MXPA01008170A - Metodos de inactivar patogenos usando luz pulsada de espectro amplio. - Google Patents

Abstract

Metodos para reducir el contenido de patogenos de una composicion derivada biologicamente iluminando la composicion con al menos un pulso de alta intensidad, corta duracion de luz policromatica incoherente en un espectro amplio. En las composiciones tratadas resultantes, las bio-moleculas de interes permanecen biologicamente activas. El contenido de patogenos, tales como virus, bacterias, pirogenos, hongos y/o priones, presentes en una composicion derivada biologicamente, tal como suero de sangre, plasma de sangre u otro producto de sangre, incluyendo insulina, transferina, heparina, colageno, factor VIII y/o factor IX, o una composicion que contiene anti-cuerpos monoclonales, proteinas de lineas celulares de ingenieria genetica o similares, se reduce por iluminacion con luz pulsada de espectro amplio. El contenido de HIV-1, SV40, parvo-virus canino o virus de diarrea viral bobina en una composicion derivada biologicamente, es reducido dramaticamente con un solo pulso de luz de espectro amplio.

Description

MÉTODOS DE INACTIVAR PATÓGENOS USANDO LUZ PULSADA DE ESPECTRO AMPLIO Antecedentes de la Invención El uso de composiciones derivadas biológicamente en investigación científica y en la manufactura de sustancias farmacéuticas/terapéuticas en ubicuo. La sangre humana es usada de manera rutinaria como una fuente de agentes de proteína para el tratamiento de diversos desórdenes y enfermedades ; por ejemplo, el plasma sanguíneo es fraccionado para proveer factor VIII, factor IX, anti-trombina, transferina, albúmina, inmunoglo-bulinas, y plaquetas, así como otros agentes terapéuticos. Métodos de cultivo de tejidos son empleados comúnmente en la producción de numerosos agentes farmacéuticos/ erapéuticos y composiciones relacionadas, tales como ADN recombinante y/o proteína recombinante a partir de líneas celulares producto de ingeniería genética, vectores virales, aminoácidos, peptonas, insulina y anticuerpos monoclonales. De manera similar, reactivos derivados de animales, tales como albúmina de suero de bovino (BSA) y componente de sangre de oveja, son usados de manera rutinaria en investigación y manufactura. Debido a que estas composiciones son derivadas de organismos vivos, incluyendo seres humanos, animales y plantas, pueden estar contaminadas con uno o mas virus, bacterias u otros patógenos. Si un ser humano u otro animal se pusiera en contacto con tal producto contaminado, podrían resultar infección, enfermedad o incluso la muerte del individuo. Este riesgo de infección es de preocupación particular donde. el individuo debe ser tratado de manera rutinaria con una composición por un período de tiempo prolongado; por ejemplo, algunos hemofílicos son tratados regularmente con composiciones derivadas de sangre durante toda su vida. De manera similar, las personas que tienen sistemas inmunológicos severamente comprometidos, tales como aquéllas con el síndrome de la inmuno-deficiencia adquirida (SIDA) , están en riesgo particular de infección por exposición a patógenos contaminantes en composiciones derivadas biológicamente. Los animales que están siendo tratados con productos farmacéuticos veterinarios están similarmente en riesgo de composiciones contaminadas. Además de plantear un riesgo de infección al individuo que recibe la composición derivada biológicamente, la efectividad de la composición misma puede ser comprometida por la presencia de contaminantes virales, bacterianos y otros contaminantes patógenos . Las composiciones derivadas biológicamente no son usadas solamente en la producción de sustancias farmacéuticas/ terapéuticas, pero tales productos son también usados de manera frecuente como reactivos (o para producir reactivos) para investigación biológica. Cuando un reactivo derivado biológicamente es contaminado con un virus, una bacteria u otro patógeno, el proyecto de investigación para el cual se emplea puede ser tornado inútil, inconcluso o, incluso peor, engañoso. Los productos de la sangre que son usados frecuentemente en la manufactura y la investigación incluyen BSA y proteínas de plasma sanguíneo humano . .ADN y proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales, vectores virales y composiciones relacionadas también son ejemplos de composiciones derivadas biológicamente usadas en procesos tanto de investigación como de manufactura. Aunque es menos factible que estos productos sean contaminados por virus, bacterias y/u otros patógenos, tal contaminación es no obstante posible. Adícionalmente, cuando se usan tales composiciones como herramientas en investigación, si se tornan contaminadas, pueden plantear un riesgo considerable a tal investigación, haciendo preocupante la contaminación en estos casos. Por tanto, las composiciones derivadas biológicamente, particularmente aquéllas de origen humano o animal, incluyendo por ejemplo líneas celulares, sangre y/o plasma, requieren de estrictas evaluaciones de seguridad viral antes de ser comercializadas. Los enfoques actuales para proveer tales seguridades incluyen probar los materiales fuente y los productos respecto de virus, bacterias y/u otros patógenos en pasos específicos de manufactura, usando ensayes de falta de efectividad u otras pruebas de diagnóstico. La efectividad de los materiales de prueba es limitada por la metodología de prueba disponible, la sensibilidad del ensaye y la posibilidad de un patógeno desconocido o mutado no detectable, especialmente un virus. Por tanto, al desarrollar procesos de manufactura, se incluyen pasos de proceso que están diseñados para remover o inactivar virus y/u otros patógenos de tal composición derivada biológicamente. Estos procesos son probados respecto de su capacidad para remover o inactivar virus al nivel de seguridad requerido o el mas apropiado. La suma de las reducciones logarítmicas para cada paso de proceso determina la efectividad global de la revisión viral exhaustiva. Por ejemplo, al menos una reducción logarítmica en el contenido viral es requerida para cada paso de proceso. Actualmente, están disponibles numerosos métodos para descontaminar o esterilizar composiciones derivadas biológicamente. Generalmente, estos métodos de tratamiento incluyen métodos físicos, métodos químicos, métodos térmicos, métodos de irradiación y, de preferencia, algunas combinaciones de éstos. El calentamiento prolongado de composiciones biológicamente derivadas; el tratamiento de tales composiciones con uno o mas agentes químicos, combinado con su calentamiento o irradiación; y el uso de métodos de inactivación viral por detergente en solvente son tres de los métodos mas comúnmente usados de descontaminación de composiciones derivadas biológicamente. Sin embargo, ningún método de desactivación de patógenos, especialmente virus, en composiciones derivadas biológicamente, ha probado ser exitoso contra un amplio espectro de agentes patógenos subsecuentemente. A mayor abundamiento, la mayoría de estos métodos requiere de procesamiento adicional de la composición biológica a fin de remover los productos químicos empleados al desactivar los virus, las bacterias y/u otros patógenos. De manera frecuente, estos pasos adicionales de procesamiento incluyen uno o mas pasos de extracción y/o pasos de cromatografía, lo que incrementa dramáticamente el costo de manufactura del producto final y, por tanto, incrementa el precio al menudeo del producto al consumidor. Métodos físicos ejemplares disponibles para remover o inactivar virus y/u otros contaminantes incluyen métodos de filtración altamente especializados, cromatografía por afinidad, cromatografía por intercambio de iones y f accionamiento con polietilenglicol. Sin embargo, hay muchas limitaciones de estos métodos físicos, particularmente cuando muchas composiciones no pueden ser filtradas. De esta manera, en la medida en que se usan métodos de filtración, cromatografía y otros métodos