Anwendungsgebiet
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Die Erfindung betrifft die Reinigung und Desinfektion von Eiern von parasitischen Nematoden
und Plathelminthen unter Verwendung von radikalischen Molekülen. Das Verfahren ermöglicht
die Gewinnung von vitalen Wurmeiern, die befreit sind von infektiösen Mikroorganismen und
deren Nukleinsäuren. Anwendungsgebiet der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung
pharmazeutischer Präparate von Wurmeiern, die ohne Gefahr einer Ansteckung des Patienten
mit unerwünschten Infektionserregern verwendet werden können für die Behandlung von
Autoimmunerkrankungen, z. B. Morbus Crohn, ulzerative Colitis und Diabetes Typ 1 sowie von
allergischen Erkrankungen, z. B. atopischer Dermatitis, Ekzem, Asthma bronchiale, Rhinitis
allergica, Rhinoconjunktivitis, Nahrungsmittelallergien und Psoriasis.
Beschreibung
Hintergrund der Erfindung
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Autoimmunerkrankungen wie die entzündlichen Darmerkrankungen Morbus Crohn und
ulzerative Colitis als auch allergische Erkrankungen wie Asthma, Rhinitis allergica
(Heuschnupfen), atopische Dermatitis und Nahrungsmittelallergien sowie Psoriasis nehmen in
den westlichen Zivilisationen seit etwa 30 Jahren kontinuierlich und in erheblichem Ausmaß zu.
Beispielsweise erkranken in der heutigen Zeit fast ein viertel der Kinder in Nordeuropa an
atopischer Dermatitis. Die starke Verbreitung von Psoriasis, Asthma, Heuschnupfen und
Nahrungmittelallergien in der deutschen Bevölkerung ist allgemein bekannt.
(Thestup-Pedersen K 1997, Which factors are of relevance in the pathogenesis of atopic
dermatitis? European Journal of Dermatology 7: 549-553; Von Mutius E 1998, The rising trends
in asthma and allergic disease. Clinical and Experimental Allergy 28: 45S-49S; Elliott DE et al.
2000, Does failure to acquire helminthic parasites predispose to Crohn's disease? FASEB J 14:
1848-1855).
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Nach der bekannten "Hygiene-Hypothese" sollen Autoimmunerkrankungen und Allergien in
der heutigen Zeit vor allem deshalb entstehen, weil unser Immunsystem während kritischer
Lebensabschnitte im Kindesalter zu wenig durch Infektionsstress stimuliert wird.
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In den westlichen Industrienationen mit allgemein guter Hygiene, wo einerseits Allergien und
Autoimmunerkrankungen in der Bevölkerung oft auftreten, werden andererseits nur wenige
Menschen mit parasitischen Würmern infiziert. Im Unterschied dazu macht fast jeder Mensch in
den Tropen bei mangelnder sanitärer Versorgung ständig Infektionen mit Wurmparasiten durch.
Unter naturnahen Lebensbedingungen ist eine ständige Exposition des Menschen mit
Wurmparasiten gegeben und vor allem bei Kindern sind normalerweise Würmer vorhanden.
Allergien und Autoimmunerkrankungen sind dagegen in tropischen Ländern sehr selten. Es
besteht also eine auffallende, umgekehrte Korrelation zwischen einer hohen Prävalenz von
Wurmparasiten und einer seltenen Inzidenz von Autoimmunerkrankungen und Allergien.
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Im Lauf der Evolution des Menschen adaptierte das Immunsystem auf die Präsenz von
Würmern. Das Immunsystem erfordert insbesondere während der frühkindlichen Entwickung
eine Prägung, bei der die Immunantworten gegenüber Würmern einerseits und gegenüber
mikrobiellen Erregern andererseits trainiert und ausbalanziert werden. Fehlen jedoch
parasitische Würmer und damit ausbalanzierende Mechanismen des Systems, können
Reaktionen des Immunsystems fehlreguliert werden und so dominant auf Mikroorganismen
ansprechen, daß bei einigen Personen sonst harmlose Substanzen der normalen
Darmbakterien exzessiv starke Reaktionen des Körpers auslösen können. Dies kann gegen den
eigenen Körper gerichtete entzündliche Prozesse zur Folge haben oder zu Allergien führen.
