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Verweis auf
verwandte Anmeldungen
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Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der US-Seriennummer
09/0997,852, eingereicht am 15. Juni 1998, und von der US-Seriennummer
09/165,829, eingereicht am 2. Oktober 1998, die beide hier durch Referenz
in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die Erfindung betrifft Verfahren
zur Sterilisierung von Materialien und zur Herstellung von Vakzinen (Impfstoffen).
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Es gibt verschiedene Verfahren und
Vorrichtungen zur Sterilisierung, Dekontamination oder Desinfektion
von biologischen und nicht biologischen Materialien. Diese Verfahren
schließen
thermale Zerstörung
(z. B. Verbrennen), Hitzesterilisierung, Bestrahlung (z. B. ultraviolette
oder ionisierende Bestrahlung), Gassterilisierung (z. B. Verwendung
von Ethylenoxid), Fotosensibilisierung, Membransterilisierung und
die Verwendung von chemischen Desinfektionsmitteln (z. B. Formaldehyd,
Glutaraldehyd, Alkohole, Quecksilberverbindungen, vierwertige Ammoniumverbindungen,
halogenierte Verbindungen, Lösungsmittel/
Detergenzien -Systeme oder Peroxide) ein.
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Hitzesterilisierung (z. B. Autoklavieren)
wird häufig
verwendet, beispielsweise zur Sterilisierung von medizinischen Lösungen vor
ihrer Verwendung in einem Patienten. Hitzesterilisierung erfordert
typischerweise das Erhitzen einer Lösung auf 121°C für mindestens
15 Minuten unter Druck in einem Autoklaven, Aufrechterhalten der
Hitze- und Druckbedingungen für
einen Zeitraum, der ausreicht, um Bakterien, Pilze und Protisten und
inaktive Viren in der Lösung
zu töten.
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Viele wieder verwendbare medizinische
Artikel und Materialien sind nicht geeignet zur Desinfektion oder
Sterilisierung in einem Autoklaven. Beispielsweise werden Plastikteile
auf medizinischen Vorrichtungen, Blutdialysierungsgeräten und
Faseroptikvorrichtungen normalerweise durch chemische Germizid-Behandlung sterilisiert.
Im Allgemeinen benötigen
Germizide bis zu mehreren Stunden Behandlung zur Inaktivierung von Mikroorganismen.
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Um in der pharmazeutischen Herstellung
Sterilität
sicher zu stellen, wird häufig
Gassterilisierung eingesetzt. Allerdings kann die Gassterilisierung
(z. B. unter Verwendung von Ethylenoxid) zeitraubend sein, vorheriges
Anfeuchten erfordern, Heizen und das Evakuieren der Probenkammer,
gefolgt von der Behandlung mit hohen Konzentrationen des Gases für jeweils
bis zu 20 Stunden.
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Richtig angewendet können herkömmliche
Desinfektionsmittel vegetative Bakterien, bestimmte Pilze und lipophile
Viren oder Viren mittlerer Größe inaktivieren.
Allerdings hemmen diese Desinfektionsmittel häufig nicht Tuberkelbazillen,
sporenbildende Bakterien oder nicht-lipophile Viren oder Viren geringer
Größe.
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Ein weiteres Verfahren zur Lyse von
Zellen wodurch Sterilisierung einer Probe erreicht wird, wird beschrieben
in Microbiology (Davis et al., Harper & Row, Hagerstown, MD, 1980). Man
nimmt an, dass dieses Verfahren des Einfrierens und Auftauens der
Probe seine Wirkung durch die Bildung von winzigen Eistaschen in
den Zellen entfaltet, wenn die Bakteriensuspension eingefroren wird.
Die Eiskristalle und die hohen, örtlich begrenzten
Konzentrationen der Salze verursachen beide Schaden an den Bakterien.
Ein einzelnes Einfrierungsereignis ist generell ausreichend, um
nur einige der Bakterien zu töten,
jedoch resultieren wiederholte Einfrierungs-/Auftauzyklen in einer
fortschreitenden Verringerung der Lebensfähigkeit. Die Letalität ist mit
langsamem Einfrieren und schnellem Auftauen korreliert.
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Herkömmliche Einfrier-/Auftauverfahren
sind in der Geschwindigkeit von Einfrier/Auftauzyklen durch die
Zeit begrenzt, die benötigt
wird, um Hitze zu und aus dem Zentrum der Proben zu bringen, um
Phasenveränderungen
zu bewirken. Die Gleichgewichtsquote ist insbesondere im Fall von
Proben mit großem
Volumen (z. B. etwa 100 ml oder größer) langsam. Die Sterilisierungseffizienz
dieser herkömmlichen
Verfahren ist dadurch begrenzt, dass es unmöglich ist, eine große Anzahl
von Einfrier-/Auftauzyklen mit diesen Verfahren durchzuführen.
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Herkömmliche Verfahren der Nahrungskonservierung
schließen
Pasteurisierung ein, in der ein Nahrungsmittel für einen Zeitraum bei einer
erhöhten
Temperatur gehalten wird.
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US-Patent Nr. 3,445,568 offenbart
ein elektro-hydraulisches Verfahren, in dem Mikroorganismen, die in
einem flüssigen
Medium suspendiert sind, einer oder mehreren heftigen Druck- oder
Schockwellen ausgesetzt werden, um die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen
zu zerstören,
ohne ihre Antigenität
zu zerstören. Weiterhin
wird offenbart, dass einige Kombinationen von Chemikalien, UV-Bestrahlung,
Hitze, Druckschock und Verwirbelung Mikroorganismen zerstören können. US-Patent
Nr. 5,316,745 beschreibt eine Ultrahochdruck-Sterilisierungsvorrichtung
und ein Verfahren, zur Sterilisierung eines Materials, wobei das
Material hohen Druckniveaus und reduzierten Druckniveaus ausgesetzt
wird. Hashizume C. et al. (Biosci. Biotech. and Biochem., 59 (8),
1455–1458,
1995) haben gezeigt, dass Hochdruckbehandlung, die auf Nahrungssterilisierung
bei geringeren Temperaturen angewendet wird, mit geringerem Druck
eine größere Wirkung
hat, ohne den ursprünglichen
Geschmack und Geruch zu zerstören.
Darüber
hinaus, dass Sterilisierung stattfindet, wenn hoher Druck die natürlichen
Strukturen von biologischen Makromolekülen zerstört, d. h. Proteine und Lipide von
Mikroorganismen.
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Es besteht ein anhaltender Bedarf
an der Entwicklung von verbesserten Verfahren zur Sterilisierung, insbesondere
zur Inaktivierung von Viren und anderen Mikroben in Materialien,
die auch Proteine enthalten, die eine Aktivität besitzen, die man aufrecht
erhalten will, wie Blutgerinnungsfaktoren, Antikörper, Blutenzyme (z. B. Lipasen,
Phosphatasen) und Wachstumsfaktoren. Die Entwicklung von Verfahren
zur Inaktivierung von nicht-verkapselten Viren ist eine besondere
Herausforderung, da die äußeren Hüllen solcher
Viren normalerweise Proteine einschließen, die den Proteinen ähnlich sind,
die man bewahren möchte.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die Erfindung basiert auf der Entdeckung,
dass biologische und nicht biologische Materialien sterilisiert,
dekontaminiert oder desinfiziert werden können durch wiederholte Zyklen
zwischen relativ hohen und niedrigen Drücken. Druckzyklisierung kann
bei geringen Temperaturen, bei Raumtemperatur oder bei erhöhten Temperaturen
(z. B. von etwa –40°C bis etwa
95°C) durchgeführt werden.
Neue Verfahren, die auf dieser Entdeckung beruhen, können in
beispielsweise der Herstellung von Vakzinen, der Sterilisierung
von Blutplasma oder -serum, der Dekontamination von militärischen
Vorrichtungen, in der Nahrungsmittel- und Getränkeproduktion und in der Desinfektion
von medizinischer Ausrüstung
Anwendung finden. Die neuen Verfahren können auch in Produktionsverfahren
oder Forschungsverfahren eingebaut werden.
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Generell bietet die Erfindung ein
Verfahren zur Sterilisierung eines Materials. Das Verfahren schließt die Schritte
der zur Verfügungsstellung
eines Materials bei einem Anfangsdruck (z. B. 1 atm) und Temperatur (z.
B. 25°C,
geringere Temperaturen wie 0°C, –5°C, –25°C, – 40°C oder geringer)
ein; Kühlen
des Materials auf eine Temperatur Te, wobei Te –40°C bis 10°C ist; Steigern des Drucks auf
einen erhöhten
hydrostatischen Druck, der ausreichend ist, um wenigstens einige
(z. B. wenigstens etwa 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 99% oder auch
im Wesentlichen alle) Mikroben, die in dem Material enthalten sind,
zu inaktivieren (z. B. in einem Bereich von etwa 5.000 psi [34,5
MPa] bis etwa 95.000 psi [655,0 MPa] oder in dem Bereich von etwa 10.000
psi [68,9 MPa] bis etwa 75.000 psi [517,1 MPa] oder im Bereich von
etwa 95.000 psi [655 MPa] bis etwa 150.000 psi [1.034,5 MPa]; und
nachfolgend Verringern des Drucks auf einen reduzierten Druck, der
in etwa der gleiche sein kann wie der Anfangsdruck, weniger oder
größer als
der Anfangsdruck (z. B. um 1 atm), und wiederholtes zyklisches Durchlaufen
des Drucks zwischen einem erhöhten
Druck und einem reduzierten Druck, um ein sterilisiertes Material
zur Verfügung
zu stellen (d. h. ein Material, das einen reduzierten Mikroben-Titer
besitzt).
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In einigen Fällen schließt das Material ein Protein
ein. In solchen Fällen
kann es wünschenswert
sein, dass der erhöhte
Druck nicht ausreicht, um Proteine während der Zeit, in der der
Druck auf einem erhöhten Niveau
ist, irreversible zu denaturieren. Der Fachmann versteht, dass „Denaturierung
eines Proteins" die
Denaturierung einer ausreichenden Menge des Proteins bedeutet, um
die Nützlichkeit
des Proteins für
eine bestimmte Anwendung zu reduzieren oder zu zerstören. Typischerweise
macht die irreversible Denaturierung von mehr als etwa 50% des Proteinmoleküls in einer
Probe die Probe zu einer unzufriedenstellenden Quelle des Proteins.
In einigen Fällen
ist jedoch ein Zurückbleiben
von nur 10% oder weniger der Proteinaktivität ausreichend.
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Das Material kann auf Temperaturen
unter null Grad abgekühlt
werden (z. B. von etwa –40°C bis etwa 0°C, besonders
zwischen etwa –20°C und etwa
5) entweder vor oder nachdem der Druck erhöht wird. Die Temperatur kann
nachfolgend erhöht
werden, entweder vor oder nachdem der Druck verringert wird.
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Der Druck wird wiederholt zyklisiert
(z. B. 2, 3, 5, 10 oder sogar 100 Mal oder mehrmals) zwischen dem erhöhten Druck
und dem Anfangsdruck. Diese Zyklisierung kann bei der Anfangstemperatur
durchgeführt
werden, bei einer geringen Temperatur (z. B. Temperaturen unter
Null, wie zwischen –40°C und 0°C oder zwischen –20°C und –5°C), oder
während
das Material auf eine niedrige Temperatur abgekühlt wird. Die Zeitsteuerung der
Zyklen kann so erfolgen, dass es der Temperatur des Materials ermöglicht wird
vor jedem Zyklus, zu equilibrieren (z. B. auf die Temperatur der
Wände eines
Reaktionsgefäßes, in
dem das Verfahren durchgeführt wird).
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In einigen Fällen kann ein Material bei
geringerer Temperatur in einem festen (d. h. gefroren) Zustand bei
dem Anfangsdruck sein, jedoch in dem flüssigen (d. h. geschmolzen oder
getaut) Zustand bei dem erhöhten
Druck. In einigen Fällen
verursacht Druckzyklisierung begleitende Einfrier-/Auftauzyklisierung.
Die zeitlichen Muster der Pulsation können optional verändert werden.
Während
jedes Zyklus wird der Druck abwechselnd gesteigert und dann verringert.
Das Verhältnis
der Zeit bei hohem Druck zu der Zeit bei geringem Druck wird als „Pulsationsmuster-Verhältnis" bezeichnet. Ein
Pulsationsmuster-Verhältnis
größer als
1 : 1 (z. B. 2 : 1 oder mehr) kann in den meisten Fällen eine
optimale Inaktivierung von Kontaminanten erzeugen, wohingegen ein
Pulsationsverhältnis
von weniger als 1 : 1 eine größere Menge
an zurückbleibenden
richtig gefalteten sensitiven Proteinen ergeben kann.
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Das sterilisierte Material kann beispielsweise
eine biologische Probe, Blutplasma, vom Blutplasma abgeleitete therapeutische
und/oder diagnostische Produkte, biologische Flüssigkeiten, medizinische Flüssigkeiten,
Medikamente, Forschungslösungen
und Reagenzien, Serum, lebendes Gewebe, medizinische oder militärische Ausrüstung, ein
Nahrungsmittel, eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Vakzin
sein. Das sterilisierte Material kann anfänglich beispielsweise mit einem
Bakterium oder mehreren Bakterien, einem Virus, einem Pilz, einem
Protsten, einem Sporenbildner, einem Protozoen Parasit, mit Malaria-induzierenden
Organismen, mit Giardia oder mit viral infizierten Zellen infiziert
sein, kontaminiert sein oder sie auf andere Weise enthalten.
