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Septische Komplikationen stehen heute mit an der Spitze der Todesursachen von Patienten, die wegen einer anderweitigen schweren Erkrankung auf Intensivstationen liegen. Ursachen sind die durch die Grundkrankheit geschwächte Immunabwehr und die nicht völlig zu verhindernde Übertragung der Krankheitserreger von andern Personen bzw. durch Kontakt mit kontaminierten Gegenständen.
Heute geben über 60 Antibiotica aus 13 verschiedenen Präparategruppen die Möglichkeit, einen nachgewiesenen Keim gezielt zu bekämpfen. Eine frühzeitige Diagnose und damit eine verbesserte Therapiemöglichkeit kann die Oberlebenschance von Patienten mit bakteriellem oder mykotischem Systembefall entscheidend verbessern.
Die Diagnose einer Sepsis ergibt sich aus dem klinischen Bild (Fieber, Schüttelfrost, Leukozytose, Linksverschiebung im Differentialblutbild, Verbrauchskoagulopathie, unter Umständen septischer Schock und andere, nicht obligate Zeichen) und aus dem kulturellen Keimnachweis im Blut des Patienten. Bei positivem Keimnachweis ergibt das Antibiogramm zugleich wichtige Anhaltspunkte für die wirkungsvollste antibiotische oder antimykotische Therapie. Die heute gebräuchlichen bakteriologischen Nachweisverfahren stellen im wesentlichen nur technische Varianten der um die Jahrhundertwende entwickelten Blutkulturtechniken dar. Durch die Einführung der Liquoidvenüle und der Blutkulturflasche mit vorgefertigtem Nährboden wurde eine relative Optimierung der klassischen Verfahren erreicht. Für klinische Belange ist die Ausbeute aber auch mit diesen Verfahren noch nicht zufriedenstellend.
Die bisherigen Verbesserungen der Blutkulturverfahren beschränkten sich auf die Entwicklung empfindlicherer bakteriologischer Nachweistechniken. Das gilt sowohl für die radiometrisch Messung von markiertem Co : ! als auch für die Membranfiltermethode und ihre Weiterentwicklungen.
Die Chance, mit der herkömmlichen Blutentnahmetechnik zu Kulturzwecken den Erreger zu identifizieren, wird in der Literatur unterschiedlich beurteilt. Besondere Schwierigkeiten scheint der Nachweis der Erreger bei endokarditischen Septikämien und Pilzseptikämien zu bereiten. So werden bei ausgewählten Patientenkollektiven 70% aller Septikämien erst post mortem aus dem Obduktionsbefund diagnostiziert. Die niedrige Trefferquote könnte nach heutigem Wissen zwei Ursachen haben :
1. Ein septischer Streuherd gibt die Erreger nicht kontinuierlich, sondern schubweise in die Blutbahn ab. Der ideale Zeitpunkt, den Erreger aus der Blutbahn zu erhalten, liegt schon vor dem Beginn der klinischen Symptome, wie Fieber und Schüttelfrost.
2. Ein grosser Teil der Patienten ist bereits mit Antibiotica vorbehandelt. Diese Antibiotica gelangen unweigerlich zusammen mit den Erregern ins Kulturmedium und unterdrücken das Keimwachstum. Die Blutkultur wird fälschlicherweise negativ.
Dies bedeutet, dass man häufig bei klinisch wahrscheinlicher Sepsis gegen einen unbekannten Erreger kämpft, oft auch, ohne zu wissen, ob es sich um eine bakterielle Sepsis oder um eine Pilzsepsis handelt. Die Wahl des richtigen antibakteriellen oder antimykotischen Antibiotikums bzw.
Chemotherapeutikums wird damit zur Glücksache.