físicos, frecuentemente son uno en una serie de procedimientos de descontaminación. Por ejemplo, para producir soluciones relativamente puras de factor VIII, factor IX o inmunoglobulina, el plasma sanguíneo tiene que ser primero sometido a un protocolo de tratamiento con detergente en solvente, luego tratado por cromatografía y finalmente filtrado adicionalmente para rendir el producto final deseado. Puede usarse ultra-filtración para eliminar parvo-virus de sangre o productos de sangre, pero este método es parcialmente efectivo únicamente. Por ejemplo, puede aplicarse a concentrados de factor IX, pero no de factor VIII. Otros métodos bien conocidos de remover o inactivar virus, bacterias y/u otros patógenos que contaminan composiciones derivadas biológicamente son descritos, por ejemplo, en las patentes US Nos. 4,540,573 (Neurath y colaboradores), 4,946,648 (Dichtelmüller y colaboradores), 5,418,130 (Platz y colaboradores), 5,527,704 (Wolf, Jr. y colaboradores), 5,663,043 (Zepp y colaboradores) y 5,866,316 (Kempf y colaboradores) . Estas patentes describen tratamientos en combinación de composiciones derivadas biológicamente, particularmente productos de sangre de mamíferos, tales como plasma, fracciones de plasma o materia celular de plasma (eritrocitos, plaquetas o fracciones de proteína) , para inactivar los componentes virales y/o bacterianos en ellos. Además, todos los métodos descritos incluyen el uso de al menos un agente químico para ya sea degradar directamente el organismo contaminante o sensibilizarlo para degradación por otro agente químico o calor o radiación. El uso de tales métodos de tratamiento combinados es mas efectivo y mas confiable respecto de algunos virus que el tratamiento con un solo agente químico. Por ejemplo, los experimentos han demostrado que el tratamiento el frío con ß-propiolactona únicamente provee solamente 0-3 de inactivación logarítmica de HIV y SV40 en plasma (Scheidler y colaboradores, 1998) , y que el tratamiento de plasma sanguíneo con radiación ultravioleta únicamente provee protección contra infección de hepatitis a solamente alrededor de 40% de los receptores; mientras que una tasa de infección de cero es resultado del uso de plasma tratado tanto con ß-propiolactona como radiación ultravioleta. (Lo Grippo y colaboradores, "Human Plasma Treated with Ultraviolet and Propiolactone - Six Year Clinical Evalua-tion" , JAMA 1987:722-726 (1964)) . De esta manera, comprensiblemente, el uso de un solo agente químico para inactivar componentes virales en composiciones derivadas biológicamente se está tornando menos preferido. Las patentes US Nos. 4,726,949; 4,866,282; y 4,952,812, concedidas a Miripol y colaboradores (en lo sucesivo, colectivamente, las patentes de Miripol) describen la irradiación de una capa delgada de glóbulos blancos con radiación ultravioleta predominantemente de una longitud de onda de 280 a 320 nm, por alrededor de 0.25 a 15 minutos, a fin de ocasionar que los glóbulos blancos pierdan sustancialmente su capacidad de desplegar una respuesta inmune a un paciente alo-inmunizado. Las patentes de Miripol enseñan que focos ultravioletas que emiten energía significativa a una longitud de onda de 254 nm deben ser evitados al poner en práctica los métodos descritos pues la luz a tal longitud de onda ocasiona daño a glóbulos blancos. De manera similar, el rango UV-A (alrededor de 365 nm) es identificado como indeseable pues no provee una buena reducción del efecto de alo-inmunización de linfocitos. Aunque las patentes de Miripol describen un método de irradiar un producto de sangre (a saber, glóbulos blancos) con radiación ultravioleta, no hay indicación de que tales métodos serían útiles para la descontaminación de composiciones derivadas biológicamente inactivando virus, bacterias y/u otros patógenos, ni tampoco hay indicación de que luz pulsada de espectro amplio, que necesariamente incluye luz tanto en el rango de 254 como de 365 nm, pueda aportar una mejorada descontaminación en comparación con la radiación ultravioleta sola. Aunque se conocen y usan diversos métodos de descontaminación de composiciones derivadas biológicamente, ningún método ha sido desarrollado, el cual sea efectivo de manera confiable contra la mayoría de los microorganismos patógenos y que pueda ser usado seguramente en composiciones derivadas biológicamente, incluyendo proteínas terapéuticas y/u otras bio-moléculas . Los tratamientos con calor generalmente requieren de una gran cantidad de tiempo y pueden ser nocivos a la proteína u otro agente que se busque recuperar; por ejemplo, las fracciones de proteína de plasma y la albúmina humana requieren de calentamiento a 6?Dc por 10 a 11 horas para inactivar virus. Se ha encontrado que el parvo-virus, la hepatitis A y otros virus envueltos en no lípidos son resistentes a tratamientos con solventes/detergentes, y se ha demostrado también que el parvovirus es resistente a inactivación con calor. Dada la prevalencia de los métodos de descontaminación por adición de agentes químicos a la composición derivada biológicamente, se han desarrollado numerosos métodos para remover o desactivar estas composiciones después de tal tratamiento de descontaminación. Por ejemplo, las patentes US Nos, 4,540,573 (Neurath y colaboradores) , 4,789,545 (Woods y colaboradores) , y 5,817,765 (Isaksson y colaboradores) describen diferentes métodos de separar un producto final derivado biológicamente de los contaminantes químicos presentes en el mismo como resultado de tratamientos para desactivar contaminantes patógenos. Obviamente, es indeseable la necesidad de llevar a cabo pasos adicionales de procesamiento a fin de remover de una composición derivada biológicamente agentes químicos previamente añadidos . Aunque las bacterias y otros contaminantes patógenos son causa de preocupación, en la manufactura y el uso de composiciones derivadas biológicamente, los virus son a menudo la mayor preocupación. Los virus son agrupados frecuentemente con base en su genoma, es decir virus de ADN o .ARN, y/o de acuerdo con la característica física de estar envueltos o no envueltos. Además, los virus individuales son categorizados generalmente en una familia de virus con los cuales comparten ciertas características evolutivas. De esta manera, por ejemplo, los virus de la familia del virus del herpes (Herpesviridae) son virus de ADN envueltos y los virus de la familia Adenoviridae son virus de ADN no envueltos. Ejemplos de familias de virus de .ARN envueltos y no envueltos son, respectivamente, la familia Flaviviridae (que incluye el virus de la fiebre amarilla, el virus de la hepatitis C y el virus de la diarrea de bovinos) , y la familia Picornaviri-dae (que incluye el virus de la polio, el rinovirus y el virus de la hepatitis A) . Naturalmente, aquellos virus que son los mas virulentos a seres humanos y/o los mas prevalecientes en composiciones derivadas biológicamente son de la mayor preocupación en el desarrollo y la implementación de procedimientos de descontaminación. Tales virus incluyen, por ejemplo, el parvovirus, el virus de vacuolación simio (SV40) , el virus de la inmuno-deficiencia humana (HIV) , los virus de hepatitis y el virus de la diarrea viral de bovinos (BVDV) . El parvo-virus es un virus de ADTNT no envuelto. La infección con el parvo-virus humano B19 puede dar como resultado un aborto, o una anemia persistente en aquéllos infectados con HIV. El parvo-virus puede ser transmitido por la sangre o productos de la sangre, y es resistente tanto a tratamiento térmico como a tratamiento con solventes/detergentes. Incluso ha sido transmitido con composiciones tratadas mediante una combinación de dos métodos de inactivación. El parvo-virus canino (CPV) es ubicuo en el ambiente y es un patógeno veterinario serio contra el cual se requieren vacunas. De manera significativa, los métodos de foto-inactivación que han demostrado ser capaces de inactivar HIV no son efectivos contra CPV (Hirayama y colaboradores, 1997) .