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Die Erfindung bietet auch ein Verfahren
zur Inaktivierung eines Virus in einem Material. Das Verfahren schließt ein die
Schritte: zur Verfügung
stellen eines Materials bei einem Anfangsdruck und Temperatur; und Aussetzen
des Materials gegenüber
wiederholten Druckzyklen (z. B. 2 bis 100 Zyklen, mehr als etwa
3, 10, 50, 100, 1.000 oder 10.000 Zyklen). Jeder Druckzyklus schließt die Schritte
des Steigerns des Drucks auf einen erhöhten Druck (z. B. zwischen
etwa 10.000 psi [86,9 MPa] und etwa 120.000 psi [827,4 MPa], zwischen
etwa 40.000 psi [275,8 MPa] und etwa 100.000 psi [689,5 MPa] oder
zwischen etwa 70.000 psi [482,6 MPa] und etwa 90.000 psi [620,5
MPa] ein, Aufrechterhalten eines erhöhten Drucks für einen
Zeitraum Te, Verringern des Drucks auf einen
reduzierten Druck und Halten des Materials bei einem reduzierten
Druck (z. B. einem Druck, der geringer ist, als der erhöhte Druck
und geringer als, gleich oder größer als
der anfängliche
Druck), für
einen Zeitraum ti. Der erhöhte Druck
ist ausreichend, so dass jeder Zyklus wenigstens einige (z. B. wenigstens
etwa 1%, 5%, 10%, 25%, 50% oder mehr) der Viren in dem Material
inaktiviert, wenn der erhöhte
Druck für
eine Zeit Te (z. B. zwischen etwa 0,5 und
etwa 300 Sekunden, oder zwischen etwa 10 und etwa 30 Sekunden) aufrecht erhalten
wird.
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In einigen Fällen schließt das Material ein Protein
ein. In solchen Fällen
kann der erhöhte
Druck ein Druck sein, der ausreichen würde, um im Wesentlichen alle
(z. B. 50%, 75%, 90%, 95% oder mehr) Proteine irreversibel zu denaturieren,
wenn der erhöhte
Druck für
eine Zeit im Wesentlichen länger
als Te (z. B. 2, 3, 5, 10, oder 100-fach
Te oder mehr) aufrecht erhalten wird, aber
er ist nicht ausreichend ist, um das Protein irreversibel zu denaturieren,
wenn der erhöhte
Druck nur für
einen Zeitraum Te oder weniger aufrecht
erhalten wird.
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Das Protein kann beispielsweise ein
Blutgerinnungsfaktor (z. B. Faktor VII, VIII, IX, XI und oder XIII) sein,
ein Immunglobulin (z. B. IgG, IgM), ein monomeres Protein, ein multimeres
Protein oder ein Gemisch von Proteinen sein.
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Das Virus kann ein verkapseltes oder
nicht verkapseltes Virus sein (z. B. humanes Parvovirus B19, Schweineparvovirus,
Rinderparvovirus, humanes Immundefizienzvirus, Herpes-simplex-Virus,
Hepatitis-A-Virus, Bakteriophage MS2 oder transfusionsübertragenes
Virus).
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Das Verfahren kann auch den Schritt
des Abkühlens
des Materials auf eine Temperatur Te einschließen (z.
B. etwa –40°C bis etwa
10°C, oder
etwa –25°C bis etwa –10°C), vor Aussetzen
des Materials gegenüber
einem erhöhten
Druck.
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Jedes der neuen, vorstehend beschriebenen
Verfahren kann auch verwendet werden, um Vakzine gegen spezifische
Mikroben zu erzeugen. Beispielsweise kann eine Suspension mikrobieller
Zellen erhalten werden, sterilisiert werden durch eines der neuen
Verfahren (z. B. das Verfahren, das Druckzyklisierung einschließt und potentiell
Einfrier-/Auftauzyklisierung bei Temperaturen unter null) und kombiniert
werden mit einem Adjuvans zum Virus, Herpessimplex-Virus, Hepatitis-A-Virus,
Bakteriophage MS2 oder transfusionsübertragens Virus).
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Das Verfahren kann auch den Schritt
des Abkühlens
des Materials auf eine Temperatur Te (z.
B. etwa –40°C bis etwa
10°C, oder
etwa –25°C bis etwa –10°C) vor dem
Aussetzen des Materials gegenüber
einem erhöhten
Druck einschließen.
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Jedes der neuen, vorstehend beschriebenen
Verfahren kann auch verwendet werden, um Vakzine gegen spezifische
Mikroben zu erzeugen. Beispielsweise kann eine Suspension mikrobieller
Zellen erhalten werden, sterilisiert werden durch eines der neuen
Verfahren (z. B. das Verfahren, das Druckzyklisierung einschließt und potentiell
Einfrier-/Auftauzyklisierung bei Temperaturen unter Null) und kombiniert
werden mit einem Adjuvans, um ein Vakzin zu produzieren. Liegen
Toxine in der Suspension vor, können
diese entfernt werden (z. B. nach dem Sterilisationsschritt).
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In einigen Fällen kann es nützlich sein,
Additive einzuschließen,
wie einen Phasenwechselkatalysator (z. B. Glaspartikel), ein proteinstabilisierendes
Agens (z. B. einen Zucker, Glyzerin, ein hydrophiles Polymer, ein
Zyklodextrin, ein Caprylat, Acetylfryptophanoat, Polyethylenglykol,
Antioxidanz oder einen proteinspezifischen Liganden) oder eine Nukleinsäure-bindende
Verbindung (z. B. einen Fotosensibilisator, wie ein Psoralen) in
Verbindung mit dem Material, das sterilisiert werden soll. Einige
dieser Zusätze
können
nachfolgend durch Zentrifugation oder Filtration, falls notwendig,
entfernt werden.
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In einer weiteren Ausführungsform
bietet die Erfindung eine Vorrichtung zur Sterilisierung eines Materials.
Die Vorrichtung schließt
ein Druckausgleichgefäß ein, das
eingerichtet ist, um einen externen Druck auf ein Material in ihm
zu übertragen.
Das Gefäß muss in
der Lage sein, einem erhöhten
Druck zu widerstehen (z. B. Drücken,
denen in der Praxis von einem der neuen Verfahren, die vorstehend
beschrieben sind, begegnet wird), muss in der Lage sein, in eine
Druckzyklisierungsvorrichtung zu passen (z. B. wie psi); aufgrund
der kurzen Dauer der Druckzyklen (z. B. zwischen etwa 1 s und etwa
300 s) und in einigen Fällen
den geringen Temperaturen (z. B. zwischen etwa –10°C und etwa –40°C), jedoch verhindern die neuen
Verfahren, die Verursachung von exzessiver, irreversibler Denaturierung
der Proteine in den Materialien, die dadurch sterilisiert werden.
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In noch einer anderen Ausführungsform
bietet die Erfindung ein weiteres Verfahren zur Sterilisierung eines
Materials, das Proteine einschließt. Das Verfahren schließt die Schritte
des zur Verfügung
stellens des Materials bei einem Anfangsdruck; des Zusetzen von
einem oder mehreren proteinstabilisierenden Reagenzien (z. B. Zucker
wie Glukose; Glyzerin; ein hydrophiles Polymer; ein Zyklodextrin;
ein Caprylat; Acetyltryptophanoat; Polyethylenglykol; ein Antioxidanz;
oder einen proteinspezifischen Liganden) zu dem Material; des Steigerns
des Drucks auf einen erhöhten
Druck (z. B. etwa 10.000 [68,9 MPa] bis 70.000–80.000 psi [482,6–552 MPa],
abhängig
von der Stabilität
des Proteins); des Inkubierens des Materials für eine Zeit, die ausreichend
ist, damit Sterilisation auftritt ohne einen wesentlichen Verlust
der Proteinfunktion; und des Wiederherstellens des Drucks auf den
anfänglichen
Druck ein, um ein sterilisiertes Material zur Verfügung zu
stellen. Wieder kann der Druck wiederholt zyklisiert werden.
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In jedem der vorstehenden Verfahren
kann das zu sterilisierende Material in seiner Endverpackung zur Verfügung gestellt
werden, die Verpackung ist in der Lage, Druck zu übertragen,
ohne zu zerreißen.
Beispielsweise kann die Verpackung hermetisch in flexiblem Plastik
(z. B. PVC oder Polyethylen) abgeschlossen sein.
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Alternativ kann die Verpackung eine
Spritze sein und der Druck kann über
einen Kolben übertragen werden.
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Die Erfindung bietet auch ein Verfahren
zur Druckbehandlung von infektiösem
Material. Das Verfahren schließt
die Schritte des Verpackens des Materials in einen Container ein,
der angepasst ist, um einen externen Druck auf das Material zu übertragen;
Untertauchen des Containers in eine sterilisierende, chemische Lösung (z.
B. enthaltend ein oxidierendes Agens, einen Alkohol, Harnstoff,
ein Guanidiniumsalz, eine Säure
oder eine Base); und Druckbehandeln des Materials in dem Container.
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In jedem der vorstehenden Verfahren
kann der pH des Materials, das sterilisiert werden soll, optional auf
mehr als etwa 10 (z. B. zwischen 10 und 14 oder zwischen 11 und
12) oder auf weniger als etwa 4 (z. B. zwischen 0 und 4, oder zwischen
2 und 3) eingestellt werden, bevor der Druck gesteigert wird. Solche
pH-Einstellungen können
nützlich
sein für
beispielsweise die Inaktivierung von pH-sensitiven Mikroben (z.
B. Parvovirus) oder Mikroben in Materialien, die Proteine einschließen, die
resistent gegen pH-Extreme sind (z. B. IgG), sie können die
Sterilisierungsverfahren beschleunigen und können es in einigen Fällen ermöglichen,
das Verfahren insgesamt bei geringeren Drücken durchzuführen.
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Wie hier verwendet, bedeutet der
Ausdruck „Temperaturen
unter Null" eine
Temperatur weniger als 0°C
(z. B. –1°C, –5°C, –10°C, –20°C und weniger).
Alle Temperaturen hier sind in Grad Celsius, wenn nicht anders angegeben
ist, und werden nur durch „°C" angegeben. Die Einheiten
des Drucks werden hier in Pfund pro Quadratzoll (psi) oder in Atmosphären. (atm)
angegeben. 1 atm ist etwa 14,5 psi, 1 bar oder 101,3 Kilopascal.
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Ein Tieftemperatur-Druckverfahren
(„cryobares
Verfahren") ist
ein Verfahren, das wenigstens eine Druckveränderung einschließt, die
bei einer Temperatur unter Null durchgeführte werden. In einigen Tieftemperatur-Druckverfahren
wird der Druck zwischen zwei Drücken
zyklisiert (z. B. etwa 14,5 psi [0,1 MPa] bis etwa 5.000 psi [34,5
MPa], 35.000 psi [241,5 MPa], 70.000 psi [483 MPa], 80.000 psi [552
MPa], 100.000 psi [689,5 MPa] und höher), während die Temperatur entweder
auf einer Temperatur unter null Grad aufrecht erhalten wird oder
in einem Temperaturbereich unter null Grad variiert wird.
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Die Ausdrücke „sterilisieren", „desinfizieren", „inaktivieren" und „dekontaminieren" werden hier abwechselnd
verwendet, wenn es nicht anders vom Zusammenhang gefordert wird.
Es sollte beachtet werden, dass „Sterilisierung" (Töten aller
Organismen) in bestimmten Verfahren nicht synonym mit „Dekontamination" sein kann, wenn
die Kontaminante nicht lebend ist, wie ein Protein oder Prion.
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Die neuen Verfahren stellen verschiedene
Vorteile zur Verfügung
Beispielsweise können
die Verfahren bei Temperaturen unter null Grad ausgeführt werden
(z. B. zwischen etwa –40°C und 0°C). Druckzyklisierung, die
bei Temperaturen unter null Grad durchgeführt wird, kann Vorteilhafterweise
Oszillation zwischen verschiedenen Phasen des Wassers in oder außerhalb
der Zellen oder Vesikel von biologischen Kontaminanten induzieren.
Der Übergang
zwischen den festen und flüssigen
Zuständen
kann physikalischen Stress auf Membranen, Wände und Vesikel ausüben, wodurch
der beabsichtigte Verfahren erleichtert wird. Der Bereich von Temperaturen
unter null, der generell in den neuen Verfahren verwendet wird,
wird leicht mit relativ kostengünstiger Ausstattung
erreicht (z. B. kommerzielle Kühlvorrichtungen),
die bereits in einer Auswahl von Formen und Größen erhältlich sind, um einen spezifischen
Bedarf zu erfüllen. Ähnlich kann
der Bereich der erforderlichen Drücke für eine Standardoperation der
Verfahren (z. B. von etwa 14,5 psi [0,1 MPa] bis etwa 30.000 psi
[206,8 MPa], 70.000 psi [482,6 MPa], 80.000 psi [552 MPa], 100.000
psi [690 MPa] oder höher)
durch Vorrichtungen erzeugt werden, wie sie in PCT US97/03232 beschrieben
sind.
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Eine Vorrichtung zur Sterilisation
eines Materials durch ein Tieftemperatur-Druckverfahren wird generell
eine Kammer einschließen,
um das Material zu enthalten, die Kammer ist in der Lage, einen
ausgewählten erhöhten Druck
durchzuführen
und ein System einschließen
zur Kontrolle, Veränderung
oder Regulation der Temperatur und des Drucks in der Kammer. Die
Vorrichtung kann schnelles Steigern und Verringern des Drucks ermöglichen,
der ausreichend ist, um Denaturierung von Proteinen während der
Druckregelungs- und – entregelungsschritte
der Druckzyklen zu verhindern Die optimale Geschwindigkeit ist beispielsweise
abhängig
von der Temperatur, die in dem Verfahren verwendet wird; generell
werden höhere
Raten bei höherer
Temperatur benötigt.
