 80.00 psi [414 MPa und 552 MPa] druckbehandelt wurden, wie nachstehend angegeben. Die angegebenen Drücke wurden für 60 Sekunden aufrecht gehalten, gefolgt von Druckentlassung und Temperaturequilibrierung für 5 Minuten. Die Zeit zur Druckbehandlung (etwa 3 Sekunden) und Druckentlassung (etwa 1 Sekunde) sind nicht in der angegebenen Druckbehandlungszeit eingeschlossen. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Die Daten weisen darauf hin, dass der optimale Druck unter diesen Temperatur- und Zeitbedingungen etwa 75.000 psi war.
Beispiel 19: Inaktivierung von MS2: Pulsationszeitoptimierung
Um die relativen Raten der MS2-Inaktivierung und des Verlusts von fVIII-Aktivität zu messen als eine Funktion der Zeit bei erhöhtem Druck für jeden Puls, wurden Bedingungen, ähnlich denen, die in Beispiel 18 eingesetzt wurden, verwendet. Jede Probe wurde auf –20°C für 5 Minuten equilibriert. Die Proben wurden druckbehandelt auf etwa 80.000 psi [552 MPa] und dort zwischen 15 und 120 Sekunden gehalten, wie nachstehend angezeigt, gefolgt von Druckentlassung und Temperaturequilibrierung für 5 Minuten. Der Druckbehandlungszyklus wurde 2 weitere Male wiederholt. Die Zeiten, die zur Druckbehandlung (d. h. etwa 3 Sekunden) und Druckentlassung (d. h. etwa 1 Sekunde) benötigt wurden sind nicht in der angegebenen Druckbehandlungszeit enthalten. Eine zweite Runde der Experimente wurde durchgeführt mit Druckpulsdauern von 10 bis 120 Sekunden. Die Ergebnisse der zwei Experimente waren wie folgt:
Diese Daten weisen darauf hin, dass die Verringerung der Druckpulsdauer auf Zeiten wie 10 Sekunden eine positive Wirkung auf die Gewinnung von fVIII hat, wohingegen sie geringe oder keine Wirkung auf den Grad der MS2-Inaktivierung hat.
Beispiel 20: Inaktivierung von MS2: pH-Wirkung
Drei Milliliter humanes Plasma wurde mit 50 μl MS2-Stock in LB versetzt. Eine 10X-Stock-Lösung von 3-[Cyclohexamino]-1-Propansulfonsäure (CAPS) wurde hergestellt und 1 : 10 mit dem versetzten Plasma verdünnt. Diese Probe und eine reine Plasmakontrollprobe wurden bei –70°C eingefroren und verschlossen mit Silikon-Schmierfett und PARAFILM^®. Vor der Behandlung wurde jede Probe für 4 Minuten in die Reaktionskammer gebracht, um an die experimentelle Temperatur zu equilibrieren.
100 μl jeder Probe wurden für serielle Verdünnung entfernt. Phagen wurden 100-fach seriell verdünnt in Lambda-Broth in Mikrozentrifugenröhrchen. Um eine ordnungsgemäße Mischung sicherzustellen, wurden die Proben vor weiterer Verdünnung gevortext. 100 μl jeder Verdünnung wurden mit 100 μl Log-Phasen MS2-Wirt E. coli gemischt, für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Drei Milliliter Lambda Top Agar (bei 47–50°C) wurde zugesetzt, dann wurden die Röhrchen kurz gevortext und über Lambda Agar Platten gegossen. Die Proben wurden einem Druck von 60.000 psi [441 MPa] für 10 Minuten ausgesetzt, dann untersucht.
Die Ergebnisse waren wie folgt:

Bedingung Titer

100 mM CAPS pH 10,5 3,0e6

Kontrolle 3,9e9
Die Daten weisen darauf hin, dass der Zusatz von Puffer zur Steigerung des pHs eine Inaktivierung des Virus bei einem Druck ermöglichte, bei dem keine Aktivierung nach Behandlung mit neutraler Lösung auftrat.