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Kinder, die in einer ländlichen Gegend in Europa wohnen und sich öfters in Tierställen
aufhalten, entwickelten erheblich seltener Asthma, Heufieber und atopische Sensibilisierung als
Kinder, die ohne Kontakt mit der Landwirtschaft aufwachsen (Riedler et al. 2001, Exposure to
farming in early life and development of asthma and allergy: a cross-sectional survay. Lancet
358: 1129-1133). Sehr wahrscheinlich beeinflussen Infekte mit Würmern und Mikroorganismen
die Reifung des kindlichen Immunsystems insofern positiv, daß das Risiko der Entstehung von
Allergien vermindert wird. Stall- und Weidetiere sind gewöhnlich Träger parasitischer Würmer,
welche die Umgebung mit den von ihnen produzierten Eiern kontaminieren. Die infektiösen Eier
können leicht mit Schmutz vom Menschen aufgenommen werden. Parasiten-Arten der Nutztiere
beginnen ihre Entwicklung auch im Menschen, werden jedoch rasch immunologisch abgewehrt.
Beispielsweise können zur Infektionsfähigkeit herangereifte Eier des in Schweinen
parasitierenden Peitschenwurms Trichuris suis zufällig vom Menschen aufgenommen werden.
Es entwickeln sich dann im Darm des Menschen kleine Würmer, die völlig apathogen sind und
nach wenigen Wochen wieder abgestoßen werden. (Mehlhorn H et al. 1993, Diagnose und
Therapie der Parasitosen von Haus-, Nutz- und Heimtieren, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart;
Mehlhorn H und Piekarski G 1995, Grundriß der Parasitenkunde. Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart; Mehlhorn H (Hrsg.) 2001, Enzyclopedic Reference of Parasitology, Springer Verlag,
Heidelberg).
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Viele Arten von parasitischen Würmern können den Menschen infizieren und zu chronischem
Befall führen. Die Mehrheit dieser Parasiten gehören zu den Rundwürmern (Nematoden) oder
den Plattwürmern (Plathelminthes). Oft liegt bei einem Menschen gleichzeitig ein Befall mit zwei
oder mehr Arten von Wurmparasiten vor. Besonders häufig auftretende Arten von parasitischen
Nematoden des Menschen sind der Spulwurm Ascaris lumbricoides (mehr als 1 Milliarde
infizierte Personen), die Hakenwürmer Ancylostoma duodenale und Necator americanus (etwa
900 Millionen Infizierte), der Peitschenwurm Trichuris trichiura (bei etwa 700 Millionen
Menschen) und der Madenwurm Enterobius vermicularis (300-500 Millionen). Hinzu kommt eine
Reihe von Nematoden-Arten, mit denen jeweils bis zu 90 Millionen Personen infiziert sind. Zu
den Plathelminthen gehören die Bandwürmer (Cestoden) und die Saugwürmer (Digenea).
Häufiger Parasit des Menschen ist der Zwergbandwurm Hymenolepis nana. Auch Rinder-,
Schweine- und Fischbandwürmer der Gattungen Taenia und Diphyllobothrium sind in weiten
Teilen der Erde regelmäßige Begleiter des Menschen. Als Humanparasiten sind Saugwürmer
von erheblicher Bedeutung, zum Beispiel sind fast 250 Millionen Menschen Träger von
Pärchenegeln der Gattung Schistosoma. Viele Millionen Personen sind mit verschiedenen
Darm- und Gallengangparasiten infiziert, z. B. mit Clonorchis sinensis, Opisthorchis felineus und
viverrini, Fasciola hepatica und Arten von Heterophyes, Echinostoma und Paragonimus.
(Mehlhorn H 2001)
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Die immunologischen Reaktionen des Körpers gegen Parasiten bzw. im Zusammenhang mit
Autoimmunerkrankungen und Allergien zeigen folgende Grundprinzipien:
- a) Bei der Entstehung von Autoimmunerkankungen spielen dominierende Lymphozyten vom Typ
T-Helfer 1 (Th1)-vermittelte Immunreaktionen die zentrale Rolle, und exzessive Folgereaktionen
hiervon führen zu Schädigungen des körpereigenen Gewebes.
