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Septischc Komplikationen stehen heute mit an der Spitze der
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Todesursachen von Patienten, die wegen einer anderweitigen schweren
Erkrankung auf Intensivstationen liegen. Ursachen sind die geschw-ichte Infektabwehr
durch die Grundkrankheit und die nicht völlig zu verhindernde Verschleppung von
Krankheitserregern anderer Patienten.
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Heute geben uns über 60 Antibiotica aus 13 verschiedenen Präparategruppen
die Möglichkeit in die Hand, einen nachgewiesenen Keim gezielt anzugehen. Eine frühzeitige
Diagnose und damit eine verbesserte Therapiemöglichkeit kann die über lebenschance
von Patienten mit bakteriellem oder mykotischem Systembefall entscheidend verbessern.
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Die Diagnose einer Sepsis ergibt sich aus dem klinischen Bild (Fieber,
Schüttelfrost, Leukozytose, Linksverschiebung im Differentialblutbild, Verbrauchskoagulopathie,
u. U. septischer Schock und andere, nicht obligate Zeichen) und aus dem kulturellen
Keimnachweis im Blut des Patienten. Bei positivem Keininachweis ergibt das Antibiogramm
zugleich wichtige Anhaltspunkte für die wirkungsvollste antibiotische oder antimykotische
Therapie.
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Die heute gebräuchlichen bakteriologischen Nachweisverfahren stellen
im wesentlichen nur technische Varianten der um die Jahrhundertwende entwickelten
Blu Lkul turtechniken dar. Durch die Einführung der Liquoidvenüle und der Blutkulturflasche
mit vorgefertigtem Nährboden wurde eine relative Optimierung der klassischen Verfahren
erreicht. Für klinische Belange ist die Ausbeute aber auch mit diesen Verfahren
noch nicht zuiriedenstellend. Die bisllerigen Verbesserungen der BlutkulturverEahren
beschrnkten sich auf die Entwicklung empfindlicherer bakteriologischer Nachweistehniken
. Das gilt sowohl für die radiometrische Messung von markicrtom C02 als auch für
die Membranfiltcrmethodc und illre Weiterentwicklungen.
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Die Chance, mit der herkömmlichen Blutentnahmetechnik zu Kulturzwecken
den Erreger zu identifizieren, ist mit nur 30 % aller klinisch sicheren Fälle erschreckend
gering. Diese niedrige Trefferquote könnte nach heutigem Wissen zwei Ursachen haben;
1. Ein septischer Streuherd gibt die Erreger nicht kontinuierlich, sondern schubweise
in die Blutbahn ab. Der ideale Zeitpunkt, den Erreger aus der Blutbahn zu erhalten,
liegt schon vor dem Beginn der klinischen Symptome wie Fieber und Schüttelfrost.
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2. Ein großer Teil der Patienten ist bereits mit Antibiotica vorbehandelt.
Diese Antibiotica gelangen unweigerlich zusammen mit den Erregern ins Kulturmedium
und unterdrücken das Keimwachstum. Die Blutkultur wird fälschlicherweise negativ.
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--Dies bedeutet, daß man in 70 % der Fälle von klinisch sicherer Sepsis
gegen einen unbekannten Erreger kämpft, meistens auch, ohne zu wissen, ob es sich
um eine bakterielle Sepsis oder um eine Pilzsepsis handelt. Die Wahl des richtigen
Antibioticums oder Antimykoticums wird damit zur Glückssache.
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Seit Jahren wird versucht, diese diagnostische Lücke zu schließen.
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Neue Methoden wurden entwickelt, die schneller und sicherer als die
klassischen Verfahren den Erregernachweis im Blut liefern sollten. Aber auch diesen
neuen Verfahren sind drei entscheidende Nachteile erhalten geblieben. Noch immer
muß die Blutprobe genau zum Zeitpunkt des Einschwemmens von Mikroorganismen in die
Zirkulation entnommen werden, im Idealfall also, bevor der Patient mit einem Temperaturanstieg
rcagiert. Außerdem gelangt immer nur ein kleines Aliquot aus dem großen Blutreservoir
zur Untersuchung. Bei antibiotisch vorbehandelten Patien Len werden scllließlicll
Antibioticareste mit in die Kultur gebracht und bewirken dort eine ilemmung des
Keimwachstums.