Beispiel 21: Inaktivierung von Pathogenen in klinischen Proben
Proben von humanem Plasma wurden über einen Zeitraum von 4 Minuten auf –10°C equilibriert. Der Druck wurde gesteigert auf einen erhöhten Druck von 20.000 psi [138 MPa) für 1 Minute. Der Druck wurde reduziert auf Atmosphärendruck und für 1 Minute equilibriert. Dieses Verfahren wurde 9 weitere Male wiederholt. Ähnliche Behandlungen wurden durchgeführt unter Verwendung von gesteigerten Drücken von 30.000 [206,8 MPa), 40.000 [275,8 MPa), 50.000 [345 MPa) und 60.000 psi [414 MPa). Eine Kontrollprobe wurde bei – 10°C für einen gleichen Zeitraum (etwa 20 Minuten) gehalten, ohne dass der Druck gesteigert wurde.
Nach der Behandlung wurden klinische Assays durchgeführt, um die Aktivität von verschiedenen Analyten zu bestimmen. Die folgenden Analyten waren durch jegliche Druckzyklusbehandlungen unbeeinflusst.
Harnsäure
Kalzium
Phosphor
Glukose
Creatinin
Harnstoffstickstoff
Na, K, Cl, Mg, Bikarbonat
Triglyzeride GB
Gesamt-Bilirubin
Gesamt-Protein
Albumin
Cholesterin
Lipase
Anionen-GAP
BUN-/Creatinin-Verhältnis
Albumin-/Globulin-Verhältnis
alkalische Phosphatase
Die Aktivitäten der folgenden multimeren Enzyme wurden in den Proben reduziert, die Druck von 30.000 psi und mehr ausgesetzt wurden:
Creatinkinase (CK)
Alaninaminotransferase (ALT)
Aspartataminotransferase (AST)
Leber-Alkoholdehydrogenase (LD)
Gamma-Glutamyltransferase (GGT)
Obwohl dort genug Restaktivität zurückblieb, beispielsweise um solche Unterschiede zwischen normalen und erhöhten Spiegeln dieser Enzyme zu messen, die in Patienten mit Leberdysfunktionen auftreten würden, war ein Sterilisationsverfahren gewünscht, das die Aktivität von multimeren Enzymen nicht reduziert.
Zu diesem Zweck wurden die folgenden Experimente durchgeführt: Humane Plasmaproben wurden auf –10°C für 4 Minuten equilibriert und der Druck wurde auf 80.000 psi [552 MPa] über einen Zeitraum von etwa 5 Sekunden erhöht und für eine bestimmte Dauer dort gehalten. Der Druck wurde dann auf Atmosphärendruck über etwa 2 Sekunden verringert. Das Verfahren wurde 2 weitere Male wiederholt. Die Dauer, bei der der erhöhte Druck getestet wurde, war 1, 5, 10, 30, 60, 120 und 240 Sekunden. Die Plasmaproben wurden dann auf enzymatische Aktivität getestet.
Die Aktivität der zwei getesteten monomeren Enzyme, Lipase und Amylase, wurde durch keine Druckdauer beeinflusst.
Bei einer Dauer von 30 Sekunden und mehr waren die Aktivitäten von LD, CK, AST und ALT fast vollständig eliminiert, wohingegen die Aktivitäten von GGT und alkalischer Phosphatase (ALK) auf die Hälfte reduziert waren. Bei einer 5-Sekunden-Dauer waren alle Enzymaktivitäten verbessert. Bei einer 1-Sekunden-Dauer hatten ALT, GGT und ALK fast vollständige Aktivität und LD, AST und CK hatten 40% bis 70% der Aktivität der unbehandelten Kontrolle.
Auch bei kurzer Dauer können akzeptable Spiegel der Inaktivierung von Pathogenen erreicht werden, beispielsweise in den vorstehenden Beispielen.