Die Vorrichtung stellt auch Systeme zur Entfernung eines sterilisierten
Materials auf antiseptische Weise aus der Kammer zur Verfügung. Zusätzlich kann
eine typische Sterilisationsvorrichtung zur Verwendung in den neuen
Verfahren eine Vielzahl von Kontrollen, Regulatoren und Temperatur
und/oder Drucksensoren einschließen. Das Druckmedium kann beispielsweise
eine Wasser-/ Ethylenglykollösung
oder andere nicht-gefrierende Lösungen
oder ein Festmaterial, wie gepuderter Talk, sein.
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Die Vorrichtungen, die notwendig
sind, um die neuen Verfahren durchzuführen, können leicht angepasst werden,
um die Erfordernisse bestimmter Anwendungen zu erfüllen. Beispielsweise
kann eine kleine, tragbare Vorrichtung erhalten werden, wodurch
Sterilisations- oder Dekontaminationsverfahren auf dem Feld durchgeführt werden
können
(z. B. durch Sanitäter
oder medizinisches Militärpersonal).
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Temperaturvariationen können auch
zur Lyse von Mikroben beitragen. Temperatur, Druck, Zyklusanzahl
oder Zyklusfrequenz kann variiert werden, um die Wirksamkeit des
Sterilisationsverfahrenes zu maximieren.
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Die neuen Verfahren sind sehr schnell.
Beispielsweise kann der Druck bei einer Frequenz von etwa 1 MHz
bis etwa 10 Hz zyklisiert werden, was es typischerweise ermöglicht,
den gesamten Sterilisationsverfahren innerhalb von Minuten zu vervollständigen.
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Die neuen Verfahren ermöglichen
es, pathogene Organismen in einem Material zu neutralisieren, ohne
die begleitende Denaturierung von Proteinen. Die neuen Verfahren können Denaturierung
verhindern, die häufig
nach Sterilisation von biologischen Materialien auftritt.
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Schnelle und ökonomische Sterilisation ist
erreichbar mit einem Minimum an Proteinzerstörung oder Denaturierung. Die
neuen Verfahren können
somit vorteilhaft zur Produktion von hochaktiven Vakzinen verwendet
werden. Diese Vakzine können
Vakzinen, die bei höheren
Temperaturen erzeugt wurden, überlegen sein,
da höhere
Temperatur Zerstörung
von sowohl kovalenten als auch nicht-kovalenten Bindungen in Proteinen
verursachen können
und zu einem größerem Grad
der irreversiblen Denaturierung führen als die hier beanspruchten
Verfahren. Hohe Temperaturen können
auch zu kovalenten Bindungen von Proteinen an kleine Moleküle, wie
oxidierter Glukose, führen.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass sie verwendet werden kann,
um Viren und Bakterien in Patientenproben vor der Analyse zu inaktivieren.
Laboranten können
dem Risiko unterworfen sein, eine Infektion zu bekommen (z. B. von
Viren wie dem humanen Immundefizienzvirus und Hepatitis B Virus),
wenn sie Gewebeproben, Zellen oder Flüssigkeiten, die von dem Patienten
zur Analyse entnommen wurden, handhaben. Um dieses Risiko zu verhindern,
können
solche Proben in einem Container gesammelt werden, der konstruiert
wurde, um in eine Druckzyklisierungsvorrichtung inseriert zu werden.
Ein geeigneter Behälter
sollte komprimierbar sein oder sollte einen Kolben oder Stempel
haben, um den Druck zu übertragen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren
können
dann mit einer Probe in dem Container durchgeführt werden, ohne die Probe
vor der pathogenen Inaktivierung freizusetzen. In einem Beispiel
wird gesammeltes Blut in einer Spritze verschlossen und die verschlossenen
Spritze wird dann in eine Druckkammer, gefüllt mit einem Medium, das den
Sterilisierungsdruck überträgt, wie
70% Ethanol, gebracht. Die Probe wird dann mit einem erfindungsgemäßen Verfahren
behandelt und zur Analyse entnommen.
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Andere Vorteile der neuen Verfahren
schließen
die Verhinderung oder Reduktion des Bedarfs chemischen Zusätze zu Blutfraktionen
zuzusetzen; die Skalierbarkeit des Verfahrens von einzelnen Einheiten
bis zu großen,
vereinigten Proben oder zu kontinuierlichen Online-Verfahren; und
Eliminierung von Nebenwirkungen der Hitzeinaktivierungsverfahren
auf Proteinbestandteile ein.
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Falls nicht anderweitig definiert,
haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die
gleiche Bedeutung, wie sie normalerweise von dem Fachmann auf dem
Gebiet , zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden. Obwohl
Verfahren und Materialien, die ähnlich
oder gleich den hier beschriebenen sind, in der Praxis oder dem
Ausprobieren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind
geeignete Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. Alle
Publikationen, Patentanmeldungen, Patente und andere Referenzen,
die hier erwähnt
sind, sind in ihrer Gesamtheit durch Referenz eingeschlossen. Im
Falle eines Konflikts geht die vorliegende Beschreibung einschließlich Definitionen
vor. Zusätzlich
sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur zur Veranschaulichung
und nicht dazu gedacht, einzuschränken.
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Weitere Eigenschaften und Vorteile
der Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung und
durch die Ansprüche
ersichtlich.
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Detaillierte
Beschreibung
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Die Erfindung stellt ein Verfahren
zur Verfügung,
durch das ein Material sterilisiert oder dekontaminiert werden kann
durch hohen Druck im Bereich von etwa 5.000 [34,5 MPa] bis 95.000
psi [655 MPa], vorzugsweise in dem Bereich von 30.000 [206,8 MPa]
bis 75.000 psi [517,1 MPa]. Das Material wird entweder vor oder nach
der Druckbehandlung auf eine bestimmte Temperatur eingestellt, die
sowohl mit der Erhaltung der gewünschten
Eigenschaften des Materials als auch mit der Zerstörung der
Kontaminanten kompatibel ist.
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Obwohl die Temperatur, der Druck,
die Anzahl und die Dauer der Zyklen und die relative zeitliche Planung
des Drucks und der Temperaturveränderung
variieren kann, werden die neuen Verfahren generell gemäß dem folgenden
Verfahren durchgeführt:
Ein Material wird bei einem Anfangsdruck (z. B. Atmosphärendruck, 14,5
psi) und Temperatur (z. B. Raumtemperatur, 25°C, oder einer gekühlten Temperatur,
wie 0°C
bis 4°C
oder eine Gefriertemperatur, wie –80°C bis –20°C) zur Verfügung gestellt. Das Material
wird dann bis zu einem erhöhten
Druck unter Druck gesetzt. Der Druck kann dann wiederholt zwischen
dem erhöhten
Druck und dem Außendruck
zyklisiert werden. Das Material kann in einem gefrorenen Zustand
nach der letzten Druckentlassung produziert werden oder kann auf
0°C oder
mehr aufgewärmt
werden, bevor der Druck entlassen wird, um ein nicht gefrorenes,
sterilisiertes Produkt zu produzieren.
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Die vorstehenden Verfahren können auch
in Verbindung mit Verfahren verwendet werden, in denen ein bekannter
statischer Druck und/oder ein bestimmter Druck für einen gegebenen Zeitraum
aufrecht erhalten wird. In einigen Fällen kann der Druck auf einem
stark erhöhten
Niveau für
einen Zeitraum aufrecht erhalten werden, der ausreichend ist zur
Inaktivierung vom Mikroben, der jedoch nicht ausreicht, um Proteine
irreversibel zu denaturieren.
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Ist ein Phasenwechsel in einem Sterilisationsverfahren
involviert, kann ein Katalysator zugegeben werden, um den Wechsel
zu beschleunigen. Beispielsweise kann die Anwesenheit von fein zerteiltem
Glas oder anderen Materialien Nukleationsstellen zum Frieren einer
Probe oder eines Materials zur Verfügung stellen.
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Allgemein
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Anwendungen dieser neuen Verfahren
schließen
die Sterilisation von Materialien, wie Blutplasma von Spendern (z.
B. zur Verwendung in Transfusionen), die Sterilisierung von gereinigten
oder teilweise gereinigten therapeutischen und diagnostischen Proteinen,
die von Blut abgeleitet sind, medizinischen Proben (Blut, Urin, Fäkalien,
Haar, Biopsie oder anderen Gewebeproben), Arzneimitteln (z. B. biosynthetische
Antisense-Arzneimittel), Bioarzneimitteln und transgen erzeugten
Proteinen ein. Die neuen Verfahren können verwendet werden, um die
Proliferation von Viren in inkubierten Materialien zu hemmen oder
solche Materialien zu sterilisieren. Die neuen Verfahren können auch
verwendet werden, um die Sterilität von Kosmetika, Pharmazeutika
und industriellen Produkten sicher zu stellen.
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Beispiele für Mikroben, die durch die neuen
Verfahren inaktiviert werden, schließen sowohl hydrophile als auch
lipophile Viren ein; nahezu jedes Bakterium, einschließlich z.
B. Staphylokokken, Mikrokokken, pyrogene Streptokokken, Diphteroide
(z. B. lipophile, nichtlipophile, anaerobe Diphteroide, wie Propiobakterium, gram-negative
Enterobazillen (z. B. Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus,
Serratia), Neisseria, aerobe Sporenbildner, Mycobakterien; Pilze,
einschließlich
z. B. Hefe, Pityrosporum ovale, Pityrosporum orbiculare, Candida
albicans, Candida parapsilosis, Torulopsis glabarata und filamentöse Dermatophytenspezies;
Protisten und niedere multizelluläre Organismen, einschließlich Protozon-Parasiten;
und Darmwurmparasiten; Malaria induzierende Organismen; Giardien;
und viral infizierte Zellen.
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Beispiele für Viren, die durch die neuen
Verfahren inaktiviert werden können,
schließen
sowohl DNA- als auch RNA-Viren ein, wie das humane Parvovirus B19
(„B19"), Schweine-Parvovirus („PPV"), Bakteriophage
MS2 („MS2") und Hepatitis A
Virus (HAV). Sowohl B19 als auch HAV sind klein (etwa 15–30 nm)
und besitzen keine äußere Hülle, die
aus Lipiden besteht (nicht umhüllt),
sind resistent gegenüber
Hitze und chemischer Behandlung und sind schwierig durch Nanofiltration
zu entfernen. PPV und MS2 sind ähnlich
resistente Viren, die als Forschungsmodelle für die Humanpathogenen B19 und
HAV dienen können.
Umhüllte
Viren (z. B. humanes Immundefizienzvirus, Hepatitis B Virus und
Hepatitis C Virus) sind auch potentielle Ziele der neuen Verfahren.
Zurzeit uncharakterisierte Viren, wie einige neu erkannte Formen
von Hepatitis-Virus und transfusionsübertragene Viren können auch
verletzlich durch die neuen Verfahren sein.
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Plasmasammlungen enthalten häufig Hepatitis
C Virus (HCV). Verfahren zur Erzeugung von Blutprodukten können somit
von einem Verfahren profitieren, das HCV und andere Viren inaktiviert.
Humaner Parvovirus B19 (B19) ist eine weitere gängige Kontaminante von Plasma.
Hepatitis A Virus (HAV) Kontaminanten sind weniger gängig, jedoch
immer noch störend.
Sowohl B19 als auch HAV sind klein (etwa 15–30 nm), besitzen keine äußere Hülle, zusammengesetzt
aus Lipiden (nicht umgehüllt),
sind resistent gegenüber
Hitze und chemischer Behandlung und sind schwer durch Nanofiltration
zu entfernen. Umhüllte
Viren (z. B. HIV, HBV, HCV) sind auch potentielle Ziele der neuen
Verfahren. Zurzeit uncharakterisierte Viren, wie einige neu erkannte
Formen von Hepatitis-Virus und das transfusionsübertragne Virus (TTV) können auch
durch diese neuen Verfahren verletzlich sein. Zusätzlich sind
prion-basierte infektiöse
Mittel, wie übertragbare
spongiforme Enzephalopathie, schwierig zu screenen und zu inaktivieren.
Da jedoch die erfindungsgemäßen Verfahren
unter geeigneten Bedingungen Proteinentfaltung induzieren können, kann
es möglich
sein, solche Mittel durch die erfindungsgemäßen Verfahren zu inaktivieren.
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Aufgrund der Möglichkeit, dass zerstörte Viruspartikel
sich nach der Druckbehandlung wieder zusammenbauen können, kann
es wünschenswert
sein, die Nukleinsäuren,
die in dem Virus enthalten sind, irreversible abzubauen. Gemäßigt hohe
Drücke
(z. B. 20.000 psi [138 MPa] bis 60.000 psi [414 MPa] können Komplexe
von Nukleasen und ihren endogenen Inhibitoren zerstören. Die
aktivierten Nukleasen können
dazu dienen, Nukleinsäuren
abzubauen und dadurch die irreversible Inaktivierung von Viren zu
verstärken.
Zusätzlich kann
gemäßigter Druck
die Aktivierung von nicht-inhibierten Enzymen beschleunigen. Das
Verfahren kann verstärkt
werden durch den Zusatz von Nukleasen. In einigen Fällen ist
es wünschenswert,
eine magnesium-unabhängige
Nuklease zuzusetzen, wie bei der Behandlung von zitriertem Plasma,
da das Zitrat Magnesiumionen binden kann und somit magnesiumabhängige Nukleasen
inhibiert.
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Alternativ können wesentlich höhere Drücke (z.