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Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Diagnoseverfahren zu schaffen,
welches die erwähnten Nachteile nicht aufweist und es ermöglicht, Krankheitserreger,
die zu einem unbekannten Zeitpunkt in den Kreislauf des Patienten eindringen, zu
diagnostischen Zwecken zu isolieren, gegebenenfalls von anhaftenden Antibioticaresten
zu befreien und mit möglichst geringem Arbeitsaufwand zu bestimmen.
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Diese Aufgabe wurde durch die obenstehenden Patentansprüche gelöst.
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Das der Erfindung zugrunde liegende Prinzip der Hämoperfusion wird
seit längerem angewendet zur Behandlung schwerer Intoxikationen, z. B. Schlafmittelvergiftungen.
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Es handelt sich bei diesem Verfahren um die Abtrennung von Pharmaka
aus dem Blut durch Adsorption an Kohle, also eine rein therapeutische Behandlung.
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Es war überraschend, daß nunmehr ein diagnostisches Verfahren zur
Verfügung gestellt werden kann, welches den Nachteil infektiöser Partikel, d. h.
Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze sowie Viren ermöglicht, ohne daß sich signifikante
Veränderungen der natürlichen Blutbestandteile, wie z. B. Erythrozyten, Leukozyten
und Thrombozyten, ergeben.
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Als Adsorbentien eignen sich hämocompatible, die Erreger selektiv
bindende Polymere, wobei diese als Adsorbens per se eingesetzt werden, aber auch
auf einen porösen Träger aufgetragen werden können, d. h. alle in Frage kommenden
Polymere können außer als Schichtbildner auch als "bead-material" dienen, sofern
sie genügend porös sind oder gemacht werden können.
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Als Polymere können beispielsweise Polyacrylate oder Polymethacrylate,
wie z. B. Polyhydroxyäthylmethacrylat verwendet werden. Als weitere Polymere seien
Adsorberharze, wie Amberlite XAD II, Celluloseacetat, Kollodium und Nylon genannt.
Als Träger der Schichtbildner können beispielsweise poröse Materialien wie Glas,
keramische Materialien, z. B.
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Ton, Metalloxide wie Aluminiumoxid, Titanoxid, Zirkonoxid, Siliciumoxid
oder Aktivkohle verwendet werden.
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Es hat sich acrylhydrogelbeschichtete Pflanzenkohle bewährt. Der Anteil
des Beschichtungsmittels beträgt 0,5-10 i, vorzugsweise 2 % des Gesamtgewichts des
Adsorbens. Das Verfahren der Beschichtung ist dem Fachmann geläufig und bedarf keiner
näheren Erläuterung.
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Weiterhin zu verwenden sind als Adsorbens mit aufgedampfter Kohle
beschichtetes, poröses Material, wie beispielsweise Glas.
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Es eignet sich auch poröses Glas, welches biocompatibel gemacht wird
durch Kupplung mit heparin und/oder Albumin, welches antithrombogen wirkt. Für die
Bindung von Heparin kann z. B.
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die Verknüpfung mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids herangezogen
werden. Als Glas eignet sich das sog. "Controlled bor glas" Die Adsorbentien können
außer in Form kleiner Partikel oder Granulen z. B. auch in Form von Platten oder
Folien vorliegen, die in die Elämoperfusionskammer eingelegt werden und leicht entnommen
und bequem in den Nährboden oder die Nährlösung eingebracht werden können.
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Die Bestimmung der Erreger erfolgt vorzugsweise im adsorbierten Zustand.
Ilierin liegt ein wesentlicher Vorteil, weil das Adsorbcns mit den daran gebundenen
Erregern direkt in das Nährmedium eingebracht werden kann. Es können die an sich
bekannten mikrobiologischen, virologischen oder elektronenmikroskopischen Nachweismethoden
herangezogen werden.
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ifierzu wird das mit den Erregern angereicherte Adsorbens im Fall
von Bakterien und Pilzen folgendermaßen angezüchtet: Mit einer in einem geeigneten
Nährmedium sterilen Pinzette werden ca. 20-30 Adsorbens-Partikel möglichst schonend
in die Oberfläche des Nährbodens eingedrückt. Gleichzeitig können flüssige Nährmedien
mit einigen Partikeln beschickt werden.
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Die Bebrütung erfolgt bei 37 0C. Die weitere Identifizierung erfolgt
mit den üblichen Routinemethoden der Bakteriologie und Mykologie. Im Fall von Viren
erfolgt eine Züchtung auf Eikulturen.
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Es ist ferner möglich, das Adsorbens mit Puffer zu waschen, mit Alkohol
zu entwässern, mit gepuffertem Glutaraldehyd zu behandeln und rasterelektronenmikroskopisch
zu untersuchen.
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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich insbesondere
eine Vorrichtung, die durch eine in einem extrakorporalen Kreislauf sich befindende
an beiden Seiten offene, Hämocompatibles, die Bakterien, Pilze und Viren selektiv
bindendes Adsorbens enthaltende Säule (1), in der das Adsorbens (5) durch Filter
(2) mit übergestülptem Dekkel (3) zusammengehalten ist, wobei die Deckel (3) öffnungen
mit Anschluß für Blutzuführende und Blutabführende Schlauchleitungen (4) aufweisend
gestaltet sind.
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Die Deckel (3) können beispielsweise so beschaffen sein, daß sie iuf
die Stiulc aufscllraubbar sind. Jedenfalls sind sie leicht und olinc Gefahr der
I<ontalllillatioll abneiuubar zur scllllelle
bequemen Entleerung
des Inhalts, was sehr wesentlich ist. Der Blutabfluß kann mit einem Transfusionsbesteck
(6) mit Filter (7) versehen sein. Als Material der Bestandteile sind inerte, leicht
verarbeitbare Kunststoffe wie Teflon geeignet.
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Die für rein diagnostische Zwecke bestimmte Vorrichtung hat vorteilhaft
geringe Abmessungen. Die Säule weist einen Durchmesser von etwa 1-3 cm und eine
Höhe von etwa 2-10 cm auf.
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Durch das geringe Volumen werden keine der theoretisch an sich möglichen
Nebenwirkungen, wie Blutdruckabfall, Thrombozytopenie, Verlust an Immunglobulinen,
Adsorption verabreichter Medikamente, Hämolyse, ausgelöst.
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Ingesamt ist die Vorrichtung von geringem Volumen, deshalb klinisch
unbedenklich, was einen wesentlichen technischen Fortschritt bedeutet. Sie ist rasch
und bequem handhabbar, mit relativ niedrigen Herstellungskosten belastet und somit
als Wegwerfartikel einzusetzen.
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Figur 1 zeigt die Kapsel. Alle Teile sind vorteilhaft aus Teflon
gefertigt und damit im Autoklaven bei 1300C sterilisierbar. Die Kapsel wird mit
acrylhydrogelverkapselter Pflanzenkohle gefüllt und nach Durchspülung mit physiologischer
Kochsalzlöslmg bei 130cm Autoklaven sterilisiert.
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Tierversuche Zum Vergleich der Effektivität der konventionellen Blutkultur
mit einer Kultur aus Perfusionskohle bot sich zunächst der Tierversuch an. Versuchstiere
waren 250 - 300 g schwere Wistarratten. Eine experimentelle Sepsis wurde durch i,v-Injektion
definierter Keimzahlen von Candida albicans simuliert. Zugang für die Hämoperfusion
waren PVC-Schläuche in den Iliacalgefäßen. Sie wurden in Äthernarkose plaziert-.'
Die weitere Untersuchung erfolgte am wachen Tier im Restrik-.
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tionskäfig.
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Mit einer Flußgeschwindigkeit von 1 - 2 ml/m'in wurde das Blut der
Ratte über eine Rollenpumpe aus der Arterie über die Kohlekapsel zurück in die Vene
befördert. In der Kapsel befanden sich 3 g acrylhydrogelbeschicteter Pflanzenkohle.
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R (Haemocol , Fa. Smith & Nephew, England) ,das restliche Blut
füllvolunen des Systems betrug 3 ml. Zu Versuchsbeginn wurde das System mit Frischblut
von einem Spendertier gefüilt. Zu Beginn der Perfusion wurde mit 100 IE Heparin
antikoaguliert, die später notwendige Heparinisierung richtete sich nach der Lee-White-Gerinnungs
zeit.
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60 min nach i.v.-Injektion von 1 ml der Candida-Suspension wurde zunächst
eine arterielle Blutkultur entnommen, im Anschluß daran die Perfusion für die Dauer
einer Stunde begonnen. Nach Abschluß der Hämoperfusion wurde die Aktivkohle unter
sterilen Kautelen mit Ringerlösung gewaschen. Ein Teil der Kohlepartikel gelangte
zum Kulturversuch, der andere Teil nach Fixierung mit Glutaraldehyd - Sörensen-Puffer
zur rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung.
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Kulturelle Diagnostik Die bakteriologische Verarbeitung der Perfusionskohle
aus den Tierversuchen erfolgte derart, daß sofort nach Abschluß des Tierversuchs
die Perfusionskohle unter sterilen Kautelen entnommen und bakteriologisch aufgearbeitet
wurde.
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Mit der sterilen Pinzette wurden pro Platte ca. 20 Kohlepartikel
auf die festen Nährmedium verteilt und leicht in die Oberfläche eingedrückt Als
Nährboden wurde für die Originalkulturen Saboraud-Maltose-Agar und für die Anreicherungen
Saboraud-Nährmedium flüssig eingesetzt. Äls.Kontrollen zur Erkennung etwaiger Verunreinigungen
wurden gleichzeitig Blutagarplatten und Mac Conkey-Nährböden mitgeführt. Gußplatten
wurden durch Übergießen von etwa 20 über die Petrischale verteilten Kohlepartikeln
mit verflüssigtem Agarrjedium angefertigt.
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Am 2., 4. und 8. Tag wurde aus den flüssigen Anreicherungen (Thioglycolat,
Traubenzuckerbouillon) Material auf die gleichen Nährböden in fester Form überimpft,
wie sie für die Originalkulturen eingesetzt wurden.
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Präparationstechnik für die rasterelektronenmikroskopische Untersuchung.
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Die Kohlepartikel wurden nach Entnahme aus der Patrone in-2 - 3 %igem
auf pH 7.2 gepuffertem Glu,2raldehyd 24 Stunden lang fixiert.
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Das fixierte Material wurde anschließend in mehrfach zu wechselnder
Pufferlösung gewaschen und in einer aufsteigenden Reihe von Alkohol- entwässert.
Aus dem reinen Alkohol wurden die Präparate in mindestens 4 Stufen in Frigen 11
über geführt (Alkohol / Frigen: 2 / 1, 1 / 1, 1 / 2,-reinesFrigen) und in einem
Druckgefäß nach der Kritischen-Punkt-Methode konserviert
Nach Aufbringen
der Kohlepartikel auf die Probenteller des Raster-Elekeronennikroskops wurde eine
elektrisch leitende Schicht mittels einer Sputteranlage aufgebracht. Die Untersuchung
erfolgte mit dem Stereosean Mark II A der Firma Cambridge Ltd, England.
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Mit der diagnostischen Hämoperfusion wird im Gegensatz zu den vorher
diskutierten Techniken eine Optimierung des Untersuchungsmaterials angestrebt. Man
bleibt hierbei über einen längeren Zeitraum in den Kreislauf eingeschaltet, so daß
der Erreger nach dem Ausschwemmen durch diese "Falle" der Kohlekapsel abgefangen
werden muß.
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Die mit der diagnostischen Hämoperfusion durchgeführten Versuche an
der Ratte weisen auf eine größere Empfindlichkeit der Perfusionsmethode gegenüber
der Liquoidvenüle hin. Ergänzende Experimente mit grampositiven und gramnegativen
Keimen sprechen dafür, daß diese Aussage auch für Bakterien gilt. Die überlegene
Nachweisempfindlichkeit dokumentiert sich bei einer Infektionsdosis von 105 bis
107 Keimen pro Tier durch positive Hämoperfusionskulturen bei überwiegend negativen
Liquoidvenülen. Bei den Liquoidvenülen trat in 2 Fällen ein Wachstum zu einem vergleichsweise
späteren Zeitpunkt auf. In einem Fall blieben die Kulturen der Kohle und der Liquoidvenüle
negativ.
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Hervorzuheben ist, daß die Keime bei der Hämoperfusionsmethode in
der Regel direkt und nicht auf dem Umweg über eine flüssige Anreicherung gezüchtet
wurden. Die bakteriologische Aufarbeitung der Kohlepartikel zur Anzüchtung ist einfach
und jedem bakteriologischen Routinelabor zumutbar.
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Die Stabilität der Bindung von Keimen an die Kohleoberfläche eröffnet
die Möglichkeit einer Trennung von Keimen und anhaftenden Antibioticaresten durch
einen einfachen Waschvorgang.
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Durchführung des Verfahrens beim Menschen Eine Teflonkapsel wird mit
2 % acrylhydrogelbeschichteter Aktivkohle (Smith & Nephew, England) gefüllt,
im Autoklaven sterilisiert und in einem extrakorporalen Kreislauf mit dem Patienten
verbunden. Der Anschluß der Kapsel an den Patienten erfolgt in der Regel durch unilaterale
Punktion von Arteria femoralis und Vena femoralis gemäß der Seldinger-Technik. Das
Blut durchströmt die Kapsel von oben nach unten. Es ist nicht notwendig, in das
System eine Blutpumpe einzuschalten. Als zusätzliche Sicherung vor Luft- oder Partikelembolien
dient das kommerzielle Transfusionsbesteck im venösen Rücklauf. Um eine Thrombosierung
im extrakorporalen Kreislauf zu verhindern, werden vor Perfusionsbeginn 5.000 IE
Heparin i. v. injiziert. Soll länger als 60 Min.
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perfundiert werden, sind weitere Heparingaben unter Kontrolle der
Lee-White-Gerinnungszeit erforderlich. Nach beliebig langer Kontaktzeit mit dem
strömenden Blut des Patienten wird der extrakorporale Kreislauf wieder unterbrochen.
Die Aktivkohle kann dann durch Waschen mit einer sterilen Elektrolytlösung von anhaftenden
Antibioticaresten befreit werden, bevor sie mitsamt den ebenfalls haftenden Erregern
in ein Nährmedium gegeben wird.
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In diesem Medium gelingt es dann, wie oben beschrieben, die Keime
zu identifizieren und ihre Empfindlichkeit auf verschiedene Antibiotica und Antimykotica
zu testen. Aus dieser Testung ergeben sich harte Daten, welches Präparat den Patienten
vermutlich am Leben erhalten kann.
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Zur technischen Durchführung der diagnostischen Hämoperfusion gibt
es - je nach dem klinischen Zustand des Patienten - zwei Alternativen. -Patienten
mit-Sepsis entwickeln sehr häufig als Zweitkrankheit ein akutes Nierenversagen.
Wenn der Patient wegen des Nierenversagens sowieso mit der Hämodialyse behandelt
werden muß, genügt es, die Kapsel einfach ins Schlauchsystem der Dialyse mit einzuschalten,
und zwar in den arteriellen Schenkel, jedoch erst nach der Blutpumpe. Je nach Umfluß
ist damit automatisch ein Kontakt der Kohle mit 100-200 ml Blut pro Minute gewährleistet.
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Beim nierengesunden Patienten mit Sepsis hat sich ein anderes Vorgehen
bewährt. Die Kohlekapsel wird zunächst durch Perfusion mit einer Heparin-Kochsalzlösung
(1000 IE auf 1000 ml) von Luftblasen befreit. Nächster Schritt ist die Punktion
je einer Arterie und einer Vene des Patienten mit Kunststoffkanülen, deren Mindestlumen
1.4 mm betragen sollte. Es wird nach der Seldinger-Technik verfahren. Dann wird
die arterielle Punktionskanüle mit dem oberen Ende der Kapsel verbunden, die venöse
Kanüle über ein Transfusionsbesteck mit dem unteren Ende.
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Nach öffnen der Klemmen werden noch einmal 5000 IE Heparin ins System
injiziert, um eine Gerinnung zu vermeiden. Die Perfussion des Systems erfolgt jetzt
druckpassiv, d. h. ohne Zwischenschalten einer Pumpe, aus der Differenz zwischen
arteriellem und venösem Druck. Die optimale Dauer der diagnostischen Hämoperfusion
liegt bei etwa 60 Min. Der durchschnittliche Umfluß bei der hier geschilderten druckpassiven
Perfusion liegt bei 30 ml/min.
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Somit lassen sich insgesamt folgende Vorteile der Hämoperfusionsmethode
gegenüber den herkömmlichen Verfahren definieren.
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Die Hämoperfusion zeichnet sich gegenüber der herkömmlichen Blutkulturtechnik
durch eine größere Nachweisempfindlichkeit aus. Zudem bietet sie den Vorteil, daß
Kulturergebnisse und damit die Antibiogramme der Resistenztestung früher vorliegen.
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Durch einen Spülvorgang nach der Hämoperfusion kann verhindert werden,
daß Antibio-L1ai:este mit in die Kultur gelangen.
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Ein Hauptvorteil esteh jedoch in der Möglichkeit einer länger dauernden
Dräsonz im kreislauf des Menschen. Damit erhöht sich die WahrscheinicL:kern den
Zeitpunkt einer i?eimeinschwemmung nicht zu verpassen.
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Bei herkömmlichen Blutkulturen ist nachteilig, daß sie in der Regel
mehrfach wiederholt werden müssen. Die Gefäßzugänge, die bei der Hämoperfusion erforderlich
sind, sind oft aus anderer Indikation bereits geschaffen (Dialyse, Herzchirugie,
arterielles Druckmonitoring usw.). In diesen Situationen genügt es, die Kapsel mit
den vorgegebenen Anschlüssen zu verbinden. Besonders während einer Dialysebehandlung
ist die Einschaltung der Kapsel ins arterielle System ohne Probleme.
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Die bei der therapeutischen Hämoperfusion von Vergiftungen beschriebenen
Nebenwirkungen sind bei der diagnostischen Perfusion durch das verkleinerte Volumen
der Perfusionskapsel vernachlässigbar gering. Bei 7 Patienten ergaben Kontrollen
von Hämoglobin, Erythrozyten-, Leukozyten- und Thrombozytencount sowie LDH-Aktivität
im Serum vor und nach diagnostischer Perfusion keine signifikanten Veränderungen.
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Zusammenfassend bietet das erfindungsgemäße neue System dem Kliniker
eine Bereicherung seiner diagnostischen Möglichkeiten beim Verdacht auf Septikämie.
Der Patient wird durch die Diagnostik nicht gefährdet. Die Trefferchance für ein
positiveres Ergebnis ist höher als bei den bisher bekannten Verfahren. Zudem ist
im Falle eines positiven Kulturbefundes sowohl die Keimidentifizierung als auch
das Antibiogramm früher als bisher zu erwarten.
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