Was beansprucht wird, ist:

Claims

Ein Verfahren zur Sterilisierung eines Materials, das eine Mikrobe enthält, wobei das Verfahren umfasst: zur Verfügung stellen eines Materials bei einem Anfangsdruck und Temperatur; Kühlen des Materials auf eine Temperatur Te, wobei Te –40°C bis 10°C ist; Aussetzen des Materials einem erhöhten hydrostatischen Druck, der ausreicht, um wenigstens einige der Mikroben in dem Material zu inaktivieren; Verringern des Drucks auf einen reduzierten Druck und wiederholtes zyklisches Durchlaufen des Drucks zwischen einem erhöhten Druck und einem reduzierten Druck, dabei zur Verfügung stellen eines sterilisierten Materials.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Material weiterhin ein Protein umfasst und der erhöhte Druck nicht ausreicht, um das Protein irreversibel zu denaturieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erhöhte Druck ausreichend ist, um wenigstens 10% der Mikroben in dem Material zu inaktivieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der reduzierte Druck etwa 1 atm ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anfangstemperatur etwa 25°C ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anfangstemperatur weniger als etwa 0°C ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Anfangstemperatur zwischen –20°C und –5°C ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erhöhte Druck in einem Bereich von etwa 5000 psi bis etwa 95000 psi [34,5 bis etwa 655,0 MPa] ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erhöhte Druck in einem Bereich von etwa 30000 bis etwa 75000 psi [206,8 bis etwa 517,1 MPa] ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erhöhte Druck in einem Bereich von etwa 95000 bis etwa 150000 psi [655,0 bis etwa 1034,2 MPa] ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend, Kühlen des Materials auf eine verringerte Temperatur vor der Erhöhung des Drucks und den zyklischen Schritten.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die verringerte Temperatur zwischen etwa –40°C und etwa 0°C ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die verringerte Temperatur zwischen etwa –20°C und etwa –5°C ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Material eine Suspension pathogener Zellen ist.
Verfahren nach Anspruch 14, weiterhin umfassend, Entfernen im Wesentlichen aller Toxine, die in der Suspension sein können, aus der Suspension.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anfangstemperatur zwischen –0°C und 0°C ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend, zur Verfügung stellen von ausreichend Zeit, um es der Temperatur des Materials zu ermöglichen vor jedem Steigern des Drucks zu equilibrieren.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend, Kühlen des Materials.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Kühlschritt vor dem Drucksteigerungs-Schritt durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Kühlschritt nach dem Drucksteigerungs-Schritt, jedoch vor dem Druckverringerungs-Schritt durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Material auf eine Temperatur im Bereich von. etwa –40°C bis etwa 0°C gekühlt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Material auf eine Temperatur im Bereich von etwa –20°C bis etwa –5°C gekühlt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18–22, weiterhin umfassend, Erwärmen des Materials auf eine gesteigerte Temperatur vor dem Druckverringerungs-Schritt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18–22, weiterhin umfassend, Erwärmen des Materials auf eine gesteigerte Temperatur nach dem Druckverringerungs-Schritt.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend, Einstellen des pH des Materials vor dem Drucksteigerungs-Schritt auf einen pH größer als etwa 10.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend, Einstellen des pH des Materials vor dem Drucksteigerungs-Schritt auf einen pH geringer als etwa 4.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das sterilisierte Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus, einer biologischen Probe, Blutplasma, therapeutischen oder diagnostischen Produkten, die aus Blutplasma stammen, biologischen Flüssigkeiten, medizinischen Flüssigkeiten, Medikamenten, Forschungslösungen und Reagenzien, Serum, lebendem Gewebe, medizinischer oder militärischer Ausstattung, einem Nahrungsmittel, einer pharmazeutischen Zubereitung und einem Impfstoff.