Seit Jahren wird versucht, diese diagnostische Lücke zu schliessen. Neue Methoden wurden entwickelt, die schneller und sicherer als die klassischen Verfahren den Erregernachweis im Blut liefern sollten. Aber auch diesem neuen Verfahren sind drei entscheidende Nachteile erhalten geblieben. Noch immer muss die Blutprobe genau zum Zeitpunkt des Einschwemmens von Mikroorganismen in die Zirkulation entnommen werden, im Idealfall also, bevor der Patient mit einem Temperaturanstieg reagiert. Ausserdem gelangt immer nur ein kleiner Anteil aus dem grossen Blutvorrat zur Untersuchung. Bei antibiotisch vorbehandelten Patienten werden schliesslich Antibiotikareste mit in die Kultur gebracht und bewirken dort eine Hemmung des Keimwachstums.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Diagnoseverfahren zu schaffen, welches die erwähnten Nachteile nicht aufweist und es ermöglicht, Krankheitserreger, die zu einem unbekannten Zeitpunkt in den Kreislauf des Patienten eingeschwemmt werden, zu diagnostischen Zwecken zu isolieren, gegebenenfalls von anhaftenden Antibiotikaresten zu befreien und mit möglichst geringem Arbeitsaufwand zu bestimmen.
Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemässe Verfahren zum Nachweis von Erregern, wie Bakterien, Pilzen und Viren, im Blut in Anwesenheit eines gerinnungshemmenden Mittels, dadurch
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gelöst, dass man die Erreger in einem extrakorporalen Blutkreislauf mittels eines selektiv bindenden haemocompatiblen Adsorbens abtrennt und die an das Adsorbens gebundenen Erreger durch übliche bakteriologische, mykologische, virologische oder elektronenmikroskopische Methoden nachweist.
Das der Erfindung zugrunde liegende Prinzip der Hämoperfusion wird seit längerem angewendet zur Behandlung schwerer Intoxikationen, z. B. Schlafmittelvergiftungen. Es handelt sich bei diesem Verfahren um die Abtrennung von Pharmaka aus dem Blut durch Adsorption an Kohle, also eine rein therapeutische Behandlung.
Es war überraschend, dass nunmehr ein diagnostisches Verfahren zur Verfügung gestellt werden kann, welches den Nachweis von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze sowie Viren, ermöglicht, ohne dass sich signifikante Veränderungen der natürlichen Blutbestandteile, wie z. B. Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten, ergeben.
Als Adsorbentien eignen sich hämocompatible, die Erreger selektiv bindende Polymeren, wobei diese als Adsorbens per se eingesetzt werden, aber auch auf einen porösen Träger aufgetragen werden können, d. h. alle in Frage kommenden Polymeren können ausser als Schichtbildner auch als "bead-material" dienen, sofern sie genügend porös sind oder gemacht werden können.
Als Polymeren können beispielsweise Polyacrylate oder Polymethacrylate, wie z. B. Polyhydroxy- äthylmethacrylat verwendet werden. Als weitere Polymeren seien Adsorberharze, wie Amberlite XAD II, Celluloseacetat, Kollodium und Nylon genannt. Als Träger der Schichtbildner können beispielsweise poröse Materialien wie Glas, keramische Materialien, z. B. Ton, Metalloxyde wie Aluminiumoxyd, Titanoxyd, Zirkonoxyd, Siliciumoxyd oder Aktivkohle verwendet werden.
Es hat sich acrylhydrogelbeschichtete Pflanzenkohle bewährt. Der Anteil des Beschichtungsmittels beträgt 0, 5 bis 10%, vorzugsweise 2% des Gesamtgewichts des Adsorbens. Das Verfahren der Beschichtung ist dem Fachmann geläufig und bedarf keiner näheren Erläuterung.
Weiterhin zu verwenden sind als Adsorbens mit aufgedampfter Kohle beschichtetes, poröses Material, wie beispielsweise Glas. Es eignet sich auch poröses Glas, welches biocompatibel gemacht wird durch Kupplung mit Heparin und/oder Albumin, welches antithrombogen wirkt. Für die Bindung von Heparin kann z. B. die Verknüpfung mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids herangezogen
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von Platten oder Folien vorliegen, die in die Hämoperfusionskammer eingelegt werden und leicht entnommen und bequem in den Nährboden oder die Nährlösung eingebracht werden können.
Die Übertragung der Erreger auf den Nährboden erfolgt vorzugsweise im adsorbierten Zustand.
Hierin liegt ein wesentlicher Vorteil. Es können die an sich bekannten mikrobiologischen, virologischen oder elektronenmikroskopischen Nachweismethoden herangezogen werden.
Hiezu wird das mit den Erregern angereicherte Adsorbens im Fall von Bakterien und Pilzen folgendermassen angezüchtet : Mit einer sterilen Pinzette werden zirka 20 bis 30 Adsorbens-Partikel möglichst schonend in die Oberfläche des Nährbodens eingedrückt. Gleichzeitig können flüssige Nährmedien mit einigen Partikeln beschickt werden. Die Bebrütung erfolgt bei 37Dc. Die weitere Identifizierung erfolgt mit den üblichen Routinemethoden der Bakteriologie und Mykologie. Im Fall von Viren erfolgt eine Züchtung auf Eikulturen.
Es ist ferner möglich, das Adsorbens mit Puffer zu waschen, mit Alkohol zu entwässern, mit gepuffertem Glutaraldehyd zu behandeln und rasterelektronenmikroskopisch zu untersuchen.
Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eignet sich insbesondere eine Vorrichtung, die durch eine in einem extrakorporalen Kreislauf sich befindende, an beiden Seiten offene, hämocompatibles, die Bakterien Pilze und Viren selektiv bindendes Adsorbens enthaltende Säule --1--, in der das Adsorbens --5-- durch Filter --2-- mit übergestülptem Deckel --3-- zusammengehalten ist, wobei die Deckel --3-- Öffnungen mit Anschluss für blutzuführende und blutabführende Schlauchleitungen --4-- aufweisen.
Die Deckel --3-- können beispielsweise so beschaffen sein, dass sie auf die Säule aufschraubbar sind. Jedenfalls sind sie leicht und ohne Gefahr der Kontamination abnehmbar zur schnellen bequemen Entleerung des Inhalts, was sehr wesentlich ist. Der Blutabfluss kann mit einem Trans- fusionsbesteck --6-- mit Filter --7-- versehen sein. Als Material der Bestandteile sind inerte, leicht verarbeitbare Kunststoffe wie Teflon geeignet.
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Die für rein diagnostische Zwecke bestimmte Vorrichtung hat vorteilhaft geringe Abmessungen.
Die Säule weist einen Durchmesser von etwa 1 bis 3 cm und eine Höhe von etwa 2 bis 10 cm auf.
Durch das geringe Volumen werden keine der theoretisch an sich möglichen Nebenwirkungen, wie Blutdruckabfall, Thrombozytopenie, Verlust an Immunglobulinen, Adsorption verabreichter Medikamente, Hämolyse, ausgelöst.
Insgesamt ist die Vorrichtung von geringem Volumen, deshalb klinisch unbedenklich, was einen wesentlichen technischen Fortschritt bedeutet. Sie ist rasch und bequem handhabbar, mit relativ niedrigen Herstellungskosten belastet und somit als Wegwerfartikel einzusetzen.
Fig. 1 zeigt die Kapsel. Alle Teile sind vorteilhaft aus Teflon gefertigt und damit im Autoklaven bei 1300c sterilisierbar. Die Kapsel wird mit acrylhydrogelverkapselter Pflanzenkohle gefüllt und nach Durchspülung mit physiologischer Kochsalzlösung bei 1300c im Autoklaven sterilisiert.
Tierversuche
Zum Vergleich der Effektivität der konventionellen Blutkultur mit einer Kultur aus Perfusionskohle bot sich zunächst der Tierversuch an. Versuchstiere waren 250 bis 300 g schwere Wistarratten. Eine experimentelle Sepsis wurde duch i. v.-Injektion definierter Keimzahlen von Candida albicans simuliert. Zugang für die Hämoperfusion waren PVC-Schläuche in den Iliacalgefässen. Sie wurden in Äthernarkose plaziert. Die weitere Untersuchung erfolgte am wachen Tier im Restriktionskäfig.
Mit einer Flussgeschwindigkeit von 1 bis 2 ml/min wurde das Blut der Ratte über eine Rollenpumpe aus der Arterie über die Kohlekapsel zurück in die Vene befördert. In der Kapsel befanden
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restliche Blutfüllvolumen des Systems betrug 3 ml. Zu Versuchsbeginn wurde das System mit Frischblut von einem Spendertier gefüllt. Zu Beginn der Perfusion wurde mit 100 IE Heparin antikoaguliert, die später notwendige Heparinisierung richtete sich nach der Lee-White-Gerinnungszeit.
60 min nach i. v.-Injektion von 1 ml der Candida-Suspension wurde zunächst eine arterielle Blutkultur entnommen, im Anschluss daran die Perfusion für die Dauer einer Stunde begonnen. Nach Abschluss der Hämoperfusion wurde die Aktivkohle unter sterilen Bedingungen mit Ringerlösung gewaschen. Ein Teil der Kohlepartikel gelangte zum Kulturversuch, der andere Teil nach Fixierung mit Glutaraldehyd - Sörensen-Puffer zur rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung.
Kulturelle Diagnostik
Die bakteriologische Verarbeitung der Perfusionskohle aus den Tierversuchen erfolgte derart, dass sofort nach Abschluss des Tierversuchs die Perfusionskohle unter sterilen Kautelen entnommen und bakteriologisch aufgearbeitet wurde.
Mit der sterilen Pinzette wurden pro Platte zirka 20 Kohlepartikel auf die festen Nährmedien verteilt und leicht in die Oberfläche eingedrückt. Als Nährboden wurde für die Originalkulturen Saboraud-Maltose-Agar und für die Anreicherungen Saboraud-Nährmedium flüssig eingesetzt. Als Kontrollen zur Erkennung etwaiger Verunreinigungen wurden gleichzeitig Blutagarplatten und Mac Conkey-Nährböden mitgeführt. Gussplatten wurden durch Übergiessen von etwa 20 über die Petrischale verteilten Kohlepartikeln mit verflüssigtem Agarmedium angefertigt.
Am 2., 4. und 8. Tag wurde aus den flüssigen Anreicherungen (Thioglycolat, Traubenzuckerbouillon) Material auf die gleichen Nährböden in fester Form überimpft, wie sie für die Originalkulturen eingesetzt wurden.
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puffertem Glutaraldehyd 24 h lang fixiert.
Das fixierte Material wurde anschliessend in mehrfach zu wechselnder Pufferlösung gewaschen und in einer aufsteigenden Reihe von Alkohol entwässert. Aus dem reinen Alkohol wurden die Präparate in mindestens 4 Stufen in Frigen-11-übergeführt (Alkohol/Frigen : 2/1,1/1, 1/2, reines Frigen) und in einem Druckgefäss nach der Kritischen-Punkt-Methode konserviert.
Nach Aufbringen der Kohlepartikel auf die Probenteller des Raster-Elektronenmikroskops wurde eine elektrisch leitende Schicht mittels einer Sputteranlage aufgebracht. Die Untersuchung erfolgte mit dem Stereoscan Mark II A der Firma Cambridge Ltd, England.
Mit der diagnostischen Hämoperfusion wird im Gegensatz zu den vorher diskutierten Techniken
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eine Optimierung des Untersuchungsmaterials angestrebt. Man bleibt hiebei über einen längeren Zeitraum in den Kreislauf eingeschaltet, so dass der Erreger nach dem Ausschwemmen durch diese "Falle" der Kohlekapsel abgefangen werden muss.
Die mit der diagnostischen Hämoperfusion durchgeführten Versuche an der Ratte weisen auf eine grössere Empfindlichkeit der Perfusionsmethode gegenüber der Liquoidvenüle hin. Ergänzende Experimente mit grampositiven und gramnegativen Keimen sprechen dafür, dass diese Aussage auch für Bakterien gilt. Die überlegene Nachweisempfindlichkeit dokumentiert sich bei einer Infektionsdosis von 105 bis 107 Keimen pro Tier durch positive Hämoperfusionskulturen bei überwiegend negativen Liquoidvenülen. Bei den Liquoidvenülen trat in 2 Fällen ein Wachstum zu einem vergleichsweise späteren Zeitpunkt auf. In einem Fall blieben die Kulturen der Kohle und der Liquoidvenüle negativ.
Hervorzuheben ist, dass die Keime bei der Hämoperfusionsmethode in der Regel direkt und nicht auf dem Umweg über eine flüssige Anreicherung gezüchtet wurden. Die bakteriologische Aufarbeitung der Kohlepartikel zur Anzüchtung ist einfach und jedem bakteriologischen Routinelabor zumutbar.
Die Stabilität der Bindung von Keimen an die Kohleoberfläche eröffnet die Möglichkeit einer Trennung von Keimen und anhaftenden Antibioticaresten durch einen einfachen Waschvorgang.
Durchführung des Verfahrens beim Menschen
Eine Teflonkapsel wird mit 2% acrylhydrogelbeschichteter Aktivkohle (Smith f ; Nephew, England) gefüllt, im Autoklaven sterilisiert und in einem extrakorporalen Kreislauf mit dem Patienten verbunden. Der Anschluss der Kapsel an den Patienten erfolgt in der Regel durch unilaterale Funktion von Arteria femoralis und Vena femoralis gemäss der Seldinger-Technik. Das Blut durchströmt die Kapsel von oben nach unten. Es ist nicht notwendig, in das System eine Blutpumpe einzuschalten.
Als zusätzliche Sicherung vor Luft- oder Partikelembolien dient das kommerzielle Transfusionsbesteck im venösen Rücklauf. Um eine Thrombosierung im extrakorporalen Kreislauf zu verhindern, werden vor Perfusionsbeginn 5000 IE Heparin i. v. injiziert. Soll länger als 60 min perfundiert werden, sind weitere Heparingaben unter Kontrolle der Lee-White-Gerinnungszeit erforderlich. Nach beliebig langer Kontaktzeit mit dem strömenden Blut des Patienten wird der extrakorporale Kreislauf wieder unterbrochen. Die Aktivkohle kann dann durch Waschen mit einer sterilen Elektrolytlösung von anhaftenden Antibioticaresten befreit werden, bevor sie mitsamt den ebenfalls haftenden Erregern in ein Nährmedium gegeben wird.
In diesem Medium gelingt es dann, wie oben beschrieben, die Keime zu identifizieren und ihre Empfindlichkeit auf verschiedene Antibiotica und Antimykotica zu testen. Aus dieser Testung ergeben sich Aussagen darüber, welches Präparat den Patienten vermutlich am Leben erhalten kann.
Zur technischen Durchführung der diagnostischen Hämoperfusion gibt es-je nach dem klinischen Zustand des Patienten - zwei Alternativen. Patienten mit Sepsis entwickeln sehr häufig als Zweitkrankheit ein akutes Nierenversagen. Wenn der Patient wegen des Nierenversagens sowieso mit der Hämodialyse behandelt werden muss, genügt es, die Kapsel einfach ins Schlauchsystem der Dialyse mit einzuschalten, u. zw. in den arteriellen Schenkel, jedoch erst nach der Blutpumpe. Je nach Umfluss ist damit automatisch ein Kontakt der Kohle mit 100 bis 200 ml Blut pro min gewährleistet.
Beim nierengesunden Patienten mit Sepsis hat sich ein anderes Vorgehen bewährt. Die Kohlekapsel wird zunächst durch Perfusion mit einer Heparin-Kochsalzlösung (1000 IE auf 1000 ml) von Luftblasen befreit. Nächster Schritt ist die Punktion je einer Arterie und einer Vene des Patienten mit Kunststoffkanülen, deren Mindestlumen 1. 4 mm betragen sollte. Es wird nach der Seldinger-Technik verfahren. Dann wird die arterielle Punktionskanüle mit dem oberen Ende der Kapsel verbunden, die venöse Kanüle über ein Transfusionsbesteck mit dem unteren Ende. Nach Öffnen der Klemmen werden noch einmal 5000 IE Heparin ins System injiziert, um eine Gerinnung zu vermeiden. Die Perfusion des Systems erfolgt jetzt druckpassiv, d. h. ohne Zwischenschalten einer Pumpe, aus der Differenz zwischen arteriellem und venösem Druck.
Die optimale Dauer der diagnostischen Hämoperfusion liegt bei etwa 60 min. Der durchschnittliche Umfluss bei der hier geschilderten druckpassiven Perfusion liegt bei 30 ml/min.
Somit lassen sich insgesamt folgende Vorteile der Hämoperfusionsmethode gegenüber den herkömmlichen Verfahren definieren.
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Die Hämoperfusion zeichnet sich gegenüber der herkömmlichen Blutkulturtechnik durch eine grössere Nachweisempfindlichkeit aus. Zudem bietet sie den Vorteil, dass Kulturergebnisse und damit die Antibiogramme der Resistenztestung früher vorliegen. Durch einen Spülvorgang nach der Hämoperfusion kann verhindert werden, dass Antibioticareste mit in die Kultur gelangen.
Ein Hauptvorteil besteht jedoch in der Möglichkeit einer länger dauernden Präsenz im Kreislauf des Menschen. Damit erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, den Zeitpunkt einer Keimeinschwemmung nicht zu verpassen.
Bei herkömmlichen Blutkulturen ist nachteilig, dass sie in der Regel mehrfach wiederholt werden müssen. Die Gefässzugänge, die bei der Hämoperfusion erforderlich sind, sind oft aus anderer Indikation bereits geschaffen (Dialyse, Herzchirurgie, arterielle Drucküberwachung usw. ). In diesen Situationen genügt es, die Kapsel mit den vorgegebenen Anschlüssen zu verbinden. Besonders während einer Dialysebehandlung ist die Einschaltung der Kapsel ins arterielle System ohne Probleme.
Die bei der therapeutischen Hämoperfusion von Vergiftungen beschriebenen Nebenwirkungen sind bei der diagnostischen Perfusion durch das verkleinerte Volumen der Perfusionskapsel vernachlässigbar gering. Bei 7 Patienten ergaben Kontrollen von Hämoglobin, Erythrozyten-, Leukozytenund Thrombozytenzählung sowie LDH-Aktivität im Serum vor und nach diagnostischer Perfusion keine signifikanten Veränderungen.
Zusammenfassend bietet das erfindungsgemässe neue Verfahren dem Kliniker eine Bereicherung seiner diagnostischen Möglichkeiten beim Verdacht auf Septikämie. Der Patient wird durch die Diagnostik nicht gefährdet. Die Trefferchance für ein positiveres Ergebnis ist höher als bei den bisher bekannten Verfahren. Zudem ist im Falle eines positiven Kulturbefundes sowohl die Keimidentifizierung als auch das Antibiogramm früher als bisher zu erwarten.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zum Nachweis von Erregern, wie Bakterien, Pilzen und Viren, im Blut in Anwesenheit eines gerinnungshemmenden Mittels, dadurch gekennzeichnet, dass man die Erreger in einem extrakorporalen Blutkreislauf mittels eines selektiv bindenden haemocompatiblen Adsorbens abtrennt und die an das Adsorbens gebundenen Erreger durch übliche bakteriologische, mykologische, virologische oder elektronenmikroskopische Methoden nachweist.