El virus de vacuolación simio (SV40) en un virus de ADN no envuelto. Exposición humana accidental a SV40 ocurrió a finales de los años cincuenta y principios de los sesenta cuando se usaron vacunas contra polio y adenovirus preparadas en células de monos conteniendo SV40, Shah, K. , y colaboradores, Am. J. Epidemiology, 103:1-12 (1976) . Aunque las encuestas epidemiológicas no han encontrado una relación discernible entre exposición a SV40 y el desarrollo de tumores (en particular, no se encontró ninguna asociación entre exposición a vacunas contra polio contaminadas con SV40 y la incidencia de tumores de cerebro y ovarios) , recientemente se han detectado en una variedad de tejidos humanos secuencias de ADN relacionadas con SV40. Por ejemplo, ADN relacionado con SV40 ha sido encontrado en tumores del plexo coroidal, ependimonas, mesoteliomas y osteosarcomas . Ver, por ejemplo, Bersagel y colaboradores, NEJ Med . , 326:988-93 (1992); Carbone y colaboradores, Oncogene 9:1781-90 (1994); Cristando y colaboradores, J. Environ. Patho Toxicol Oncol . , 14:29-34 (1995); y Martini y colaboradores, Cáncer Res . , 56:4820-25 (1996) . Además, se han aislado infecciones de SV40 de un tumor del plexo coroidal, Lednecky y colaboradores, Viroloay, 212:710-717 (1995) . No es claro bajo qué circunstancias y en qué medida los contaminantes de SV40 en composiciones derivadas biológicamente pueden infectar a receptores de ese producto. De esta manera, es ventajoso realizar un esfuerzo por remover y/o inactivar SV40 presente en composiciones derivadas biológicamente antes de su administración. Desafortunadamente, se ha encontrado que el SV40 es relativamente resistente al calor y que es inactivado de manera inconsistente por tratamiento con ß-propiolactona. Ver Lelie y colaboradores, J. Med. Virol . , 23(3) : 297301 (nov. 1987) y Scheidler y colaboradores, Biologicals , 26 (2) :135-144 (junio 1998). El virus de la inmuno-deficiencia humana (H1V) es un virus de .ARN no envuelto, bien conocido, que ocasiona enfermedades y la muerte en seres humanos. Bajo condiciones apropiadas, el HIV puede ser inactivado por radiación gamma (Salai y colaboradores, Ann. Transplant, 2(1) :55-56, 1997), y por algunos productos químicos (Dewilde y colaboradores, Biol . Chem. , 379(1) : 1377-79, 1998, Arthur y colaboradores, AIDS Res . Human Retroviru-ses, 14 (supl. 13):5311-19 (oct. 1998). Sin embargo, HIV-2 muestra únicamente inactivación limitada con ß-propiolactona (Scheidler y colaboradores, Biologicals , 26(2):135-44 (junio 1998) . De manera similar, se ha demostrado que el tratamiento térmico de HIV es efectivo en solamente algunas composiciones (Azari y colaboradores, Artif. Cells Blood Substit. Immobil Biotech, 26 (5-6) :577-82 (nov. 1998); mientras que tanto HIV-1 como HIV-2 pueden ser inactivados por un solvente/detergente inapropiado en unos cuantos minutos (Biesert y colaboradores, Vox Sang 74 (supl. 1) : 207-212 (1998). También se ha reportado que el HIV puede ser inactivado por* un tratamiento en combinación de luz visible y el pigmento, azul de metiieno (Muller-Breitkreutz y Mohr, 1998) . El virus de la diarrea viral de bovinos (BVDV) es un virus de ARN envuelto de la familia de los flavivirus, que ocasiona enfermedades severas en el ganado. Debido a que este virus es capaz de cruzar la placenta e infectar el feto bovino, se estima que entre 10 y 75% de los productos comerciales de suero de bovino fetal están contaminados con BVDV. Aunque no es claro si, bajo qué circunstancias y en qué medida el BVDV puede infectar seres humanos, su presencia ha sido vinculada con gastroenteritis infantil y microcefalia en seres humanos (Harasawa, 1997) . De preocupación adicional es el hecho de que las cepas no citopáticas de BVDV pueden incorporaxr el .ARN de la célula hospedera en sus genomas, con ello planteando el punto de oncogenicidad dentro de líneas celulares continuas contaminadas con este virus. La inactivación limitada de BVDV ha sido lograda usando productos químicos, tales como ß-propiolactona (Scheidler y colaboradores, Biologicals, 26 (2) : 135-144 (junio 1998). Adicionalmente, se ha mostrado que tratamiento térmico a 74ÜC por 90 minutos logra una reducción logarítmica de 7 de BVDV (Azari y colaboradores, Actif. Cells Blood Substit. Immobil . Biotech., 26 (5-6) :577-82 (nov. 1998). Sin embargo, obviamente, tal tratamiento térmico severo y prolongado no es apropiado para muchas composiciones contaminadas . La luz pulsada de espectro amplio (BPL) provee un enfoque para la desactivación de microorganismos usando pulsos de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un espectro amplio. BPL es diferente de luz UV no pulsada, continua en muchas maneras. El espectro de BPL contiene luz UV, pero también incluye un mas amplio espectro de luz, en particular entre alrededor de 180 y alrededor de 2,600 nm. El espectro de BPL es similar al de la luz del sol a nivel del mar, aunque es 90,000 veces mas intenso, e incluye longitudes de onda UV entre 200 y 300 nm que son normalmente filtradas por la atmósfera de la tierra. Se aplica BPL en pulsos de corta duración de energía relativamente elevada, en comparación con los tiempos de exposición mas largos y la menor energía de la luz UV no pulsada. Ver, por ejemplo, las patentes US Nos. 5,034,235 (Dunn y colaboradores), 5,489,442 (Dunn y colaboradores), 5,768,853 (Bushnell y colaboradores) y 5,786,598 (Clark y colaboradores) . Se ha usado BPL para descontaminar y/o esterilizar diversos objetos objetivo, tales como productos alimenticios, paquetes, agua y otros fluidos, semi-fluidos y objetos sólidos. Principalmente, ello se logra colocando el objeto objetivo en o pasando el objeto objetivo a través de una cámara de esterilización BPL, y exponiendo el objeto a un número ^apropiado de destellos de BPL a un nivel de energía apropiado. Ver, por ejemplo, las cuatro patentes anteriores y la patente US No. 5,900,211 (Dunn y colaboradores) . Sin embargo, de manera importante, el uso de BPL para descontaminar composiciones derivadas biológicamente no ha sido descrito o contemplado hasta ahora. Aunque se ha demostrado que BPL es útil en la desactivación de diversos microorganismos sobre la superficie de objetos sólidos y/o dentro de ciertos fluidos relativamente transparentes, no ha habido sugerencia alguna de que BPL pudiera ser útil para descontaminar composiciones derivadas biológicamente que contienen proteínas y/u otras bio-moléculas de interés. Debido a que las composiciones terapéuticas y farmacéuticas derivadas biológicamente a menudo son administradas por vía intravenosa y, en cualquier caso, en una forma concentrada, el retiro completo de los microorganismos contaminantes es crítico para asegurar su seguridad. De manera similar, el proceso de descontaminación debe ser seleccionado para descontaminar de manera efectiva y confiable la composición derivada biológicamente sin afectar de manera adversa la efectividad del producto final. BPL provee efectos biológicos que son diferentes de los de la luz UV no pulsada. Por ejemplo, se sabe que las bacterias pigmentadas, tales como Aspergillus niger, son mas resistentes a la radiación UV que las esporas de bacilos. Sin embargo, en estudios que usan BPL, Aspergíllus niger fue mas sensible, sobre superficies secas, a BPL que tres diferentes esporas de bacilos: Bacillus stearother ophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus pumilus . Además, el tratamiento UV convencional lesiona el ADN por mecanismos que pueden ser revertidos bajo ciertas condiciones experimentales, clasificadas ya sea como "reparación enzimática oscura" o "reparación enzimática clara" (Block, S., Disinfec ion, Sterilization and Preservation, 4a. edición, Williams and Wilkins, Estados Unidos (1991) ) . Esta foto-reactivación por enzimas ya sea oscuras o claras no ocurre cuando se usa BPL para tratar el mismo microorganismo (tal como Bacillus subtilis , Bacillus pumilus, Aspergillus niger, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli , Salmonella choleraesuis y Pseudomonas aeruginosa) (Furukawa y colaboradores, "Brand New Pulsed Light Sterilization Technology Can Sterilize Both Injectable Solution and its 2 mL Polyethylene Container", presentada en el Congreso Internacional PDA, Japón (feb. 1999) ) . La presencia de longitudes de onda en el rango visible diferencia adicionalmente BPL de la luz UV como lo hacen los medios para generar las dos diferentes luces. La luz UV es habitualmente generada usando lámparas de mercurio, que plantean algunos riesgos de seguridad; mientras que se genera BPL por medio de lámparas que usan un gas inerte, es decir xenón) . De esta manera, lo que se necesita es un nuevo método de inactivar virus, bacterias y/u otros patógenos contenidos en composiciones derivadas biológicamente, que sea efectivo contra una variedad de patógenos, especialmente una variedad de virus, y que pueda emplearse en una variedad de composiciones sin comprometer de manera innecesaria la efectividad del producto final . Compendio de la Invención La presente invención enfoca las necesidades anteriores y otras aportando métodos y aparatos para la descontaminación de composiciones derivadas biológicamente, usando pulsos de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un espectro amplio. En particular, se describen en la presente métodos de reducir, en al menos un valor logarítmico de uno, el contenido de un patógeno activo, tal como un virus, una bacteria, una toxina, un pirógeno, un hongo y/o un prión, presente en una composición derivada biológicamente, el método comprendiendo proveer una composición derivada biológicamente que comprende al menos un patógeno e iluminar la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un espectro amplio, tal que el contenido del patógeno activo sea reducido en un factor de al menos 10 (es decir, valor logarítmico de uno) . Los métodos descritos en la presente pueden ser aplicados ventajosamente a una composición derivada biológicamente tal como anticuerpos monoclonales, proteínas de líneas celulares mamíferas de ingeniería genética, productos de terapia génica (tales como vectores de virus) , productos derivados de sangre humana y/o animal, productos biológicos farmacéuticos (tales como heparina y/o colágeno), suero de bovino, sangre de oveja, peptonas/ aminoácidos y/o insulina/transferina de bovinos, sin destruir los rasgos terapéuticos, farmacéuticos, antigénicos, nutricionales u otros rasgos deseables de la composición. En particular, proteínas, polisacáridos, lípidos de ácido nucleico, anticuerpos y otras bio-moléculas de interés presentes en la composición derivada biológicamente no pierden propiedades esenciales para su uso pretendido, es decir las bio-moléculas de interés no son alteradas de manera irreversible, por ejemplo, de modo que ya no exhiban mas su bio-actividad deseable, por exposición a tal luz pulsada de amplio espectro. De esta manera, ventajosamente, la composición derivada biológicamente requiere unos cuantos pasos adicionales de proceso, si acaso, como resultado de tal tratamiento con luz pulsada de amplio espectro. Por consiguiente, en un aspecto, se proveen en la presente métodos rápidos, eficientes y confiables para inactivar virus tales como, por ejemplo, HIV-1 o HIV-2, hepatitis A, B o C, HTLV-I o II o citomegalovirus, presentes en productos derivados biológicamente, tales como plasma sanguíneo, exponiendo el producto a al menos un pulso de alta intensidad, corta duración de BPL, es decir luz policromática incoherente en un amplio espectro. En un aspecto adicional, se proveen en la presente métodos similarmente rápidos, eficientes y confiables para la inactivación de virus, tales como, por ejemplo, SV40 y/o los virus relacionados portados en sangre presentes en una composición derivada de sangre animal exponiendo la composición a BPL. En otro aspecto, se proveen en la presente métodos de reducir el contenido de un patógeno presente en una composición derivada biológicamente, el método comprendiendo primero diluir la composición derivada biológicamente, seguido por iluminar la composición derivada biológicamente diluida con al menos un pulso de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un amplio espectro y, finalmente, concentrar la composición derivada biológicamente a una concentración deseada. En este aspecto, la presente invención es útil para descontaminar composiciones derivadas biológicamente que son algo no transmisivas a luz de espectro amplio y de esta manera pueden no ser descontaminadas suficientemente si no son primero diluidas. Adicionalmente, donde el contenido de proteína de la composición derivada biológicamente es particularmente elevado, por ejemplo mayor de alrededor de 10%, puede ser deseable primero diluir la composición antes de iluminar la misma con BPL a fin de tanto mejor controlar los efectos de BPL sobre las proteínas como mejor controlar la inactivación de los patógenos presentes en la composición. Adicionalmente provistos en la presente son métodos para la inactivación de una pluralidad de microorganismos contaminantes presentes en composiciones derivadas biológicamente, donde los microorganismos incluyen al menos dos seleccionados del grupo que consiste en virus, bacterias, hongos y priones y donde proteínas, péptidos y/u otras bio-moléculas de interés en la composición no son alterados de manera irreversible, y de esta manera permanecen efectivos para su fin pretendido, el método comprendiendo exponer la composición derivada biológicamente a al menos un pulso de luz de espectro amplio.