B. 50.000 psi bis 150.000 psi [345 –1035 MPa]) zur Sterilisation
von Materialien, die druckstabil sind, wie kleine Moleküle, Arzneimittel
oder thermostabile Proteine verwendet werden. Ein Druckzyklus-Einfrier-/Auftau-Sterilisationsverfahren
(z. B. ein Verfahren, das Vorteil aus der zyklischen Bildung von
Hochdruck-Eis wie Eis III, Eis IV, Eis V oder Eis VI zieht) kann
verwendet werden.
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Sind die biologischen Kontaminanten
verhältnismäßig druckstabil
und enthält
das Material labile Proteine, die zurückbehalten werden sollen, kann
eine Abwandlung dieses Verfahrens verwendet werden. In dieser Abwandlung
wird der Druck schnell gesteigert (z. B. in weniger als 5 Sekunden
oder weniger als 1 Sekunde) auf einen sehr hohen Maximaldruck (z.
B. 100.000 psi [690 MPa] oder höher)
und nur kurz auf einem hohen Druck gehalten (z. B. weniger als 5
Sekunden). Der Druck und die Zeit sind gewählt, um einen hohen Grad der Mikrobeninaktivierung
zur Verfügung
zu stellen, allerdings ist die Zeit kurz genug, dass Proteine, die
durch die erhöhten
Druckbedingungen denaturiert wurden, keine Zeit haben, um zu einem
ausreichenden Maß in
irreversible Komplexe zu aggregieren, bevor sie sich in ihre natürliche Form
zurückfalten.
Der Druck wird dann schnell entlassen (z. B. in weniger als 5 Sekunden
oder weniger als 1 Sekunde). Die Inaktivierung von Mikroben, wie
Viren, kann zu einem wesentlich größerem Maß fortschreiten als die irreversible
Aggregation oder Denaturierung von Proteinmolekülen.
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Die Durchführung der Druckzyklisierung
bei geringer Temperatur kann weiterhin die Zurückbehaltung von aktiven Proteinen
verbessern, durch Verlangsamung der Aggregationsrate und Steigern
der Proteinrückfaltungsrate.
Unter bestimmten Bedingungen bei hohem Druck und geringen Temperatur
(z. B. 100.000 psi [690 MPa] und –20°C) kann sich Hochdruck-Eis (d.
h. Eis V oder Eis VI) bilden. Proteine, die in der Gitterstruktur
von Hochdruck-Eis gefangen sind, können weniger wahrscheinlich
aggregieren. Das Hochdruck-Eis
benötigt
eine bestimmte Zeit, um zu schmelzen, dies kann für die Proteine
in dem Material ausreichend sein, um zurückzufalten, während sie
in der Festphase gefangen sind. Der Zusatz von Glukose kann auch
die Proteinfaltungsrate steigern.
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Es wurde auch gezeigt, dass Druck
die Aktivität
von zahlreichen Enzymen steigert. Beispielsweise wird Rnase-Aktivität durch
erhöhten
hydrostatischen Druck beschleunigt. Diese Wirkung kann in Verbindung mit
den neuen Verfahren zur Inaktivierung von Viren ausgenutzt werden.
RNA-Viren sind nach Hochdruckbehandlung leicht abzubauen.
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Bluttransfusion
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Die neuen Verfahren können verwendet
werden, um die Sicherheit von Bluttransfusionen zu verbessern. Plasmaproteinprodukte,
wie intravenöses
Immunglobulin („IVIg"), Faktoren VII,
VIII, IX, XI und XIII, Albumin, von Willebrand-Faktor, Fibrinogen,
Antithrombin III, Protein C, C1-Inhibitor, Alpha-1-Antitrypsin und
Fibrinabdichtungsstoffe werden beispielsweise von Blutern, Krebspatienten
und Nierendialysepatienten benötigt. Allerdings
können
Viren, die in Blutprodukten vorliegen, ein Risiko für Patienten
darstellen, die solcher Produkte bedürfen. Auch bei Verwendung von
neuen Filtrationstechniken, die viele Zellen eliminieren, können bestimmte
Bakterien und Viren in den Produkten verbleiben.
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Herkömmliches Blutplasma wird isoliert
durch Erhalten einer Blutprobe (z. B. gesammelt in einem Röhrchen,
das ein Antikoagulanz enthält),
Zentrifugieren der Probe in einem Plasmatrennungsröhrchen und Dekantieren
des Plasma von dem Prezipitat in dem Röhrchen. Obwohl dieses Verfahren
das Plasma von der Hauptmasse der Zellen befreit, bleiben einige
Zellen unweigerlich indem Plasma. Wenn die zurückbleibenden Zellen beispielsweise
Bakterien oder Viren einschließen,
können
Krankheiten durch Transfusion verbreitet werden. Die neuen Verfahren
können
mit dem Plasma, das durch das vorstehend beschriebene Dekantierungsverfahren
erhalten wurde, durchgeführt
werden. Die Kontaminanten, die im Plasma zurückbleiben, können durch
die neuen Verfahren inaktiviert werden.
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Sterilisation
von Reagenzien und Medien
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Die neuen Verfahren können auch
verwendet werden, um industrielle Produkte zu sterilisieren. Beispielsweise
wird häufig
Rinderserum in molekularbiologischen Laboratorien für Zellkulturen
verwendet. Mikrobielle Kontamination von Quellen-Lagermaterial der
Versorger tritt selten auf; wenn es jedoch passiert, können die ökonomischen
Kosten und die zeitlichen Verzögerungen
häufig
erheblich sein. Die gegenwärtigen
Verfahren zur Sterilisation von fötalem Kälberserum (z. B. Hitze oder
Filtration) können
funktionell wichtige Proteine (z. B. Wachstumshormone) inaktivieren
und auch Schwankungen von Lieferung zu Lieferung verursachen. Darüber hinaus,
auch wenn das Quellen-Lagermaterial ursprünglich steril ist, kann es
versehentlich nach Öffnen
in dem Labor kontaminiert werden. Die neuen Verfahren können entweder
in einem Produktionsverfahren (z. B. Charge oder kontinuierlich)
verwendet werden oder in individuellen Laboren zur Vorbehandlung
von Serum oder anderen Medien vor dem Begin eines Experiments.
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Vakzin Produktion
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Vakzine werden typischerweise durch
Durchführung
einer Inaktivierungsbehandlung einer Lösung kultivierten Viren hergestellt
(z. B. Erhitzen, oder Zusetzen und Entfernen von chemischen Denaturierungsmitteln).
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Ein erfolgreiches Vakzin-Herstellungsverfahren
sollte Idealerweise in einem hohem Grad der viralen Inaktivierung
resultieren, sollte es jedoch dem Produkt erlauben, seine Fähigkeit,
eine schützende
Immunantwort in dem Patienten zu stimulieren, beizubehalten. Hochdruckverfahren
sind gut geeignet, um die Kriterien zu erfüllen, die für eine erfolgreiche Vakzinproduktion
benötigt
werden: Da kalte, druck-denaturierte Proteine eine Struktur beibehalten,
die der nativen Struktur ähnlicher
ist, als erhitzte oder chemisch denaturierte Proteine, könne druckinaktivierte
Viren somit immunogener sein. Druckdenaturierte Proteine aggregieren
auch weniger wahrscheinlich, wodurch höhere Erträge des Vakzins zur Verfügung gestellt
werden. Das hier beschriebene Druckinaktivierungsverfahren kann ökonomisch
in einem großen
Maßstab
durchgeführt
werden, da es im Wesentlichen keine Chemikalien zuzusetzen oder
zu entfernen gibt und im Gegensatz zur Hitze kann Druck schnell
durch eine große
Probe übertragen
werden.
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Die spezifischen Bedingungen, die
zur Vakzinproduktion notwendig sind, können variieren abhängig von
der bestimmten Mikrobe, die inaktiviert werden soll. Beispielsweise
kann im Fall von sporenbildenden Organismen optional eine Vorbehandlung
mit geringem Druck und gemäßigter Temperatur
(z. B. 10.000 psi [86,9 MPa] und 40°C) angewendet werden, um die
Sporen zu veranlassen, zu keimen. Die gekeimten Sporen können dann
durch die erfindungsgemäßen Verfahren
inaktiviert werden.
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Druckverstärkte Fotosensibilisierung
von Nukleinsäuren:
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Es wurde ein Verfahren zur Sterilisation
beschrieben, wobei das Produkt, das sterilisiert werden soll, mit
einem chemischen Agens gemischt wird, das vorzugsweise an DNA oder
RNA bindet und mit der Nukleinsäure
reagiert (Radosevich, „Seminars
in Thrombosis and Hemostasis," Bd.
24, Nr. 2, Seiten 157–161, 1998).
In einigen Fällen
wird Licht verwendet, um die chemische Gruppe zu aktivieren. Nachteile
eines solchen Verfahrens können
begleitenden Schaden an den gewünschten
molekularen Bestandteilen des zu sterilisierenden Produkts einschließen (z.
B. durch nicht-spezifische Reaktion mit Chemikalien oder durch Bestrahlung oder
durch unvollständige
oder langsame Penetration der inaktivierenden Chemikalie in das
Innere der Mikrobe). Die Anwendung von erhöhten Drücken kann im Wesentlichen diese
Problem überwinden
durch Permeabilisierung von Zellen und Viren, um den Eintritt von
inaktivierenden Chemikalien zu ermöglichen. Erhöhte Drücke können auch
die Affinität
und Selektivität
der Moleküle
für Nukleinsäuren erhöhen, wodurch
die Verwendung von geringeren chemischen Konzentrationen und geringeren
Mengen der Bestrahlung ermöglicht
wird. Somit wird ein schnelleres, weniger teures und effizienteres
Verfahren erhalten.
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Eine Vorrichtung zur Ausführung des
fotochemischen Verfahrens kann ein Hochdruck-Durchflusssystem, wie beschrieben in
PCT-Anmeldung US96/03232, einschließen, das eine Reaktionskammer
hat, die wenigstens ein druckbeständiges Fenster einschließt, das
aus einem Material, wie Quarz oder Saphir, hergestellt sein kann,
und eine Vorrichtung zur Bestrahlung des Materials durch das Fenster.
Der Flüssigkeitsfluss
ist so, dass das ganze Material den bestrahlten Bereich passiert.
Das Material kann dann antiseptisch gesammelt werden. Das Material
kann in einer Reaktionskammer eingeführt werden bei Hochdruck oder
bei geringem Druck und dann vor der Bestrahlung druckbehandelt werden.
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Chemische
Inaktivierung von Viren
-
Eine Vielzahl von Chemikalien (z.
B. Jod, Ethylenimin, Ascorbinsäure,
Thiophosphoamid, Kongorot, Paraformaldehyd) kann verwendet werden,
um Lösungen,
die labile Proteine enthalten, zu sterilisieren. Allerdings kann
die Verwendung dieser Chemikalien negative Wirkungen haben, einschließlich langsamer
Inaktivierung, einem Potential für
Proteinschädigung,
oder die Unfähigkeit
von Verbindungen, in das Innere der Mikrobe zu gelangen. Erhöhter Druck
kann die Sterilisierungsaktivität
dieser Chemikalien erhöhen,
ohne die negativen Wirkungen zu verschlimmern (z. B. durch Steigern
der Wirksamkeit der Chemikalien gegen hitzestabile, nicht-verkapselte
Viren, wie das Parvovirus und Hepatitis A Virus).
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Stabilisierung
von Proteinen und Enzymen
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In einigen Fällen kann es wünschenswert
sein, eine Lösung
zu sterilisieren oder ein anderes Material, das ein unstabiles Protein
enthält,
das irreversibel denaturiert werden würde bei dem Druck, der notwendig
ist, um das vorstehend beschriebene Sterilisationsverfahren durchzuführen. In
diesen Fällen
kann ein Stabilisierungsagens (z. B. Aminosäuren, wie Glycin oder spezifische
Liganden von Proteinen in dem Gemisch, Liganden der Proteine, die
gewonnen werden sollen oder Zucker, wie Glyzerin, Xylose oder Glukose)
zu dem Material vor der Druckbehandlung zugesetzt werden. Beispielsweise
können
die Stabilisatoren des humanen Serumalbumins Caprylat und Acetyltryptophanoat
Blutplasmaproben zugesetzt werden und die Plasmaproben können dann
dem Tieftemperatur-Drucksterilisationsverfahren
ohne übermäßige Destabilisierung
von spezifischen Plasmaproteinen unterworfen werden. Der Stabilisator
kann dann durch Standardverfahren (z. B. Dialyse, Filtration, Chromatographie)
entfernt werden.
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Druckbehandlung
von infektiösen
Materialien
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Hydrostatischer oder pulsierender
Druck kann ein nützliches
Werkzeug zur Sterilisierung, Zell- und Viruszerstörung und
Nukleaseinaktivierung sein für
Materialien, die potentiell Agenzien infektiöser Erkrankungen enthalten.
Vielmehr rufen allgemeine Sicherheitsüberlegungen nach der Verhinderung
von Infektionen der Personen, die das Material handhaben und der
Verhinderung von Kontamination von anderen Materialien. Ein Weg,
um solche Kontamination zu verhindern, ist die Verwendung einer
Sterilisierungslösung
(z. B. 10% CLOROX®-Bleiche; 70% Ethanol;
konzentrierter Harnstoff; oder ein Guanidinumsalz) oder ein oxidierendes
Agens als Druckbehandlungsmedium.
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Beispielsweise kann das Material
in einen geschlossenen und flexiblen Behälter gebracht werden, der dann
in die chemische Sterilisierungslösung untergetaucht werden kann.
Die Lösung
kann dann innerhalb eines zweiten, chemisch inerten Behälters verschlossen
sein (d. h., um es vom Kontakt mit Metallteilen auf der Innenseite
einer Druckkammer abzuhalten). Das inerte Druckbehandlungsmedium
kann dann verwendet werden, um das Volumen zwischen der Innenseite
der Druckbehandlungskammer und dem Behälter, der das Material und
die sterilisierende Lösung
hält, zu
füllen.