- b) In der Induktion und
Aufrechterhaltung allergischer Immunantworten spielen Allergen-spezifische T-Helfer Zellen von
Typ2 (Th2-vermittelte Reaktionen die entscheidende Rolle. Sie stimulieren mittels bestimmter
Interleukine bestimmte Immuneffektoren, welche die Pathogenese bewirken. c) Infektionen mit
Würmern induzieren zunächst ebenfalls typischerweise zunächst eine dominierende Expansion
der Th2 Zellen.
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Es ist nun bekannt, daß bei Befall mit Wurmparasiten die Aktivität von Immunmechanismen
gegen die Parasiten wieder herunterreguliert werden. Dadurch vermeidet der Körper, daß
überschießende Immunreaktionen auch die körpereigenen Gewebe schädigen. Es werden
hierbei Cytokine gebildet (IL10 und TGF-β), die eine Abschwächung von Th1 als auch Th2
Antworten bewirken (Doetze A et al. 2000, Antigen-specific cellular hyporesponsiveness in a
chronic human helminth infection is mediated by Th3/Tr1-type cytokines IL-10 ancl TGF-β but not
by a Th1 to Th2 shift. Int Immunol 12: 623-30)
Stand der Technik
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Es wurde entdeckt und in Patenten beschrieben, daß sowohl Autoimmunerkrankungen als
auch allergische Erkrankungen durch ärztlich verordnete und künstlich herbeigeführte
Infektionen der Patienten mit parasitischen Würmern therapiert werden können.
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Die Patentschrift WO 9933479 und die korrespondierende Patenschrift AU 1821399
beschreiben eine pharmakologische Wirkung von Wurmparasiten auf Autoimmunerkrankungen,
namentlich die Darmkrankheiten Morbus Crohn und ulzerative Colitis, sowie auf die rheumatoide
Arthritis, Typ 1 Diabetes mellitus, Lupus erythematosis, Sarcoidosis und Multiple Sklerosis.
Diese Autoimmunerkrankungen beruhen auf einer überstarken Th1 Aktivierung, woraus
entzündliche Prozesse der betroffenen Gewebe resultieren. Diese Erfindung zielt dabei auf eine
Therapie der exzessiven Th1-Reaktionen ab. Eine Dämpfung von krankhaften Th2-Effekten
wurde nicht beschrieben.
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Vom Anmelder Alpha-Biocare GmbH wurde mit dem Titel "Mittel mit Nematoden und
Plathelminthen zur Behandlung allergischer Erkrankungen" die Erfindung zum Patent
eingereicht, daß Wurmparasiten als Mittel zur Behandlung von allergischen Erkrankungen wie
atopischer Dermatitis, Ekzem, Rhinitis allergica, Rhinoconjunktivitis, Asthma bronchiale,
Nahrungsmittelallergien und Psoriasis verwendet werden können. Diese Erfindung zielt auf eine
Dämpfung und Therapie der exzessiven Th2-Reaktionen ab.
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Die Therapie der Autoimmunerkrankungen als auch die Therapie der allergischen
Erkrankungen nach den zuvor genannten Patentschriften beruhen auf einer Applikation von
lebenden, infektiösen Stadien von Nematoden oder Plathelminthen. Die Eier der Wurmparasiten
sind für beide Anwendungsgebiete besonders geeignete Wurmstadien.
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Die Gewinnung von Eiern der parasitischen Nematoden und Plathelminthen aus den adulten
Würmern bzw. aus den Fäzes infizierter Tiere oder Personen ist in zahlreichen
Fachpublikationen detailliert beschrieben (z. B.: Ash LR und Orihel TC 1987, Parasites: a guide
to laboratory procedures and identification. ASCP Press, American Society of Clinical
Pathologists, Chicago; Mehlhorn et al. 1993, Diagnose und Therapie der Parasitosen von Haus-,
Nutz- und Heimtieren. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart; Rommel M et al. 2000,
Verterinärmedizinische Parasitologie, Parey-Verlag, Berlin; Mehlhorn 2001, Literaturstelle siehe
oben). Die Verfahren dienen zumeist zur Diagnose von vorhandenen Infekten, sie sind aber aber
auch dazu geeignet, Ausgangsmaterial für die Laborhaltung der Parasiten zu gewinnen. Auch in
den Patentschriften WO 9933479, der korrespondierenden Patenschrift AU 1821399 sowie in der
zum Patent angemeldeten Erfindung des Anmelders Alpha-Biocare GmbH mit dem Titel "Mittel
mit Nematoden und Plathelminthen zur Behandlung allergischer Erkrankungen" wird auf die
parasitologischen Standardverfahren verwiesen, mit denen Eier der parasitischen Würmer
gewonnen werden können, bevor aus diesen medizinische Präparaten hergestellt werden. Als
besonders geeignet wurde in den Patentschriften das bekannte Verfahren der Flotation
angeführt. Hierbei werden Eier aus adulten Würmern in vitro oder aus den Fäzes von infizierten
Tieren oder Personen dadurch angereichert, daß das Material in einer wässrigen Lösung mit
hoher Dichte aufgeschwemmt und zentrifugiert wird. Die leichteren Eier flottieren in der relativ
schwereren Lösung und können dann weitgehend gereinigt vom Überstand der Lösung
abgenommen werden.