En todavía un aspecto adicional, se proveen en la presente métodos de inactivar al menos un microorganismo presente en una composición derivada biológicamente exponiendo la composición- a pulsos de alta intensidad (es decir, 0.01 a 50 J/cm2, por ejemplo 0.05 a 1.0 J/cm2, donde la densidad de energía es medida en la superficie del objeto objetivo), de corta duración (es decir, de 10 ns a 100 ms, por ejemplo 0.3 ms) , de luz policromática, incoherente en un espectro amplio (es decir, 170 a 2,600 nm; 1.8 x 1015 a 1.2 x 1014 Hz) . Generalmente, se usarán de uno a cinco pulsos. En un aspecto particular, la invención provee un método de reducir el contenido de un patógeno activo presente en una composición derivada biológicamente, el método comprendiendo los pasos de proveer una composición derivada biológicamente que comprende, al menos un patógeno e iluminar la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un amplio espectro, tal que el contenido del patógeno activo sea reducido en un factor de al menos 10. En otro aspecto particular, la invención provee un método de inactivar un virus presente en una composición derivada biológicamente que incluye una bio-molécula de interés, el método comprendiendo los pasos de proveer una composición derivada biológicamente que comprende una bio-molécula de interés y un virus, e iluminar la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de luz pulsada de espectro amplio, tal que el virus sea inactivado. En un aspecto particular adicional, la invención provee una composición derivada biológicamente que contiene una biomolécula de interés, la cual composición tiene un contenido de virus activo reducido en un factor de al menos- 10 desde su contenido original como resultado de tratamiento iluminando la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de luz pulsada de espectro amplio, tal que el virus sea inactivado mientras dicha bio-molécula permanece biológicamente activa. En todavía otro aspecto particular, la invención provee un método de reducir el contenido de un patógeno activo presente en una composición derivada biológicamente, el método comprendiendo los pasos de proveer una composición derivada biológicamente que comprende al menos un patógeno y al menos una biomolécula de interés, e iluminar la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un espectro amplio, tal que el contenido del patógeno activo sea reducido y la bio-molécula de interés no sea destruida. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una vista esquemática de la zona de tratamiento de un aparato ejemplar de procesamiento de luz pulsada que puede ser usado para descontaminar composiciones derivadas biológicamente de acuerdo con la presente invención, el cual aparato emplea placas delgadas, espaciadas estrechamente, dentro de las cuales reside la composición al ser tratada; La figura 2 es una vista esquemática de_ otro aparato ejemplar de procesamiento de luz pulsada útil en la presente, el cual aparato trata composiciones derivadas biológicamente que fluyen longitudinalmente a través de una camisa que rodea una fuente de luz pulsada incoherente, alargada, que provee pulsos de alta intensidad, corta duración de luz policromática en el espectro amplio; La figura 3 es una vista esquemática de todavía otro aparato ejemplar de procesamiento de luz pulsada, donde la composición derivada biológicamente fluye en una dirección paralela a una o mas fuentes de luz incoherente, alargadas, dentro de un reflector elíptico, y es tratada con pulsos de alta intensidad, corta duración de luz policromática en un amplio espectro,- y La figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra algunos de los diversos pasos que pueden ser utilizados para preparar una composición derivada biológicamente para descontaminación con luz pulsada, exponiendo tal composición a la luz pulsada y posteriormente procesando la composición descontaminada. Descripción Detallada de las Formas de Realización Preferidas La presente invención provee un método para inactivación rápida, confiable y eficiente de patógenos presentes en composiciones derivadas biológicamente. Se ha encontrado que pulsos de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un amplio espectro pueden ser usados para inactivar virus, bacterias y otros patógenos (que para fines de esta solicitud se entenderá incluyen pirógenos, toxinas, hongos y priones) presentes en una composición derivada biológicamente, tal como, por ejemplo, composiciones derivadas de sangre, composiciones derivadas de líneas celulares de ingeniería genética, composiciones derivadas mediante procesos de cultivo de tejidos y productos relacionados, generalmente sin destruir propiedades biológicas deseables de bio-moléculas de interés, tales como, por ejemplo, proteínas, polisacáridos, anticuerpos, lípidos de ácido nucleico, aminoácidos y/o peptonas en la composición. En particular, una composición derivada biológicamente es colocada en y/o hecha fluir a través de un aparato de tratamiento de luz pulsada de amplio espectro. Dentro de una zona de tratamiento del aparato, la composición es iluminada por al menos uno, de preferencia dos y con la mayor preferencia tres pulsos de corta duración (por ejemplo, de menos de alrededor de 100 ms, de preferencia alrededor de 0.3 ms) de luz policromática, incoherente de alta intensidad (por ejemplo, 0.01 a 50 J/cm2, por ejemplo 0.05 a 1.0 J/cm2, medida en la superficie de la composición), en un amplio espectro (por ejemplo, 170 a 2,600 nm; es decir, 1.8 x 1015 a 1.2 x 1014 Hz) . Globalmente, se anticipa que los métodos comerciales puedan emplear de uno a cinco pulsos cortos. Como resultado de tal iluminación, el contenido de patógeno activo dentro de la composición derivada biológicamente es reducido en al menos un valor logarítmico de uno (es decir, un factor de 10) y de preferencia es reducido en un valor logarítmico de mas de 2 (es decir, un factor de 100) . De la manera mas ventajosa, este método de tratamiento puede ser administrado fácil y rápidamente en diversos puntos durante el procesamiento de la composición derivada biológicamente, con ello proveyendo seguridad adicional de inactivación completa o casi completa de patógenos en la composición. Pueden emplearse diversos aparatos para poner en práctica estos métodos reductores de patógenos. Aparatos diseñados para proveer luz policromática incoherente de alta intensidad, corta duración, en un amplio espectro, son descritos, por ejemplo, en las patentes US antes mencionadas '442, v 853, ?442, '853, ?598 y la patente US No. 5,900,211. Comunes a los aparatos usados para proveer el tratamiento con luz pulsada de amplio espectro son el hecho de que la cámara de tratamiento sea hermética a la luz; la(s) lámpara (s) de destellos están colocadas dentro del aparato tal que la luz que se emite de ellas sea dirigida de manera óptima al objeto objetivo; el material reflectivo es de preferencia empleado para maximizar adicionalmente la luz pulsada dirigida hacia el objeto objetivo; y materiales transmisivos (es decir, cuarzo, zafiro -o materiales similares) son empleados donde se requiere material entre las -2?-lámparas de destellos y el objeto objetivo (tales como estructuras de soporte para el objeto objetivo dentro de la cámara) , de modo que se minimice la interferencia con la BPL. De importancia particular en el diseño o la selección del aparato para tratamiento con BPL es la configuración de la zona de tratamiento del aparato, es decir el área dentro del aparato donde el objeto objetivo va a ser iluminado con la luz pulsada. Debido a que la luz pulsada debe iluminar todas las superficies del objeto objetivo, la zona de tratamiento será generalmente diseñada para maximizar la luz pulsada dirigida al objeto objetivo. Por ejemplo, donde se emplea mas de una lámpara de destello de manera simultánea para descontaminar el objeto objetivo, la zona de tratamiento de preferencia será diseñada tal que el objeto objetivo esté aproximadamente equidistante de cada lámpara de destellos y las lámparas de destellos de preferencia estén colocadas para rodear el objeto objetivo. A fin de asegurar que la luz pulsada ilumine la totalidad del objeto objetivo, estructuras empleadas para sostener el objeto objetivo dentro de la zona de tratamiento son de preferencia formadas de material que sea al menos alrededor de 1%, de preferencia al menos alrededor de 10%, con mayor preferencia al menos alrededor de 50%, y con la mayor preferencia al menos alrededor de 85% transmisivo a BPL. Las siguientes descripciones son de aparatos ejemplares que pueden ser empleados en la esterilización o descontaminación de composiciones derivadas biológicamente de acuerdo con la presente invención. La figura 1 muestra una vista esquemática de una zona de tratamiento de un aparato ejemplar preferido para uso en el tratamiento de composiciones derivadas biológicamente con BPL. En este aparato preferido, dos delgadas (es decir, menos de alrededor de 5 mm, por ejemplo alrededor de 2 mm) placas transmisivas 110, 112 están colocadas generalmente paralelas entre sí y espaciadas muy cerca entre sí (es decir, menos de alrededor de 5 mm de distancia, por ejemplo alrededor de 1 mm) para proveer un pasaje o conducto 100 a través del cual