Der Container, der die Sterilisierungslösung hält, kann beispielsweise ein
Plastikbeutel, ein Schraubverschluss-Plastikbehälter, eine verschlossene Spritze
oder eine Schrumpfverpackung sein.
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Die Erfindung wird weiter in den
folgenden Beispielen beschrieben, die den Rahmen der Erfindung, die
in den Ansprüchen
beschrieben wird, nicht einschränken.
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Beispiele
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Beispiel 1: Deaktivierung
des Lambda Phagen durch Tieftemperatur-Druckverfahren
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Für
jeweils 4 Proben wurde 2,5 μl
Lambda Phagen Stock (5 × 1011 pfu/ml) 100-fach durch Zusatz von etwa
248 μl Kälberserum
verdünnt.
Ein Fünftel
der 2,5 μl
Lambda Phagen Stock Probe wurde 100-fach in Suspensionsmedium verdünnt. Zwei
Phagen Serum Proben (250 μl)
wurden gefroren durch Untertauchen von Röhrchen in einem ethanol-trockenen
Eisbad; drei andere Proben wurden auf Eis gebracht.
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Eine der gefrorenen Phagen Serum
Proben wurde zyklisiert zwischen 36.000 psi [248,4 MPa] (30 Sekunden)
und 14,7 psi [0,101 MPa] (30 Sekunden) für 5 Minuten. Während der
Druckbehandlung wurde die Temperatur dieser Probe bei –10°C gehalten.
Die zurückbleibende
gefrorene Probe wurde bei 14,7 psi [0,101 MPa] während des Experiments als Kontrolle
gehalten. Bei der Wiederholung dieses Experiments wurde eine Trockeneisprobe
auf –10°C für 5 Minuten
erwärmt.
Eine dritte Phagen Serum Probe wurde unter Druckgesetzt auf 36.000
psi [248,4 MPa] für
10 Minuten bei 23°C.
Die zwei zurückbleibenden
Proben, die als Positivkontrollen verwendet wurden, waren eine Phagen
Serum Probe, inkubiert bei 23°C
für 10
Minuten ohne Druckbehandlung und ein Phagen Suspensionsmedium (d.
h. 0,0496 M Natriumchlorid, 4,06 mM Magnesiumsulfat, 50 mM Tris
Cl pH 7,5 und 1,0 g/l Gelatine) mit jeweils weder Druck- noch Temperaturbehandlung.
Nach der Druckbehandlung wurden 102-, 104- und 106-fach Verdünnungen
von Phagenproben in Suspensionsmedium hergestellt.
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Eine Kultur von Ampicillin-resistenten
E. coli wurde bis zur Sättigung
in Lambda Broth (d. h. 10 g/l Trypton, 0,042 M Natriumchlorid),
0,2% Maltose und 10 mM Magnesiumsulfat (Current Protocols in Molecular
Biology, Seite 1.11.1) wachsen gelassen.
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Um Infektion zu induzieren, wurden
100 μl der
Phagenprobe 300 μl
der E. coli-Kultur, die vorstehend präpariert wurde, zugesetzt, und
die Kultur wurde für
10 Minuten bei 37°C
inkubiert. 2,5 ml Lambda Top Agar (d. h. 10 g/l Trypton, 42 mM Natriumchlorid,
7 g/l Agar) wurde jedem Phagen-E.-coli Gemisch zugesetzt, gevortext
und sofort auf Lambda-Platten ausgebreitet (d. h. 10 g/l Typton,
0,042 M Natriumchlorid, 10.0 g/l Agar in 90 mm Petrischalen).
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Nach Inkubation der Platten für 16 Stunden
bei 37°C
wurden die Lambda-Plaques entweder gezählt oder, für Platten mit hoher Konfluenz,
der gesamte Oberflächenbereich,
der mit Plaques bedeckt war, eingeschätzt. Die plaquebildenden Einheiten
pro Milliliter (pfu/ml) wurden berechnet durch Multiplizieren des
Verdünnungsfaktors
mit der Anzahl der Plaques, die auf jeder Platte erschienen.
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Die plaquebildende Aktivität von Lamda-Phage
wurde um 5 Größenordnungen
reduziert durch abwechselnden hydrostatischen Druck bei –10°C. Man fand,
dass die Dichte der gefrorenen, druck-zyklisierten Probe 9,4 × 105 pfu/ml war, während die der gefrorenen, nicht-druckbehandelten
Kontrolle 3,2 × 1011 pfu/ml war. In einem zweiten Experiment
wurde die plaquebildende Aktivität
von 9 × 1010 pfu/ml auf 6,4 × 104 pfu/ml nach
abwechselnder Druckbehandlung reduziert. Im Gegensatz zu den gefrorenen
Proben lag dort nur eine 3-fache
Verringerung der plaquebildenden Aktivität in den Raumtemperaturproben
vor. Die Probe, die bei 36.000 psi für 5 Minuten bei 23°C gehalten
wurde, erreichte 1,2 × 1011 pfu und die Kontrolle, die bei 14,7 psi gehalten
wurde, hatte 3,1 × 1011 pfu.
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Serum hatte eine sehr geringe, wenn überhaupt
eine Wirkung auf plaquebildende Aktivität. Es waren 50 × 1011 pfu in der Probe, die in Suspensionsmedium
verdünnt
war und die Probe, die 100-fach in Serum verdünnt war, verringerte nur auf
3,1 × 1011 pfu. Nur einmaliges Einfrieren bei Atmosphärendruck
(14,7 psi) hatte offensichtlich keine Wirkung auf die plaquebildende
Aktivität.
Es waren 3,2 × 1011 pfu in der gefrorenen Probe und 3,1 × 1011 pfu in der Probe, die bei Raumtemperatur
inkubiert wurde (23°C).
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Beispiel 2: Wirkung von
Pulsationsfreguenz auf virale Inaktivierung.
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Ein Experiment wurde durchgeführt, um
die Wirkung von Pulsationsfrequenz auf die Inaktivierung von Lambda-Bakteriophage
in Serum zu bestimmen.
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Eine Serumprobe wurde mit dem Virus
inokuliert und wie in Beispiel 1 behandelt, jedoch mit variierenden
Frequenzen der Pulsation und einem maximalen Druck von 40.000 psi
[275,8 MPa]. Alle Proben wurden bei –6°C behandelt und die Gesamtzeit
der Behandlung für
alle Proben war 15 Minuten und die Zeit, die bei hohen und geringen
Drücken
verbracht wurde, war 7,5 Minuten in jedem Experiment. Das Experiment
wurde zweifach ausgeführt
für jeden
Satz der experimentellen Bedingungen. Die viralen Titer wurden wie
in Beispiel 1 gemessen.
-
Ein paralleles Experiment wurde durchgeführt an einem
Modell eines therapeutischen Proteins, um zu sehen, ob seine Aktivität aufrecht
erhalten wurde. Antifluoreszein-Ziegen-IgG (Chemicon International; Tecuma,
CA) wurde hergestellt in einer Konzentration von 4 mg/ml in 5% Glukose
und 0,3% NaCl. Die Lösung
wurde dann der gleichen Behandlung wie in dem bakteriophagen Inaktivierungsexperiment
unterzogen und untersucht durch Messen der Fähigkeit, die Fluoeszenz einer
50 nM Lösung
Fluoeszein zu quenschen. Die folgenden Daten wurden erhalten:
-
-
Dieses Experiment zeigt, dass die
Pulsation von Druck bei geringer Temperatur eine signifikante Wirkung
auf die Rate der viralen Inaktivierung haben kann und nützlich sein
kann in der Produktion von therapeutischen und diagnostischen Blutprodukten.
Das Verfahren kann unter Bedingungen des Drucks und der Temperatur
arbeiten, die in Übereinstimmung
sind mit hoher Rückgewinnung
und richtig gefalteten therapeutischen Proteinen und kann wirksam
gegen viele Typen von Viren sein.
-
Beispiel 3: Beschleunigung
der Nukleaseaktivität
in einem hyperbarischen Sterilisationsverfahren
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Adultes Rinderserum wird auf 50%
(v/v) mit Wasser verdünnt
und auf 0°C
abgekühlt.
Vier Aliquots des Serums werden in 250 μl Mikrozentrifugenröhrchen verteilt,
so dass 25 μl
Luft in jedem Röhrchen
vorliegen. Die Röhrchen
werden auf Eis gehalten bis zur Verwendung. 2 μg pUC19-Plasmid-DNA und 2 μg Hefe Gesamt RNA
(Sigma) in 5 μl
50 mM Tis-Puffer, pH 8,0, werden jeder Probe zugesetzt zu geeigneter
Zeit. 5 μl
Wasser werden vor der Druckbehandlung zu Probe #4 gegeben. Die Reaktionen
werden durch Zusatz von 10 mM Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexen gestoppt
und durch Platzieren der Proben auf Eis. Die Behandlung dieser Proben
ist wie folgt:
- Probe #1: Kontrollprobe (d.
h. nur Nukleinsäuren).
In dieser Probe werden die Vanadylribonukleoside vor den Nukleinsäuren zugesetzt.
- Probe #2: Serum und Nukleinsäuregemisch,
inkubiert bei 25°C
für 10
Minuten. Die Reaktion wird sofort, wie vorstehend beschrieben, gestoppt.
- Probe #3: Serum und Nukleinsäuregemisch,
druckbehandelt auf 60.000 psi bei 25°C für 10 Minuten. Die Reaktion
wird, wie vorstehend beschrieben, gestoppt.
- Probe #4: Serum, druckbehandelt auf 60.000 psi bei 25°C für 10 Minuten;
die Nukleinsäuren
werden zugesetzt, das Gemisch wird für 10 Minuten inkubiert und
die Reaktion wird, wie vorstehend beschrieben, gestoppt.
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Alle Proben werden mit einem gleichen
Volumen Phenol-/Chloroform-/Isoamyl-Alkoholgemisch extrahiert, um Proteine
zu entfernen, gefolgt von Präzipitation
der Nukleinsäuren
in 70% Ethanol. Das Nukleinsäurepellet
wird dann wieder gelöst
in 20 μl
TE-Puffer. 10 μl der resultierenden
Lösung
wird auf ein 0,8%-iges Agarosegel zur Elektrophorese geladen. Nach
der Elektrophorese wird DNA durch Ethidiumbromidfluoreszenz sichtbar
gemacht. 5 μl
der zurückbleibenden
Probe werden quantifiziert unter Verwendung von PicoGreen- und Ribogreen-Farbstoffen
(Molecular Probes).
-
Proben #3 und #4 zeigten beide gesteigerte
Degradation im Vergleich zu Probe #2. Die Nukleinsäuren in
Probe #4 werden mehr degradiert als die Nukleinsäuren in Probe #3. Diese Ergebnisse
zeigen, dass Druck Blutnukleasen sowohl durch direkte Stimulierungsaktivität als auch
durch Entlassungsinhibitoren beschleunigen kann.
-
Beispiel 4: Druck- und
temperaturinduzierte Inaktivierung von Saccaromyces cerevisiae
-
Saccaromyces cerevisiae wurde in
YPD-Flüssigmedium
(1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Dextrose) wachsen gelassen, bis die
Kulturen eine Dichte von 2 × 106 Zellen/ml erreichten. Die S.-cerevisiae-Proben
wurden dann 1 : 10 in Kälberserum
verdünnt
und dann verschiedenen Drücken
und Temperaturen unterworfen.
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Zunächst wurde die Temperatur während eines
Druckbehandlungsverfahrens konstant bei 23,8°C gehalten. Eine Probe wurde
bei 36.000 psi (248,4 MPa] für
10 Minuten bei 23,°C
gehalten. Eine zweite Probe wurde zwischen 36.000 psi [248,4 MPa]
und 14,7 psi [0,101 MPa] zyklisiert bei 30 Sekundenintervallen für 10 Minuten
bei 23,8°C.
Der Druck und die Temperatur wurden jeweils konstant gehalten bei
14,7 psi [0,101 [MPa] und 23,8°C
für eine
dritte Probe als Positivkontrolle.
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Bei den nächsten drei Proben wurde die
Temperatur reduziert, während
gleiche Druckbehandlungen durchgeführt wurden. Somit wurde eine
vierte Probe auf –3,6°C abgekühlt und
dann bei 36.000 psi [248,4 MPa] für 10 Minuten druckbehandelt.
Eine fünfte
Probe wurde auch auf –3,6°C abgekühlt und
dann 10 Zyklen des Drucks abwechselnd zwischen 36.000 psi [248,4
MPa] und 14,7 psi [0,101 [MPa] bei 30 Sekundenintervallen unterworfen.
Als eine positive Kontrolle wurde eine sechste Probe auf –3,6°C abgekühlt, wurde
jedoch nicht der Druckbehandlung unterworfen.
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Nach den notwendigen Druck- und Temperaturbehandlungen
wurden alle Proben um die Faktoren 10, 100 und 1.000 verdünnt, verteilt
auf LPD-Platten (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Dextrose, 1,5% Agar)
und wachsen gelassen bei 32°C
für 24
Stunden. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (cfu) wurde berechnet durch
Multiplizieren der Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor.
-
Eine ausgeprägte Inaktivierung von Saccaromyces
cerevisiae durch Druckbehandlungen wurde sowohl bei 23,8°C als auch
bei –3,6°C beobachtet.
Die koloniebildende Aktivität
der druckbehandelten Probe lag im Bereich von 1 × 102 cfu
bis 5,6 × 103 cfu bei den druckbehandelten Proben. Die
positiven Kontrollen lagen in der koloniebildenden Aktivität von 1,1 × 105 cfu bis 9,2 × 105 cfu.
