PT633721E - Descontaminacao de plaquetas com 8-metoxipsoraleno - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

DESCONTAMINAÇÃO DE PLAQUETAS COM 8-METOXIPSORALENO

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção, em geral, refere-se à inactivação de contaminantes em materiais que se pretendem para utilização in vivo, e em particular à inactivação de microrganismos em preparações de sangue antes de armazenamento durante um longo período de tempo e da transfusão.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O sangue inteiro recolhido de voluntários para receptores de transfusão é normalmente separado nos seus componentes: glóbulos vermelhos, plaquetas e plasma. Cada uma destas fracções é individualmente armazenada e usada para tratar uma multitude de condições específicas e de doenças. Por exemplo, o componente de glóbulos vermelhos é usado para tratar anemia; o componente de concentrado plaquetário é usado para controlar hemorragias; e o componente de plasma é frequentemente usado como fonte de Factor de Coagulação VIII no tratamento da hemofilia. O ideal seria que as preparações de células sanguíneas fossem retiradas de sangue recentemente tirado e imediatamente transfundidas para o receptor. No entanto, na grande maioria dos casos, a logística de operações num centro de dadores de sangue não permite esta possibilidade. As transfusões são necessárias dia e noite e é difícil, se não impossível, recrutar dadores a horas impróprias. Assim sendo, os centros de dadores de sangue têm de usar produtos sanguíneos armazenados.

Nos Estados Unidos, os procedimentos de armazenamento de sangue são regulamentados pelo governo. O período máximo de armazenamento para os componentes sanguíneos recolhidos neste sistema estão especificamente descritos. Por exemplo, componentes de sangue total colhidos num sistema “aberto” (isto é, não- 2

estéril) devem, pelas regras governamentais, devem ser transfundidos dentro de vinte e quatro horas e na maioria dos casos dentro de seis a oito horas. Em contraste, quando se recolhe sangue inteiro num sistema “fechado” (isto é, estéril), os glóbulos vermelhos podem ser armazenados até quarenta e dois dias (dependendo do tipo de anticoagulante e do meio de armazenamento usado) e o plasma pode ser congelado e armazenado durante períodos ainda mais prolongados.

Murphy e Gardner, New Eng. J. Med. 280:1094 (1969), demonstraram que as plaquetas armazenadas sob a forma de plasma rico em plaquetas (PRP) a 22°C têm melhor período de meia vida in vivo de que quando é armazenado a 4°C. Assim, podem-se transfundir concentrados plaquetários mais aceitáveis depois de serem armazenados à temperatura ambiente. Até à pouco tempo, as regras permitiam o armazenamento de concentrado plaquetário à temperatura ambiente até sete dias (dependendo do tipo de contentor de armazenamento). No entanto, verificou-se que a incidência de crescimento bacteriano e as subsequentes reacções à transfusão no receptor aumentam até níveis inaceitáveis com concentrados plaquetários com sete dias. Os concentrados plaquetários, agora, não devem ser armazenados durante mais de cinco dias.

Os sacos para sangue usados para as preparações de concentrados plaquetários são por si só estéreis, tal como os sacos que lhe estão ligados. Pode-se pensar que é um assunto relativamente simples manter a preparação de sangue estéril durante as manipulações necessárias para concentrar as plaquetas. No entanto, as bactérias podem ser introduzidas de, pelo menos, duas maneiras diferentes. Em primeiro lugar, se o dador tem uma bacteriémia suave, o sangue será contaminado· independentemente dos métodos de recolha e armazenamento. O conhecimento adequado da história do dador e das suas condições físicas irão diminuir este problema mas não o eliminam. Ver B. J. Grossman et al., Transfusion 31: 500 (1991). Uma segunda, mas mais penetrante, via de contaminação é a picada da agulha. Mesmo quando se usam métodos “estéreis” para a preparação da pele, é muito difícil esterilizar as criptas à volta das glândulas sudoríperas e folículos pilosos. Durante a picada, esta pele contaminada é frequentemente cortada num pequeno “centro” por uma agulha pontiaguda. Este centro serve para “semear” o saco de sangue com bactérias que podem crescer e tomar-se um risco para o receptor.

De facto, muitos pacientes que necessitam de transfusões de plaquetas têm falta de mecanismos de defesa para a destruição normal porque estão a fazer quimioterapia ou devido a uma simples doença hematológica. O crescimento de organismos, mesmo que aparentemente inócuos, nas plaquetas armazenadas pode, após a transfusão, resultar numa reacção por parte do receptor e em morte. Ver, por exemplo, B. A. Myhre JAMA 244: 1333 (1980). J. M. Heal et al. Transfusion 27: 2 (1987).

Os trabalhos feitos sobre a extensão da contaminação das plaquetas diferiram entre si nos métodos, tamanhos de amostra e nos esquemas de detecção de bactérias. D. H. Buchholtz, et al, Transfusion, 13: 268 (1973) divulgam um nível total de contaminação de plaquetas de 2,4% quando se examina uma grande amostra (>1000 sacos) e fizeram medições exaustivas do crescimento bacteriano. Enquanto que algumas unidades estavam fortemente contaminadas com apenas 24 horas de armazenamento, a incidência como um todo variava de acordo com a idade do concentrado e aumentava com a prática de misturar unidades individuais; mais de 30% das misturas estavam contaminadas após 3 dias. Ver também D. H. Buchholtz, et al, New Eng. J. Med. 285: 429 (1971). Enquanto que outros clínicos sugerem números mais baixos, estudos recentes indicam as transfusões plaquetárias sépticas são registadas muito por defeito. Ver, por exemplo, J. F. Morrow et al. JAMA 266: 555 (1991).

Fazer a pré-cultura das plaquetas não é uma solução para o problema da contaminação bacteriana. O ensaio de cultura demora 48 horas para detectar crescimento. Guardar as unidades de plaquetas por mais dois dias para esperar pelos resultados iria, ironicamente, criar uma pequena margem de segurança. Ver Tabela 2 em J. F. Morrow et al. JAMA 266: 555 (1991). Enquanto que as unidades muito contaminadas seriam detectadas no inicio, as unidades ligeiramente contaminadas podem crescer durante mais dois dias. Acabariam por ser transfundidas unidades mais velhas e potencialmente mais contaminadas.

Lavar as células sanguíneas (por exemplo, com solução salina) ou filtrar as bactérias não são soluções práticas. Estas técnicas são demoradas e ineficazes, pois podem reduzir o número de células sanguíneas viáveis para serem transfundidas. Mais 4

importante ainda é o facto de que estas técnicas envolvem a “entrada” no sistema de armazenamento. Assim que se faz uma entrada num sistema previamente fechado, o sistema é considerado “aberto”, e a transfusão deve ocorrer rapidamente, independentemente do modo em como o sangue foi recolhido e processado no início.

Por fim, os antibióticos não são uma solução razoável. A contaminação ocorre a partir de um largo espectro de organismos. Os antibióticos necessitariam de cobrir esse espectro. Muitos receptores são alérgicos aos antibióticos. Para além disso, há um crescente número de estirpes de bactérias resistentes aos antibióticos que não seriam inactivadas.

Em suma, há a necessidade de inactivar bactérias dos componentes sanguíneos antes do armazenamento e da transfusão de um modo que permita a utilização de um sistema fechado. Esta aproximação deve ser capaz de lidar com uma grande variedade de organismos sem prejudicar o produto sanguíneo ou o receptor da transfusão.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de contaminantes em materiais que se pretendem para utilização in vivo e em sangue articular e produtos sanguíneos para utilização em humanos. A invenção está definida nas reivindicações. De acordo com a presente invenção, utiliza-se selectivamente um composto que se liga ao ácido nucleico, para tratar a contaminação por microrganismos. Numa das formas de realização, a presente invenção contempla um método de inactivação de microrganismos nas preparações de sangue antes de armazenamento a longo prazo e das transfusões, compreendendo: a) fornecimento, em qualquer ordem, i) 8-metoxipsoraleno; ii) meios para activar o 8-metoxipsoraleno; iii) uma preparação sanguínea que se pretende para utilização in vivo que se suspeita de estar contaminada com microrganismos; b) adição de 8-metoxipsoraleno à preparação sanguínea numa concentração final de 30 pg/ml ou menos; e c) activação do 8-metoxipsoraleno, de modo que os compostos se liguem covalentemente ao ácido nucleico de uma porção dos microrganismos. O método da presente invenção é particularmente útil quando os microrganismos consistem em microrganismos unicelulares e multicelulares, como bactérias, fungos, micoplasma e protozoários. A presente invenção é utilizada com sucesso em plaquetas e plasma.

Numa das formas de realização preferidas, a activação consiste um aparelho de fotoactivação capaz de emitir uma determinada intensidade de um espectro de radiação electromagnética que compreende comprimentos de onda entre 180 nm e 400 nm. A intensidade é inferior a 20. mW/cm2 e a preparação sanguínea é exposta a esta intensidade durante menos de dez minutos. Numa das formas de realização, a preparação sanguínea é exposta a esta intensidade apenas durante aproximadamente cinco minutos.

Noutra forma de realização, a presente invenção contempla um método de tratamento do material que se pretende para utilização in vivo, que consiste em: a) fornecer, por qualquer ordem, i) um ou mais compostos fotoreactivos que se liguem aos ácidos nucleicos; ii) meios para fotoactivar os compostos que se liguem aos ácidos nucleicos; e iii) uma preparação sanguínea que se pretende para utilização in vivo que se suspeita de estar contaminada com microrganismos; b) adição do composto fotoreactivo que se liga aos ácidos nucleicos ao material; e c) fotoactivação do composto fotoreactivo que se liga aos ácidos nucleicos com um espectro de radiação electromagnética com um pico de intensidade entre 330 nm e 350 nm, de modo que os compostos se liguem covalentemente ao ácido nucleico de uma porção dos microrganismos. De preferência, os meios de fotoactivação compreendem filtros de cortes de comprimentos de onda a 320 nm, abaixo dos quais não se transmite radiação, e a 360 nm, acima dos quais não se transmite radiação. A intensidade é inferior a 20 mW/cm2.

Esta forma de realização também é utilizada com sucesso em preparações sanguíneas, como plaquetas e plasma. Quando se inactivam preparações sanguíneas, é preferível que a exposição a esta intensidade seja inferior a dez minutos. Não se pretende que a presente invenção se limite a compostos que liguem a ácidos nucleicos específicos. Numa forma de realização, a presente invenção contempla compostos fotoreactivos que se liguem aos ácidos nucleicos, seleccionados do grupo que consiste nas furocumarinas. Numa forma de realização preferida, a furocumarina é um psoraleno, como o 8-metoxipsoraleno. A presente invenção também contempla composições com propriedades anti-microbianas. Numa forma de realização, a composição compreende uma solução aquosa de 8-metoxipsoraleno com uma concentração inferior a 30 (ig/ml e material que se pretenda para utilização in vivo. De preferência, a concentração deve ser aproximadamente 3 pg/ml. A presente invenção também contempla a utilização de compostos que se liguem a ácidos nucleicos em combinação com outros reagentes (incluindo meios de armazenamento específicos), preparados terapêuticos, e farmacêuticos.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é uma vista em perspectiva de uma forma de realização do aparelho da presente invenção. A figura 2 é uma representação de um corte seccional do aparelho representado na Figura 1 ao longo da linha 2-2. A Figura 3 é uma representação de um corte seccional do aparelho representado na Figura 1 ao longo da linha 3—3. A Figura 4 é uma representação de um corte seccional do aparelho representado na Figura 1 ao longo da linha 4—4. A Figura 5 mostra esquematicamente a aproximação à descontaminação da presente invenção aplicada especificamente aos produtos sanguíneos. A Figura 6 é um gráfico que mostra a fotoadição do 8-metoxipsoraleno ao ácido nucleico. A Figura 7 é um gráfico que mostra a fotoadição do 8-metoxipsoraleno (8-MOP) em comparação com o 4’-aminometil-4,5’-trimetilpsoraleno (AMT), medido por HPLC. fiv

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de contaminantes em materiais que se pretendem para utlização in vivo. Em particular, o método da presente invenção consiste no tratamento de concentrados plaquetários quanto à contaminação por microrganismos.

Tal como já foi referido, o sangue é recolhido e normalmente separado em glóbulos vermelhos, plaquetas e plasma. Cada uma destas fracções é individualmente armazenada em condições específicas antes da sua utilização in vivo. Em muitos casos, a extensão da contaminação está relacionada com o tempo de armazenamento, devido ao crescimento. Espera-se que um método que inactive os microrganismos no momento da colheita do sangue evite o crescimento durante o armazenamento.

Numa das formas de realização, a presente invenção contempla a inactivação das plaquetas após a separação mas antes do armazenamento. Nesta forma de realização, utiliza-se selectivamente um composto que se liga aos ácidos nucleicos para tratar a contaminação por microrganismos.

Numa das formas de realização, o composto que se liga aos ácidos nucleicos é seleccionado do grupo que compreende as furocumarinas. Numa forma de realização preferida, a furocumarina é um psoraleno que é activado por um aparelho de fotoactivação.

Os psoralenos são compostos tricíclicos formados por uma fusão linear de um anel furano com uma cumarina. Os psoralenos podem-se intercalar entre os pares de bases das cadeias duplas dos ácidos nucleicos, formando aduções covalentes com as bases de pirimidina com a absorção de luz de comprimento de onda ultravioleta (UVA). G. D. Cimino et al., Ann. Rev. Biochem. 54: 1151 (1985). Hearst et al., Quart. Rev. Biophys. 17:1 (1984). Se houver uma segunda pirimidina adjacente à monoadução psoraleno-pirimidina e na cadeia oposta, a absorção de um segundo fotão pode levar à formação de uma dupla adução com funções de cruzamento entre as cadeias. S. T. Isaacas et al., Biochemistry 16: 1058 (1977). S. T. Isaacas et al., Trends in Photobiology (Plenum) pp 279-294 (1982). J. Tessman et al, Biochem. 24: 1669 (1985). Hearst et al., Patentes estadunidenses N° 4,124,589; 4,169,204, e 4,196,281.

Verificou-se que os psoralenos inactivam vírus em certos produtos sanguíneos. Ver H. J. Alter et al., The Lancet (ii: 1446)(1988). L. Lin et al., Blood 74: 517 (1989). G. P. Wiesehahn et al., patentes estadunidenses n° 4,727,027 e 4,748,120, descrevem a utilização de uma combinação de 8-metoxipsoraleno (8-MOP) e irradiação. Mostram que 300 pg/ml de 8-MPO em conjunto com uma hora ou mais de irradiação com luz ultravioleta podem efectivamente inactivar vírus. No entanto, estas condições de tratamento prejudicam o produto sanguíneo devido à transferência de energia. Esta aproximação só é realizável se se suprimirem as células danificadas limitando a concentração de oxigénio molecular, o que é um processo caro e difícil. O método de inactivação da presente invenção fornece um método de inactivação de organismos unicelulares e multicelulares, e em particular, de bactérias, fungos, micoplasma e protozoários. Em contraste com aproximações anteriores, o método da presente invenção não prejudica as plaquetas. Não há danos significativos em relação às células, e assim, não há a necessidade de limitar a concentração de oxigénio molecular. A presente invenção contempla a utilização de muito menores concentrações de compostos que se liguem aos ácidos nucleicos, do que as que eram anteriormente utilizadas. Por exemplo, contempla concentrações de 8-MOP de 30 pg/ml ou menos. De facto, a concentração preferida de 8-MOP para a descontaminação bacteriana em concentrados plaquetárias é de 3 pg/ml ou inferior, isto é, cem vezes inferio à concentração à utilizada por G. P. Wiesehahn et al, supra.

Para além disto, a presente invenção contempla a utilização de muito menores doses de radiação do que foi anteriormente descrito. Este facto é conseguido com fontes de irradiação de menor intensidade, com filtros de corte de comprimentos de onda (ver em baixo), e/ou períodos de irradiação mais curtos. Numa forma de realização preferidas, o tempo de irradiação é variável e controlada de 1 segundo até 99 minutos, com incrementos de um segundo.

Numa das formas de realização, o aparelho da presente invenção é montado num agitador, dando movimento horizontal e sinusoidal com amplitude e frequência variável. Numa outra forma de realização, bloqueiam-se os sacos quanto ao calor de lâmpadas e de outras fontes.

Apesar de não se pretender que a presente invenção seja limitada pela teoria da inactivação, a utilização de concentrações mais baixas do composto e de doses de irradiação mais baixas provém da compreensão do facto de que quando de aplica a presente invenção à descontaminação de um organismo unicelular ou multicelular (em oposição aos vírus), a inactivação será conseguida com menor nível de ligação aos ácido nucleicos. Para além disso, reconhece-se que a inactivação não necessita de ser completa. O que significa, a inactivação parcial será adequada desde que a porção viável, durante o período de armazenamento, não seja capaz de crescer até níveis suficientes para provocar doenças.

Para compreender este facto, de que em qualquer método de inactivação se pode ou não conseguir a inactivação completa, é útil considerar um exemplo específico. Diz-se que uma cultura bacteriana está esterilizada se uma alíquota da cultura transferida para uma placa de meio de cultura fresco e se posta em condições que permitam o crescimento, ele não for detectável após um determinado período de tempo.Ό período de tempo e as condições de crescimento (por exemplo, a temperatura) definem um “factor de amplificação”. Este factor de amplificação aliado às limitações do método de detecção (por exemplo, a inspecção visual da placa de cultura para verificar a existência de colónias de bactérias) define a sensibilidade de um método de inactivação. Um número mínimo de bactérias viáveis deve ser aplicado à placa para um sinal de detectabilidade. Com o método de detecção óptimo, este número mínimo é 1 célula bacteriaiia. Com um método de detecção subóptimo, o número mínimo de células bacterianas determina o “limiar” abaixo do qual o método parece ser completamente eficaz (a acima do qual o método é, de facto, apenas parcialmente eficaz).

Este espaço entre o factor de amplificação de um teste e o limiar que o método de detecção define pode ser ilustrado. Por exemplo, as células bacterianas podem ser $ f)' β / κ·χ colocadas numa placa; ο método de detecção é arbitrariamente escolhido como sendo inspecção visual. Assume-se que o tempo e as condições de crescimento são tal que ocorreu uma amplificação total de 104. O sinal detectável será proporcional ao número de células bacterianas presentes após a amplificação. Para fins de cálculo, o limiar de detecção é de 106 células; se depois da amplificação estiverem presentes menos de 106 células, não se detectam visualmente colónias de células e o método de inactivação irá parecer eficaz. Com o factor de amplificação de IO4 e o limiar de detecção de 106, o limite de sensibilidade seria de 100 células bacterianas; se na alíquota original estivessem presentes menos de 100 células bacterianas viáveis depois de ser realizado o método de esterilização, a cultura parecerá estéril.

Esta situação é comum nos testes de crescimento bacteriano. A sensibilidade do teste é tal que estão presentes células bacterianas viáveis mas o teste não é capaz de as detectar. Este facto pode explicar, pelo menos em parte, a variabilidade dos resultados obtidos por investigadores que tentaram determinar a extensão da contaminação bacterinana em produtos sanguíneos. Ver D. H. Buchholz, et al., Transfusion 13:268 (1973), em que se discute esta variabilidade. É de notar que em alguns países, a contaminação das plaquetas por organismos celulares é mais penetrante, e assim sendo mais séria que as contaminações víricas. Por exemplo, na América do Sul, o organismo mais importante proveniente do sangue é o T. cruzi, que é o agente etiológico da doença de Chagas. Cerca de 16-18 milhões de pessoas, na América, estão infectadas (incluindo 11% da população do Chile). Verifica-se que o método de descontaminação da presente invenção é adequado para a inactivação deste protozoário. A presente invenção contempla aparelhos e métodos para a fotoactivação e em específico, para a activação de compostos fotoreactivos que se ligam aos ácidos nucleicos. A presente invenção contempla aparelhos com uma fonte barata de radiação electromagnética que está integrada numa unidade. Em geral, a presente invenção contempla um aparelho de fotoactivação para o tratamento de compostos fotoreactivos que compreende: a) meios para providenciar comprimentos de onda adequados de radiação electromagnética de modo a causar a activação de pelo menos um composto fotoreactivo; b) meios para manter as plaquetas numa relação fixa em relação aos meios que fornecem a radiação durante a activação; e c) meios para manter a temperatura das plaquetas dentro do intervalo de temperaturas desejado durante a activação. A presente invenção também contempla métodos, compreendendo: a) suporte dos recipientes de plaquetas, contendo um ou mais compostos fotoreactivos numa relação fixa com uma fonte fluorescente de radiação electromagnética; b) irradiação simultânea das plaquetas com a referida radiação electromagnética de modo a causar a activação de pelo menos um composto fotoreactivo; e c) manutenção da temperatura das plaquetas dentro de um intervalo de temperatura desejado durante a activação. A melhor característica de uma forma de realização do aparelho da presente invenção envolve: A) uma fonte barata de radiação electromagnética numa relação fixa com os meios que suportam os recipientes com as amostras, B) fotoactivação rápida, C) grande processamento de amostras , D) controlo de temperatura das amostras irradiadas, e E) segurança inerente. A. Fonte de Radiação Electromagnética

Um aparelho de fotoactivação preferido da presente invenção tem uma fonte barata de radiação ultravioleta numa relação fixa com os meios de suporte dos recipientes das amostras. A radiação ultravioleta é uma forma de energia que ocupa uma porção do espectro de radiação electromagnética (o espectro de radiação electromagnética varia dos raios cósmicos até às ondas de radio). A radiação ultravioleta pode ter origem em fontes naturais e em fontes artificiais. Dependendo da fonte de radiação ultravioleta, pode ser acompanhada por outros tipos (não ultravioleta) de radiação electromagnética (por exemplo, luz visível).

Descrevem-se aqui tipos particulares de radiação ultravioleta em termos de comprimentos de onda. Os comprimentos de onda são aqui descritos em termos de nanómetros (“nm”; 10’9 metros). Para os fins deste trabalho, a radiação ultravioleta extende-se aproximadamente de 180 nm até aos 400 nm. Quando uma fonte de radiação, devido a filtros ou a outros meios, não permite radiação abaixo de um determinado coomprimento de onda (por exemplo, 320 nm), diz-se que tem um “corte” (cutoff) inferior àquele comprimento de onda (por exemplo, “um corte de comprimento de onda a 300 nanómetros). Do mesmo modo, quando uma fonte de radiação apenas permite que haja radiação abaixo de um determinado comprimento de onda (por exemplo, 360 nm), diz-se que tem um “corte” (cutoff) superior àquele comprimento de onda (por exemplo, “um corte de comprimento de onda a 360 nanómetros).

Em qualquer reacção fotoquímica deseja-se eliminar ou minimizar as reacções secundárias prejudiciais. Algumas destas reacções secundárias podem ser causadas pela excitação de cromóforos endógenos que podem estar presentes durante o procedimento de activação fotoquímica. Num sistema em que apenas estão presentes o ácido nucleico e o psoraleno, os cromóforos endogenos são as próprias bases dos ácidos nucleicos. Restringindo o processo de activação a comprimentos de onda superiores a 320 nm minimiza os danos directos ao ácido nucleico pois há muito pouca absorção por parte dos ácidos nucleicos acima dos 313 nm.

Nos produtos sanguíneos, o ácido nucleico está normalmente presente em conjunto com outros cromóforos biológicos. Se o fluído biológico for apenas proteínas, o corte aos 320 nm será adequado para minimizar as reacções secundárias (os aminoácidos aromáticos não absorvem acima dos 320 nm). Se o fluído biológico incluir células e/ou constituintes celulares, haverá muitos outros cromóforos, incluindo o grupo hemo e as flavinas.

Os grupos hemo são abundantes nos produtos sanguíneos porque provêm da lise dos glóbulos vermelhos. As flavinas, tais como os grupos hemo, são necessárias para a respiração metabólica. Ambos os cromóforos irão prejudicar as células se forem excitados pela fotoirradiação.

Os grupos hemo têm três bandas principais de absorção: duas estão na região vermelha do espectro visível; a outra está centrada nos 400 nm. As flavinas têm dois picos principais de absorção: um a 450 nm e o outro a 370 nm. β

Tendo em conta a presença destes cromóforos endógenos nos produtos sanguíneos, pretende-se que o aparelho da presente invenção seja desenvolvido de modo a permitir a irradiação dentro de um pequeno intervalo de comprimentos de onda específicos e desejáveis, e assim evitando danos nas células causados pela transferência de energia. O intervalo preferido de comprimentos de onda desejáveis situa-se entre 320 e 350 nm.

Pode-se conseguir alguma selectividade pela escolha das fontes de irradiação comerciais. Por exemplo, enquanto que os tubos fluorescentes normais emitem em comprimentos de onda que vão dos 300 nm até acima dos 400 nm (com o maior pico centrado cerca dos 360 nm), as lâmpadas fluorescentes do tipo BLB são desenvolvidas de modo a remover os comprimentos de onda acima dos 400 nm. Estas, no entanto, apenas fornecem um corte superior de comprimentos de onda.

Numa forma de realização preferida, o aparelho da presente invenção compreende meios de filtração adicionais. Numa forma de realização, o meio de filtração consite num filtro de corte (cutoff) de vidro, como uma peça de vidro de Cobalto. Numa outra forma de realização, o meio de filtração consiste num filtro de uma solução líquida que transmite apenas numa região específica do espectro electromagneético, como uma solução aquosa de Co(NC>3)2. Esta solução de sal tem uma janela de transmissão de 320-400 nm. Numa forma de realização preferida, a solução aquosa de Co(N03)2 é usada em combinação com N1SO4 de modo a remover o componente 365 nm do espectro de emissão da fonte fluorescente ou da lâmpada de arco usada. A solução Co-Ni conserva muito bem a sua transmissão inicial mesmo depois de dezenas de horas de exposição à luz directa de fontes de elevada energia. Não se pretende que a presente invenção seja limitada pelo filtro usado. Variados sais inorgânicos e vidros satisfazem as condições necessárias. Por exemplo, o sulfato cúprico é um filtro em geral muito útil para retirar os infravermelhos, quando se pretende isolar apenas os ultravioletas. A sua estabilidade com fontes intensas é bastante boa. Os técnicos desta área conhecem outros filtros, Também se podem usar lâmpadas reflectoras ou de abertura para conseguir comprimentos de onda e intensidades específicas. 14 ?e ¢31711 í

Quando se usa radiação ultravioleta em termos de irradiação, é expressa em termos de fluxo de intensidade (miliwatts por centímetro quadrado ou “mW cm'2”)- “Saída” (output) é aqui usado para incluir quer as emissões de radiação (sim ou não, ligado ou desligado) quer o nível de radiação. Numa forma preferida de realização, a intensidade é monitorizada em 4 locais, 2 em cada lado do plano de irradiação.

Uma fonte preferida de radiação ultravioleta é uma fonte fluorescente. A fluorescência é um caso especial de luminescência. A luminescência envolve a absorção de radiação electromagnética por uma substância e a conversão da energia em radiação de diferentes comprimentos de onda. Com a fluorescência, a substância que é excitada pela radiação electromagnética regressa ao seu estado inicial emitindo um quantum de radiação electromagnética. Apesar de até aqui se pensar que as fontes fluorescentes são de intensidade demasiado baixa para serem úteis na fotoactivação, numa das formas de realização da presente invenção utiliza-se fontes fluorescentes de modo a obter resultados só atingíveis com equipamentos mais caros.

Tal como é aqui usado, uma relação fixa é definida como sendo a distância e geometria fixa entre a amostra e a fonte de luz durante a irradiação da amostra. A distância diz respeito à distância entre a fonte e a amostra no local de suporte. Sabe-se que a intensidade da luz é inversamente relacionada proporcional ao quadrado da distância em relação à fonte. Assim, pequenas modificações na distância à fonte podem ter efeitos drásticos na intensidade. Como as modificações na intensidade podem ter impacto no resultados da fotoactivação, nos aparelhos da presente invenção evitam-se AS ALTERAÇÕES NA DISTÂNCIA. Este facto possibilita a reproductibilidade e a repetitibilidade. A geometria relaciona-se com o posicionamento da fonte de luz. Por exemplo, pode-se imaginar que a fonte de luz se pode posicionar à volta do suporte da amostra de várias maneiras diferentes (dos lados, por baixo, num circulo, etc.). A geometria usada numa forma de realização preferida da presente invenção permite uma exposição uniforme à luz de intensidade apropriada para uma rápida fotoactivação. A geometria do aparelho preferido da presente invenção envolve fontes múltiplas de lâmpadas lineares em oposição às fontes únicas. Para além disto, existem várias superfícies reflectoras e várias superfícies absorventes. Devido à sua geometria complicada, as modificações no número de lâmpadas ou na sua localização em relação à posição da amostra a ser irradiada devem ser evitadas, pois essas modificações terão como resultado alterações na intensidade. B. Fotoactivação Rápida A fonte de luz da forma de realização preferida da presente invenção permite a fotoactivação rápida. As características de intensidade do aparelho de irradiação foram seleccionadas de modo a serem as convenientes tendo em conta o facto de poder haver muitos conjuntos de amostras múltiplas para serem processadas. Com esta previsão, um tempo de exposição de quinze minutos ou menos é um objectivo prático.

Ao desenhar os aparelhos da presente invenção, a posição relativa dos elementos do aparelho preferido foi optimizada de modo a permitir um tempo de irradiação de quinze minutos, de modo que, quando medido para os comprimentos de onda entre 320 e 350 nanómetros, se fornece uma intensidade de fluxo de aproximadamente 1 mW cm"2 aos recipientes das amostras. Numa forma de realização preferida, o aparelho irradia ambos os lados do saco. C. Processamento de um Grande Número de Amostras

Tal como já foi referido, outra importante característica do aparelho de fotoactivação da presente invenção é o facto de possibilitar o processamento de um grande número de amostras. Para este efeito, um elemento do aparelho é um meio de suporte das plaquetas, e em particular, os sacos com o sangue. Na forma de realização preferida da presente invenção, os meios de suporte consistem em placas de vidro entre duas margens de luz, com capacidade para seis sacos com 50 ml (equivalente ao saco Dupont Stericell) e para a tubagem e ligações de uma só vez. Ao aceitar os sacos normalmente usados e comercialmente disponíveis, o aparelho da presente invenção permite o processamento conveniente de grande número de amostras. D. Controlo de Temperatura

Tal como já foi referido, uma importante característica do aparelho de fotoactivação da presente invenção é o controlo de temperatura. O controlo de temperatura é importante porque a temperatura da amostra no momento da exposição à luz pode ter um impacto dramático nos resultados. Por exemplo, as condições que promovem a estrutura secundária nos ácidos nucleicos também potenciam as constantes de afinidade de muitos derivados do psoraleno para os ácidos nucleicos. Hyde e Hearst, Biochemistry, 17, 1251 (1978). Estas condições são uma mistura da composição do solvente e da temperatura. Com o ARN ribossómico 5S de cadeia simples, a irradiação a baixas temperaturas aumenta em duas vezes a adição covalente de HMT ao rARN 5S a 4°C quando comparado com 20°C. Thompson et al., J. Mol. Biol. 147: 417 (1981). A influência da temperatura nas ligações do psoraleno foi também observada em relação aos polinucleotídeos sintéticos. Thompson et al„ Biolchemistry 21: 1363 (1982).

Em relação às bactérias, deve-se ter em conta que ocorre a reparação das ligações cruzadas que se formam durante a irradiação. No entanto, quando se utilizam temperaturas baixas durante a irradiação, o processo de reparação das bactérias é suprimido. Assim, uma irradiação a 15°C tem um efeito significativo no nível de inactivação que é observada. E. Segurança Inerente A radiação ultravioleta pode provocar queimaduras graves. Dependendo da natureza da exposição, pode ser carcinogénico. A fonte de luz de uma forma de realização preferida da presente invenção é vedada ao utilizador. Este facto contrasta com fontes de ultravioletas manuais comerciais tal como com as grandes fontes de alta intensidade. Numa forma de realização preferida, a fonte de irradiação está contida dentro de um contentor feito de um material que obstrui a transmissão de energia radiante (isto é, um contentor opaco). Não de deixa passar irradiação para o utilizador. Isto permite a segurança inerente para o utilizador.

EXPERIÊNCIAS

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar certas formas de realização preferidas da presente invenção e não foram feitos para limitar o seu âmbito.

Na divulgação experimental que se segue, utilizam-se as seguintes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar); μΜ (micromolar); N (Normal); mole (moles); mmole (milimoles); pmole (micromoíes); nmole (nanomoles); gm (gramas); mg (miligramas); μg (microgramas); L (litros); ml (mililitros); μΐ (microlitros); cm (centímetro); mm (milímetros); μιη (micrómetros); nm (nanómetros); °C (grau Centígrado); HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência). EXEMPLO 1

Tal como já foi referido, a presente invenção contempla aparelhos e métodos para a activação de compostos fotoreactivos que se ligam aos ácidos nucleicos. Neste exemplo, descreve-se um aparelho de fotoactivação para a descontaminação de produtos sanguíneos de acordo com o método da presente invenção. O aparelho compreende: a) meios para fornecer comprimentos de radiação electromagnética apropriados de modo a provocar a activação de pelo menos um composto fotoreactivo; b) meios para suportar uma pluralidade de produtos sanguíneos numa relação fixa com os meios de irradiação durante a activação; e c) meios para manter a temperatura das plaquetas dentro de um intervalo de temperaturas desejado durante a activação. A Figura 1 é uma vista em perspectiva de uma forma de realização do aparelho que tem as características acima mencionadas. A figura mostra um contentor opaco (100) com uma porção que foi removida, contendo um conjunto de lâmpadas (101) acima e abaixo do local que contém as plaquetas (102) colocadas entre um conjunto de placas (103, 104). O um conjunto de placas (103, 104) está descrito com mais pormenor mais à frente.

As lâmpadas (101) que se ligam a uma fonte de energia (não representada), servem como fonte de radiação electromagnética. Apesar de não estar limitada quanto ao tipo 18 p<f de lâmpada, a forma de realização está configurada de modo a aceitar uma lâmpada padrão na indústria, duplo ‘bipinf O contentor (100) pode ser aberto com um fecho (105) de modo que as plaquetas possam ser colocadas de modo apropriado. Tal como se vê na Figura 1, o contentor (100), quando está fechado, retém completamente a radiação das lâmpadas (101). Durante a irradiação, o utilizador pode confirmar que o aparelho está a trabalhar olhando através de uma janela de segurança (106) que não permite a transmissão de luz ultravioleta para o utilizador. O contentor (100) também serve como base para vários componentes electrónicos num painel de controlo (107), incluindo, como exemplo, um interruptor para a energia, um temporizador e um cronómetro. Por conveniência, o interruptor da energia, pode estar ligado ao temporizador e este estar ligado em paralelo ao cronómetro e à fonte de radiação electromagnética. O temporizador permite ao utilizador preestabelecer o tempo de irradiação a um nível desejável de exposição. O cronómetro mantém um registo do número total de horas de irradiação que é fornecida pela fonte de radiação electromagnética. Esta característica permite que as lâmpadas (101) sejam monitorizadas e substituídas antes que a intensidade emitida diminua abaixo de um nível mínimo necessário para a fotoactivação rápida. A Figura 2 é uma representação de um corte seccional do aparelho representado na Figura 1 ao longo da linha 2—2. A Figura 2 mostra a disposição das lâmpadas (101) com o contentor (100) aberto. Um reflector (108A, 108B) rodeia completamente cada conjunto de lâmpadas (101). Os recipientes com as plaquetas (102) são colocados entre o conjunto de placas superior (103) e o conjunto de placas inferior (104). Cada conjunto de placas é constituído de uma placa superior (103 A, 104A) e de uma placa inferior (103B, 104B). Os conjuntos de placas estão (103, 104) estão ligados através de um gonzo (109) que está desenhado de modo a proporcionar o espaço criado pelos os recipientes com as plaquetas (102). O conjunto de placas superior (103) pousa cuidadosamente em cima os recipientes com as plaquetas (102) que estão apoiados no conjunto de placas inferior (104).

Podem-se, convenientemente, colocar detectores (110A, 110B, 110C, 110D) entre as placas (103A, 103B, 104A, 104B) dos conjuntos de placas (103, 104). Podem estar ligados a um painel de circuito impresso (111) que por sua vez está ligado ao painel de controlo (107). A Figura 3 é uma representação de um corte seccional do áparelho representado na Figura 1 ao longo da linha 3—3. Colocam-se seis recipientes com as plaquetas (por exemplo, sacos unitários de plaquetas de teflon) numa relação fixa acima do conjunto de lâmpadas (101). A temperatura das plaquetas pode ser controlado por via de um só ventilador (112) ou, de preferência, utilizando um aparelho de troca de calor (113) com portas de arrefecimento de entrada (114) e de saída (115) ligadas a uma fonte de arrefecimento (não representada). A Figura 4 é uma representação de um corte seccional do aparelho representado na Figura 1 ao longo da linha 4—4. A Figura 4 mostra claramente, a aproximação ao controlo da temperatura de uma forma de realização preferida do aparelho. As placas do conjunto de placas superior (103A, 103B) e as placas do conjunto de placas inferior (104A, 104B) criam uma câmara de controlo da temperatura (103C, 104C), respectivamente. O ventilador (112) pode fazer circular ar éntre as câmaras (103C, 104C). Quando se utiliza o aparelho de troca de calor (113), o ar circulante é arrefecido e passado entre as placas (103A, 103B, 104A, 104B). EXEMPLO 2 A Figura 5 mostra um forma de realização em que as plaquetas são tratadas pelo método da presente invenção. Depois da fraccionação, as plaquetas são transferidas para um saco contendo um composto que se liga aos ácidos nucleicos (representado na Figura 1 como saco sombreado). Este saco, que tem propriedades de transmissão e outras características apropriadas para a presente invenção, é depois colocado num aparelho de irradiação (tal como o descrito no Exemplo 1, acima) e é irradiado. Os compostos livres podem ser recolhidos ou “capturados” se desejar, por um aparelho de captura. Em tal caso, o saco não conterá outros compostos para além dos que estão contidos nas células; o saco não terá compostos livres (este saco está representado na' Figura 1 a sombreado). EXEMPLO 3

Neste exemplo, os métodos de descontaminação da presente invenção são aplicados para inactivar Yersinia enterocolitica, tipo selvagem, serótipo 3, biótipo 4. Este organismo encontra-se nos produtos sanguíneos. Ver, na generalidade, R.Y. Dodd, In: Transfusion Medicine in the 19990’s (American Assoe. Blood Banks 1990) (S.J. Nance* ed). Ver também B. J. Grossman etal, Transfusion 31:500 (1991).

Fez-se uma cultura com crescimento de uma noite inoculando 10 ml de um caldo de infusão cérebro- coração (Brain- Heart Infusion- BHI) com uma picada de uma cultura de mobilidade. Manteve-se esta cultura a 35°C e usou-se 0,1 ml para inocular 20 ml de caldo BHI para ser usado no ensaio. Depois de incubação durante uma noite, a cultura estacionária foi centrifugada durante 15 minutos a 1900 g, rejeitou-se o sobrenadante, e resuspendeu-se a pílula bacteriana em 1 ml de soro normal inactivado pelo calor. Foi colocado numa unidade de plaquetas humanas frescas obtidas no Blood Bank de Alameda -Contra Costa Medicai Association. Retiraram-se do saco alíquotas de 5 ml de concentrado plaquetário contendo bactérias e receberam quantidades específicas de 8-MOP e de radiação UVA, excepto no caso dos controlos, que foram irradiados sem psoraleno, ou não receberam tratamento (ver Tabela 1). A temperatura foi mantida a 25°C durante a irradiação colocando o concentrado plaquetário em câmaras de vidro ‘tapado’ com revestimento de água ligado a um banho de água circulante. O aparelho de irradiação (Derma Control dolton, III:; Modelo n° 1224-Especial) usou dois conjuntos (seis lâmpadas/ conjunto com espaços de 2,5 polegadas), um conjunto acima da amostra e o outro por baixo da amostra (assim, a amostra está a cérca de 3 polegadas das lâmpadas). Cada conjunto está separado do outro por cerca de seis polegadas, têm um reflector metálico polido por trás de cada, e estão cobertos por uma folha de plástico acrílico transmissor de UVA. A amostra a ser processada (por exemplo, saco de plaquetas) é colocado na folha inferior.

TABELA 1 droga 8-MOP/mI Tempo de irr.,(min)0 Log/ml -título 1 Sem droga 0 9,1 2 Sem droga 10 9,3 0,2 n J 8-MOP 30 pg 10 <0 >-9,1 4 8-MOP 10 10 <0 >-9,1 5 8-MOP 2 10 3,4 -5,7 6 8-MOP 0,2 10 6,8 -2,3 7 8-MOP 0,06 10 9,0 -0,1

Usaram-se lâmpadas Derma Control tipo F587T12-BL-HO. São tubos de “luz negra” (desenvolvidas de modo emitir em comprimentos de onda específicos devido a um revestimento de fósforo interno) de 24 polegadas de comprimento. O pico de comprimento de onda está abaixo dos 360 nm, ao contrário das lâmpadas de mercúrio ou das lâmpadas de fluorescentes “BLB” comuns. A intensidade total é inferior a 20 mW/cm .

As bactérias foram quantificadas por plaqueamento de 0,1 ml de diluições decimais em caldo BHI em placas de Petri de 100 mm contendo BHI agarizado. Após 24 horas de incubação a 35°C, contaram-se as colónias e calculou-se a concentração bacteriana por ml. Os resultados (Tabela 1) mostram que apenas 3 pg/ml de 8-MOP são capazes de inactivar quase seis logaritmos de bactérias. Com 10 μg/ml, dez minutos são radiação mais do que suficientes. De facto, com 10 pg/ml, cinco minutos devem ser adequados. EXEMPLO 4

Artuc e os seus colaboradores analisaram a solubilidade do 8-MOP em proteínas séricas humanas e bovinas, e mostraram que em concentrações de 8-MOP que variam de 100 a 1000 ng/ml, concentrações semelhantes às observadas em pacientes que estão a fazer terapia de psoraleno ultravioleta A (PUVA) para a psoríase, 75% a 80% estava ligada à albumina. M. Artuc et al.„ J. Derm. 101:669 (1979). η

Neste exemplo, a ligação entre o 8-MOP e o Calf Thymus DNA é comparado usando plasma e um meio sem proteínas de modo a validar a eficiência das interacções psoraleno- nucleico nas condições dos métodos de descontaminação da presente invenção. Apesar destas medições usarem ácido nucleico eucariótico em vez de ácido nucleico bacteriano, este é um indicador útil do grau de formação de ligações nas bactérias.

[0077] Preparou-se 3H-8-MOP com uma concentração de 115 μg/ml em etanol com uma actividade específica de 4,7x106 CPM/micrograma (daqui em diante denominado “stock 8-MOP”)- Depois, 130,5 ou 22 μΐ (2 de cada) para amostras contendo DNA (“+DNA”) e 52,2 ou 8,7 μΐ para amostras que não contêm DNA (“-DNA”) foram secas. Às amostras +DNA, adicionou-se 40 μΐ de stock DNA (7,7 mg/ml) tal como 460 μΐ de plasma (congelado com um dia) ou 450 μΐ de tampão Tris-EDTA (“TE”). Ao último também se adicionou 10 μΐ de NaCl 5M. Para as amostras -DNA (isto é, os controlos), adicionou-se 184 μΐ de plasma e 16 μΐ de água.

As amostras agitadas suavemente durante aproximadamente- uma hora e fizeram-se contagens para verificar o 8-MOP dissolvido.

Cada amostra (100 μΐ) foi irradiada num HRI-100 (HRI Research Inc., Concord, CA) a 25°C durante 0, 2, 4, 6, 8 e 16 minutos. As amostras foram mantidas a 4°C durante a noite depois da irradiação. Depois, as amostras foram extraídas. Em primeiro lugar, preparou-se uma solução de fenol com pH 8 com utilização de Tris 0,1M pH 8. Cada amostra foi extraída com 100 μΐ de fenol. Cada amostra foi centrifugada durante 5 minutos de modo a remover a fase aquosa para outro tubo. Fez-se uma segunda extracção com 100 μΐ de 1:1 de fenol: clorofórmio. Fez-se uma extracção final com 100 μΐ de clorofórmio. A fase aquosa final foi precipitada pela adição de 50 μΐ de NaCl ajustado de modo a dar uma concentração final de NaCl de 0,2 M e depois pela adição de 250 μΐ de etanol. As amostras foram novamente centrifugadas (10 minutos). O sobrenadante foi removido e

as pílulas foram secas. As pílulas foram resuspensas em 100 μΐ de TE e novamente precipitadas. Este processo repetiu-se num total de 3 precipitações. As pílulas finais foram dissolvidas em 600 μΐ de água e fez-se a contagem de 100 μΐ. Cada amostra foi testada quanto ao DNA por medição de absorvância (260 nm). Os níveis de 8-MOP foram calculados como ligações por 1000 pares de bases (“8-MOP:kBP”). Os resultados (Figura 6) mostram que o plasma não modifica significativamente a cinética de adição do 8-MOP ao DNA. A frequência de formação de ligações 8-MOP-DNA prevê uma elevada multiplicidade de modificações no genoma bacteriano. Para além disso, este tipo de medições bioquímicas tem o potencial de fornecer um meio de monitorizar a eficiência do método de inactivação fotoquímica. EXEMPLO 5 A fotoactivação de psoralenos e isopsoralenos pode ter como resultado uma variedade de fotoprodutos. “Fotoprodutos” pode ser entendido considerando as reacções possíveis do composto fotoreactivo quando exposto a comprimentos de onda activadores de radiação electromagnética. Apesar de não estar limitado a nenhum mecanismo em específico, crê-se que a reacção do composto fotoreactivo no seu estado fundamental (“C”) com comprimentos de onda activadores de radiação electromagnética cria espécies excitadas de curta duração (“C*”): C-»C* O que acontece em seguida é em grande parte função dos potenciais reagentes estão disponíveis para as espécies excitadas. Como têm curta duração, crê-se que a reacção destas espécies com o ácido nucleico (“NA”) só é possível se o ácido nucleico estiver presente no momento que se gera a espécie excitada. Assim, a reacção deve, em termos operacionais, ter lugar na presença de comprimentos de onda activadores de radiação electromagnética, isto é, "fotoligação"; não é uma ligação no escuro. A reacção pode ser representada da seguinte forma:

C*+NA->NA:C produto da reacção será daqui em diante referido como "Produto de Fotoadição" e deve ser distinguido de "Fotoproduto".

Com a reacção descrita, podemos considerar a situação em que o ácido nucleico não está disponível para ligação no momento em que o composto é exposto aos comprimentos de onda activadores de radiação electromagnética. Como as espécies excitadas têm curta duração e não têm ácido nucleico com que reagir, as espécies excitadas podem simplesmente voltar ao seu estado fundamental.

C*-»C

Por outro lado, as espécies excitadas podem reagir com elas mesmas (isto é, espécies no estado fundamental ou excitadas) criando um complexo estado fundamental (C:C). O produto destas auto-reacções em que dois composto reagem é referido como “fotodímero” ou simplesmento como “dímero”. As auto-reacções, no entanto, não estão limitadas a dois compostos; pode-se formar uma variedade de multímeros (trímeros, etc.).

As espécies excitadas não se limitam a reagir com elas mesmas, podem reagir com o ambiente, como elementos do solvente (“E”) (por exemplo, iões, gases, etc.) de modo a produzir outros produtos:

C* + E->E:C E este tipo de reacção que se crê provocar danos celulares (por exemplo, reacção com o oxigénio de modo a criar espécies ligadas ao oxigénio). Para além disso, pode simplesmente sofrer um rearranjo interno (“isomerização”) numa forma derivada do seu estado fundamental (“[“): C* 25

Por fim, as espécies excitadas podem sofrer outras reacções para além das aqui descritas. A presente invenção e a compreensão do “fotoproduto” não dependem de qual (se houver alguma) destas reacções ocorre. “Fotoproduto”- qualquer que seja a sua natureza- existe desde que, a seguir à reacção de um composto com comprimentos de onda activadores de radiação electromagnética, há um produto resultante que pode interagir com outros componentes do meio ambiente da reacção.

Com psoralenos como o 4’-hidrometil-4,5’,8-tri-metilpsoraleno (HMT), há vários produtos resultantes quando o HMT é exposto a comprimentos de onda activadores de radiação electromagnética. Os principais produtos resultantes são dois fotodímeros ciclo-butil. Num dos dímeros, os dois aneis pirona numa configuração cis-sin, enquanto que no outro dímero, a ligação ocorre entre a extremidade furano de uma molécula e a extremidade pirano da outra, também com configuração cis-sin. Um terceiro produto resultante do HMT é um fotoisómero do HMT monomérico. Neste isómero, os oxigénios do anel central assumem uma posição 1,4 em vez da orientação 1,3 normal. Enquanto que não se espera que os dois fotodímeros tenham uma actividade intercalante devido a considerações geométricas, o fotoisómero permanece plano, e assim, pode ter uma associação intercalativa positiva com ácidos nucleicos de cadeia dupla e, assim, pode ser mutagéneo.

Neste exemplo, o enfraquecimento fotoquímico do 8-MOP é comparado com o AMT. As amostras foram analisadas por HPLC em fase reversa usando uma coluna Rainen Dynamax 300A. O gradiente de eluição foi feito com 0,1M acetato de amónia/ acetonitrilo (0-70% de acetonitrilo em 42 minutos). O AMT elui como um pico único aproximadamente aos 24 minutos nestas condições. A detecção foi por absorção a 260 ou 330 nm. O último comprimento de onda foi usado para amostras com plasma.

Prepararam-se soluções padrão de cada composto com várias concentrações. Estas soluções foram depois diluídas 1:10 em água, depois injectou-se 300 μΐ para análise. Todas as amostras foram monitorizadas a 300 nm. Os picos foram analisados medindo ’ί I „ quer a altura do pico quer a sua área, depois convertidos em valores de gh/ml usando o gráfico padrão. A área do pico foi determinada fotocopiando o registo, cortando a cópia do pico e depois pesando-o. Os dois métodos deram o mesmo resultado.

Os resultados estão representados na Figura 7. O AMT degrada-se claramente, que o 8-MOP. Espera-se então que gere mais fotoprodutos- que eventualmente iriam terminar no receptor da transfusão. Em contraste, não se espera que o 8-MOP gere uma quantidade significativa de fotoprodutos. Este facto é importante quando se considera que a autoridade concluiu que o 8-MOP é não-mutagénico. EXEMPLO 6

Quando as plaquetas são activadas, uma glicoproteína de membrana granular alfa chamada GMP140 fica exposta na superfície da plaqueta. Menos de 5% de plaquetas frescas, normais, não estimuladas expressam níveis detectáveis de GMP140 por citometria de fluxo. Ver, na generalidade, M. J. Metzelaar, Studies on the Expression of Activation - Markers on Human Platelets (Thesis 1991).

Para a medição de GMP140, coloca-se uma pequena alíquota de plasma rico em plaquetas num tampão HEPES contendo um anticorpo que se liga a GMP140 ou IgG de rato controlo. O CD62 é um anticorpo monoclonal comercialinente disponível que se liga a GMP140 (disponível no Sanbio, Uden, Holanda; Clatag Labs, So. São Francisco, CA e Becton Dickinson, Mountian View, CA). Depois de quinze minutos de incubação, adiciona-se ao tubo IgG Anti-Rato caprino conjugado com FITC em quantidades de saturação. Por fim, as células são diluídas em solução salina isotónica, fixadas com paraformaldeído e analisadas num FAC-SCAN (Becton Dickinson, Mountian View, CA). O controlo positivo é feito pela adição de Phorbol Myristate Acetate (PMA) ao sistema de teste numa concentração final de 10'7 M.

Neste exemplo, usou-se o CD62 para medir o impacto, se existir, da irradiação por si só na activação das plaquetas. Os anticorpos foram guardados em pequenas alíquotas (0,01 mg/ml) a -40°C antes da sua utilização. Usou-se um controlo IgG de rato (0,05 mg/ml) (Becton Dickinson, Mountian View, CA #9040) 5x concentrado. No momento da utilização, diluiu-se 1:5 em tampão HEPES. O segundo anticorpo foi IgG Anti-Rato caprino conjugado com FITC (TAGO, Burlingame, CA #3506). Foi guardado em pequenas aliquotas a -20°C. O Phorbol Myristate Acetate (PMA) (Sigma, St Louis, MO) foi armazenado a -40°C. No momento da utilização foi dissolvido DMSO (a concentração de trabalho foi 1,62x10'5 M).

Preparou-se paraformaldeído a 16% (PFA) (Sigma, St Louis, MO) adicionando 16 gramas de paraformaldeído a 100 ml de água desionizada. Aqueceu-se esta mistura a 70°C, e então adicionou-se NaOH a 3 M, gota a gota até que a solução se tomou clara. A solução foi arrefecida e o pH foi ajustado a 7,4 com HC1 1 N. Foi filtrada e guardada. Usou-se um tampão isotónico comercialmente disponível: Hematall Isotonic Diluent (Fisher # CS 606-20).

Para medir a activação das plaquetas dos concentrados plaquetários, obteve-se uma unidade de sangue da Blood Bank of Alameda-Contra Costa Medicai Association. Retiraram-se aliquotas de 5 ml do saco e receberam quantidades específicas de radiação UVA, excepto no que diz respeito ao controlo, que não recebeu tratamento algum para além de ser colocado numa câmara de irradiação. A temperatura foi mantida a 25°C durante a irradiação colocando os concentrados plaquetários em câmaras de vidro ‘tapado’ com revestimento de água ligado a um banho de água circulante. O aparelho de irradiação (Derma Control, Dolton, III.; Modelo n° 1224-Special) foi descrito no Exemplo 3. Depois da irradiação, as plaquetas foram armazenadas durante 5 dias. Em determinados momentos específicos, tiraram-se aliquotas para serem processadas. O processamento envolveu a adição de uma alíquota (por exemplo, 5 microlitros) de concentrado plaquetário a cada tubo de centrífuga contendo o anticorpo e os reagentes necessários e depois foi tudo misturado suavemente com um vortex. As amostras foram incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente.

Adicionou-se (5 microlitros) de IgG Anti-Rato caprino - FITC (diluído 1:10 com tampão HEPES) a cada tubo e a solução foi agitada suavemente com um vortex. As amostras foram incubadas durante mais 15 minutos à temperatura ambiente.

Adicionou-se Isoton II (1 ml) a cada tubo e misturou-se suavemente com uma pipeta descartável de polipropileno. Adicionou-se PFA a 8% em HEPES (150 microlitros) a cada amostra diluída até um final de 1%. As plaquetas foram analisadas no FACSCAN. Os resultados estão resumidos na Tabela 2. TABELA 2

Dia 3 Dia 5 Condições Não activado PMA activado Não activado PMA activado Controlo 17 85 25 89 UV 5’ 17 87 24 86 UV 10’ 51 84 77 79 A activação é expressa na forma de percentagem. Como é claro, a inactivação durante dez minutos (UV 10’) teve como resultado um impacto significativamente negativo nas plaquetas armazenadas; as plaquetas foram claramente activadas. Por contraste, a irradiação durante cinco minutos (UV 5’) teve como resultado uma activação não significativa em comparação com o controlo que não recebeu irradiação. EXEMPLO 7

Dados os resultados do Exemplo 6, torna-se claro que é necessário um tempo de irradiação mais curto ou o uso de filtros para evitar danos nas células provocados pela irradiação UV. Neste exemplo, usa-se CD62 para medir o impacto da radiação na activação das plaquetas na presença de psoraleno. Tempos de irradiação mais curtos ou filtros de comprimentos de onda são usados em separado. Tempos de irradiação mais curtos. Obteve-se novamente uma unidade de sangue da Blood Bank of Alameda-Contra Costa Medicai Association. Retiraram-se alíquotas de 5 ml do saco para receder cinco minutos (5’) de radiação UVA na presença de 10 pg/ml de 8-MOP, excepto no controlo que não recebeu tratamento algum para além de ser colocado numa câmara de irradiação. A temperatura foi mantida a 25°C durante a irradiação colocando os concentrados plaquetários em câmaras de vidro ‘tapado’ com revestimento de água ligado a um banho de água circulante. O aparelho de irradiação (Derma Control, Dolton, III.; Modelo n° 1224-Special) foi descrito no Exemplo 3.

Depois da irradiação, as plaquetas foram novamente armazenadas durante 5 dias, como no Exemplo 6. Em determinados momentos específicos, tiraram-se alíquotas para serem testadas com o anticorpo CD62 e analisadas no FACSCAN para mostrar que, nestas condições, as plaquetas podem ser inactivadas sem sofrerem danos e armazenadas durante cinco dias antes da transfusão.

Filtros de comprimentos de onda. Usou-se uma solução aquosa de Co(NC>3)2 em combinação com N1SO4 de modo a remover substancialmente 0 componente 365 nm do espectro de emissão da fonte de luz usada. A solução Co-Ni pode ser convenientemente usada em vez de água como refrigerante durante a irradiação.

Depois de dez minutos de irradiação com 0 filtro, as plaquetas foram armazenadas e testadas com 0 anticorpo CD62 no FACSCAN para mostrar que, nestas condições, as plaquetas podem ser inactivadas sem sofrerem danos e armazenadas durante cinco dias antes da transfusão.

Lisboa, 2 h JUL. 200P

Dr. Américo da Silva Carvalho

Agente Qficit! R. Castilho, 20

Telefs. 2136513S3-2í2854ôl'3

Claims (13)

1 1

REIVINDICA ÇÕES 1. Um método de inactivação de microrganismos em preparações de plaquetas antes de um longo período de armazenamento e da sua administração que compreende a) fornecimento, em qualquer ordem de, i) uma furocumarina; ii) meios para fotoactivar a referida furocumarina que consiste numa fonte fluorescente de radiação ultravioleta que emite uma intensidade do espectro de radiação electromagnética inferior a 20 mW/cm2; iii) uma preparação sanguínea que se pretende para utilização in vivo que se suspeita de estar contaminada com microrganismos sendo que esta preparação está contida num saco; b) adição da referida furocumarina à preparação de plaquetas no referido saco; c) fotoactivação da referida furocumarina durante menos de dez minutos de modo que a referida furocumarina se ligue de forma covalente ao ácido nucleico de uma porção dos referidos microrganismos.

2. O método da reivindicação 1, em que a referida preparação de plaquetas consiste num concentrado plaquetário.

3. O método da reivindicação 1, em que a referida preparação de plaquetas consiste em plasma rico em plaquetas.

4. O método de qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a referida furocumarina é adicionada numa concentração final entre 3 e 30 qg/ml.

5. O método de qualquer das reivindicações 1 a 4, em que os referidos meios de activação compreendem um aparelho de fotoactivação capaz de emitir uma determinada intensidade do espectro de radiação electromagnética com comprimentos de onda entre os 180 nm e os 400 nm.

6. O método da reivindicação 5, em que os referidos meios de activação compreendem filtros que providenciam cortes do comprimento de onda a 320 nm, abaixo dos quais não se transmite radiação, e a 360 nm, acima dos quais não se transmite radiação.

7. O método de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que a referida preparação de plaquetas é exposta à referida intensidade durante aproximadamente cinco minutos.

8. O método de qualquer das reivindicações 1 a 7, em que a furocumarina é'um psoraleno.

9. O método da reivindicação 8, em que o psoraleno é o 8-metoxipsoraleno.

10. O método de qualquer das reivindicações 1 a 9, em que depois da activação do passo c) a referida preparação de plaquetas é armazenada à temperatura ambiente antes da sua administração.

11. O método de qualquer das reivindicações 1 a 10, o passo c) de fotoactivação é realizado sem a limitação da concentração de oxigénio molecular na preparação de plaquetas.

12. Uma Composição com propriedades antimicrobianas que consiste numa solução aquosa de 8-metoxipsoraleno com uma concentração entre, aproximadamente 3 pg/ml e 30 pg/ml e plaquetas apropriadas para utilização in vivo.

13. A composição da reivindicação 12, em que a referida concentração é aproximadamente 3 pg/ml. Lisboa, 2 h JUL 2Pftft

Telefs. 213851339-213854613