pueda pasar la composición por tratarse. A cada lado de las placas 110, 112 hay dos sistemas de lámparas de destellos 102, 104, cada uno incluyendo un reflector 106 que rodea parcialmente una lámpara de destellos 108. Tales sistemas de lámparas de destellos son comercialmente asequibles, por ejemplo, de PurePulse Technologies de San Diego, California, Estados Unidos, como Purebright, modelo No. PBS-1. Las lámparas de destellos 108 son de preferencia alargadas, y el flujo de la composición derivada biológicamente (ilustrado por la flecha 114 en la figura 1) es de preferencia paralelo a las lámparas de destellos alargadas. Las placas 110, 112 son de preferencia fijas entre sí a lo largo de los dos bordes opuestos que son paralelos a la lámpara de destellos de modo que una composición que pase entre ellas sea ahí contenida. Puede emplearse un gel transmisívo adecuado, tal como, por ejemplo, agarosa. En lugar de placas paralelas, puede emplearse un conducto transmisivo rectangular (por ejemplo, cuarzo o zafiro) para transportar la composición a través de la zona de tratamiento ilustrada. Aunque solamente se ilustran dos sistemas de lámpara de destellos 102, 104, el conducto 100 puede estar rodeado por fuentes de luz pulsada. En cualquier caso, la luz emitida de los sistemas de lámpara de destellos 116 es dirigida hacia la composición derivada biológicamente al pasar a través de (o residir en) el conducto 100, con ello inactivando virus y/u otros microorganismos ahí contenidos. De manera ventajosa, espaciando las placas 110, 112 del conducto 100 mas juntas, la composición que está siendo tratada es esparcida en una delgada capa, con ello facilitando la exposición de la totalidad de la composición a la luz pulsada, incluso cuando la composición es relativamente no transparente y/o no diluida. La figura 2 muestra una vista esquemática de otro aparato ejemplar 50 que puede ser empleado para inactivar virus y/u otros microorganismos contaminantes en la composición. El aparato 50 comprende un alojamiento cilindrico, reflectivo que define una cámara de tratamiento 202 a través de la cual fluye la composición rodeando una fuente de luz pulsada 204. La fuente de luz pulsada es una lámpara de destellos de xenón, de alta energía, provista con una fuente de energía convencional (no mostrada) de acuerdo con la práctica convencional para la operación de lámparas de destellos.

Una bomba de circulación de líquidos 208 controla la tasa de flujo de la composición a- través de la cámara de tratamiento 202 con relación a la tasa de repetición de pulsos de la fuente de luz pulsada 204 de modo que, durante el tiempo en que reside la composición dentro de la cámara de tratamiento 202, todo el producto que pasa a su través sea expuesto a un número predeterminado de pulsos de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un amplio espectro. De manera sumamente general, la composición que está siendo tratada será bombeada a través de la cámara a una tasa de flujo de alrededor de 1-4 litros/minuto. La composición que sale de la cámara de tratamiento 202 por tanto es descontaminada y generalmente no infecciosa. La cámara de tratamiento de producto 202 puede estar dispuesta de modo de estar separada de la fuente de luz pulsada 204 para impedir que la composición que hay en ella haga contacto con la fuente de luz 204. Eso puede lograrse, por ejemplo, empleando una camisa de cuarzo (o cilindro de cuarzo) alrededor de la fuente de luz 204, la composición que está siendo tratada pasando afuera de la camisa de cuarzo. Puede hacerse circular agua de enfriamiento entre la -fuente de luz 204 y la camisa de cuarzo. El diámetro de la cámara de tratamiento variará dependiendo de muchos factores, incluyendo pero sin limitarse a las características específicas de absorción de la composición por tratarse, las características físicas y de operación de la fuente de luz 204, es decir lámparas de destellos, y el grado de mezcla de producto entre pulsos, es decir destellos de luz. La cámara de tratamiento 202 puede incluir un conjunto reflector, a fin de reflejar la iluminación que atraviesa la composición de vuelta hacia la trayectoria de flujo de la composición. Cuando se usa un reflector externo, el conjunto reflector puede incluir un cilindro (o tubo) de cuarzo (u otro material transmisivo) dentro del cual se hace circular la composición y fuera del cual se coloca el reflector externo. Se observa que algunos fluidos derivados biológicamente, ya sea naturales o después de disolución, son relativamente transparentes a la luz, incluyendo porciones significativas del espectro UV. En consecuencia, hay una relativamente poca atenuación mediante absorción en tales composiciones, la densidad de flujo reduciéndose en mayor medida solamente como una función de la distancia desde la fuente de luz. Sin embargo, para otras composiciones que tienen una considerable absorción, la densidad de flujo se reducirá como una función tanto de la distancia desde la lámpara de destellos como de la absorción de tal composición. En cualquier caso, una densidad de flujo mínima deseada, por ejemplo 0.4 o 0.5 J/cm2 (o incluso tan baja como 0.1 o 0.2 J/cm2, dependiendo de los microorganismos particulares que se vayan a desactivar) debe mantenerse a través de toda la zona de tratamiento. De manera alternativa o en adición, debe ocurrir mezclado para asegurar que todo el fluido que se esté tratando sea sometido a una intensidad de flujo apropiada y el número de pulsos para lograr el grado o nivel deseado de inactivación, es decir muerte o esterilización. Aunque la lámpara de destellos 204 está ubicada internamente de la cámara de tratamiento 202 en el aparato 50 de la figura 2, la figura 3 muestra que una o mas lámparas de destellos 256 pueden ubicarse alternativamente (o en adición) externamente de una cámara de tratamiento 252. La cámara de tratamiento 252 está colocada a lo largo de un foco de un reflector elíptico 254. Una lámpara de destellos 256 está colocada a lo largo de otro foco del reflector elíptico 254. La lámpara de destellos 256 puede ser encamisada de manera óptima en un tubo de cuarzo para su enfriamiento con agua. Debido a que los pulsos de luz so enfocados por el reflector elíptico 254 hacia el. centro de la cámara de tratamiento 252, se provee compensación de la absorción de luz de la composición que esté siendo tratada, de modo que toda la composición sea sometida a un tratamiento de luz uniforme. En una variación (no mostrada) de la forma de realización mostrada, pueden utilizarse, si se desea reflectores elípticos múltiples, cada uno teniendo una lámpara de destellos en un foco y la cámara de tratamiento 252 en el otro foco. Aunque se han descrito diversos aparatos útiles en la práctica de los métodos de la presente invención, los técnicos en i • -31-la materia apreciarán que diversos otros aparatos, incluyendo combinaciones de los aparatos antes descritos, pueden ser empleados de manera alternativa para estos fines y, de esta manera, se contemplan igualmente en la presente. Por ejemplo, puede emplearse un pequeño esterilizador de luz pulsada para tratar soluciones intravenosas que contienen composiciones derivadas biológicamente, el cual puede, por ejemplo, recibir entubado intravenoso en una compuerta de entrada, pasar la solución a través de la cámara de luz pulsada y hacia afuera por una compuerta de salida, y luego a través del entubado intravenoso restante y hacia un paciente. En tal aparato de tratamiento, se emplea BPL para iluminar y tratar una composición derivada biológicamente para reducir el contenido de patógeno, por ejemplo virus y/o bacterias, por al menos un factor de diez. De preferencia, el método de tratamiento comprende iluminar la composición derivada biológicamente con luz pulsada teniendo una intensidad de al menos alrededor de 0.01 J/cm2, de preferencia alrededor de 0.02 a alrededor de 50 J/cm2, y con la mayor preferencia de alrededor de 0.05 a 1.0 J/cm2, donde se mide la intensidad de la energía en la superficie de la composición que está siendo iluminada. Los pulsos de luz son de preferencia de muy corta duración. Se prefieren duraciones de pulsos de alrededor de 100 ms; son mas preferidas duraciones de entre alrededor de 10 ns y 100 ms, por ejemplo alrededor de 0.3 ms . Además de que la luz pulsada sea de alta intensidad y corta duración, debe ser caracterizada como luz policromática, incoherente, en un espectro amplio. De preferencia, la luz incluye longitudes de onda de alrededor de 170 a alrededor de 2,600 nm (es decir, frecuencias de alrededor de 1.8 x 1015 a alrededor de 1.2 x 1014 Hz) . Debido a que el tiempo entre pulsos puede ser sumamente corto, por ejemplo menor de alrededor de 100 ms, puede completarse un solo tratamiento de inactivación de pulsos múltiples en menos de un minuto para cada tratamiento. Si el tratamiento es de un producto que fluye que está siendo bombeado o circulado de otra manera (a diferencia de un tratamiento por cargas) , puede ser deseable proveer una pluralidad de lámparas de destellos espaciadas a lo largo de la trayectoria de flujo para permitir una mayor tasa de flujo. Este tipo de tratamiento contrasta enormemente con métodos hasta ahora conocidos de reducir el contenido de patógenos en composiciones