-
Hintergrund der Erfindung
-
1. Erfindungsgebiet
-
Die vorliegende Erfindung betrifft
den medizinischen Bereich der Hämatologie
und genauer gesagt ein verbessertes Verfahren und eine Vorrichtung
zum Entfernen von Desinfektionsmittel-Farbstoffen beispielsweise
Methylenblau aus dem Blut, aus Blutfraktionen oder anderen. verderblichen
Flüssigkeiten,
zu denen die Farbstoffe zum Zwecke der Desinfektion hinzugegeben
worden sind.
-
2. Beschreibung des Stand
der Technik
-
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt braucht man
nur menschliches Blut und Bluttransfusion erwähnen, um Angst hervorzurufen,
die mit der Furcht zusammenhängt,
dass jemand Aids (Acquired Immunodeficiency Syndrome) aus verdorbenem
Blut bekommen könnte.
Während
es wahr ist, dass zahlreiche auf Antikörpern basierende und weitere
Tests es möglich
gemacht haben, die überwiegende
Mehrzahl an HIV (Humanes Immundefizienz-Virus, dem ursächlichen
Agens von Aids) infizierten Blut aus unserer Blutversorgung zu entfernen, macht
der gegenwärtige
Stand von Aids als einer unheilbaren, fatalen Erkrankung selbst
ein relativ geringes Risiko für
viele nicht akzeptabel.
-
Das Risiko einer Infektion kann sowohl
durch Verbesserung der Sensitivität diagnostischer Tests, die an
dem Blut angewandt werden und durch das Entwickeln von Verfahren
zum Desinfizieren von Blut reduziert werden, so dass das infizierte
Blut, das den Tests entkommt, im wesentlichen bedeutungslos gemacht
wird. Ein zusätzlicher
Vorteil der Möglichkeit,
Blut zu desinfizieren, liegt darin, dass es viele andere durch Blut übertragbare
virale Erkrankungen neben Aids gibt. Die Öffentlichkeit ist sich im allgemeinen
im klaren über
die verschiedenen Arten von Hepatitis, die aus Bluttransfusionen
herrühren
können.
Diese Erkrankungen reichen von kaum störenden zu fatalen, wie im Fall
der fulminanten Hepatitis oder beim Leberkrebs, welcher mit bestimmten
Formen der Hepatitis stark korreliert. Es gibt zweifelsohne viele
weitere im Blut vorhandene virale Pathogene, die bis jetzt nicht
entdeckt wurden.
-
Ein Mittel zum Eliminieren oder Entfernen
von Viren aus dem Blut ist die Verwendung der "Fototherapie" oder "Fotodesinfektion". Nahezu alle pathogenen Erreger mit
der möglichen
Ausnahme von "Prionen" sind bekannt da für, dass
die Nucleinsäuren
als genetisches Material enthalten. Während Nucleinsäuren in
menschlichen Zellen durch Proteine verpackt sind und durch das Zytoplasma
und die Kernhülle
geschützt
sind, sind sie in typischen Viren stärker exponiert. Das macht es
möglich,
ihnen schneller eine fotochemische Schädigung zuzufügen. Nucleinsäuren absorbieren
die Lichtenergie natürlicherweise
im ultravioletten Bereich. Ein großer Teil der Hautschäden, die
durch das Sonnenlicht verursacht werden, entsteht in der Tat aufgrund
fotochemischer Schädigung
von Nucleinsäuren.
-
Es gab einige Experimente unter Verwendung
ultravioletten Lichts zum Desinfizieren von Blut, aber diese haben
sich im allgemeinen nicht als zufriedenstellend herausgestellt.
Die Niveaus der Ultraviolettstrahlung, die im Blut getragene Pathogene
inaktivieren, sind schwierig zu verabreichen und können auch
Schäden an
zellulären
und Proteinbestandteilen des Bluts verursachen. Des weiteren kann
die ultraviolette Strahlung schwer zu handhaben sein und Materialien,
die gewöhnlich
bei der Handhabung von Blut verwendet werden, schädigen, oder
es nicht schaffen, in sie einzudringen.
-
Es ist gut bekannt, dass ein Chromophor,
das Licht im normalen sichtbaren Spektrum absorbiert, verwendet
werden kann, um indirekt eine Desinfektion auszuüben. Das Chromophor absorbiert
im wesentlichen sichtbares Licht und wird "angeregt". Diese Zusatzenergie durch das Absorbieren
des Lichts muss irgendwo hin; sie kann in Form beschleunigter molekularer
Vibration des Chromophors in Wärme
umgewandelt werden; sie kann als Fluoreszenz reemittiert werden;
oder sie kann in einer fotochemischen Reaktion verbraucht werden.