Somit wurde die koloniebildende Fähigkeit von Saccaromyces cerevisiae
um etwa 2 bis 3 Größenordnungen
verringert.
-
Beispiel 5: Druck- und
temperaturinduzierte Inaktivierung des Moloney Murine Leukämie-Virus
-
Ein retroviraler Vektor, pLNCX, enthaltend
Phi+ (das verlängerte
virale Verpackungssignal) und einen Neomycin-Resistenzmarken (Neor), jedoch ohne virale Strukturgene, wurde
in Verbindung mit einer Verpackungszelllinie, NIH-Cyt2, verwendet.
Die NIH-Cyt2-Zellen exprimierten die gag-, pol- und env-viralen
Strukturgene, die notwendig sind für Partikelbildung und Replikation,
jedoch nicht das RNA-Verpackungssignal Phi+. Somit erzeugten der
pLNCX-Vektor und die NIH-Cyt2-Zelllinie zusammen infektiöse, replikationsinkompetente
Partikel, die strukturell identisch zum Moloney Murine Leukämie-Virus (MMLV) sind.
Diese infektiösen MMLV-Partikel
enthalten RNA, die den pLNCX-Vektor kodiert.
-
MMLV-infektiöse Partikel, suspendiert in
DMEM mit 10% Kälberserum
(CS) werden bei 4°C
und 14,7 psi gehalten mit Ausnahme während der Druck- und Temperaturbehandlungen,
die nachstehend beschrieben sind. Hydrostatischer Druck für eine Probe
wird zwischen 35.000 psi [241,5 MPa] und 14,7 psi [0,1 MPa] bei 30
Sekunden in Intervallen zyklisiert, während die Temperatur bei 2°C gehalten
wird. Als eine positive Kontrolle wird die Temperatur einer zweiten
Probe bei 2°C
für 10
Minuten bei 14,7 psi [0,1 MPa] gehalten. Eine dritte Probe wird
zwischen 35.000 psi [241,5 MPa] und 14,7 psi [0,1 MPa] bei 30 Sekundenintervallen
bei – 10°C zyklisiert.
Eine vierte Probe wird bei 35.000 psi (241,5 MPa] für 5 Minuten
bei –10°C gehalten.
Als eine positive Kontrolle wird eine fünfte Probe in Trockeneis eingefroren
und dann auf –10°C für 5 Minuten
erwärmt.
-
Die Proben werden Schälchen mit
NIH-Cyt2-Zellen zugesetzt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, um
die Zellen mit dem retroviralen Vektor pLNCX zu transfizieren. Als
eine Negativkontrolle wird eine Platte der Zellen pseudotransfiziert
(mock-transfected) mit viral freiem DMEM-CS. Die Zellen werden DMEM
mit 10% Kälberserum
und in G418 wachsen gelassen, was es nur Zellen mit Neor erlaubt,
zu wachsen und somit auf stabile Transformanden selektiert. Nach
einem Zeitraum von 10 Tagen werden die Schälchen mit PBS gespült, mit
Methylen blau gefärbt,
wieder mit PBS gefärbt
und dann werden die Kolonien gezählt.
Der virale Titer, exprimiert in koloniebildenden Einheiten (cfu)
wird berechnet durch Multiplizieren des Verdünnungsfaktors mit der Anzahl
der Kolonien.
-
Beispiel 6: Druckzyklisierungsinaktivierung
von Escherichia coli-inokuliertem Serum
-
Eine Kultur eines Ampicillin-resistenten
E.-coli-Stamms in LB/amp-Medium (Luria broth, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin)
wurde bis zur Sättigung
wachsen gelassen. Eine Probe adultes Rinderserum (Sigma) wurde mit
30 μl E.-coli-Lösung pro
ml Serum inokuliert. Aliquots (280 μl jeweils) des inokulierten
Serums wurden in neun Mikrozentrifugenröhrchen gebracht. Die Proben
in den neun Röhrchen
wurden den folgenden experimentellen Bedingungen unterworfen:
Probe
1 wurde unbehandelt gelassen als Kontrolle.
Probe 2 wurde bei
Umgebungsdruck gehalten (d. h. etwa 14,7 psi [0,101 MPa], während die
Temperatur zwanzig Mal zwischen etwa –17°C und Raumtemperatur zyklisiert
wurde (d. h. etwa 25°C) über 20 Minuten.
Proben
3–6 wurden
auf –15°C bei Atmosphärendruck
abgekühlt.
Die Proben wurden für
2 Minuten stehengelassen, um sicherzustellen, dass sich ein thermales
Gleichgewicht einstellt. Die Proben wurden dann Druckzyklen bei
einer Rate von etwa 30 Sekunden/Zyklus oder 2 Hz unterworfen. Probe
3 wurde zehnmal zwischen etwa 14,7 psi (0,101 MPa] und etwa 15.000
psi (103,5 MPa] über
5 Minuten zyklisiert; Probe 4 wurde 10 zehnmal zwischen etwa 14,7
psi [0,1 MPa] und etwa 35.000 psi [241,5 MPa] über 5 Minuten zyklisiert; Proben
5 und 6 wurden zwanzig Mal zwischen etwa 14,7 psi [0,1 MPa] und
etwa 35.000 psi [241,5 MPa] über
10 Minuten zyklisiert.
Probe 7 wurde zwanzig Mal zwischen etwa
14,7 psi [0,1 MPa] und etwa 35.000 psi [241,5 MPa] bei Raumtemperatur über 6 Minuten
40 Sekunden zyklisiert.
Proben 8 und 9 wurden statischer Druckbehandlung
für 2,5
Minuten unterzogen; Probe 8 wurde bei Raumtemperatur druckbehandelt
und Probe 9 wurde bei –15°C druckbehandelt.
-
Verdünnungen der Proben wurden in
LB/ amp-Medium hergestellt und die Proben wurden plattiert. Koloniebildende
Einheiten pro Milliliter (CFU/ml) sind nachstehend gezeigt zusammen
mit Log-Reduktionen (d. h. im Verhältnis zur Kontrolle):
-
-
Somit war die wirksamste Behandlung
gemäß Probe
#7, Zyklisieren auf 35.000 psi bei etwa 25°C. Die Ergebnisse weisen darauf
hin, dass das Zyklisieren wirksamer war als statische Druckbehandlung
bei der gleichen Temperatur (vgl. Probe #8).
-
Beispiel 7: Sterilisation
von E.-coli-kontaminierten Nadeln
-
Zwei 20G-Nadeln wurden abgeschnitten,
was 3 mm des Metallschafts an der Plastikbefestigung zurückließ. Es wurden
Röhrchen
konstruiert durch Abschneiden der Enden des Plastikschafts von einer
3 ml Spritze und Verstopfen jedes Endes mit den Gummianteilen von
zwei Kolben. Ein ml einer Über-Nacht-Kultur von
E. coli wurde durch jede Nadel gegeben. Jede Nadel wurde in ein
Röhrchen
mit 1 ml Luria-Broth-(LB)-Medium gegeben. Es blieben etwa 0,2 ml
Luft oben in jedem Röhrchen.
-
Ein Röhrchen wurde 10 Zyklen der
Druckbehandlung (jeder Zyklus schloss 30 Sekunden bei 37.000 psi
[255,3 MPa] ein, gefolgt von 30 Sekunden bei 14, psi [0,101 MPa])
bei 22,2°C
unterworfen. Das zweite Röhrchen
wurde in die Druckkammer für
10 Minuten bei 22,2°C
gegeben, wurde jedoch nicht der Druckbehandlung unterzogen.
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Nach der Druckbehandlung wurden die
Nadeln aus den Röhrchen
entfernt und 0,2 ml LB wurde durch jede Nadel gegeben. Die Hälfte der
0,2 LB wurden auf eine LB-Platte verteilt. Die zurückbleibenden
0,1 ml LB wurden verdünnt
(1 : 10, 1 : 100, 1 : 1.000 und 1 : 10.000) und auf 4 LB-Platten
verteilt. Alle Platten wurden über
Nacht bei 37°C
wachsen gelassen. Die Kolonien wurden auf jeder Platte gezählt und
die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (cfu) in jeder LB-Probe
wurde berechnet.
-
Es wurde ein dramatischer Unterschied
in der koloniebildenden Aktivität
des LB-Mediums beobachtet, das durch die behandelten und unbehandelten
Nadeln gegeben wurde. Es waren 10 cfu in den 0,2 ml, die durch die
druckbehandelte Nadel gegeben wurde, wohingegen 9,2 × 105 cfu in dem LB vorlagen, das durch die unbehandelte
Nadel gegeben wurde, fast ein 100.000-facher Unterschied.
-
Beispiel 8: Druckschock-Sterilisierung
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Als ein Modell für pathogene Viren wird frisch
gefrorenes Plasma mit 108 plaquebildenden
Einheiten (pfu) pro ml Lambda-Bakteriophage, stabilisiert mit 10%
Glukose und 3 mM Natriumcaprylat, versetzt. Das Plasma wird dann
in ein Hochdruckgefäß, das 50%
Ethylenglykol als ein Druckübertragungsmedium
enthält gegeben
und die Temperatur wird auf –10°C eingestellt.
Der Druck wird dann auf 150.000 psi über einen Zeitraum von 1 Sekunde
gesteigert und bei diesem Druck für 1 zusätzliche Sekunde gehalten. Der
Druck wird dann über
einen Zeitraum von 2 Sekunden entlassen. Die Plasmaprobe wird entfernt
und Verdünnungen
werden auf E.-coli Rasen plattiert. Es wurde festgestellt, dass
die Plasmaprobe im Wesentlichen frei von infektiösem Virus ist. Die Plasmaproteine
werden durch verschiedene Verfahren, einschließlich HPLC, IgG-Antigenbildung,
Fluoreszenzverstärkung
von Dansylsarkosin durch HSA und Gerinnungsassays (einschließlich dem
aktivierten Partikel-Thromboplastin-Zeitassay, APTT) analysiert,
um die Integrität
des Gerinnungsfaktors einzuschätzen.
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Beispiel 9: Druckverstärkte fotochemische
Inaktivierung von Viren
-
Eine Probe Rinderserum wird mit 108 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro ml
Lambda-Bakteriophage inokuliert.
0,15 mM Psoralen wird zugesetzt. Die Probe wird in drei Aliquots
aufgeteilt. Die drei Proben werden wie folgt behandelt:
- (1) keine weitere Behandlung
- (2) Druckbehandlung auf 30.000 psi [206,8 MPa]
- (3) Druckbehandlung auf 30.000 psi [206,8 MPa] und gleichzeitiges
Aussetzen gegenüber
UV-Licht für
10 Minuten.
-
Alle Proben werden bei einer Temperatur
von 25°C
während
des Experiments gehalten. Die Behandlung mit Druck und Licht wird
erreicht durch Laden der Probe in eine Quarzflasche mit einem Polyethylendeckel.
Die Flasche wird in eine Ethanol-gefüllte Hochdruck-Spektroskopiezelle
(ISS, Champaign, IL) gegeben und druckbehandelt. Die Proben werden beleuchtet
durch Verbinden eines Fensters der Spektroskopiezelle mit einer
UVA-Lampe in einer festgelegten Entfernung. Nach der Behandlung
wird das Serum serienmäßig verdünnt, mit
E. coli gemischt und auf Agar ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht
bei 37°C
werden die Plaques auf den Platten gezählt, um bei einer relativen
Reduktion des viralen Titers aufgrund der Druckbehandlung und der
Kombination von Druck und Belichtung anzukommen. Man fand, dass
ein signifikant größerer Grad
der vitalen Inaktivierung in Probe #3 beobachtet wurde, verglichen
mit Proben #1 und #2. Das Experiment wird mit geringeren Konzentrationen
Psoralen wiederholt mit dem Ergebnis, dass die Kombination von Druck
und UVA-Licht eine Rate der Inaktivierung ergibt ähnlich zu
der, die durch UVA-Licht
alleine beobachtet wird, wobei sie in weniger Schaden gegenüber therapeutischen
Proteinen resultiert. Ähnliche
Experimente bestätigen, dass
weniger Lichtintensität
oder Zeit der Beleuchtung benötigt
wird, wenn die Probe druckbehandelt wird. Die Experimente zeigen
auch, dass nukleinsäurebindende
Farbstoffe, die in Verbindung mit Sauerstoff wirken (z. B. Methylenblau), ähnliche
Ergebnisse zu denen ergeben, die mit Psoralenen beobachtet wurden.
-
Beispiel 10: Druckverstärkte chemische
Inaktivierung von Viren
-
Eine Probe Rinderserum wird mit 108 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro ml
Lambda-Bakteriophage inokuliert.
Die Probe wird in 4 Aliquots aufgeteilt. Die Proben werden wie folgt
behandelt:
- #1 keine Behandlung
- #2 0,1 mM Jod zugesetzt und inkubiert für 10 Minuten
- #3 0,1 mM Jod zugesetzt und druckbehandelt auf 30.000 psi für 10 Minuten
- #4 Druck von 30.000 psi [206,8 MPa] für 10 Minuten
-
Alle Proben werden bei einer Temperatur
von 25°C
während
des Experiments gehalten. Nach Behandlung wird die Reaktion mit
einem reduzierenden Agens gequenscht und das Serum wird seriell
verdünnt,
mit E. coli gemischt und auf Agar plattiert. Nach einer Über-Nacht-Inkubation
bei 37°C
werden die Plaques auf den Platten gezählt , um bei einer relativen
Reduktion des viralen Titers aufgrund der Druckbehandlung und der Kombination
von Druck und chemischer Behandlung anzukommen. Man fand, dass Probe
#3 signifikant größere Reduktion
im viralen Titer (wie verglichen mit Probe #1) hatte als die Summe
der Reduktionen, die von Probe #2 und #4 beobachtet wurden, was
eine synergetische Wirkung von Druck und Jod zeigt. Ähnliche
Experimente wurden durchgeführt
mit geringeren Konzentrationen chemischer Zusätze und man fand, dass Druck äquivalente
virale Inaktivierung mit geringeren Konzentrationen Jod oder mit
kürzeren
Inkubationszeiten ermöglicht.