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikrobe ein oder mehren Mitglieder der Gruppe bestehend aus, einem Bakterium, einem Virus, einem Pilz, einem Protisten, einem Sporenbildner, protozoische Parasiten, Darmwurm Parasiten, malaria-induzierende Organismen, Giardia und einer viral infizierten Zelle, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Phasenübergangs-Katalysator dem Material vor der Sterilisierung zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Proteinstabilisierungs-Mittel dem Material vor der Sterilisierung zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Proteinstabilisierungs-Mittel ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus Zuckern, Glyzerin, einem hydrophilen Polymer, einem Cyclodextrin, einem Caprylat, Acetyl-Tryptophanoat, Polyethylen-Glykol, Antioxidationsmittel, und einem protein-spezifischen Liganden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei dem Material eine Nukleinsäure-bindende Verbindung vor der Sterilisierung zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Nukleinsäure-bindende Verbindung ein Photosensibilisator ist.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Photosensibilisator ein Psoralen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zu sterilisierende Material in seiner Endverpackung zur Verfügung gestellt wird, und die Verpackung so angepasst ist, das sie den Druck ohne zerreißen überträgt.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Verpackung hermetisch in flexiblem Plastik verschlossen ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Verpackung eine Spritze ist und der Druck über einen Kolben übertragen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der zur Verfügungsstellung umfasst, Einfüllen des Materials in einen Behälter, der angepasst ist, um einen externen Druck auf das Material zu übertragen; und Untertauchen des Behälters in einem Druckmittel, bevor der Druck erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei das Druckmittel eine Sterilisierungs-Lösung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus, einem Oxidationsmittel, einem Alkohol, Harnstoff, einem Guanidinium Salz, einer Säure und einer Base, ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikrobe ein Virus ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Material ein Protein einschließt und der erhöhte Druck ausreichend ist, um im Wesentlichen alle Proteine irreversibel zu denaturieren, wenn der erhöhte Druck für eine Zeit, wesentlich länger als t_e aufrechterhalten wird, aber wobei der erhöhte Druck nicht ausreichend ist, um das Protein irreversible zu denaturieren, wenn der erhöhte Druck für einen Zeitraum von t_e oder weniger aufrecht erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei der erhöhte Druck ausreichend ist, um im Wesentlichen alle Proteine zu denaturieren, wenn der erhöhte Druck für einen Zeitraum von länger als zehnmal t_e aufrechterhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei der erhöhte Druck ausreichend ist, um im Wesentlichen alle Proteine zu denaturieren, wenn der erhöhte Druck für einen Zeitraum von länger als dreimal t_e aufrechterhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei das Protein einen oder mehrere Blutgerinnungsfaktoren umfasst.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei das Protein ein oder mehrere Immunglobuline umfasst.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei das Protein ein oder mehrere monomere Proteine umfasst.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei das Protein ein oder mehrere multimere Proteine umfasst.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei das Material ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus, Blutplasma, therapeutischen oder diagnostischen Produkten, die aus Blutplasma stammen, biologischen Flüssigkeiten, medizinischen Flüssigkeiten, Medikamenten, Forschungslösungen, lebendem Gewebe und pharmazeutischen Zubereitungen.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei das Virus ein nicht-verkapseltes Virus umfasst.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei das Virus ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus, humanem Parvovirus B19, Schweine-Parvovirus, Rinder-Parvovirus, humanem Immundefizienz Virus, Herpes Simplex Virus, Hepatitis A Virus und transfusionsvermitteltem Virus.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei der erhöhte Druck 10000 bis 120000 psi [68.9 bis 827,4 MPa] ist.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei der erhöhte Druck 40000 bis 100000 psi [275,8 bis 689,5 MPa] ist.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei der erhöhte Druck 70000 bis 90000 psi [482,6 bis 620,5 MPa] ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der reduzierte Druck zwischen dem Anfangsdruck und dem erhöhten Druck liegt.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Zeit t_e 0,5 bis 300 Sekunden ist.
Verfahren nach Anspruch 55, wobei die Zeit t_e 10 bis 30 Sekunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Material zwischen 2 und 100 Zyklen ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Material wenigstens etwa 3 Zyklen ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Material wenigstens etwa 10 Zyklen ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Material wenigstens etwa 100 Zyklen ausgesetzt wird.
Herstellung eines Vakzins durch inaktivieren des Virus einer Suspension eines Virus durch das Verfahren nach Anspruch 40.