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Ein ungelöstes Problem bei der Gewinnung der Eier der parasitischen Würmer und der
Herstellung geeigneter pharmazeutischer Präparate aus diesen Eiern ist die Gefahr, daß diese
Wurmpräparate mit anderen Krankheitserregern kontaminiert sein können, die die Gesundheit
der behandelten Patienten ernstlich bedrohen. Auch wenn Wurmeier nach Möglichkeit aus den
Fäzes von solchen Tieren (z. B. Schweinen) gewonnen werden, die spezifisch pathogen frei
gehalten werden, ist nicht auszuschließen, daß mikrobielle Erreger wie Viren, Bakterien, Pilze
und einzellige Parasiten von den Wurmeier-liefernden Tieren ausgehend die Wurmpräparate
verseuchen.
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Als Beispiel für viele der gefährlichen Mikrooganismen, die in die Wurmpräparate gelangen
könnten seinen genannt: Schweineviren, Picornaviren, insbesondere die Enteroviren,
Adenoviren, Herpes-simplex-Viren, Epstein-Barr-Viren, Hepatitis-Viren, Zytomegalieviren,
Varizella-zoster-Viren, enterotoxische Bakterien wie Echerischia coli, z. B. EHEC oder ETEC,
Salmonellen, Campylobacter, Shigellen, Yersinien, desweiteren auch einzellige Parasiten wie
Balantidium coli, Cryptosporidien und Mikrosporidien.
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Die Wurm-Präparate müssen zur Sicherheit für die Patienten rigoros auf eventuell in ihnen
vorhandene Krankheitserreger getestet werden. Da hierbei jedoch nur eine begrenzte Auswahl
von Standardtests für bestimmte und bekannte Erreger gescreent werden können besteht die
Gefahr, daß Erreger, auf die nicht geprüft wurde, unerkannt in die Präparate gelangen. Dieselbe
Gefahr resultiert, wenn ein Diagnosetest aufgrund fehlerhafter Komponenten falsch negative
Ergebnisse anzeigt, oder wenn dem mit der Durchführung beauftragten Personal Fehler in der
Handhabung unterlaufen. Selbst Pathogene, die erst bei der Herstellung der Präparate in die
pharmazeutischen Produkte gelangen, beispielsweise ubiquitär vorhandene Bakterien oder
Keime, die durch unerkannte Träger von Infektionserregern beim in der Herstellung
beschäftigten Personal gestreut werden, werden bei den Produktionsverfahren nach dem Stand
der Technik nicht unschädlich gemacht. Auch intakte Nukleinsäuren abgetöteter Erreger sind in
den Präparaten unerwünscht, da z. B. bei Viren eine Aufnahme der Nukleinsäuren in die Zellen
des Patienten nicht völlig ausgeschlossen werden kann. Selbst Prionen, das sind infektiöse
Proteine, sollten nur in denaturierter und nicht-infektiöser Form in die Wurmpräparate gelangen
können. Das ungelöste Problem besteht darin, daß die Wurmpräparate nicht - wie für die
Herstellung pharmazeutischer Produkte nach dem Arzneimittelgesetz vorgeschrieben ist - durch
anerkannte Sterilisationsverfahren keimfrei gemacht werden können, weil dadurch auch die
Wurmparasiten abgetötet werden würden. Es ist aber für die Therapie mit den Würmern
unabdingbar, daß die Wurmparasiten vital bleiben.