derivadas biológicamente, que pueden requerir hasta de horas para ser completados. A fin de tratar de la manera mas eficiente y confiable las composiciones derivadas biológicamente de acuerdo con los métodos de la presente, la composición debe ser iluminada tan plenamente como sea posible por la luz pulsada de amplio espectro. De esta manera, es importante que la composición por tratarse esté contenida, al menos durante tratamiento, por material que sea suficientemente transmisivo, por ejemplo al menos 1% transmisivo, a tal luz pulsada de espectro amplio, de • f -33-modo que se logre la inactivación de manera confiable. Ejemplos de materiales adecuados incluyen, por ejemplo, poliolefinas, tales como polietileno y polipropileno, nilón, cuarzo y zafiro; la patente '598 antes mencionada discute diversos polímeros adecuados para uso en aparatos de tratamiento de luz pulsada. Pueden preferirse diferentes materiales para formar el material de contención, dependiendo de la configuración particular del aparato de tratamiento de luz pulsada en uso. Por ejemplo, donde el aparato de tratamiento emplea placas delgadas espaciadas estrechamente, a través de las cuales pasa la composición derivada biológicamente, tales placas de preferencia son formadas de un material relativamente duro, transmisivo, tal como cuarzo o zafiro. En contraste, donde la zona de tratamiento es un tubo intravenoso, será preferido un material polimérico capaz de formarse en capas. Además de considerar cuál aparato de tratamiento de luz pulsada usar y dentro de qué material contener una composición biológicamente derivada por tratarse, deben considerarse ciertas características de la composición misma. Por ejemplo, la transmisividad de la composición derivada biológicamente es importante para asegurar su completa iluminación con la luz pulsada de espectro amplio. Diversos componentes de una composición derivada biológicamente pueden contribuir a una transmisividad reducida de la composición a la luz pulsada de espectro amplio. Por ejemplo, la presencia de células enteras, altas concentraciones de proteínas y/o grandes cantidades de lípidos u otras macro-moléculas, pueden interferir con la transmisión de luz pulsada de amplio espectro a través y/o dentro de una composición derivada biológicamente. Afortunadamente, la transmisividad de una composición derivada biológicamente puede ser ajustada generalmente sin daño permanente a la composición por simple disolución, la cual a menudo es puesta en práctica en el procesamiento de tales composiciones, de modo que técnicas apropiadas para ello son bien conocidas. Si se desea mejorar la transmisividad de plasma sanguíneo, por ejemplo, a BPL a fin de optimizar su tratamiento de acuerdo con los métodos de la presente, el plasma puede ser primero diluido, por ejemplo con una solución salina apropiada, luego tratado con BPL y, después del tratamiento, re-concentrado o procesado adicionalmente para proveer el producto final deseado. Debido a que las células enteras presentes en una composición derivada biológicamente pueden ser dañadas de manera irreparable por tratamiento con luz pulsada de acuerdo con los métodos de la presente, estos métodos son mas adecuados para tratar composiciones derivadas biológicamente que bien no incluyan células enteras o bien no requieran la recuperación de células enteras intactas después de su tratamiento con BPL. Como se mencionó previamente, estos métodos pueden ser empleados de manera ventajosa para inactivar patógenos presentes en una composición derivada biológicamente, generalmente sin destruir las propiedades terapéuticas, farmacéuticas, nutricionales y/u otras propiedades deseables de la(s) bio-molécula (s) de interés dentro de la composición. Aunque la efectividad de algunas bio-moléculas de interés puede reducirse ligeramente como resultado del tratamiento con luz pulsada de espectro amplio, en muchos de esos casos la actividad restante será todavía aceptable. A mayor abundamiento, la efectividad de algunas bio-moléculas de interés puede en algunos casos ser acrecentada por tratamiento con BPL, lo que puede dar como resultado terapias mejoradas o incluso nuevas. La figura 4 es un diagrama de flujo donde se ilustran algunas de las diversas formas de realización de los métodos de la presente invención. Una muestra no diluida 300 de una composición derivada biológicamente por tratarse, puede ser diluida a una composición diluida 302 o puede ser tratada sin disolución. Tres métodos ejemplares preferidos de introducir la composición derivada biológicamente en la zona de tratamiento del aparato de tratamiento de luz pulsada son presentados: un método de flujo tubular 304, un método de tratamiento por cargas o lotes 306, y un método de tratamiento de flujo en placa 308. Formas de realización específicas del método de flujo tubular 304 han sido descritas con respecto de las figuras 2 y 3. De acuerdo con esta primera alternativa, la composición es introducida en la zona de tratamiento de la cámara de tratamiento por un tubo o un aparato similarmente alargado. Esto incluye, por ejemplo, tratamiento en un aparato de tratamiento elíptico, tratamiento a través de un tubo intravenoso, y métodos relacionados. De preferencia el tubo, al menos hasta el punto en que la composición es iluminada por luz pulsada, tiene un diámetro suficientemente pequeño tal que se ilumina la totalidad de la composición. Una segunda alternativa para introducir la composición derivada biológicamente en la zona de tratamiento de la cámara de tratamiento es tratar la composición en forma de lotes o cargas 306. En esta alternativa, por ejemplo, la composición puede ser dividida en cantidades relativamente pequeñas y colocada dentro de uno o mas recipientes apropiadamente transmisivos e iluminada con la luz pulsada. El método de tratamiento por cargas o lotes es particularmente útil para el tratamiento con luz pulsada de componentes de medios, tales como suero bovino fetal, que pueden tratarse muy rápida y muy efectivamente en pequeñas cantidades usando el método por cargas o lotes. Una tercera opción presentada en la figura 4 es el aparato de flujo en placa 308. Como se describió anteriormente en detalle, el aparato de flujo en placa 308 comprende dos placas delgadas, espaciadas estrechamente, a través de las cuales se hace fluir la composición por tratarse. De manera ventajosa, esta opción particular permite el tratamiento de un volumen significativo de la composición en un tiempo distribuyendo la composición en una capa delgada, ancha. Medios alternativos para introducir la composición derivada biológicamente a la zona de tratamiento de la cámara de trata-miento de luz pulsada serán evidentes a los técnicos en la materia. Los siguientes son algunos ejemplos de inactivación de patógenos específicos empleando los métodos descritos en la presente. En particular, se ilustra la inactivación de HIV-1 y BVDV presentes en composiciones derivadas biológicamente. Los resultados de estos experimentos muestran que el contenido de cada uno de los cuatro virus probados fue reducido de manera significativa después de tratamiento con solamente tres pulsos de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un espectro amplio. De manera significativa, se demostró una reducción en el contenido viral mayor de un valor logarítmico de tres (3) tanto para HIV-1 com CPV después de iluminación con un solo pulso de luz de espectro amplio. Un quinto ejemplo que sigue ilustra la inactivación de una bacteria, E . coli , presente en suero sanguíneo bovino fetal . Ejemplo 1: Inactivación de SV40 Células de riñon de mono verde africano (AGMK) son inoculadas con el virus simio 40 (SV40, ATCC VR-305) . El virus es cosechado cuando 75 a 100% de las células exhiben efectos citopáticos (CPE) . Materiales del virus son congelados y almacenados a -60ÜC en un medio que contiene 10 a_15% de suero bovino fetal (FBS) . Se usan células de AGMK para titulación de las muestras que contienen SV40. El medio usado para cultivo y mantenimiento de las células de AGMK es medio esencial mínimo Eagles (E-MEM) , con 5 a 10% de FBS inactívado por calor, 10 mg/ml de gentamicina, 100 unidades/ml de penicilina, y 2.5 mg/ml de fungizona. Los cultivos de células son incubados a 36-38ÜC en una atmósfera humidificada de 5-7% de C02. Un volumen de 0.2 mi de SV40 en E-MEM con 10% de FBS inactivado por calor es añadido a recipientes de muestra de polietileno estériles. Se hicieron doce muestras replicadas. Nueve de las muestras son tratadas con BPL. De éstas, tres muestras son tratadas con un solo pulso de luz, tres muestras son tratadas con dos pulsos, y tres muestras son tratadas con tres pulsos. Tres muestras no tratadas sirven como controles. Después de exposición, se lleva a cabo una titulación preparando diluciones lOx de cada muestra viral en una placa de micro-cultivo de 96 cavidades, sembrada con AGMK. Se deja adsorber SV40 por 1-2 horas, luego se retira de las cavidades y se reemplaza con medio de cultivo fresco. Se lleva a cabo una titulación de RPMI (sin rojo de fenol) como control. Todas las titulaciones son dispuestas por cuadruplicado, monitoreadas por hasta 10 días respecto de la presencia de CPE y/o cito-toxicidad. Los resultados son señados en la Tabla 1.