Bestimmte Chromophore wie der Thioninfarbstoff Methylenblau (3,7-Bis(dimethylamino)-phenazthioniumchlorid)
ist, wenn er angeregt wird, in der Lage, eine chemische Reaktion
in einer Nucleinsäure
zu potenzieren. Diese fotochemischen Reaktionen ändern die Struktur der Nucleinsäure und
machen sie funktionsuntüchtig.
Da lebende Zellen im allgemeinen Methylenblau ausschließen, ist
es virale Nucleinsäure,
die gegenüber
Schädigung
primär
anfällig
ist.
-
Obwohl Methylenblau im allgemeinen
als nicht-toxisch angesehen wird, besteht einige Sorge, dieses Material
zum Blut oder zu Blutprodukten für
medizinische Verwendung zu geben. Es ist möglich, Methylenblau mit bindenden
Substanzen wie aktivierter Aktivkohle zu entfernen (siehe US-A-5,639,376). Unglücklicherweise binden
auch viele andere Substanzen an Aktivkohle und werden entfernt,
wodurch sich die klinische Chemie und weitere diagnostische Tests ändern und
möglicherweise
die Qualität
des transfundierten Bluts oder Blutprodukts beschädigt wird.
Biokügelchen
und Ionenaus tauschharze sind ebenfalls zum Entfernen von Methylenblau
verwendet worden. (siehe WO-A-9516348), wie auch hydrophobe Liganden
(siehe WO-A-9500631).
-
Zusätzlich sind Methylenblau und
eine Vielzahl anderer Farbstoffe dafür bekannt, "Desinfektionsmittel"-Eigenschaften zu haben. Das bedeutet,
dass diese Farbstoffe selbst in Abwesenheit von Licht das Wachstum
verschiedener Mikroben, insbesondere Bakterien, inhibieren können. Die
Ursache dieser Desinfektionseigenschaften ist nicht vollständig bekannt.
Da viele der Desinfektionsmittel-Farbstoffe Oxidations-Reduktions(Redox)-Potentiale
im Bereich vieler Elektronentransportpfade des oxidativen Metabolismus
haben, scheint es möglich,
dass diese Farbstoffe durch das "Kurzschließen" dieser Elektronentransportpfade
agieren. Im allgemeinen zeigen die Farbstoffe eine unterschiedliche
Wirkung gegenüber
Gram-negativen im Vergleich zu Gram-positiven Bakterien, wobei elektronegative
Farbstoffe wirksamer bei Gram-negativen Bakterien und elektropositive
Farbstoffe wirksamer bei Grampositiven Bakterien sind.
-
Humanblut und Blutfraktionen haben
häufig
eine begrenzte Lebensdauer, da Bakterien, die irrtümlicherweise
von der Haut des Blutdonors in das Blut eingeschleppt worden sind,
sich im Blut vermehren und es letztendlich nicht verwendbar machen.
Bis heute ist keine wirksame Weise des Umgangs mit diesen bakteriellen
Kontaminanten entwickelt worden. Die Zugabe von Antibiotika oder
chemischen Desinfektionsmitteln ist nicht wünschenswert, da sie, obwohl
sie wirksam sind, das Problem des Einschleusens dieser Mittel in
Patienten zusammen mit dem Blut oder der Blutfraktion verursachen.
-
Ziele und Zusammensetzung
der Erfindung
-
Deswegen ist es ein Ziel der vorliegenden
Erfindung, ein Mittel zum einfachen Entfernen von Desinfektionsfarbstoffen
aus dem Blut, Blutprodukten oder anderen verderblichen Flüssigkeiten,
denen Farbstoffe zugesetzt worden sind, um eine virale Kontamination
zu eliminieren oder die bakterielle Reproduktion zu verhindern,
zur Verfügung
zu stellen;
es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung,
ein Material und ein Verfahren zum Entfernen von Desinfektionsmittel-Farbstoffen
zur Verfügung
zu stellen, ohne die Chemie des behandelten Bluts oder Blutprodukts ernsthaft
zu verändern;
und
es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen
Kit zum Sichern einer verlängerten
Lagerfähigkeit von
plättchenhaltigen
Lösungen
zur Verfügung
zu stellen.