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Gängige Verfahren der Sterilisation und Keimzahlverminderung, die in der Herstellung der
Wurmpräparate jedoch wegen einer gleichzeitigen Abtötung der Würmer nicht angewendet
werden können, sind z. B. die Abtötung von Mikroorganismen durch trockene Hitze oder
Dampfsterilisation (Autoklavieren), Bestrahlung mit starkem UV-Licht (200-280 nm Wellenlänge)
oder mit ionisierenden Strahlen wie radioaktiver oder Röntgenstrahlung oder Mikrowellen.
Beispielsweise reichen zur Abtötung von Nematoden-Eiern schon Gammastrahlen von 1-2 kGy
aus, während auf Viren und Bakterien erst 15-20 kGy lethal wirken (Rommel et al. 2000, siehe
oben). Auch die Sterilfiltration ist für die vorliegende Anwendung nicht möglich, weil die
Wurmeier größer sind als die zu eliminierenden Keime. Auch die üblicherweise verwendeten
Desinfektionsmittel wirken auf verschiedene Erreger nur mit unterschiedlicher Effektivität; die
Desinfektion mit zahlreichen chemischen, antimikrobiell wirkenden Mittel hat den Nachteil, daß
sich mit diesen Mitteln immer nur eine Keimreduzierung, niemals jedoch eine Sterilisation
erreichen läßt (Bast E 1999, Mikrobiolgische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag, Gustav
Fischer, Heidelberg; Robert-Koch-Institut 1997, Liste der vom Robert-Koch-Institut geprüften und
anerkannten Desinfektionsmittel und -verfahren. Bundesgesundheitsblatt 40, Nr. 9, S. 344-361,
Carl Heymanns Verlag, Köln; Wallhäußer KH 1995, Praxis der Sterilisation - Desinfektion -
Konservierung, Georg Thieme Verlag, Stuttgart). Außerdem durchdingen gebräuchliche
Desinfektionsmittel, z. B. Ethanol oder Isopropanol die Schale der Wurmeier und töten die
Parasiten ab, wodurch sich die Verwendung dieser Chemikalien ebenfalls verbietet.
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Lebensnotwendig für alle Viren, Bakterien, Pilze und einzelligen Parasiten ist deren
Erbinformation in Form von Nukleinsäuren, die zumeist als doppelsträngige DNS oder als
einsträngige RNS vorhanden sind. Die Erreger - gleich welcher Art oder Zugehörigkeit zu
bestimmten systematischen Taxa - verlieren jegliche Infektiösität, wenn ihre Nukleinsäuren
zerstört sind. Dies geschieht z. B. bei radioaktiver Bestrahlung.
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Technischer Ausgangspunkt für die vorliegende Erfindung sind die vielgestaltigen
Modifikationen der chemischen Fenton-Reaktion. Die Einzelheiten sind weiter unten
beschrieben. Die Fenton-Reaktion wurde ursprünglich in der molekularbiologischen
Grundlagenforschung benutzt, um zufällige Strangbrüche in Nukleinsäuren zu erzeugen, anhand
derer auf Assoziationen bestimmter Strangabschnitte mit Histon-Proteinen geschlossen werden
konnte. Heuzutage werden Fenton-Reaktionen in vielen Modifikationen in Laborversuchen und
Pilotanlagen auf ihre Eignung getestet, organische Substanzen in der Aufbereitung und
Reinigung von Abwässern abzubauen. Fenton-Reaktionen haben bisher jedoch noch keinen
Eingang in die Praxis der Desinfektion gefunden. (z. B. Maletzky P und Bauer R 1999,
Chemosphere 38: 2315; Wu K 1999, J Mol Catalysis A: Chemical 144: 77; Machado A 2000,
Chemosphere 40: 115; Lu MC 2000, Chemosphere 40: 125; Salem IA 2000, Int J Chem Kinet
32: 643; Salem IA, 2000, Int J Chem Kinet 40: 667). Zum Patent angemeldet wurde von Casado
Gimenez, Juan et al. unter der Nummer 9902857 beim Amerikanischen US Patent & Trademark
Office: " Process for the degradation of organic compounds in aqueous solution by means of
ozonization and sunlight irradiation". In dieser Schrift wird auf die Verwendung von Fe-Ionen
verwiesen.
Aufgabe der Erfindung
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Es besteht die Notwendigkeit, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem vitale
Wurmeier aus denen Medikamente für Autoimmunerkrankungen und Allergien hergestellt
werden sollen, sehr sicher von kontaminierenden Krankheitserregern befreit werden können.