Tabla 1: Tratamiento de SV40 con BPL Se comparan titulaciones post-exposición con la titulación pre-exposición, a fin de determinar si se redujo la no efectividad viral por exposición a BPL. El Ejemplo 1 muestra una reducción logarítmica de 2-3 de SV40. El título mas elevado disponible es usado en este ejemplo. Se espera una mayor reducción de virus cuando se usan títulos iniciales mayores, se aplican mas pulsos, o el medio es diluido a una menor concentración de proteína. Ejemplo 2: Inactivación de HIV-1 Se inocularon células CCRF-CEM con HIV tipo I, cepa HTLVXIIB" " (Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, Estados Unidos) . Se cosecha HIV-1 cuando la no efectividad alcanza un mínimo de 80%, como se determina por un ensaye de inmuno-fluorescencia F (IFA) . Materiales del virus son congelados y almacenados a -60ÜC en un medio que contiene 10 a 15% de FBS. Se usan células MT-2 (Programa de Investigación y Reactivos de Referencia de SIDA de NIH, catálogo No. 237) para titulación de las muestras que contienen HIV-1. El medio usado para cultivo y mantenimiento de las células MT-2 es RPMI 1640 (con rojo de fenol) , complementado con 2 mM L-glutamina, 25 mM Hepes, 2 g/1 de NaHC03/ 15% de FBS inactivado por calor y 50 mg/ml de gentamicina. Los cultivos celulares son incubados a 36-38?c en una atmósfera humidificada de 5-7% de C02. Se añade un volumen de 0.2 mi de HIV en RPMI con 15% de FBS inactivado por calor a recipientes de muestra de polietileno estériles. Se hacen doce muestras replicadas. Nueve de las muestras son tratadas con BPL. De éstas, tres muestras son tratadas con un solo pulso de luz, tres muestras son tratadas con dos pulsos, y tres muestras son tratadas con tres pulsos. Tres muestras sin tratar sirven como controles. Después de la exposición, se lleva a cabo una titulación preparando diluciones lOx de cada muestra viral en una placa de micro-cultivo de 96 cavidades, sembrada con células MT-2. Las diluciones de HIV-1 permanecen en las cavidades durante todo el período de titulación. Se llevó a cabo como control una titulación de RPMI (sin. rojo de fenol) . Todas las titulaciones son dispuestas por cuadruplicado, monitoreadas por hasta 10 días respecto de la presencia de CPE y/o cito-toxicidad. Los resultados son señalados en la Tabla 2.

Tabla 2: Tratamiento de HIV-1 con BPL *el límite de detección de esta prueba fue de < 3.16x1o1 Se comparan las titulaciones post-exposición con la titulación pre-exposición, a fin de determinar si la no efectividad viral fue reducida por exposición a BPL. El Ejemplo 2 muestra que ocurre una reducción logarítmica de 5 a 6 de HIV-1 usando BPL. El título mas elevado disponible es usado en este ejemplo. Se espera una mayor reducción de virus cuando se usan títulos iniciales, se aplican mas pulsos, o se diluye el medio a una menor concentración de proteína. Ejemplo 3: Inactivación de CPV Se inocularon células A-72 (ATCC CRL 1542) con CPV (ATCC CVR-2017) . El virus es cosechado cuando 75 a 100% de las células exhiben efectos citopáticos (CPE) . Materiales de virus son congelados y almacenados a -6?Dc en un medio que contiene 10 a 15% de FBS. Se usaron células A- 72 para titulación de las muestras que contienen CPV. El medio usado para cultivo y mantenimiento de las células A- 72 es E-MEM, complementado con 5-10% de FBS inactivado por calor, 10 mg/ml de gentamicina, 100 unidades/ml de penicilina, y 2.5 mg/ml de fungizona. Se incuban cultivos celulares a 36-38ÜC en una atmósfera humidificada de 5-7% de C02. Un volumen de 0.2 mi de CPV en E-MEM con 5% de FBS inactivado por calor es añadido a recipientes de muestra de polietileno estériles. Se hicieron doce muestras replicadas. De éstas, tres muestras son tratadas con un solo pulso de luz, tres muestras son tratadas con dos pulsos, y tres muestras son tratadas con tres pulsos. Tres muestras sin tratar sirven como controles . Después de la exposición, se lleva a cabo una titulación preparando diluciones lOx de cada muestra viral en una placa de micro-cultivo de 96 cavidades, sembrada con células A-72. Se deja adsorber CPV por 1-2 horas, luego se remueve de las cavidades y se reemplaza con medio de cultivo fresco. Las muestras sobre-nadantes son transferidas de la placa de titulación de CPV a placas frescas para pruebas por hemo-aglutinamiento (HA) . Se lleva a cabo como control una titulación de RPMI (sin rojo de fenol) . Todas las titulaciones son dispuestas por cuadruplicado, monitoreadas por hasta 10 días respecto de la presencia de CPE y/o cito-toxicidad. Los resultados son señalados en la Tabla 3.

Tabla 3 : Tratamiento de CPV con BPL *el límite de detección de esta prueba fue de = 3.16x1o1 Se comparan las titulaciones post-exposición con la titulación pre-exposición, a fin de determinar si la no efectividad viral fue reducida por exposición a BPL. "El Ejemplo 3 muestra que ocurre una reducción logarítmica de 3 a 4 de CPV usando BPL. El título mas elevado disponible es usado en este ejemplo. Se espera una mayor reducción de virus cuando se usan títulos iniciales, se aplican mas pulsos, o se diluye el medio a una menor concentración de proteína. Ejemplo 4: Inactivación de BVDV Se inoculan células de turbinato de bovino (BT) (ATCC CRL 1390) con BVDV (ATCC VR-534) . El virus es cultivado cuando 75 a 100% de las células exhiben efectos citopáticos (CPE) . Materiales del virus son congelados y almacenados a -60ÜC en un medio que contiene 10 a 15% de FBS. Se usan células de BT para titulación de las muestras conteniendo BVDV. El medio usado para cultivo y mantenimiento de células BT es E-MEM complementado con 15% de suero de caballo.

Las células son cultivadas a 36-38ÜC en una atmósfera humidificada de 5-7% de C02. Un volumen de 0.2 mi de BVDV en E-MEM con 5% de FBS inactivado por calor es añadido a recipientes de muestra de polietileno estériles. Se hicieron doce muestras replicadas. Nueve de las muestras son tratadas con BPL. De éstas, tres muestras son tratadas con un solo pulso de luz, tres muestras son tratadas con dos pulsos, y tres muestras son tratadas con tres pulsos. _Tres muestras sin tratar sirven como controles. Después de la exposición, se lleva a cabo una titulación preparando diluciones lOx de cada muestra viral en una placa de micro-cultivo de 96 cavidades, sembrada con células A- 72. Se deja adsorber BVDV por 1-2 horas, luego se remueve de las cavidades y se reemplaza con medio de cultivo fresco. Se lleva a cabo una titulación (sin rojo de fenol) como control. Todas las titulaciones son dispuestas por cuadruplicado, monitoreadas por hasta 10 días respecto de la presencia de CPE y/o cito-toxicidad. Los resultados son señalados en la Tabla 4.

Tabla 4 : Tratamiento de BVDV con BPL Se comparan las titulaciones post-exposición con la titulación pre-exposición, a fin de determinar si la no efectividad viral fue reducida por exposición a BPL. El Ejemplo 4 muestra que ocurre una reducción logarítmica de 4 de BVDV usando BPL. El título mas elevado disponible es usado en este ejemplo. Se espera una mayor reducción de virus cuando se usan títulos iniciales, se aplican mas pulsos, o se diluye el medio a una menor concentración de proteína. Ejemplo 5: Inactivación de E. COLI Una muestra de 15% de FBS fue inoculada con E. coli (ATCC 26) y se le permitió cultivar durante la noche, a 32ÜC, a una concentración final de 8.8xl04 CFU/ml (4.9 log CFU/ml) . Luego se iluminaron 200 µl del suero contaminado (conteniendo 17,600 CFU, es decir 4.25 log CFU) con tres pulsos de corta duración de luz de amplio espectro (1.0 J/cm/destello) de acuerdo con los métodos descritos en la presente. Se hicieron diluciones en serie (lOx) de la muestra (usando amortiguador de fosfato 0.5M) y se dispusieron sobre placas de agar estándar. Las placas fueron incubadas a 32ÜC y contadas a las 24 y las 48 horas . Después de 48 horas de incubación, no se observó E. coli sobreviviente sobre ninguna placa. Dado un nivel de sensitividad de 20 CFU (es decir 1.3 log CFU), esta prueba demostró que el tratamiento de FBS inoculado con -E. coli , con solamente tres pulsos de luz de amplio espectro, dio como resultado una reducción aproximada logarítmica de 3 en el contenido bacteriano. (4.25 log CFU - 1.3 log CFU = 2.95 log CFU) . Aunque la invención divulgada en la presente ha sido descrita por medio de formas de realización específicas y sus aplicaciones, numerosas modificaciones y variaciones pueden hacerse en ella, por parte de técnicos en la materia, sin apartarse de- los alcances de la invención tal y como se señalan en las reivindicaciones anexas. Las divulgaciones de todos los antecedentes y las patentes US son incorporadas expresamente en la presente por referencia.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método de reducir el contenido de un patógeno presente en una composición derivada biológicamente, el método comprendiendo los pasos de: proveer una composición derivada biológicamente que comprende al menos un patógeno; e iluminar la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un espectro amplio, tal que el contenido de patógeno activo sea reducido en un factor de al menos 10.
2. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho paso de proveer proporciona una omposición derivada biológicamente que comprende al menos un patógeno seleccionado del grupo que consiste en virus, bacterias, pirógenos, toxinas, hongos y priones .
3. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho paso de proveer proporciona una composición derivada biológicamente que comprende al menos un virus seleccionado del grupo que consiste en el virus de la inmuno-deficiencia humana HIV-1, HXV-2, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, HTLV-I, HTLV-II, citomegalovirus, virus de vacuolación simio 40, virus de la diarrea viral bovino y parvo-virus canino.
4. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho paso de proveer proporciona una composición derivada biológicamente seleccionada del grupo que consiste en composiciones de plasma sanguíneo, composiciones de factor VIII, composiciones de factor IX, composiciones de anti-trombina, composiciones de transferina, composiciones de albúmina, composiciones de inmunoglobulina, composiciones de anticuerpos monoclonales, composiciones de vector viral, composiciones de heparina, composiciones de colágeno, composiciones de insulina, y composiciones de albúmina de suero sanguíneo.
5. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho paso de iluminar comprende iluminar la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un espectro amplio, donde la intensidad de la luz es de al menos 0.01 J/cm2, la duración del pulso es menor de 100 ms, y las longitudes de onda de la luz son de entre 170 y 2,600 nm.
6. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho paso de iluminar comprende iluminar la composición derivada biológicamente con al menos dos pulsos de alta intensidad, corta duración .de luz policromática incoherente en un espectro amplio.
7. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho paso de proveer proporciona una composición derivada biológicamente que comprende al menos un patógeno y comprendiendo una bio-molécula de interés; y donde dicho paso de iluminar comprende iluminar la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un espectro amplio, tal que la biomolécula de interés no sea destruida.
8. 8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo además : diluir la composición derivada biológicamente antes de dicho paso de iluminar; y concentrar la composición derivada biológicamente después de dicho paso de iluminar.
9. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo además: proveer un aparato de luz pulsada de espectro amplio que comprende una zona de tratamiento que incluye al menos una lámpara de destellos y dos placas transmisivas opuestas; y hacer que la composición derivada biológicamente fluya entre las dos placas transmisivas opuestas; donde dicha iluminación de dicha composición derivada biológicamente es llevada a cabo mientras está ubicada entre las placas transmisivas opuestas.
10. 10. Un método de inactivar un virus presente en una composición derivada biológicamente, que incluye una bio-molécula de interés, el método comprendiendo los pasos de: proveer una composición derivada biológicamente que comprende una bio-molécula de interés y un virus; e iluminar la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de luz pulsada de espectro amplio, tal que el virus sea inactivado.
11. 11. Una composición derivada biológicamente que contiene una bio-molécula de interés, la cual composición tiene un contenido de virus activo reducido en un factor de al menos 10 a partir de su contenido original como resultado de tratamiento de acuerdo con la reivindicación 10, mientras dicha bio-molécula permanece biológicamente activa.
12. 12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicho paso de proveer proporciona una composición derivada biológicamente seleccionada del grupo que consiste en suero de bovino, sangre de oveja, insulina de bovino, transferina de bovino, heparina de bovino, colágeno, aminoácidos, peptonas, péptidos, anticuerpos monoclonales y proteínas a partir de una línea celular de mamífero de ingeniería genética.
13. 13. El método de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicho paso de iluminar comprende iluminar la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de luz pulsada de espectro amplio, tal que la inactivación del virus de como resultado una reducción logarítmica de al menos uno en el contenido viral activo.
14. 14. El método de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicho paso de iluminar comprende iluminar la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de luz pulsada de espectro amplio, tal que la inactivación del virus de como resultado una reducción logarítmica de al menos dos en el contenido viral activo.
15. 15. Un método de reducir el contenido de un patógeno presente en una composición derivada biológicamente, el método comprendiendo los pasos de: proveer una composición derivada biológicamente que comprende al menos un patógeno y al menos una bio-molécula de interés; e iluminar la composición derivada biológicamente con al menos un pulso de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un espectro amplio, tal que el contenido de patógeno activo sea reducido y la bio-molécula de interés no sea destruida.
16. 16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicho paso de iluminar comprende iluminar la composición derivada biológicamente tal que el contenido de patógeno activo en ella sea reducido en al menos un valor logarítmico de uno.
17. 17. El método de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicho paso de proveer proporciona una composición derivada biológicamente que comprende al menos un patógeno seleccionado del grupo que consiste en virus, bacterias, pirógenos, toxinas, hongos y priones .
18. 18. El método de acuerdo con la reivindicación 16, donde el paso de proveer proporciona una composición derivada biológicamente que comprende al menos un virus seleccionado del grupo que consiste en HIV-1, HIV-2, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, HTLV-I, HTLV-II, citomegalovirus, SV40, virus de la diarrea viral bovino y parvo-virus canino.
19. 19. El método de acuerdo con la reivindicación 15, donde el paso de proveer proporciona una composición derivada biológicamente seleccionada del grupo que consiste en suero de bovino, sangre de oveja, insulina de bovino, transferina de bovino, heparina de bovino, colágeno, aminoácidos, peptonas, péptidos, anticuerpos monoclonales y proteínas a partir de una línea celular de mamífero de ingeniería genética.
20. 20. El método de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicho paso de iluminar comprende iluminar la composición derivada biológicamente con al menos dos pulsos de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un amplio espectro. Restimen Métodos para reducir el contenido de patógenos de una composición derivada biológicamente iluminando la composición con * i. al menos un pulso de alta intensidad, corta duración de luz policromática incoherente en un espectro amplio. En las composiciones tratadas resultantes, las bio-moléculas de interés permanecen biológicamente activas. El contenido de patógenos, tales como virus, bacterias, pirógenos, hongos y/o priones, presentes en una composición derivada biológicamente, tal como suero de sangre, plasma de sangre u otro producto de sangre, incluyendo insulina, transferina, heparina, colágeno, factor VIII y/o factor IX, o una composición que contiene anti-cuerpos monoclonales, proteínas de líneas celulares de ingeniería genética o similares, se reduce por iluminación con luz pulsada de espectro amplio. El contenido de HIV-1, SV40, parvo-virus canino o virus de diarrea viral bobina en una composición derivada biológicamente, es reducido dramáticamente con un solo pulso de luz de espectro amplio.