-
Beispiel 11: Wirkungen
von Druckzyklisierungsbehandlung auf Gerinnungszeit
-
Humane Plasmaproben (BBI) wurden
mit 10 2-Minuten Druckzyklen bei 40.000 psi [275,8 MPa] und Temperaturen
im Bereich von –70°C bis 20°C behandelt
und eingefroren bei – 70°C bis zur
Verwendung gelagert. Der Assay wurde gestartet durch Zusetzen von
60 μl Plasma,
60 μl APTT-Reagens
(Sigma) (37°C)
und 60 μl
25 mM CaCl2 (37°C) in einer 100 μl Küvette. Die
Absorption wurde bei 550 nm beobachtet und die Gerinnungszeit wurde
aufgezeichnet als Zeit zu einer OD von 0,8 (etwa ½ maximal).
Man fand, dass die Verwendung von niedrigeren Temperaturen eine
dramatische Verbesserung der Gerinnungsaktivität erzeugte.
-
Beispiel 12: Integrität von IgG,
IgM, HSA und fX in Tieftemperatur-Druckbehandlung
-
IgG und IgM. Kommerzielle Zusammensetzungen
(ACCURUNTM, Boston Biomedica Inc.) humaner Plasmakontrollen für Cytomegalovirus-(CMV)
Antikörpertiter
wurden behandelt mit der Druckzyklustechnik und die Fähigkeit
von IgG und IgM, CMV-Antigen zu binden, wurde gemessen unter Verwendung
des Abbott- und Walpole-CMV-Antikörperenzym-Immunassays. Der Assay umfasst Inkubieren
der Probe mit Polysterolkügelchen,
die mit hitzeinaktivierten CMV-Antigen beschichtet sind. Die Kügelchen
werden dann gewaschen und mit Meerrettich-Peroxidase-markiertem
antihumanen Immunglobulin gewaschen. Die Kügelchen werden wieder gewaschen
und inkubiert mit einem chromogenen Substrat, das Farbe entwickelt
in einer Rate, die gebundenen Anti-CMV-Antikörper anzeigt. Verdünnungen
des ACCURUN-Materials zeigen an, dass der Assay linear ist, was
nahe legt, dass jeder Verlust der Aktivität nachgewiesen worden wäre. 260 μl Proben
Accurun wurden equilibriert auf –5°C und mit 10 Druckzyklen, umfassend
1 Minute bei erhöhtem
Druck und 1 Minute bei Atmosphärendruck
behandelt. Maximaldrücke
von etwa 10.000 [68,9 MPa] bis etwa 50.00 psi [345 MPa] wurden verwendet.
Die Proben wurden entfernt und Anti-CMV-Spiegel wurden gemessen.
Kein signifikanter Verlust von IgG- oder IgM-Aktivität wurde
für Drücke bis
zu etwa 50.000 psi [345 MPa] beobachtet.
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HSA. Die Integrität des humanen Serumalbumins
(HSA) wurde bestimmt durch seine Fähigkeit, die Fluoreszenz von
Dansylsarkosin zu verstärken.
Dieser Assay ist empfindlich gegenüber Veränderungen in der Domäne III des
Proteins und gegenüber
dem Gesamtniveau der Aggregation. 40 mg/ml HSA wurden Rinderserum
zugesetzt, das durch einen Mikron 30 Zentrifugationsfilter gefiltert
wurde, um jegliches Rinderalbumin und größere Proteine zu entfernen.
Die Proben wurden Druckpulsation unterworfen mit einem Maximaldruck von
etwa 34.000 psi [234,6 MPa] für
15 Minuten mit verschiedenen Frequenzen der Pulsation bei –5°C. Proteinaktivität wurde
gemessen durch aufeinander folgenden Zusatz von 10 μl Volumen
zu einer 3 ml Lösung
von überschüssigem Dansylsarkosin
in PBS. Die Ergebnisse zeigen an, dass Druckpulsation nützlich für die Proteinintegrität ist.
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Faktor X. um die Wirkung des Tieftemperatur-Druckverfahrens
auf einen enzymatischen Blutfaktor zu testen, wurde ein chromogener
Assay durchgeführt
mit humanen ACD-Plasma, behandelt bei verschiedenen Drücken. Die
verwendeten Bedingungen waren identisch zu denen in dem IgG-Experiment: –5°C, 10 2-Minuten-Zyklen
bei etwa 19.000 psi [131,1 MPa] bis etwa 50.000 psi [345 MPa]. Mehr
als 80% der Faktor X Aktivität blieb
erhalten.
-
Schlussfolgerungen:
-
Diese Daten zeigen, dass Druckzyklisierung
in der Lage ist, eine mehr als 107-Reduktion
des Titers von nicht-umhülltem
Virus in einem 15-Minuten Zeitraum zu reduzieren, sogar IgG-, IgM-,
Faktor-X- und HSA-Aktivitäten
können
gleichzeitig auf akzeptablem Niveau aufrecht erhalten werden. Die
Pulsation von Druck scheint die Beibehaltung der Proteinaktivität zu verstärken.
-
Beispiel 13: Druckzyklisierungsinaktivierung
von Schweine-Parvovirus (PPV) in humanem Plasma bei sehr geringer
Temperatur
-
Schweine-Parvovirus (ATCC) wird in
Schweinetestikel (PT) Zellen durch Infektion bei einer Vielzahl von
Infektionen von 0,1 und Inkubation für 6 Tage vermehrt. Die Zellen
werden durch drei Einfrier-/Auftauzyklen lysiert und die Lösung wird
dann durch Zentrifugation aufgeklart. Der resultierende PVV-Titer
ist etwa 1 × 1010 Infektionsdosen/ml.
-
Stock-PPV wird 1 : 100 in humanem
Plasma verdünnt
und in 260 μl
Volumen in zwei flexible Polyethylen-Mikrozentrifugenröhrchen (Cole
Parmer) verteilt. Ein Röhrchen
wird als „Kontrolle" bezeichnet und das
andere als „experimentell". Die Röhrchen werden
verschlossen mit Dow Corning Silikon Hochvakuumschmierfett und in
PARAFILM® (American
National Can, Menasha, WI) eingewickelt.
-
Die Hochdruckreaktionskammer wird
mit 70% Ethanol und 0,2% Rhodamin B als Indikator (tracer) gefüllt und
auf –40°C abgekühlt. Das
experimentelle Röhrchen
wird in die Hochdruckreaktionskammer für 6 Minuten gebracht, um an
die Temperatur zu equilibrieren und der Druck wird über einen
Zeitraum von 5 Sekunden auf einen Druck von 80.000 psi [552 MPa]
gesteigert. Der Druck wird für
10 Minuten bei 80.000 psi [552 MPa] gehalten und dann über einen
Zeitraum von 2 Sekunden entlassen. Es wird der Temperatur dann für 5 Minuten
ermöglicht,
zu equilibrieren. Dieses Verfahren wird für insgesamt 20 Zyklen wiederholt.
Die Kontrollprobe wird für
die gleiche Zeit bei –10°C inkubiert.
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Die PPV-Titer der Kontroll- und experimentellen
Proben werden bestimmt durch Durchführung einer halb-log seriellen
Verdünnung
in Hanks gepufferter Salzlösung
(HBSS). Jede Verdünnung
wird verwendet, um 6 Vertiefungen einer 96-Vertiefungskulturplate,
enthaltend 50% konfluente PT-Zellen, zu inokulieren.
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Nach Inkubieren der Zellen für 5 Tage
in MEM-Medium, angereichert mit 7,5% fötalem Rinderserum, wird die
Anwesenheit des Virus bestimmt durch Fixierung der Platten in 80%
Aceton für
20 Minuten und Inkubieren jeder Vertiefung mit 50 μl Fluoreszein-konjugiertem
Anti-PVV Antikörper
(VMRD Inc., Pullman WA) für 40
Minuten bei 37°C,
3 mal Waschen mit Wasser und Beobachten mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop. TCID50
wird bestimmt durch das Spearman Karber Verfahren. Man fand, dass
die experimentelle Probe keinen nachweisbaren Virus hat und die
Kontrollprobe hat einen Titer von 108 infektiöse Dosen/ml.
Eine Gerinnungszeitanalyse wird durchgeführt durch ein Einzelstadium-aktivierte
partielle Thromboplastinzeit-(APTT) Messung und man fand, dass die
Gerinnungszeit etwa 30 Sekunden für sowohl die Kontroll- als
auch die experimentellen Proben war, was darauf hinweist, dass das
Plasma geeignet ist für
Reinigung von Blutprodukten und Transfusion.
-
Beispiel 14: Druckzyklisierungsinaktivierung
von Bakterien und Pilzen
-
Verschiedene Spezies von Bakterien
werden Druckzyklisierungsprotokollen unterworfen, um die Rate der
Inaktivierung zu bestimmen. Zweihundertfünfzig Mikroliter Volumen jeder
Spezies wurden in Cole Plamer Polyethylenröhrchen aliquotiert. Die Röhrchen wurden
bei – 70°C eingefroren
und eine Schicht Hochvakuum-Schmierfett wurde oben auf die gefrorene
flüssige
Schicht gegeben. Jedes Röhrchen
wurde dann in eine Schicht PARAFILM® (American
National Can, Menasha, WI) eingewickelt.
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Die folgenden bakteriellen Spezies
wurden getestet: Bacillus cereus ATCC 14579 (ursprünglicher
Titer: 6,6 × 108 cfu/ml), Enterococcus feacium ATCC 49032
(3,3 × 108), zwei Proben Echerichia coli ATCC 43894 (8,6 × 109 und 5,4 × 107),
Pseudomonas aeruginosa ATCC 14502 bei 9,5 × 107 und
Staphylococcus aureus ATCC 9144 bei 9,9 × 107.
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Zehn 2-Minuten Druckzyklen (d. h.
1 Minute bei Umgebungsdruck, 1 Minute bei bis zu 50.000 psi [345 MPa]
wurden bei –10°C mit jeder
Bakterienkultur ausgeführt.
Bestimmte Proben jeder Spezies wurden auch einem 10-minütigem statistischen
Druck bei sowohl etwa 29.000 [200,1 MPa] und etwa 50.000 psi [345
MPa] unterworfen. Jede Probe wurde an die Kammertemperatur für 5 Minuten
vor der Druckbehandlung equilibriert. Die Kammer wurde mit 50% Ethylenglykol
in Wasser gefüllt
und mit 1% Rhodamin versetzt, um zu bestimmen, ob eine der Kammerflüssigkeiten
während
der Druckbehandlung in die Probe leckte. Nach dem Druckzyklisierungsverfahren
wurden die Proben bei –70°C gelagert,
bis sie untersucht wurden.
-
Die Proben wurden untersucht, um
den Titer (cfu/ml) nach dem Druckbehandlungsverfahren zu bestimmen.
Serielle Verdünnungen
wurden hergestellt von Aliquots jeder Probe. Jede Verdünnung wurde
auf 10 ml Festagar plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Der Titer jeder Platte wurde gezählt,
um die Rate der Inaktivierung zu bestimmen (Endtiter). Der ursprüngliche
Titer wurde dividiert durch den Endtiter, um die Reduktion der Mikroben
Anzahl zu bestimmen.
-
Alle gram-positiven und gram-negativen
Bakterien, die untersucht wurden, wurden inaktiviert. Bacillus cereus
wurde durch 5 Logs aktiviert, Enterococus faecium durch 6 Logs,
E. coli durch 7 Logs, Pseudomonas aeroginosa durch 8 Logs, Staphylococcus
aureus durch 6 Logs und Candida albicans durch 5 Logs. Für alle Bakterien
war die Druckpulsation effektiver als der statische Druck. Der dramatischste
Unterschied wurde mit Enterococcus gesehen, der inaktiviert wurde
durch weniger als 1 Log ohne Druckzyklisierung, aber durch etwa 6
Log mit Druckzyklisierung bei 5.000 psi [345 MPa]. Pseudomonas wurde
inaktiviert durch etwa 6 Logs mit Druckzyklisierung und 2,5 Logs
mit statischem Druck bei etwa 29.000 psi (200,1 MPa]. Die Rate der
Pseudomonas-Inaktivierung bei 50.000 psi [345 MPa] mit Druckzyklisierung
war größer als
8 Logs, aber mit statischem Druck blieb sie bei 6 Logs. Die Staphylococcus-Probe
wurde inaktiviert durch 2 und 6 Logs mit jeweils Druckzyklisierung
bei 29.000 psi [200,1 MPa] und 50.000 psi [345 MPa], jedoch nur
1 und 3 Logs mit den gleichen Bedingungen unter statischem Druck.
Der Unterschied in der Rate der Inaktivierung von dem geringen Titer
E. coli bei 29.000 psi [200,1 MPa] war 67-fach mit Zyklisierung
und 6,4-fach mit statischem Druck. Die Rate der Inaktivierung bei
50.000 psi [345 MPa] steigerte sich auf 4 Logs mit Zyklisierung,
jedoch nur auf 2 Logs mit statischem Druck. Der E.-coli Stamm mit
hohem Titer erreichte eine Steigerung von 4 Logs der Inaktivierung mit
Druckzyklisierung, verglichen mit statischem Druck bei sowohl 29.000
psi [200,1 MPa] und 50.000 psi [345 MPa].