Diese Aufgabe wird überraschenderweise durch den kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1
gelöst.
Lösung der Aufgabe
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Der Erfindung liegt die Entdeckung zugrunde, daß Wurmeier, aus denen Medikamente gegen
Autoimmunerkrankungen und Allergien hergestellt werden sollen, durch bestimmte radikalische
Moleküle, die Nukleinsäuren abbauen können, sicher von möglicherweise vorhandenen
Krankheitserregern dekontaminiert werden können. Aufgabe des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist die Zerstörung der Nukleinsäuren von Viren, Bakterien, Pilzen und einzelligen
Parasiten - wobei die Würmer jedoch nicht angegriffen werden, weil sie geschützt durch ihre
Eihüllen vor Schäden geschützt bleiben.
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Es wurde nach dem Stand der Technik erwartungsgemäß festgestellt, daß mit Hilfe der
Fenton-Reaktion oder verschiedenen Modifikationen dieser Technik erzeugte Hydroxid-
und/oder Sauerstoff-Radikale Viren, Bakterien und einzellige Parasiten zerstört werden.
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Überraschenderweise wurde aber in den Untersuchungen der Alpha-Biocare gefunden, daß
in denselben Ansätzen der Fenton-Reaktionen vorhandene Wurmeier nicht geschädigt
werden. Als Grund hierfür ist anzunehmen, daß die eingesetzten Reagentien nicht oder nur in
unbedeutendem Maße durch die Schale der Wurmeier diffundieren. Es können daher innerhalb
der Eier keine Molekül-Radikale gebildet werden, die eine Zerstörung der Erbinformationen
und/oder anderer lebenswichtiger Bestandteile der Würmer bewirken könnten.
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Möglicherweise sind in den Eiern auch antioxidative Enzyme vorhanden, da zumindest bei
bestimmten adulten Würmern, z. B. einer Nematoden-Art die Enzyme Superoxid dismutase und
Katalase festgestellt worden sind, die im Stoffwechsel entstehende reaktive Sauerstoff-Spezies
unschädlich machen können (Batra S et al. 1990, Antioxidative enzymes in Acanthocheilonema
viteae and effect of antifilarial agents. Biochem Pharmacol 40: 2363-9).
Vorteile der Erfindung
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Die Anwendung der erfindungsgemäßen Desinfektion der Wurm-Präparate hat wichtige
Vorteile:
Die Wurmei-Präparate können leicht in der nach den Arzneimittelgesetzen geforderten
Reinheit hergestellt werden, daß heißt, lebende Wurmorganismen können so gründlich
desinfiziert werden, daß das Verfahren einer Sterilisation nahekommt. Es werden Bakterien und
Viren unabhängig von ihrer Art und Pathogenität sicher abgetötet.
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Die weitreichende Sicherheit des Verfahrens erübrigt daher die Notwendigkeit, die Wurmei-
Präparate einer Vielzahl von Tests zur Diagnose auf zahlreiche Krankheitserreger zu
unterziehen. Es können also in der Produktion der Wurmei-Medikamente bisher erforderliche,
technisch und personell sehr aufwendige und daher kostenintensive Prüfungen vermieden
werden.
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Die Desinfektion mit Fenton-Reagentien ist leicht durchführbar und erfordert nur einfache,
billige Chemikalien. Das ausführende Personal ist keinen toxischen Substanzen ausgesetzt, die
zum Beispiel am Arbeitsplatz eingeatmet werden könnten.
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Nach Ablauf der Fenton-Reaktion sind die Molekülradikale produzierenden
Ausgangssubstanzen fast vollständig verbraucht, so daß keine Substanzreste mehr in den
pharmazeutischen Produkten übrigbleiben, die eine gesundheitliche Gefährdung des Patienten
bedeuten könnten. Auf eine nachfolgende Reinigungsstufe zur Entfernung des
Desinfektionsmittelsystems kann verzichtet werden. Verbleibende Eisensalze o. ä. Metalle sind in
ihrer Konzentration gesundheitlich völlig unbedenklich.
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Die Wurm-Eier lassen sich schon vor der erfindungsgemäßen Behandlung in die
erforderlichen luftdurchlässigen, aber keimundurchlässigen Arzneimittelformen integrieren, so
daß die Präparate auch ohne Zusatz von Konservierungsstoffen keimfrei bleiben.
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Die Wurmeier behalten nach der Behandlung ihre Vitalität, z. B. bleiben Eier von Trichuris suis
für viele Jahre haltbar. Die Wurmei-Präparate entsprechen damit in hervorragender Weise der
der Anforderung an Medikamente nach dem Arzneimittelgesetz, daß ein pharmazeutisches
Präparat mindestens 3 Jahre haltbar sein muß.
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Von Vorteil ist auch, daß z. B. im Rahmen der Überprüfung von phamazeutischen
Endprodukten nachgewiesen werden kann, ob tatsächlich eine Dekontamination der Wurmeier
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt worden ist. Es lassen sich nämlich z. B.
restliche Spuren der verwendeten Eisenverbindungen leicht im Endprodukt analysieren. Dies
ermöglicht auch die Kontrolle darüber, ob das Verfahren nur im Rahmen gewährter Lizenzen
von anderen Herstellern angewendet wird.
Beschreibung von Ausführungsbeispielen
Versuch 1
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Eier des Nematoden Trichuris muris werden aus den Fäzes von Mäusen gewonnen,
die im Labor zur Haltung der Parasiten infiziert worden sind. Die Wurmeier werden von
Substanzen der Fäzes weitgehend gereinigt, indem das Material in einer Salzlösung mit einer
Dichte von etwa 1,21 g/l aufgeschwemmt und dann bei 500 g für 10 Minuten zentrifugiert wird.
Die schwimmenden Eier werden von der Oberfläche der Lösung zusammen mit etwas der
Flüssigkeit abgenommen. Die Flüssigkeit wird mit destilliertem Wasser verdünnt und nochmals
zentrifugiert, um die jetzt sedimentierenden Eier von der hohen Salzkonzentration zu befreien.
Bei mikroskopischer Beobachtung der gewonnen Ei-Probe unter Phasenkontrast ist zu sehen,
daß die Lösung noch viele lebende Bakterien enthält, die sich in den hinteren Abschnitten des
Darmtraktes der Mäuse entwickelt hatten und in die Fäzes der Mäuse gelangt sind. Für die
nachfolgenden Behandlungen zur Dekontamination werden 2 ml der gewonnenen Ei-
Suspension mit 16 ml destilliertem Wasser verdünnt. Die Wirkung von Hydroxyl-Radikalen,
erzeugt durch Zerfall von H2O2 durch Fe2+Ionen (Fenton-Reaktion) wird untersucht, indem
jeweil 1 ml einer 10-fach konzentrierten Stammlösung von Eisenchlorid und von H2O2 zugesetzt
wird. Nach Einwirkung für bestimmte Zeiten, z. B. für 30 Minuten wird der Ansatz mikroskopisch
unter Phasenkontrast auf vitale Bakterien untersucht. Es zeigt sich, daß die Bakterien zerstört
sind. Unter sterilen Arbeitsbedingungen werden zudem kleine Mengen der Ansätze auf
Universalnährmedien in Agar-Petrischalen ausgestrichen, und dann die Platten im
Wärmeschrank bei 37°C für mehrere Tage zu bebrüten. Es zeigt sich dann, daß keine
Bakterienkolonien auf den Platten gewachsen sind. Die Ei-Proben werden außerdem bei
Raumtemperatur unter guter Belüftung gehalten, um die Embrogenese der Eier verfolgen zu
können. Im Verlauf von etwa 7 Wochen entwickeln sich die Embryonen zu infektionsfähigen
Larven. Nach oraler Verabreichung an Mäuse zeigt sich, daß die verabreichten Wurmparasiten
vital waren und zu adulten Würmern heranwachsen können.
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In weiteren Versuchen wird derselbe Ansatz benutzt, um vergleichend die Wirkung von
mehreren Modifikationen der chemischen Fenton-Oxidation zu prüfen. Getestet werden die
Systeme: H2O2/Fe2+, desgleichen auch unter Verwendung von Eisen enthaltenden Mineralien,
H2O2/Fe2+/O-3, UV/H2O2/O-3, O-3/UV, H2O2/Fe2+/UV und UV/TiO2.
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Es zeigt sich, daß die einfach durchzuführende Oxidation mit dem H2O2/Fe2+-System eine
ausreichende Wirkung hat.
Versuch 2
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In einer zweiten Versuchsreihe werden Eier von Trichuris muris wie zuvor
beschrieben gewonnen. In anderen Ansäzen werden Eier von Hymenolepis nana durch
Sedimentation aus den Fäzes infizierter Mäuse sowie Metacercarien von Echinostoma caproni
aus infizierten Schnecken der Art Biomphalaria glabrata gewonnen. Den Proben wird Listeria
monocytogenes zugesetzt, welche in Listeria-Kulturmedium mit Zusatz von 51,4 mg
Cycloheximid und 41,1 mg Nalidixinsäure pro Liter kultiviert werden. Die gemischten Proben
werden zuerst mit einer Fenton-Reaktion behandelt wie zuvor beschrieben und anschließend
einer Polymerase-Ketten-Reaktion für die Amplifikation von der Nukleinsäuresequenz des Gens
für Hämolysin (hlyA) unterzogen. Der Nachweis von Amplifikaten im Agarose-Gel zeigt nach
Anfärbung mit Ethidiumbromid durch Fehlen jeglicher fluoreszierender Banden, daß die DNA-
Sequenz der Bakterien völlig zerstört worden war. DNA, die sich außerhalb der schützenden
Eischalen der Würmer befindet, wird durch die erfindungsgemäße Anwendung der Fenton-
Reaktion offensichtlich vollständig degradiert. Die In den Eischalen bzw. Metacercarien
befindenden Würmer haben die Fenton-Reaktion überlebt und entwickeln sich nach oraler Gabe
an Mäuse zu adulten Würmern.
Anwendungsbeispiel
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Aus den Fäzes spezifisch pathogen frei gehaltener
und 6 Wochen zuvor mit Trichuris suis infizierter Schweine werden Eier von Trichuris suis mit
demselben Verfahren gewonnen, wie unter Versuch 1 beschrieben. Die angereicherten Eier
werden einer Fenton-Reaktion mit H2O2 und Fe2+Ionen bei Raumtemperatur unterzogen.
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Anschließend werden die Eier unter ständiger Belüftung gehältert. Nach etwa 8 Wochen haben
sich ausgereifte Wurmlarven entwickelt. Im Versuch, durch orale Gabe an noch nicht infizierte
Schweine kann nachgewiesen werden, daß die Wurmlarven in den Eiern vital und infektiös sind.
Jeweils etwa 2500 Eier von Trichuris suis werden in 5 ml der sterilisierten, wässrigen Lösung in
20 ml-Flaschen gegeben. Die Flaschen werden mit einem Septum aus luftdurchlässigem, aber
für Wasser und Keime undurchlässigem Sympatex-Gewebe verschlossen. In dieser Form und
nach korrekter Etikettierung der Flasche ist das pharmazeutische Produkt zur Anwendung
gegen Allergien oder Autoimmunerkrankungen fertiggestellt.
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Als bevorzugte pharmazeutische Zubereitungen, in denen die dekontaminierten, infektiösen
Wurmstadien enthalten sind, seien Suspensionen oder Lösungen (bevorzugt in Flaschen, die mit
einem luftdurchlässigen, aber keimundurchlässigem Septum verschlossen sind), Emulsionen,
Puder, Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Granulate, Suppositorien, Pasten, Salben, Gele,
Cremes, Lotions und Sprays genannt. Die genannten Arzneimittelformen können die
Wurmpräparate neben den üblichen Trägerstoffen enthalten, wie Füll-, Streck- und Bindemittel,
z. B. Stärken, Carboxymethylcellulose, Agar-agar, Alginate, Chitosan, Gelatine,
Polyvinylpyrrolidon und Feuchthaltemittel, z. B. Glycerin. Die Wurmpräparate können auch in
mikroverkapselter Form vorliegen. Die genannten Formulierungsformen können auch
Konservierungsstoffe, z. B. Ascorbinsäure oder Butylhydroxytoluol, Färbemittel, z. B. die
pharmazeutisch zugelassenen Farbstoffe, Süßmittel wie Zucker oder Saccharin, sowie
geschmacks- und geruchsverbessernde Zusätze wie Pfefferminzöl enthalten. Die
pharmazeutischen Zubereitungen können auch andere, bereits bekannte, z. B. Cortison, oder
neue pharmazeutische Wirkstoffe gegen Allergien oder Autoimmunerkrankungen enthalten.