-
Diese und weitere Ziele werden einem
gewöhnlichen
Fachmann nach dem Lesen der folgenden Beschreibung klar und werden
durch die Verwendung eines Filters aus Polyvinylalkohol-Acetal-Copolymer
zur Verfügung
gestellt. Dieses Material zeigt eine außergewöhnliche Avidität für eine Anzahl
an Desinfektionsfarbstoffen, wobei es sie schnell aus Blut oder
Blutbestandteilen entfernt, während
es nur eine begrenzte Auswirkung auf die folgende chemische Analyse
des behandelten Bluts hat. Das Filtermaterial ist im allgemeinen
eine poröse
Matrix, die keine Partikel oder Feinstoffe in das behandelte Produkt
freisetzt und seine weiße
Farbe zeigt das Festhalten des Farbstoffs schnell an. Die Zugabe
von Desinfektionsfarbstoffen gefolgt von der späteren Entfernung bietet ein
Verfahren zum Verlängern
der Nutzungsdauer gereinigter Plättchenfraktionen.
-
Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
-
Die Ziele und Merkmale der vorliegenden
Erfindung, von denen angenommen wird, dass sie neu sind, werden
genauer in den anhängenden
Ansprüchen
ausgeführt.
Die vorliegende Erfindung wird sowohl hinsichtlich des Aufbaus und
der Operationsweise am besten unter Bezugnahme der folgenden Beschreibung,
die zusammen mit den begleitenden Zeichnungen hinzugezogen wird,
ebenso verstanden wie weitere Ziele und Vorteile:
1 zeigt ein Querschnittdiagramm
einer einfachen Filtervorrichtung, die in der vorliegenden Erfindung
verwendet wird; und
2 zeigt
einen Apparat zum Verwenden der vorliegenden Erfindung, um die Lagerfähigkeit
von Plättchenkonzentraten
zu verlängern.
-
Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
-
Die folgende Beschreibung wird zur
Verfügung
gestellt, um jedem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung auszuführen und
zu verwenden, und führt
die besten Modi, die vom Erfinder zum Ausführen dieser Erfindung in Erwägung gezogen
werden, aus. Zahlreiche Modifizierungen werden dem Fachmann leicht
klar, da die generischen Prinzipien der vorliegenden Erfindung hier
besonders zum Zurverfügungstellen
eines Verfahrens zur Verwendung von Polyvinylalkohol-Acetal-Copolymer
zum Entfernen von Desinfektionsfarbstoffen aus Blut und Blutprodukten
definiert worden sind.
-
Mit "Desinfektionsfarbstoffen" wird jeder einer
Reihe künstlicher
organischer Farbstoffe, die im allgemeinen als "vitale Farbstoffe" bekannt sind, bezeichnet, einschließlich Methylenblau
und verwandter Thionin-Farbstoffe
(elektronegative), Acridinorange, Acridingelb und verwandte Acriflavine
(Acridin)-Farbstoffe (elektropositiv), Chinacrin und seine Derivate,
Brilliantgrün,
Gentianviolett, Kristallviolett und verwandter Triphenylmethan-Farbstoffe
(elektropositiv) und Bisnaphthalin-Farbstoffe wie Trypanblau und
Trypanrot.
-
Das Polyvinylalkohol-Acetal(PVAA),
das gegenwärtig
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, ist
ein besonderer medizinischer Grad des Polymers, das als MEROCEL® (registrierte
Marke) bekannt ist und hergestellt wird von der Merocel Corporation
of Mystic, CT. Dieses Material wird bereits als chirurgische Schwämme und
Verpackungen weit verwendet. Es hat eine gleichmäßige Porengröße und setzt weder
Feinstoffe noch gelöste
Substanzen frei. Während
seine Avidität
für Desinfektionsfarbstoffe
im allgemeinen von PVAA aus anderen Quellen geteilt wird, sind die
wünschenswerten
Porositätseigenschaften
und die Freiheit von kontaminierenden Lösungen nicht aus alternativen
PVAA-Materialien leicht zu erkennen. Während PVAA im allgemeinen in
Form von schwammartigen porösen
Tupfern verwendet wird, kann es auch als geschnitzeltes oder granuliertes
Material verwendet werden. PVAA war bekannt für das Entfernen von Iod (siehe WO-A-9822151).
Eine ungewöhnliche
Eigenschaft von PVAA ist seine augenscheinliche Eigenschaft, viele elektronegative
wie auch elektropositive Farbstoffe zu binden. Die meisten Bindematerialien
binden nur negative oder positive Farbstoffe, aber nicht beide.
-
Nahezu jeder Filterhalter oder jede
Säulenchromatographie-Vorrichtung
kann zur Durchführung
der vorliegenden Erfindung verwendet werden. 1 zeigt ein Beispiel eines Filters oder
einer Säulenvorrichtung 10 zur
Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Die Filtervorrichtung 10 hat
einen zylindrischen hohlen Körper 12,
der aus Polycarbonat-Kunststoff hergestellt ist, aber Acrylsäure, Polysulfon
oder jedes einer Anzahl optisch transparenter Materialien, wie beispielsweise
Glas, kann verwendet werden. Die Filtervorrichtung 10 hat einen
oberen Einlass 14 und einen unteren Abfluss 16.
Diese sind vorteilhafterweise mit Luer- Anschlüsse ausgerüstet, um Bestandteile, die
für gewöhnlich bei
der Behandlung von Blut verwendet werden, zu beinhalten. luer-lock,
swage-lock und jeder einer Anzahl zusätzlicher Typen von Anschlüssen (d.
h. Leitungsanschlüssen) können jedoch
leicht substituiert werden. Es wird schnell erkennbar, dass es ein
Schlüsselfaktor
ist, dass das Filtermaterial innerhalb der Vorrichtung 10 sichtbar
sein sollte, so dass die Absorption des Farbstoffs beobachtet werden
kann und eine neue Vorrichtung 10 in Dienst genommen werden
kann, wenn die ursprüngliche
Vorrichtung mit dem Farbstoff gesättigt worden ist (was durch
das Annähern
des Farbstoffs an den unteren Ausfluss 16 bewiesen wird).
-
Bei der tatsächlichen Verwendung enthält eine
Filterkammer 36 im allgemeinen einen oder mehrere PVAA-Filtertupfer 20.
Um die komplette Entfernung des Desinfektionsmittel-Farbstoffs zu
sichern, ist es vorteilhaft, ei ne Vielzahl an Tupfern zu verwenden,
die die Filterkammer 36 fast ausfüllen. Sobald die Tupfer den Farbstoff
absorbieren, werden sie zunehmend gefärbt (dieses setzt voraus, dass
Plasma oder relativ farblose Blutfraktionen verarbeitet werden;
im Fall von Vollblut muss der Filter gespült werden, um die Farbe zu
beobachten). Beim Einstellen des geeigneten Volumens an PVAA (d.
h. die Anzahl an Filtertupfern) wird bevorzugt eine ausreichende
Tiefe an PVAA zu verwenden, dass einige vollständig weiße PVAA bei Ende der Filtration am
Grund des Filterbehälters 36 verbleiben.
Dies stellt sicher, dass das Endprodukt frei von Desinfektionsmittelfarbstoff
ist.
-
Die PVAA-Filtertupfer werden von
einer gesinterten Scheibe oder einer ähnlichen permeablen Struktur gehalten.
Die gesinterte Scheibe 18 ist relativ dünn und besteht aus geeignetem
Kunststoff oder einem anderen inerten Material, und alternativ kann
sie aus einem Teil aus Edelstahl oder einer anderen Rasterung oder einer
perforierten Metallscheibe bestehen. Die Scheibe 18 ist
perforiert, so dass sie den PVAA Tupfer halten kann, ohne den Flüssigkeitsfluss
signifikant zu stören.
Als eine Alternative für
PVAA-Filtertupfer
ist es auch möglich,
die Filtervorrichtung 10 mit granulärem oder zerschnitzeltem PVAA-Material
zu füllen.
Ein möglicher Vorteil
eines solchen Materials liegt darin, dass es leicht in die Filtervorrichtung 10 gefüllt werden
kann. Wenn granuläres
oder zerschnitzeltes Material verwendet wird, ist es besonders kritisch,
dass die gesinterte Scheibe 18 oder ihr Gegenstück mit einer
Struktur ausgewählt
wird, die dem Verstopfen durch das granuläre PVAA widersteht.
-
Bei der normalen Verwendung wird
eine Plasma- oder Blutquelle mit Hilfe eines Schlauchs mit dem oberen
Einlass 14 verbunden. Oft ist die Quelle ein Blut 42,
das über
die Vorrichtung 10 gehängt
wird, so dass die Flüssigkeit
durch den Einlass 14 durch die Schwerkraft einfließt. Alternativ
dazu kann eine peristaltische Pumpe verwendet werden, um die Flüssigkeit
durch den Einlass 14 zu drücken. Es wird klar, dass ein
Hauptziel der Erfindung darin liegt, dem Blut zu ermöglichen,
verarbeitet zu werden, ohne die Gefahr einer Kontaminierung des
Personals oder der Laborausrüstung.
Deswegen ist es bevorzugt, dass alle Bestandteile Einwegmaterial
sind, so dass potentiell infiziertes Gut außerhalb des Kontakts mit dem
Personal oder der ständigen
Laborausrüstung
gehalten wird.
-
Nachdem die vollständige Menge
der Flüssigkeit,
das die Entfernung von Farbstoff benötigt, in die Vorrichtung 10 geflossen
ist und durch den Ausfluss 18 in ein Aufnahmebehältnis geflossen
ist, wie beispielsweise einen frischen Blutbeutel (nicht gezeigt),
kann ein beträchtliches
Volumen von Flüssigkeit
durch den PVAA zurückgehalten
werden. Im Falle gereinigter Blutfaktoren wie beispielsweise Koagulationskonzentrationen
kann dieses Volumen zurückgehaltener
Flüssigkeit
einen beträchtlichen ökonomischen
Wert darstellen. Deswegen kann ein Vakuum durch den Auslassanschluss 18 angewendet
werden, nachdem die gesamte Flüssigkeit durch
den Einlass 16 eingeflossen ist oder positiver Luftdruck
kann durch den Einlass 16 angewendet werden, um diese zurückgehaltene
Flüssigkeit
zu extrahieren. Alternativ dazu können die PVAA-Tupfer mechanisch
gequetscht werden, um die gebundene Flüssigkeit freizusetzen.
-
Beispiel 1
-
Um die Fähigkeit der vorliegenden Erfindung
zum Entfernen des Desinfektionsmittelfarbstoffs Methylenblau aus
menschlichem Blut zu testen, wurde ein Experiment unter Verwendung
von Methylenblau durchgeführt,
um entweder humanes Plasma oder eine wässrige Lösung aus humanem Serum-Albumin
(HSA) zu behandeln. Albumin wurde verwendet, da es ein Hauptbestandteil
des Blutplasmas ist, und für
seine Fähigkeit, an
verschiedene Substanzen mit hoher Affinität zu binden, bekannt ist. Daher
stellt es die schlimmste mögliche Situation
zur Entfernung von Methylenblau dar. Andererseits stellt humanes
Plasma, das ein Gemisch aus vielen Bestandteilen umfasst, einen
guten Standard zum Beurteilen dar, ob das Filterverfahren irgendeine
der Substanzen neben Methylenblau entfernt. Ein Milliliter einer
4,0 mg/ml Stocklösung
an Methylenblau in Wasser (finale Methylenblau-Konzentration 0,08
mg/ml) wurde zu 50 ml humanem Plasma hinzugegeben und zu 50 ml einer
4%igen (Gewicht pro Volumen) wässrigen
Lösung
aus HAS. Dies stellt eine höhere
Konzentration an Methylenblau dar, als für gewöhnlich bei einem Fotodesinfizierungsverfahren
verwendet wird. Die Methylenblau-Ausgangslösung war im wesentlichen blickdicht
und die Zugabe zu 0,08 mg/ml stellt eine dunkelblaue Plasma- oder
Albuminlösung
her.
-
In beiden Fällen wurde die Filtervorrichtung
10 der
1 mit 25 CF 150 MEROCEL
®-Tupfern
(26 mm Durchmesser-Scheiben, Katalog Nr. 820170) gefüllt. Nachdem
die HSA-Lösung
durchgeleitet wurde, waren die oberen 12 Tupfer eindeutig blau gefärbt, wobei
der obere Tupfer sehr dunkel war, während der 12. Tupfer nahezu
farblos war. Die unteren 13 Tupfer bleiben farblos. Ähnliche
Ergebnisse wurden mit humanem Plasma beobachtet. In beiden Fällen war
die gefilterte Lösung
farblos, was im wesentlichen die vollständige Entfernung des Methylenblaus
anzeigt. Die Proben des humanen Plasmas wurden sowohl vor und nach
der Filtration durch den PVAA einer kli nischen Chemieanalyse unterworfen,
wobei die Ergebnisse in Tabelle 1 angegeben werden. Tabelle
1
-
Mit der Ausnahme von Triglyceriden
waren die Ergebnisse nicht statistisch unterschiedlich, was darauf hinweist,
dass PVAA ein herausragender Bindestoff für Methylenblau ist, während er
nur geringe oder keine Affinität
für andere
medizinisch wichtige Plasmabestandteile hat. Die Ergebnisse mit
den Triglyceriden sind besonders interessant und möglicherweise
nützlich.
Offensichtlich ist Methylenblau-Farbstoff ausreichend lipophil,
um die Triglyceride bevorzugt abzutrennen. Wenn Methylenblau an
PVAA bindet, bindet es auch die Triglyceride an PVAA. In diesem
Beispiel ist jedes gege bene Gewicht an Methylenblau in der Lage,
mindestens 10-mal sein Gewicht an Triglyceriden zu binden (d. h.
0,08 mg/ml Methylenblau entfernt 0,91 mg/ml Triglyceride). Dies
stellt eine einzigartige Methode zum Entfernen von Triglyceriden
zur Verfügung,
z. B. beim Herstellen eines Kontrollmaterials der klinischen Chemie.
Es ist ebenfalls in Erwägung
zu ziehen, dass dieses Verfahren zum Entfernen von Triglyceriden
direkt aus dem Blut von Hyperlipidämiepatienten unter Verwendung
eines Plasmapheresetyp-Aufbaus verwendet werden kann. Das bedeutet,
dass ein System, das Blut aus einem Patienten entnehmen könnte, Methylenblau
hinzugibt, das Methylenblau-Blut durch PVAA filtert, um das Methylenblau
und die Triglyceride entfernt und das Blut dann dem Patienten zurückführt.
-
Da Albumin im allgemeinen Methylenblau
mit einer beträchtlichen
Affinität
bindet, bietet die PVAA-Bindung von Methylenblau auch ein günstiges
Mittel zum Reinigen von Albumin. Wenn PVAA mit Methylenblau gesättigt ist,
beispielsweise durch das Behandeln mit einer l%igen Gew./Vol.-wässrigen
Methylenblaulösung, gefolgt
vom ausgiebigen Waschen, um lose gebundenen Farbstoff zu entfernen,
kann das erhaltene blaue PVAA als Albumin-reinigendes Reagenz verwendet
werden oder um Albumin vor diagnostischen Tests aus Proben zu entfernen,
die durch das Albumin negativ beeinflusst werden könnten. Wenn
albuminhaltige Lösungen
durch den blauen PVAA geleitet werden, wird eine große Menge
an Albumin an das PVAA gebunden. Das gebundene Albumin kann durch
das Verändern
des pH-Wertes oder das Anwenden weiterer milder Denaturierungsbedingungen,
die dem gewöhnlichen
Fachmann gut bekannt sind, freigesetzt werden. Es ist ebenfalls offensichtlich,
dass das Binden von Albumin auch auf ein "Plasmapherese"-set up übertragbar ist, wobei Albumin
selektiv aus Donoren geerntet werden kann, ohne permanent bedeutende
Volumina an Vollblut zu entfernen.
-
Beispiel 2
-
Es wurden Tests durchgeführt, um
die Fähigkeit
von Methylenblau zu bestimmen, Yersinia enterocolitica, Serratia
marcesceus und Staphylococcus aureus, gewöhnliche Hautoberflächenbakterien,
die häufig
Blut kontaminieren, das für
Transfusionszwecke verwendet werden soll, zu inhibieren. Aliquote
von Humanplasma wurden mit Bakterien versetzt (eine Bakterienspezies
für jedes
Aliquot) in einer Konzentration von 100 Organismen pro ml. Dann
wurden die Allquote in 5 Teile geteilt: Ein Teil diente als Kontrolle,
ein zweiter Teil wurde auf 100 μM
Methylenblau gebracht, ein dritter Teil wurde auf 50 μM Methylenblau
gebracht, ein vierter Teil wurde auf 10 μM Methylenblau gebracht, und
ein fünfter
Teil wurde auf 5 μM
Methylenblau ge bracht. Die Aliquote wurden über Nacht bei Raumtemperatur
inkubiert, durch eine ausreichende Dichte an PVAA gefiltert, um
alle sichtbaren Spuren an Methylenblau zu entfernen, und 1 ml jeder
Behandlung wurde auf die Oberfläche
einer Nähragar-Petrischale
ausplatiert. Die Plättchen
wurden gerüttelt,
um die Probe über
die gesamte Agaroberfläche
zu verteilen und wurden dann bei 37°C für 24 h inkubiert. Die bakteriellen
Kolonien wurden dann gezählt; die
Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle
2
-
Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Methylenblau-Behandlung selbst bei niedrigen Konzentrationen außerordentlich
wirksam beim Abtöten
von Y. enterocolitica und S. marcescens, Gram-negativen Bakterien war.
Der Farbstoff war jedoch beim Eliminieren von S. epidermidis, einem
Gram-positiven Bakterium, weniger wirksam, außer bei relativ hohen Konzentrationen.
Es ist eine bekannte Beobachtung, dass Mittel, die Gram-negative
Bakterien betreffen, oft gegenüber
Gram-positiven Spezies unwirksam sind. Da die vorliegende Erfindung
jedoch die wirksame Entfernung selbst hoher Farbstoffkonzentrationen
erlaubt, kann es möglich sein,
selbst S. epidermidis wirksam zu inhibieren.
-
Beispiel 3
-
Die Fähigkeit von PVAA an Acridinorange
zu binden, wurde unter Verwendung von 4,0 mg/ml Lösung des
Farbstoffs in destilliertem Wasser getestet. 1 ml dieser Ausgangslösung wurde
jeweils zu 50 ml destilliertem Wasser, humanem Plasma und 4% HAS
gegeben. Jede dieser Lösungen
wurde dann durch einen Stapel von 25 CF150 MEROCEL®-Tupfern
filtriert. Die vollständige
Entfernung des Farbstoffs wurde in jedem Fall erreicht, was darauf
hindeutet, dass die PVAA-Affinität
für Acridinorange
ziemlich hoch ist. Dies macht es möglich, Acridinorange-Zugabe
zu Blut oder Blutprodukten als ein Mittel zum Zerstören von
Protozonpathogenen wie beispielsweise Plasmodien (Malaria) oder
Trypanosomen (Schlafkrankheit) zu verwenden. Acriflavine und verwandte
Farbstoffe sind sehr wirksam beim Abtöten dieser Organis men, aber
sind viel zu toxisch, um sie in Blut oder Blutprodukten zu verwenden.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, Blut oder Blutprodukte wirksam
zu behandeln, um diese Parasiten zu zerstören (wobei einige jedoch innerhalb
der roten Blutkörperchen
sein können)
und um den Farbstoff vor der Verabreichung des Bluts oder der Blutprodukte
an Patienten zu entfernen.
-
Beispiel 4
-
Sorgen über bakterielle Kontaminierungen
hat bei den zuständigen
Behörden
dazu geführt,
dass sie die erlaubte Lagerfähigkeit
der Plättchenkonzentrate
von 7 Tage auf 5 oder weniger Tage reduziert haben. Die Verwendung
von Plättchenkonzentraten
ist bei der Behandlung einer Anzahl an wichtigen Erkrankungsstadien notwendig
und die gegenwärtig
inadäquate
Versorgung mit Plättchenkonzentraten
könnte
verlängert
werden, indem die Plättchenkonzentrate
7 Tage oder älter
sind, zurückgeführt werden.
Hierfür
wurden Plättchenkonzentrate
mit bakteriellen Kontaminaten versetzt und Methylenblau wurde hinzugegeben,
um zu sehen, ob der Desinfektionsmittel-Farbstoff verwendet werden
kann, um die Plättchenkonzentrat-Dauer
zu verlängern.
-
Plättchenkonzentrate wurden mit
100 Mikroorganismen je ml an S. marcescens, Y. enterocolitica oder S.
epidermidis versetzt. Methylenblau wurde zu einer 100 μM, 50 μM, 10 μM oder 5 μM hinzugegeben
und die Proben wurden bei Raumtemperatur für 96 h inkubiert. Nach dieser
Inkubation wurden die Proben auf einem Nähragar ausquartiert und bei
37°C für 24 h inkubiert.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Kolonienanzahlen auf den Agarplatten. Tabelle
3
-
Diese Ergebnisse zeigen an, dass
Methylenblau in Gegenwart von Plättchen
immer noch sehr wirksam beim Inhibieren von Gram-negativen Bakterien
selbst bei niedrigen Methylenblaukonzentrationen ist. Wichtiger
noch, schien die Plättchenmorphologie
und die Funktion nicht durch das Methylenblau betroffen zu sein,
wie durch Standardtests bestimmt wurde. Des weiteren hat die Entfernen
von Methylenblau durch das Durchleiten der Plätt chenkonzentrate durch PVAA-Filter
nicht die Plättchenfunktion
oder Morphologie negativ beeinflusst. Deswegen scheint es, dass
die Zugabe von Methylenblau zu Plättchenkonzentraten in der Regel verwendet
werden, um das bakterielle Wachstum signifikant zu verzögern und
dadurch die Lagerfähigkeit
der Plättchenkonzentrate
zu verlängern.
-
Während
es möglich
ist, Methylenblau zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verarbeitens des Konzentrats
zuzugeben, ist es bevorzugt, Plättchenbeutel
zur Verfügung
zu stellen, die bereits die benötigte Menge
des Farbstoffs als trockenes Pulver enthalten. Wenn plättchenhaltige
Lösungen
in den Beutel eingeleitet werden, löst sich der Farbstoff und beginnt
sofort damit, die Bakterien zu zerstören. Direkt vor der tatsächlichen
Verwendung der Plättchenkonzentrate
kann die Lösung
durch PVAA-haltige Filtervorrichtungen 10 geleitet werden,
die dem in 1 ähnlich sind. 2 zeigt einen Blutbeutel 42,
der bereits die geeignete Menge an Methylenblau enthält. Wenn
eine plättchenhaltige
Lösung
durch den Einlass 44 in den Beutel gegeben wird, wird das
Methylenblau gelöst
und beginnt sofort damit, gegen bakterielles Wachstum zu schützen. Sobald
die Plättchen
einem Patienten verabreicht werden sollen. verlässt die Lösung den Beutel 42 durch
den Ausguss 46 und wird durch eine der PVAA-Filtervorrichtungen 10 entfernt,
um das Methylenblau zu entfernen. Der Blutbeutel 42 und
der Filter 10 kann vorteilhafterweise als ein Kit wie in 2 konfiguriert werden, mit
einer Leitung 48, die dazu dient, die Lösung aus dem Blutbeutel 42 in
den Filter 10 und dann in den Patienten zu leiten.
-
Beispiel 5
-
Hinsichtlich der bekannten Neigung
von sauren Desinfektionsfarbstoffen gegen verschiedene Organismen
wirksamer zu sein als basische Desinfektionsmittel-Farbstoffe, kann
es einen technischen Vorteil beim Verwenden von Mischen aus beiden
Farbstofftypen geben. Es war jedoch nicht offensichtlich, ob zwei
gegenteilig geladene Farbstoffe simultan verwendet werden können, um
durch einen PVAA-Filter entfernt werden zu können. Die ältere Literatur lehrt auch,
dass saure Farbstoffe bei sauren pH-Werten wirksamer sind, während basische
Farbstoffe bei alkalischen pH-Werten wirksamer sind. Es wurde ein
Experiment durchgeführt,
wobei Methylenblau zu einer Testlösung in einer Konzentration
von 50 μM
hinzugegeben wurde. Dann wurde Kristallviolett hinzugegeben, um
die Lösung
auf 0,025% Kristallviolett zu bringen. Wenn 50 ml dieser Lösung schnell
durch 25 Tupfer PVAA (CF 150 MEROCEL®-Tupfer)
filtriert wurden, wurden alle sichtbaren Spuren beider Farbstoffe
entfernt. Um die Desinfektionsfähigkeit
dieser Farbstoffe zu testen, wurden verschiedene Farbstoffkonzentrationen
mit Plasma gemischt und mit Pseudomonas aeruginosa (dem resistentesten
Gram-negativen Bakterium (und/oder Staphylococcus epidermidis (dem
resistentesten Gram-positiven Bakterium) zu 100 Organismen je ml
versetzt. Die Tests wurden wie oben beschrieben in Beispiel 2 durchgeführt. Im
Plasma gab es eine vollständige
Zerstörung
von S. epidermidis durch Kristallviolett und eine vollständige Zerstörung von S.
epidermidis und P. aeruginosa mittels eines Gemischs aus zwei Farbstoffen.
Außerdem
bewirkte Kristallviolett immer noch eine vollständige Zerstörung, wenn verpackte rote Blutzellen
mit S. epidermidis versetzt wurden.
-
Fachleute werden es zu schätzen wissen,
dass zahlreiche Adaptierungen und Modifikationen der gerade beschriebenen
bevorzugten Ausführungsform
konfiguriert werden können,
ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen. Deswegen ist
es verständlich,
dass die Erfindung innerhalb des Bereichs der angehängten Ansprüche anders
als spezifisch hierin beschrieben durchgeführt werden kann.