-
Druckpulsation erreichte somit eine
Steigerung der Inaktivierung gegenüber statischem Druck für alle Spezies
der getesteten Bakterien mit dem Nutzen der Druckzyklisierung, die
ausgeprägter
bei 50.000 psi [345 MPa] als bei 29.000 psi [200,1 MPa] für alle Spezies
war.
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Beispiel 15: Inaktivierung
von umhüllten
Viren
-
Um die Wirksamkeit von „cryobarer" Behandlung gegen
umhüllte
Viren zu testen, wurden humanes Immundefizienz Virus (HIV-1) und
Herpes simplex Virus (HSV-1) behandelt und ihre Infektiosität gemessen. Bei
dem HIV-Experiment bestand die „cryobare" Behandlung aus 5 Minuten Druckzyklen
bei –10°C. Jeder
Zyklus bestand aus 1 Minute bei hohem Druck und 1 Minute bei Atmosphärendruck.
Eine etwa 6 Log-Reduktion der HIV-Infektiosität wurde erreicht, wenn der
Druck auf 50.000 psi [345 MPa] erhöht wurde. Herpes simplex 1
wurde auch inaktiviert durch 6 Log bei diesem Druck. Die Behandlung
ist kompatibel mit der Beibehaltung der Integrität und Aktivität der meisten
therapeutischen Proteine, wie beispielsweise in Beispiel 21 gezeigt.
-
Beispiel 16: Inaktivierung
von MS2: Statische Druckbedingungen
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MS2-infizierte Plasmaproben wurden
druckbehandelt auf 80.000 psi bei –26°C, dann wurde die Temperatur
gesteigert auf –14°C für 5, 10,
15, 30 und 60 Minuten. Zwei Plasmaproben wurden für jedes
Experiment behandelt, eine mit Phagen für Inaktivierungsuntersuchungen
und eine ohne Phagen zur Faktoranalyse.
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Nach der „cryobaren" Behandlung wurde MS2-Infektiosität untersucht
gemäß dem folgenden
Protokoll. Der Wirt E. coli wurde bis zur Sättigung über Nacht in MS2-Broth (enthaltend
10 g/l Trypton und 42 mM Natriumchlorid), angereichert mit 0,2%
Maltose und 10 mM Magnesiumsulfat wachsen gelassen. Nach der Verdünnung des
behandelten Phagen, wo es notwendig war, wurden 100 μl Phagenprobe
zu 100 μl
E. coli gegeben, bei 23°C
für 20
Minuten inkubiert, dann bei 37°C
für 10
Minuten inkubiert. Das Phagen-E.-coli Gemisch wurde zugesetzt zu
2,5 ml geschmolzenem Top-Agar (10 g/l Trypton, 42 mM Natriumchlorid,
7 g/l Agar, 47°C), gevortext
und sofort auf 90 mm Petrischalen, enthaltend 10 g/l Trypton, 42
mM Natriumchlorid und 10 g/l Agar, ausgebreitet. Nach Inkubation
für etwa
16 Stunden bei 37°C
wurden die Plaques gezählt.
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Die Proben für Faktor-VIII Analysen wurden
bei –70°C gelagert
bis zur Untersuchung. Faktor-VIII Assays wurden durchgeführt mit
dem American Diagnostica Chromagenic Assay-Kit (Greenwich, CT):
-
Die Ergebnisse waren wie folgt, wobei „Inaktivierung" den Titer (in pfu/ml)
für die
unbehandelte Probe darstellt, geteilt durch den Titer für jede gegebene
Probe und „fVIII" den prozentualen
Anteil der Faktor-VIII Aktivität,
die für
jede Probe nach Druckbehandlung übrig
blieb (d. h. im Verhältnis
zur unbehandelten Probe):
-
-
-
Diese Daten zeigen, dass etwa Kinetiken
erster Ordnung für
Faktor VIII Verlust beobachtet wurden, wohingegen MS2-Inaktivierung
relativ unabhängig
von der Inkubationszeit war, was nahe legt, dass die virale Inaktivierung
bei dem ursprünglichen
Puls auf 80.000 psi [552 MPa] bei –26°C auftrat.
-
Beispiel 17: Inaktivierung
von MS2: Temperaturoptimierung
-
In einem Experiment zur Bestimmung
der Optimumtemperatur für
MS2-Inaktivierung wurden die Bedingungen, die in Beispiel 16 angegeben
sind, eingesetzt mit der Ausnahme, dass jede Probe für 5 Minuten an
die korrespondierende Starttemperatur, die in der Datentabelle nachstehend
angegeben ist, equilibriert wurde. Die Proben wurden druckbehandelt
auf etwa 80.000 psi [552 MPa] für
2 Minuten, gefolgt von Druckentlassung und Temperaturequilibrierung
für 5 Minuten.
Der Druckbehandlungszyklus wurde 2 weitere Male wiederholt. Die
Ergebnisse waren wie folgt:
-
-
Diese Daten zeigen signifikante (d.
h. 3 Log) Inaktivierung von MS2 unter Bedingungen (-20°C), die 50%
Wiedergewinnung von fVIII ergeben. Die höheren Temperaturen steigerten
die Inaktivierung von MS2, verringerten jedoch die Wiedergewinnung
von fVIII.
-
Beispiel 18: Inaktivierung
von MS2: Druckoptimierung
-
In einem Experiment zur Bestimmung
des Optimumdrucks für
MS2-Inaktivierung wurden die Bedingungen, die in Beispiel 16 angegeben
sind, eingesetzt mit der Ausnahme, dass jede Probe auf –17°C für 5 Minuten
equilibriert wurde und die Proben zwischen 60.000 und 80.00 psi
[414 MPa und 552 MPa] druckbehandelt wurden, wie nachstehend angegeben.
Die angegebenen Drücke
wurden für
60 Sekunden aufrecht gehalten, gefolgt von Druckentlassung und Temperaturequilibrierung
für 5 Minuten.
Die Zeit zur Druckbehandlung (etwa 3 Sekunden) und Druckentlassung
(etwa 1 Sekunde) sind nicht in der angegebenen Druckbehandlungszeit
eingeschlossen. Die Ergebnisse waren wie folgt:
-
-
Die Daten weisen darauf hin, dass
der optimale Druck unter diesen Temperatur- und Zeitbedingungen etwa
75.000 psi war.
-
Beispiel 19: Inaktivierung
von MS2: Pulsationszeitoptimierung
-
Um die relativen Raten der MS2-Inaktivierung
und des Verlusts von fVIII-Aktivität zu messen als eine Funktion
der Zeit bei erhöhtem
Druck für
jeden Puls, wurden Bedingungen, ähnlich
denen, die in Beispiel 18 eingesetzt wurden, verwendet. Jede Probe
wurde auf –20°C für 5 Minuten
equilibriert. Die Proben wurden druckbehandelt auf etwa 80.000 psi
[552 MPa] und dort zwischen 15 und 120 Sekunden gehalten, wie nachstehend
angezeigt, gefolgt von Druckentlassung und Temperaturequilibrierung
für 5 Minuten.
Der Druckbehandlungszyklus wurde 2 weitere Male wiederholt. Die
Zeiten, die zur Druckbehandlung (d. h. etwa 3 Sekunden) und Druckentlassung
(d. h. etwa 1 Sekunde) benötigt
wurden sind nicht in der angegebenen Druckbehandlungszeit enthalten.
Eine zweite Runde der Experimente wurde durchgeführt mit Druckpulsdauern von
10 bis 120 Sekunden. Die Ergebnisse der zwei Experimente waren wie
folgt:
-
-
-
Diese Daten weisen darauf hin, dass
die Verringerung der Druckpulsdauer auf Zeiten wie 10 Sekunden eine
positive Wirkung auf die Gewinnung von fVIII hat, wohingegen sie
geringe oder keine Wirkung auf den Grad der MS2-Inaktivierung hat.
-
Beispiel 20: Inaktivierung
von MS2: pH-Wirkung
-
Drei Milliliter humanes Plasma wurde
mit 50 μl
MS2-Stock in LB versetzt. Eine 10X-Stock-Lösung
von 3-[Cyclohexamino]-1-Propansulfonsäure (CAPS) wurde hergestellt
und 1 : 10 mit dem versetzten Plasma verdünnt. Diese Probe und eine reine
Plasmakontrollprobe wurden bei –70°C eingefroren
und verschlossen mit Silikon-Schmierfett und PARAFILM®. Vor
der Behandlung wurde jede Probe für 4 Minuten in die Reaktionskammer
gebracht, um an die experimentelle Temperatur zu equilibrieren.
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100 μl jeder Probe wurden für serielle
Verdünnung
entfernt. Phagen wurden 100-fach seriell verdünnt in Lambda-Broth in Mikrozentrifugenröhrchen.
Um eine ordnungsgemäße Mischung
sicherzustellen, wurden die Proben vor weiterer Verdünnung gevortext.
100 μl jeder
Verdünnung
wurden mit 100 μl
Log-Phasen MS2-Wirt E. coli gemischt, für 10 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert und für
20 Minuten bei 37°C
inkubiert. Drei Milliliter Lambda Top Agar (bei 47–50°C) wurde
zugesetzt, dann wurden die Röhrchen
kurz gevortext und über
Lambda Agar Platten gegossen. Die Proben wurden einem Druck von
60.000 psi [441 MPa] für
10 Minuten ausgesetzt, dann untersucht.
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Die Ergebnisse waren wie folgt:
Bedingung | Titer |
100
mM CAPS pH 10,5 | 3,0e6 |
Kontrolle | 3,9e9 |
-
Die Daten weisen darauf hin, dass
der Zusatz von Puffer zur Steigerung des pHs eine Inaktivierung des
Virus bei einem Druck ermöglichte,
bei dem keine Aktivierung nach Behandlung mit neutraler Lösung auftrat.
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Beispiel 21: Inaktivierung
von Pathogenen in klinischen Proben
-
Proben von humanem Plasma wurden über einen
Zeitraum von 4 Minuten auf –10°C equilibriert.
Der Druck wurde gesteigert auf einen erhöhten Druck von 20.000 psi [138
MPa) für
1 Minute. Der Druck wurde reduziert auf Atmosphärendruck und für 1 Minute
equilibriert. Dieses Verfahren wurde 9 weitere Male wiederholt. Ähnliche
Behandlungen wurden durchgeführt
unter Verwendung von gesteigerten Drücken von 30.000 [206,8 MPa),
40.000 [275,8 MPa), 50.000 [345 MPa) und 60.000 psi [414 MPa). Eine
Kontrollprobe wurde bei – 10°C für einen
gleichen Zeitraum (etwa 20 Minuten) gehalten, ohne dass der Druck
gesteigert wurde.
-
Nach der Behandlung wurden klinische
Assays durchgeführt,
um die Aktivität
von verschiedenen Analyten zu bestimmen. Die folgenden Analyten
waren durch jegliche Druckzyklusbehandlungen unbeeinflusst.
Harnsäure
Kalzium
Phosphor
Glukose
Creatinin
Harnstoffstickstoff
Na,
K, Cl, Mg, Bikarbonat
Triglyzeride GB
Gesamt-Bilirubin
Gesamt-Protein
Albumin
Cholesterin
Lipase
Anionen-GAP
BUN-/Creatinin-Verhältnis
Albumin-/Globulin-Verhältnis
alkalische
Phosphatase
-
Die Aktivitäten der folgenden multimeren
Enzyme wurden in den Proben reduziert, die Druck von 30.000 psi
und mehr ausgesetzt wurden:
Creatinkinase (CK)
Alaninaminotransferase
(ALT)
Aspartataminotransferase (AST)
Leber-Alkoholdehydrogenase
(LD)
Gamma-Glutamyltransferase (GGT)
-
Obwohl dort genug Restaktivität zurückblieb,
beispielsweise um solche Unterschiede zwischen normalen und erhöhten Spiegeln
dieser Enzyme zu messen, die in Patienten mit Leberdysfunktionen
auftreten würden,
war ein Sterilisationsverfahren gewünscht, das die Aktivität von multimeren
Enzymen nicht reduziert.
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Zu diesem Zweck wurden die folgenden
Experimente durchgeführt:
Humane Plasmaproben wurden auf –10°C für 4 Minuten
equilibriert und der Druck wurde auf 80.000 psi [552 MPa] über einen
Zeitraum von etwa 5 Sekunden erhöht
und für
eine bestimmte Dauer dort gehalten. Der Druck wurde dann auf Atmosphärendruck über etwa
2 Sekunden verringert. Das Verfahren wurde 2 weitere Male wiederholt.
Die Dauer, bei der der erhöhte
Druck getestet wurde, war 1, 5, 10, 30, 60, 120 und 240 Sekunden.
Die Plasmaproben wurden dann auf enzymatische Aktivität getestet.
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Die Aktivität der zwei getesteten monomeren
Enzyme, Lipase und Amylase, wurde durch keine Druckdauer beeinflusst.
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Bei einer Dauer von 30 Sekunden und
mehr waren die Aktivitäten
von LD, CK, AST und ALT fast vollständig eliminiert, wohingegen
die Aktivitäten
von GGT und alkalischer Phosphatase (ALK) auf die Hälfte reduziert
waren. Bei einer 5-Sekunden-Dauer waren alle Enzymaktivitäten verbessert.
Bei einer 1-Sekunden-Dauer hatten ALT, GGT und ALK fast vollständige Aktivität und LD,
AST und CK hatten 40% bis 70% der Aktivität der unbehandelten Kontrolle.
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Auch bei kurzer Dauer können akzeptable
Spiegel der Inaktivierung von Pathogenen erreicht werden, beispielsweise
in den vorstehenden Beispielen.
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Was beansprucht wird, ist: