JP3502095B2 - ８−メトキシプソラレンによる血液成分の汚染除去 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一般に、in vivo使用を目的とした物質に
含まれる汚染物の失活に関し、特に長期保存および輸血
前の血液製剤に含まれる微生物の失活に関するものであ
る。

背景 輸血を必要とするレシピエントのためにボランティア
のドナーから集めた全血は、通常その成分ごとに、すな
わち赤血球、血小板、および血漿に分別される。これら
の画分はそれぞれ別個に保存されて、多くの特殊な症状
および病気の治療に用いられる。例えば、赤血球成分は
貧血の治療に、濃厚血小板成分は出血の制御に、そして
血漿成分は血友病を治療するための血液凝固VIII因子の
供給源として頻繁に用いられている。

理想的には、すべての血液細胞製剤は採血したばかり
の血液から調製して、直ちにレシピエントに輸血される
べきである。しかしながら、大部分のケースでは血液供
給センターを運営する後方業務のためにこの可能性が阻
まれている。輸血は昼夜を問わず必要とされるが、異常
な時間帯に血液を提供してくれるドナーを手配すること
は、不可能でないにしても困難である。その結果、現在
の血液供給センターは保存血液製剤を使用しなければな
らない。

米国では、血液保存処置が政府による規制を受けてい
る。特に、これらのシステムで集められた血液成分の最
大保存期間を規定している。例えば、“開放”（つま
り、滅菌してない）システムで集められた全血成分は、
政府規約のもとで、24時間以内に、大抵の場合は６〜８
時間以内に輸血しなければならない。対照的に、“密
閉”（つまり、滅菌してある）システムで全血成分を集
めた場合は、赤血球は（用いる抗凝血剤および保存媒体
の種類に応じて）最高42日間保存することができ、血漿
はさらに長期間凍結保存してもよいことになっている。

マーフィー（Murphy）とガードナー（Gardner）は、N
ew Eng.J.Med.280:1094（1969）において、血小板濃縮
血漿（PRP）として22℃で保存した血小板が４℃で保存
したものよりも良好なin vivo半減期を有することを実
証した。かくして、室温での保存後に、より許容される
血小板濃厚液を輸血することができた。最近まで、規約
によって血小板濃厚液は（保存容器の型に応じて）最高
７日間の室温での保存が許されていた。ところが、７日
経過した血小板濃厚液を用いると、バクテリアの増殖や
レシピエントのその後の輸血反応の発生率が許容できな
いレベルにまで増加することが認められた。こうして、
現在では、血小板濃厚液は５日間しか保存することがで
きない。

血小板濃厚液製剤に用いられる血液バッグは、連結し
ている付随バッグと同様に、それ自体が滅菌されてい
る。従って、血小板を濃縮するのに必要な操作の間中血
液製剤を無菌状態に保つことは比較的簡単なことである
と考えるかもしれない。しかしながら、バクテリアは少
なくとも２つの異なる方法によって侵入しうる。まず第
一に、ドナーが軽い菌血症にかかっている場合、その血
液は採血方法や保存方法の如何にかかわらず汚染されて
しまう。適格なドナーの経歴調査と身体検査によりこの
問題を軽減できるだろうが、排除することはできない。
グロスマン（B.J.Grossman）ら,Transfusion 31:500（1
991）を参照されたい。第二に、より広まっている汚染
源は静脈穿刺である。たとえ皮膚の“殺菌”を行って
も、汗腺や毛嚢のまわりの陰窩を殺菌することは極めて
難しい。静脈穿刺の間に、この汚染された皮膚がしばし
ば鋭い針で小さい“コア”として切り取られる。このコ
アが血液バッグにバクテリアを“植えつける”ように働
き、バクテリアを増殖させてレシピエントに危険を及ぼ
すことがある。

実際、血小板の輸血を必要としている多くの患者は、
化学療法や基礎的な血液病のために、バクテリアの正常
な浄化および破壊のための宿主防御機構を欠いている。
保存血小板中に含まれる、見たところでは無害なように
思える微生物の増殖でさえ、レシピエント反応および死
をもたらすことがある。例えば、ミーレ（B.A.Myhre JA
MA 244:1333（1980）およびヒール（J.M.Heal）ら,Tran
sfusion 27:2（1987）を参照されたい。

血小板の汚染度を検査する報告は、それらの方法、サ
ンプル量、およびバクテリアの検出系が異なっていた。
ブッコルツ（D.H.Buchholz）ら,Transfusion 13:268（1
973）は、多数（＞1000バッグ）のサンプルを試験し、
かつバクテリアの培養のために十分な手段を講じた場合
に、2.4％の総血小板汚染レベルを報告した。一部のユ
ニットがちょうど24時間の保存後にひどく汚染されてい
たが、全体としての出現率は濃厚液の保存期間により変
化し、個々のユニットのプールが広範囲に実施されるに
つれて増加した（30％以上のプールが３日で汚染され
た）。ブッコルツ（D.H.Buchholz）ら,New Eng.J.Med.2
85:429（1971）も参照されたい。他の臨床医はより少な
い数を提起しているが、最近の研究は敗血症性血小板輸
血が実際よりかなり低く報告されていることを示してい
る。例えば、モロウ（J.F.Morrow）ら,JAMA 266:555（1
991）を参照されたい。

前培養血小板はバクテリアの汚染問題の解決策とはな
らない。培養アッセイで増殖を検査するには48時間かか
る。アッセイ結果を待つために血小板ユニットをさらに
２日間保持することは、皮肉にも、安全性の限界をさら
に狭めることになろう。モロウ（J.F.Morrow）ら,JAMA
266:555（1991）中の表２を参照されたい。汚染のひど
いユニットは開始時に検出されるが、汚染の軽いユニッ
トは２日間増殖させる必要がある。最後には、より古
い、汚染の可能性のより大きいユニットが輸血されるは
めになる。

血液細胞を（例えば、食塩水で）洗浄すること、ある
いはバクテリアを濾過することも実際的な解決策ではな
い。これらの技法は時間がかかり、しかも輸血に利用で
きる生存血液細胞の数を減らしてしまうので非効率的で
ある。最も重要な点として、それらは一般に貯蔵システ
ムへの“参加”を必要とする。一度密閉システムに参加
しても、そのシステムは“開放”と見なされ、そして最
初の場所での血液の採集および加工方法にかかわりな
く、すぐに輸血を行わねばならない。

最後に、抗生物質も理にかなった解決策ではない。汚
染は広範囲の微生物から生じる。抗生物質はこの範囲を
カバーする必要があろう。多くのレシピエントは抗生物
質にアレルギーを示す。さらに、失活されない薬剤耐性
バクテリア株の数が次第に増加している。

要約すると、密閉システムでの使用にかなう方法で、
貯蔵および輸血保存に先立って血液成分からバクテリア
を失活する手段を開発する必要がある。このアプローチ
は、血液製剤または輸血のレシピエントに害を及ぼすこ
となく、さまざまな生物を取り扱えるものでなければな
らない。

発明の概要 本発明は、in vivo使用を目的とした物質、特にヒト
用の血液および血液製剤に含まれる汚染物を処理する方
法に関する。本発明によれば、微生物による汚染を処理
するために核酸結合性化合物が選択的に用いられる。一
つの態様において、本発明は長期保存および輸血前の血
液製剤に含まれる微生物の失活方法に関し、該方法は:
a）任意の順序で、ｉ）８−メトキシプソラレン、ii）
８−メトキシプソラレンを活性化する手段、iii）微生
物で汚染されている疑いのあるin vivo使用を意図した
血液製剤、を用意し;b）血液製剤に８−メトキシプソラ
レンを約30μg/mlまたはそれ以下の最終濃度で加え；そ
してｃ）８−メトキシプソラレンを活性化して、核酸結
合性化合物を微生物の一部の核酸に共有結合で結合させ
る；ことからなっている。

本発明の方法は、微生物が単細胞および多細胞の生
物、例えばバクテリア、真菌、マイコプラズマおよび原
生動物である場合に特に有用である。本発明は血小板お
よび血漿に関して成功裏に用いられる。

好ましい態様において、活性化手段は、180〜400nmの
波長を有する所定の強度の電磁放射線スペクトルを発す
ることができる光活性化装置を含む。強度は20mW/cm²よ
り小さいことが好ましく、この強度に血液製剤を10分未
満の間さらす。一つの態様では、血液製剤をこの強度に
約５分間だけさらす。

他の態様において、本発明はin vivo使用を意図した
物質の処理方法に関し、該方法は:a）任意の順序で、
ｉ）１種またはそれ以上の光反応性の核酸結合性化合
物、ii）該核酸結合性化合物を光活性化する手段、およ
びiii）微生物で汚染されている疑いのあるin vivo使用
を意図した物質、を用意し;b）光反応性の核酸結合性化
合物を該物質に加え；そしてｃ）光反応性の核酸結合性
化合物を、330〜350nmの波長で最大強度を有する電磁放
射線スペクトルにより光活性化して、該核酸結合性化合
物を微生物の一部の核酸に共有結合で結合させる；こと
からなっている。好まくは、光活性化手段が320nm（こ
れ以下の放射線を透過しない）および360nm（これ以上
の放射線を透過しない）の波長カットオフを有するフィ
ルターを含む。その強度は20mW/cm²より小さいことが好
ましい。

本発明のこの態様も、血小板や血漿のような血液製剤
に成功裏に用いられる、血液製剤が不活化される場合
は、この強度への露光を10分未満にすることが好まし
い。

本発明は特定の核酸結合性化合物に限定されるもので
はない。一つの態様において、本発明はフロクマリン類
よりなる群から選ばれる光反応性の核酸結合性化合物を
意図している。好ましい態様では、フロクマリンは８−
メトキシプソラレンのようなプソラレンである。

本発明はまた、抗微生物特性を有する組成物を意図し
ている。一つの態様において、該組成物はヒトでのin v
ivo使用を目的とした物質および30μg/mlより低い濃度
の８−メトキシプソラレンの水溶液からなる。好ましく
は、該濃度はおよそ３μg/mlである。

さらに、本発明は、核酸結合性化合物を他の試薬（特
殊な保存媒体を含む）、治療用の製剤、および薬剤と組
み合わせて使用することを意図している。

図面の説明 図１は、本発明装置の一態様の透視図である。

図２は、図１に示した装置の線２−−２に沿った断面
図である。

図３は、図１に示した装置の線３−−３に沿った断面
図である。

図４は、図１に示した装置の線４−−４に沿った断面
図である。

図５は、特に血液製剤に適用される本発明の汚染除去
アプローチを図式的に示す。

図６は、核酸への８−メトキシプソラレンの光付加を
示すグラフである。

図７は、HPLCで測定したときの4'−アミノメチル−4,
5',8−トリメチルプソラレン（AMT）の分解に対する８
−メトキシプソラレン（８−MOP）の分解を示すグラフ
である。

発明の開示 本発明は、in vivo使用を目的とした物質（特に血液
および血液製剤）に含まれる汚染物の処理方法に関す
る。一つの態様において、本発明の方法は微生物による
汚染について血小板濃厚液を処理することを含む。

前述のように、全血は採血後に一般には赤血球と血小
板と血漿とに分別される。これらの画分はそれぞれin v
ivo使用に先立って特殊な条件下で別個に保存される。
多くの場合、汚染度は増殖のため保存期間に関係してく
る。採血時に微生物を失活する方法は貯蔵中の増殖を防
止することが期待されるだろう。

一つの態様において、本発明は分別後であるが貯蔵前
に血液製剤を不活化することを意図している。この態様
では、微生物による汚染を処理するために核酸結合性化
合物が選択的に用いられる。

一つの態様において、核酸結合性化合物はフロクマリ
ン類よりなる群から選ばれる。好ましい態様では、フロ
クマリンが光活性化装置により活性化されるプソラレン
である。

プソラレンはフラン環とクマリンとの線縮合により形
成される三環式化合物である。プソラレンは二本鎖核酸
の塩基対の間に入って、長波長紫外線（UVA）の吸収に
よりピリミジン塩基との共有結合付加物を形成すること
ができる。シミノ（G.D.Cimino）ら,Ann.Rev.Biochem.5
4:1151（1985）およびハースト（Hearst）ら,Quart.Re
v.Biophys.17:1（1984）を参照されたい。プソラレン−
ピリミジン一付加物に隣接して反対鎖に第２のピリミジ
ンが存在すると、第２の光子の吸収により鎖間架橋とし
て機能する二付加物が形成される。イサックス（S.T.Is
aacs）ら,Biochemistry 16:1058（1977）；イサックス
（S.T.Isaacs）ら,Trends in Photobiology（Plenum）p
p.279−294（1982）；テスマン（J.Tessman）ら,Bioche
m.24:1669（1985）；ハースト（Hearst）ら，米国特許
第4,124,589号，同第4,169,204号および同第4,196,281
号を参照されたい（参考としてここに組み入れる）。

プソラレンはいくつかの血液製剤に含まれるウイルス
を失活することが知られている。アルター（H.J.Alte
r）ら,The Lancet（ii:1446）（1988）；リン（L.Lin）
ら,Blood 74:517（1989）；ヴィーゼハーン（G.P.Wiese
hahn）ら，米国特許第4,727,027号および同第4,748,120
号を参照されたい（参考としてここに組み入れる）。こ
れらの文献は８−メトキシプソラレン（８−MOP）と照
射との併用を記載している。それらは、300μg/mlの８
−MOPが１時間またはそれ以上の紫外線照射との併用に
よりウイルスを効果的に失活し得ることを示している。
しかしながら、これらの処理条件はエネルギー転移のた
め血液製剤に害を及ぼす。これらのアプローチは、酸素
分子の濃度を制限することによって細胞への損傷が特に
抑制されているときだけ実行可能であるが、かかるプロ
セスは厄介で費用がかかる。

本発明の失活法は単細胞および多細胞の生物、特にバ
クテリア、真菌、マイコプラズマおよび原生動物を失活
する方法を提供する。従来法と対照的に、本発明の方法
は血液製剤に害を及ぼさない。細胞への有意な損傷が見
られず、それ故酸素分子の濃度を制限する必要がない。

本発明は、これまでの濃度よりはるかに低い濃度の核
酸結合性化合物を使用することを意図している。例え
ば、本発明では30μg/mlまたはそれ以下の濃度で８−MO
Pを使用する。実際に、バクテリア汚染の除去に適した
８−MOPの濃度は３μg/mlまたはそれ以下、つまりヴィ
ーゼハーン（G.P.Wiesehahn）ら（前掲）が使用してい
た濃度より100倍低い濃度である。

さらに、本発明は以前に記載された照射線量よりはる
かに低い線量を使用することを意図している。これは、
より低い強度の放射線源、波長カットオフフィルター
（下記参照）および／または比較的短い照射時間により
達成される。好ましい態様において、照射時間は可変的
であるが、１秒から99分までの間で１秒の増分で調整さ
れる。

一つの態様において、本発明の装置は、可変振動数お
よび振幅の水平で一方向の正弦曲線運動を与える攪拌機
上に設置される。他の態様では、ランプ、バラストおよ
び他の源より発生する熱からバッグを遮断する。

本発明を失活の理論によって制限するつもりはない
が、より低い化合物濃度および照射の使用は、本発明を
（ウイルスに対して）単細胞や多細胞生物の汚染除去に
適用する場合、より低レベルの核酸結合により失活が達
成されるだろう、という認識から出発している。さら
に、失活は完全である必要はないという認識がある。言
い換えると、生きている生物が保存期間内に病気を起こ
すレベルにまで増殖する能力を備えてさえいなければ、
部分失活で十分であろう。

どのような場合にも、失活法が完全な失活を成し遂げ
ても遂げなくてもよいことを理解するために、特定の例
を挙げて説明することが役に立つだろう。バクテリアの
培養では、新たな培養プレートに移して増殖させたと
き、培養物のアリコートがある一定の期間後に検出不能
であれば、滅菌されたと言える。この期間および成育条
件（例えば温度）が“増殖ファクター”を規定する。こ
の増殖ファクターは検査法（例えば、バクテリアコロニ
ーの外観についての培養プレートの目視検査）とともに
失活法の感度を規定する。シグナルを検出可能にするた
めに最小数の生存バクテリアをプレートにまく必要があ
る。最適な検査法の場合、この最小数は１個のバクテリ
ア細胞である。次に適する検査法では、シグナルを観察
できるようにまかれるバクテリア細胞の最小数が１より
多くてもよい。検査法が“閾値”を決定し、閾値以下で
は該方法は完全に有効であると考えられるが、実際に、
閾値以上では該方法は部分的に有効であるにすぎない。

アッセイの増殖ファクターと検査法を規定する閾値と
の相互関係を例示することができる。例えば、バクテリ
ア細胞をプレートにまき、検査法として目視検査を任意
に選択する。成育条件および期間は10⁴の全面増殖が起
こるようなものであると仮定する。検出可能なシグナル
は増殖後に実際に存在するバクテリア細胞の数に比例す
るだろう。計算のために、検出閾値を10⁶細胞とする。1
0⁶より少ない細胞が増殖後に存在する場合は、細胞のコ
ロニーを目視で検出することができず、失活法は有効で
あるように見えるだろう。10⁴の増殖ファクターおよび1
0⁶の検出閾値であると仮定すると、感度限界は100のバ
クテリア細胞となろう。100個より少ない生存バクテリ
ア細胞が滅菌法を行った後のバクテリア培養物のもとの
アリコート中に存在するならば、その培養物はなお滅菌
されているように見えるだろう。

このような状況がバクテリアの増殖アッセイでは一般
的である。アッセイの感度は、生きているバクテリア細
胞が存在するのに、それらをアッセイで検出できないよ
うな感度である。こうした事情により、少なくとも部分
的に、血液製剤のバクテリア汚染の程度を測定しようと
した研究者が示した結果のバラツキを説明できる。ブッ
コルツ（D.H.Buchholz）ら,Transfusion 13:268（197
3）を参照されたい。そこには、このようなバラツキが
論じられている。

多くの国では、細胞性生物による血液製剤の汚染がウ
イルスによる汚染よりも広まっており、それ故重大な問
題となっていることに注意すべきである。例えば、南ア
メリカにおいて最も重要な血液由来の生物としてT.cruz
iがあり、これはシャーガス病（Chagas disease）の病
因である。南アメリカでは約1600〜1800万人の人達（チ
リの人口の11％を含む）が感染している。本発明の汚染
除去法はこの原生動物の失活にうまく適合すると考えら
れる。

本発明は、光活性化、特に光反応性核酸結合性化合物
の活性化のための装置および方法を意図している。本発
明は１つのユニットに統合される電磁放射線の安価な供
給源を有する装置を含む。一般的には、本発明は、ａ）
少なくとも１種の光反応性化合物を活性化させるための
適当な波長の電磁放射線を供給する手段;b）活性化の間
中、放射線供給手段との固定関係で複数の血液製剤を支
持する手段；およびｃ）活性化の間中、血液製剤の温度
を所望の温度範囲内に維持する手段；を含む光反応性化
合物を処理するための光活性化装置を含む。また、本発
明は、ａ）電磁放射線の蛍光源との固定関係で、１種ま
たはそれ以上の光反応性化合物を含む複数の血液製剤容
器を支持し;b）複数の血液製剤に同時に該電磁放射線を
照射して少なくとも１種の光反応性化合物を活性化さ
せ；そしてｃ）活性化の間中、血液製剤の温度を所望の
温度範囲内に維持する；ことからなる方法を含む。

本発明装置の一態様の主な特徴は、Ａ）サンプル容器
を支持する手段と固定された関係にある安価な紫外線
源、Ｂ）迅速な光活性化、Ｃ）多数のサンプルの処理、
Ｄ）照射サンプルの温度制御、およびＥ）固有の安全性
などである。

A.電磁放射線源 本発明の好ましい光活性化装置は、サンプル容器を支
持する手段と固定された関係にある安価な紫外線源を有
する。紫外線は電磁放射線スペクトル（宇宙線から電波
までの範囲）の一部を占めるエネルギー形態である。紫
外線は多くの天然および人工の供給源から得られ、その
供給源に応じて、他のタイプ（非紫外）の電磁放射線
（例えば、可視光線）が混じっていてもよい。

本明細書では、特定のタイプの紫外線を波長によって
記載し、波長をナノメートル（“nm";10^-9メートル）で
表す。本発明の目的のためには、紫外線は約180〜400nm
の範囲である。放射線源が、フィルターや他の手段によ
って、特定の波長（例えば、320nm）以下の放射線を発
生しない場合、それはその波長で下端“カットオフ（cu
toff）”（例えば、300nmでの波長カットオフ）を有す
ると言われる。同様に、放射線源が特定の波長（例え
ば、360nm）以下の放射線のみを発生する場合、それは
その波長で上端“カットオフ”（例えば、360nmでの波
長カットオフ）を有すると言われる。

どのような光化学反応においても、有害な副反応を排
除するか最小限にくい止めることが望ましい。一部の副
反応は光化学活性化法の間に存在しうる内因性の発色団
の励起によって起こり得る。核酸とプソラレンだけが存
在する系では、内因性の発色団は核酸塩基それ自体であ
る。320nmより大きい波長に活性化法を限定すると、313
nm以上では核酸による吸収がきわめてわずかしかないの
で、核酸の直接的損傷が最小限に抑えられる。

血液製剤においては、一般に核酸が他の生物学的発色
団とともに存在する。生物学的液体がタンパク質のみで
ある場合は、副反応を抑えるために320nmのカットオフ
で十分であろう（芳香族アミノ酸は320nm以上を吸収し
ない）。生物学的液体が細胞および／または細胞性成分
を含む場合は、ヘムやフラビンなどの他の発色団が多く
存在するだろう。

ヘムは赤血球の溶解により生じ、血液製剤中に豊富に
存在する。フラビンは、ヘムと同様、代謝呼吸に必要と
される。これらの内因性発色団は両方とも光照射によっ
て励起されると細胞に害を与えるだろう。

ヘムは３本の主要な吸収バンドを有し、２本は可視ス
ペクトルの赤色領域にあり、もう１本は約400nmに集ま
っている。フラビンは２本の主要な吸収ピークを有し、
１本は450nmにあり、もう１本は370nmにある。

これらの内因性発色団が血液製剤中に存在することを
考慮して、本発明の装置は狭い範囲の望ましい特定波長
での照射を可能にするように設計されるものであり、か
くしてエネルギー転移によって起こる細胞損傷を避ける
ことができる。好ましい波長範囲は320〜350nmである。

市販の照射源を選ぶことによってある種の選択性が達
成される。例えば、典型的な蛍光管は300nmから400nm以
上の範囲の波長を発する（幅広のピークが360nm付近に
集中する）が、BLB型の蛍光灯は400nm以上の波長を除く
ように設計されている。しかし、これは上端カットオフ
をもたらすにすぎない。

好ましい態様において、本発明の装置は追加のフィル
ター手段を含むものである。一つの態様では、このフィ
ルター手段が１枚のコバルトガラスのようなガラス製の
カットオフフィルターからなる。他の態様では、このフ
ィルター手段がCo（No₃）_２の水溶液のような特定領域
の電磁スペクトルしか透過しない液体フィルター溶液か
らなる。この塩溶液は320〜400nmの透過窓をもたらす。
好ましい態様では、Co（No₃）_２の水溶液をNiSO₄ととも
に使用して、用いる蛍光またはアーク源の発光スペクト
ルの365nm成分を除くようにする。Co−Ni溶液は、高エ
ネルギー源の直接光に何十時間も露光した後でさえ、そ
の初期透過性をきわめて良好に保持する。

本発明は用いる特定のフィルターによって制限される
ものではない。数種類の無機塩類およびガラスがこれら
の必要条件を満たしている。例えば、紫外線だけを取り
出そうとする場合、硫酸銅は赤外線を除くのに最も有効
な一般用フィルターである。強烈なエネルギー源におけ
るその安定性は非常に優れている。他の塩類も当業者に
は知られている。開口部や反射ランプも特定の波長およ
び強度を得るために使用し得る。

本明細書において紫外線を放射照度によって記載する
場合、それは強度フラックス（平方センチメートル当た
りのミリワット、すなわち“mW/cm²"）で表される。
“出力”は紫外線の放射（あり又はなし；オン又はオ
フ）と放射照度のレベルの両方を含むと定義される。好
ましい態様では、強度を４箇所（照射面のそれぞれの側
について２箇所ずつ）でモニターする。

好ましい紫外線源は蛍光源である。蛍光は発光の特殊
なケースである。発光は物質による電磁放射線の吸収お
よび異なる波長の放射線へのエネルギーの変換を伴う。
蛍光の場合は、電磁放射線によって励起された物質が多
量の電磁放射線を発生することによってその基底状態に
戻る。これまで、蛍光源は光活性化に用いるには強度が
低すぎると考えられてきたが、一つの態様において、本
発明は今までは高価な装置でのみ達成できた結果を得る
ために蛍光源を採用している。

本明細書中で用いるとき、固定された関係とは、サン
プル照射中にサンプルと光源との間に一定の距離および
幾何学的配列（ジオメトリー）を含むことと定義され
る。距離は支持されるときのサンプルと光源の間の距離
に関係する。点光源からの光の強度は点光源からの距離
の二乗と逆の関係にあることが知られている。従って、
光源からの距離のわずかな変化が強度に劇的な影響を及
ぼすことがある。強度の変化は光活性化の結果に影響す
るので、本発明の装置では距離の変化がないようにして
ある。これにより再現性と反復性が達成される。

幾何学的配列は光源の位置決定に関係がある。例え
ば、光源はサンプルホルダーのまわりにいろいろな方法
で（例えば両側面に、底部に、または環状に）配置し得
ることが想像できよう。本発明の好ましい態様で用いら
れる幾何学的配列は、迅速な光活性化のために適当な強
度の均一な露光を可能にするものである。本発明の好ま
しい装置の幾何学的配列は１つの点光源と対照的に線状
ランプの複数の光源を含む。さらに、いくつかの反射面
といくつかの吸収面を備えている。この複雑な幾何学的
配列ゆえに、照射されるサンプルの位置に対するランプ
の位置または数の変化（かかる変化は強度の変化をもた
らすだろう）が回避されるようになっている。

B.迅速な光活性化 本発明の好ましい態様の光源は迅速な光活性化を可能
にする。照射装置の強度特性は、多数のサンプルセット
を処理する必要があるかもしれないと予測して、便利な
ように選択されている。この予測によると、15分または
それ以下の露光時間が実際的な目標となる。

本発明の装置を設計する際には、照射時間が15分とな
るように該装置の部材の相対的位置を最適化した。こう
して、320〜350nmの波長について測定するとき、約1mW/
cm²より大きい強度フラックスがサンプル容器にそそが
れる。好ましい態様では、該装置はバッグの両面を照射
する。

C.多数のサンプルの処理 上記のように、本発明の光活性化装置の他の重要な特
徴は多数のサンプルを処理できる点にある。これに関し
て、本発明装置の１つの部材は複数の血液製剤、特に血
液バッグを支持する手段からなる。本発明の好ましい態
様において、支持手段は、一度に、６つの50mlバッグ
（Dupont Stericellバッグに相当）を収容することがで
きる２列の光源の間のガラスプレート、コネクター、そ
れにチューブからなる。普通に用いられる市販の血液バ
ッグを受け入れることによって、本発明の装置は多数の
サンプルを簡便に処理することができる。

D.温度制御 上記のように、本発明の光活性化装置の重要な特徴の
１つは温度を制御できる点にある。温度制御は、露光時
のサンプルの温度が結果に大きく影響するので重要であ
る。例えば、核酸の二次構造を促進する条件は多くのプ
ソラレン誘導体の核酸への親和定数をも高める。ハイド
（Hyde）およびハースト（Hearst）,Biochemistry,17,1
251（1978）を参照されたい。これらの条件には溶媒の
組成と温度の両方が関係している。一本鎖の5Sリボソー
ムRNAの場合は、低温での照射がHMTの5SrRNAへの共有結
合付加を促進し、４℃では20℃のときとの２倍である。
トンプソン（Thompson）ら,J.Mol.Biol.147:417（198
1）を参照されたい。合成ポリヌクレオチドに関して
も、温度により誘導されるプソラレン結合の増強が報告
されている。トンプソン（Thompson）ら,Biochemistry,
21:1363（1982）を参照されたい。

バクテリアについては照射の間に架橋の修復が起こる
ことに注意すべきである。しかし、照射の際に比較的低
い温度を用いると、バクテリアの修復過程が抑制され
る。かくして、観察される失活のレベルには15℃での照
射がかなりの効果を及ぼす。

E.固有の安全性 紫外線はひどい火傷を起こすことがあり、露光の状態
によっては発癌性もある。本発明の好ましい態様の光源
は使用者から遮蔽されている。これは手で支持する市販
の紫外線源や大型で高強度の紫外線源と対照的である。
好ましい態様では、放射エネルギーの透過を遮断する材
料でできているハウジング（すなわち、不透明なハウジ
ング）の中に照射源を収容し、使用者には放射線が透過
しないようにする。これにより使用者への安全性が確保
される。

実験 下記の実施例は本発明の或る好ましい実施態様および
側面を説明するのに役立ち、本発明の範囲を限定するも
のと解釈されるべきではない。

下記の実験の開示において、次の略号が適用される。
eq（当量）;M（モル）；μＭ（マイクロモル）;N（規
定）；モル（モル数）;mモル（ミリモル数）；μモル
（マイクロモル数）;nモル（ナノモル数）;g（グラ
ム）;mg（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）;L
（リットル）;ml（ミリリットル）；μｌ（マイクロリ
ットル）;cm（センチメートル）;mm（ミリメートル）；
μｍ（マイクロメートル）;nm（ナノメートル）；℃
（摂氏温度）;HPLC（高速液体クロマトグラフィー） 実施例１ 上記のように、本発明は光反応性の核酸結合性化合物
の活性化のための装置および方法を意図している。この
実施例では、本発明の方法により血液製剤を汚染除去す
るための光活性化装置が記載される。この装置は、ａ）
適当な波長の電磁放射線を与えて少なくとも一種の光反
応性化合物の活性化を生じさせるための装置;b）活性化
中に放射線供給装置と固定した関係で多数の血液製剤を
支持するための装置；およびｃ）血液製剤の温度を活性
化中に所望の温度範囲内に保つための装置を含む。

図１は、上記の特徴を統合した装置の一実施態様の透
視図である。この図は、プレート集成装置103、104の間
に配置された複数の代表的な血液製剤を含む手段102の
上下にバルブ101のアレイを含む不透明のハウジング100
（その一部が除去されている）を示す。プレート集成装
置103、104は続いて更に充分に説明される。

バルブ101（これらは電源（図示されていない）に接
続可能である）は、電磁放射線の源として利用できる。
特別なバルブの型に限定されないが、その実施態様は工
業規格の二重ビピン（dualbipin）ランプを受け入れる
ような形状にされている。

ハウジング101は、血液製剤を適切に入れることがで
きるようにラッチ105により開放し得る。図１に示され
るように、ハウジング100は、閉じられた場合に、バル
ブ101からの放射線を完全に含む。照射中に、使用者
は、安全ビューポート106（これは使用者への紫外線の
透過を許さない）を通してながめることによりその装置
が作動していることを確かめることができる。

また、ハウジング100は、例えば、電源スイッチ、カ
ウントダウンタイマー、および時間メーターを含む制御
板107の幾つかの電子部品の取付装置として利用でき
る。便宜上、電源スイッチはカウントダウンタイマーに
配線でき、これは順に時間メーターおよび電磁放射線の
源に並列に配線される。カウントダウンタイマーは、使
用者が照射時間を所望の露光のレベルにすることを可能
にする。時間メーターは、電磁放射線の源により与えら
れる照射時間の合計数の記録を維持する。この特徴は、
バルブの出力が迅速な光活性化に必要な最小レベルより
下に減少する前に、バルブ101を監視して、それを変化
させる。

図２は２−−２の線に沿った図１に示された装置の断
面図である。図２は、ハウジング100が開放された場合
のバルブ101の配置を示す。リフレクタ108A、108Bがバ
ルブ101のそれぞれのアレイを完全に包囲する。血液製
剤を含む手段102が上部プレート集成装置103と下部プレ
ート集成装置104の間に置かれる。それぞれのプレート
集成装置は上部プレート103A、104Aおよび下部プレート
103B、104Bを含む。プレート集成装置103、104は、血液
製剤を含む手段102により生じた空間を収容するように
設計されるヒンジ109を介して連結される。上部プレー
ト集成装置103は、下部プレート集成装置104の下部プレ
ート104Bにより支持された血液製剤を含む手段102の上
に静かに載るようにされる。

検出器110A、110B、110C、110Dは、プレート集成装置
103、104のプレート103A、103B、104A、104Bの間に都合
良く置くことができる。それらは印刷回路板111に配線
でき、これは順に制御板107に配線される。

図３は３−−３の線に沿った図１に示された装置の断
面図である。６個の血液製剤を含む手段102（例えば、
テフロン血小板ユニットバッグ）が、バルブ101のアレ
イの上に固定関係で置かれる。血液製剤の温度が、ファ
ン112単独により、または、更に好ましくは、冷却源
（図示されていない）に連結された冷却入口114および
冷却出口115を有する熱交換器113を使用することにより
調節し得る。

図４は４−−４の線に沿った図１に示された装置の断
面図である。図４は、その装置の好ましい実施態様の温
度調節方法を更に明らかに示す。上部プレート集成プレ
ート103A、103Bおよび下部プレート集成プレート104A、
104Bのそれぞれが、温度調節室103C、104Cをそれぞれ形
成する。ファン112が室103C、104Cの中およびその間に
空気を循環し得る。熱交換器113が使用される場合、循
環空気が冷却され、プレート103A、103B、104A、104Bの
間に通される。

実施例２ 図５は、血小板が本発明の方法により処理される実施
態様を示す。分別後に、血小板が、核酸結合性化合物を
含むバッグ（陰をつけたバッグとして図１に示される）
に移される。次に、このバッグ（これは本発明に適した
透過性およびその他の特性を有する）が照射装置（例え
ば、上記の実施例１に記載された装置）中に入れられ、
そして照射される。遊離化合物が回収されてもよく、ま
たは所望により捕捉装置により“捕捉されてもよい”。
このような場合、バッグは細胞中に含まれる化合物のみ
を含むであろう。すなわち、そのバッグは遊離の化合物
を含まないであろう（このバッグは陰をつけていないも
のとして図１に示される）。

実施例３ この実施例では、本発明の汚染除去方法がエルジニア
・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、野
生型、血清型３、生物型４を失活するのに適用される。
この生物は血液製剤中に見られる。一般には、R.Y.Dod
d,Transfusion Medicine in the 1990's（American Ass
oc.Blood Banks 1990）（S.J.Nance,編集）を参照のこ
と。また、B.J.Grossmanら,Transfusion 31:500（199
1）を参照のこと。

その生物の一夜培養物を、運動性穿刺（motility sta
b）からのブレインハートインフュージョン（BHI）ブロ
ス10mlに接種することにより行った。これを35℃に保
ち、その0.1mlを使用して実験用のBHIブロス20mlに接種
した。35℃で一夜インキュベートした後、静置培養物を
1900gで15分間にわたってペレット化し、上澄みを捨
て、そしてバクテリアペレットを熱不活化した普通の血
清プール1ml中に懸濁させた。これをアラメダ−コント
ラ・コスタ・メディカル・アソシエーション（Alameda
−Contra Costa Medical Association）の血液バンクか
ら得られたヒト血小板の期限が切れたばかりのユニット
に注入した。バクテリアを含む血小板濃厚液のアリコー
ト5mlをバッグから取り出し、対照（これはプソラレン
を使用せずに照射されたか、または処理を受けていなか
った）以外は、特定量の８−MOPおよびUVA照射を受け取
った（表１を参照のこと）。血小板濃厚液を循環水浴に
取り付けた栓付きガラス製水ジャケット室に入れること
により温度を照射中に25℃に保った。照射装置（デルマ
・コントロール（Derma Control）、ドルトン（Dolto
n）、Ill.;型番号1224−スペシャル）は二つのアレイ
（2.5インチで隔置された６個のランプ／アレイ）を使
用し、一つのアレイは試料の上にあり、そしてもう一つ
のアレイは試料の下にあった（こうして、試料はランプ
から約３インチのところにある）。各アレイは約６イン
チだけ他のものから分離されており、その背後に研磨さ
れた金属リフレクタを有し、そしてUVA透過性アクリル
プラスチックシートで覆われている。処理すべき試料
（例えば、血小板バッグ）は下部シートの上に置かれ
る。

デルマ・コントロールF587T12−BL−HO型バルブを使
用した。これらは長さ24インチの“ブラックライト”チ
ューブ（内部蛍光被覆物により特定の波長を放出するよ
うに工作されている）である。最大波長は、簡単な水銀
ランプまたは普通の“BLB"蛍光バルブと異なり、360nm
未満である。全強度は20mW/cm²未満である。

BHIブロス中の連続10倍希釈液0.1mlを、BHI寒天を含
む100mmのペトリ皿にプレートすることによりバクテリ
アを定量化した。35℃で24時間のインキュベーション後
に、コロニーをカウントし、バクテリア濃度を1ml当た
りの基準で計算した。結果（表１）は３μg/ml程度に少
量の８−MOPが6logのバクテリアを殆ど失活することが
できることを示す。10μg/mlでは、10分が充分すぎる照
射を与える。実際に、10μg/mlでは、５分間の照射が適
当である。

実施例４ アルタック（Artuc）とその共同研究者らがヒトおよ
びウシの血清タンパク質中の８−MOPの溶解性を試験
し、100〜1000ng/mlの範囲の８−MOP濃度、即ち、乾癬
のプソラレン紫外線Ａ（PUVA）治療を受けている患者で
観察された濃度と同様の濃度では、８−MOPの75％〜80
％がアルブミンに結合されることを示した。M.Artucら,
Brit.J.Derm.101:669（1979）。

この実施例では、本発明の汚染除去方法のもとにプソ
ラレン−核酸相互作用の有効性を実証するために、血漿
およびタンパク質不含媒質を使用して、ウシ胸腺DNAへ
の８−MOPの結合が比較される。この測定はバクテリア
核酸ではなく真核生物核酸を使用したが、それはバクテ
リアに関する付加物生成の程度の有益な指標となる。

³H−８−MOPを4.7 x 10⁶CPM/マイクログラムの比活性
でエタノール中115μg/mlの濃度に調製した（以下、
“８−MOP原液”）。その後、DNAを含む試料（“＋DN
A"）につき８−MOP原液130.5μｌまたは22μｌ（それぞ
れ２つ）、またDNAを含まない試料（“−DNA"）につき5
2.2μｌまたは8.7μｌを乾燥させた。＋DNA試料に、DNA
原液（7.7mg/ml）40μｌを添加しただけでなく、血漿
（１日経過の凍結したもの）460μｌまたはトリス−EDT
A（“TE"）緩衝液450μｌを添加した。後者には5MのNaC
l 10μｌも添加した。−DNA試料（即ち、対照）につ
き、血漿184μｌおよび水16μｌを添加した。

試料を約１時間にわたって軽くボルテックス混合し、
カウントをチェックして８−MOPが溶解したことを確か
めた。

それぞれの試料（100μｌ）を25℃で０分、２分、４
分、８分、および16分にわたってHRI−100（HRIリサー
チ社、コンコード、CA）で照射した。試料を照射後４℃
に一夜保った。その後、試料を抽出した。最初に、フェ
ノール溶液を0.1MのトリスpH8で平衡にすることによりp
H8に調整した。次にそれぞれの試料をフェノール100μ
ｌで抽出した。それぞれの試料を５分間遠心分離して水
相を新しいチューブに移した。２回目の抽出を100μｌ
のフェノール：クロロホルム（1:1）で行った。最後の
抽出を100μｌのクロロホルムで行った。

最後の水相を、0.2MのNaClの最終濃度を得るように調
節されたNaCl 50μｌを添加し、次にエタノール250μｌ
を添加することにより沈殿させた。再度、試料を遠心分
離した（10分間）。上澄みを除去し、ペレットを乾燥さ
せた。ペレットをTE100μｌに再度懸濁させ、そして沈
殿させた。これを合計３回の沈殿につき繰り返した。最
後のペレットを水600μｌに入れ、100μｌをカウントし
た。それぞれの試料を、吸光度（260nm）を測定するこ
とによりDNAにつき分析した。８−MOPレベルを1000の塩
基対当たりの付加物としてプロットした（“８−MOP:kB
P"）。結果（図６）は、血漿がDNAへの８−MOPの付加速
度論を殆ど変化させないことを示す。

８−MOP−DNA付加物生成の頻度はバクテリアゲノムの
高度の修飾を予告する。更に、この型の生化学的測定
は、光化学失活方法の効率を監視する手段を与える可能
性を有する。

実施例５ プソラレンおよびイソプソラレンの光活性化は種々の
光生成物を生じ得る。“光生成物”は、電磁放射線の活
性化波長に暴露された場合の光反応性化合物の可能な反
応を考えることにより最も良く理解される。正確な機構
に限定されないが、基底状態（“C"）の光反応性化合物
と電磁放射線の活性化波長の反応は短命励起種
（“Ｃ^＊”）を生じると考えられる。

Ｃ→Ｃ^＊ 次に起こることは、主として、潜在的な反応体が励起種
に利用される作用である。それは短命であるので、この
種と核酸（“NA"）の反応は、励起種が生成される時に
核酸が存在する場合にのみ可能であると考えられる。こ
うして、その反応は、操作に関して、電磁放射線の活性
化波長の存在下にある必要があり、即ち、それは“光結
合性”である。それは暗結合性ではない。その反応は以
下のように表し得る。

Ｃ^＊＋NA→NA:C この反応の生成物は、以下、“光付加生成物”と称さ
れ、“光生成物”とは区別されるべきである。

記載されるこの反応により、その化合物が電磁放射線
の活性化波長に暴露される時に核酸が結合に利用されな
い状況を今考えることができる。励起種は短命であり、
反応する核酸を有しないので、励起種は単にその基底状
態に戻ることがある。

Ｃ^＊→Ｃ 一方、励起種はそれ自体（即ち、基底状態または励起
種）と反応して基底状態複合体（“C:C"）を生じ得る。
２種の化合物が反応するこれらの自己反応の生成物は
“光二量体”または単に“二量体”と称される。しかし
ながら、自己反応は２種の化合物に限定されない。種々
の多量体（三量体、等）が生成し得る。

励起種はそれ自体と反応することに限定されない。そ
れはその環境、例えば、溶媒の要素（“E"）（例えば、
イオン、ガス、等）と反応してその他の生成物を生成し
得る。

Ｃ^＊＋Ｅ→E:C この種の反応（例えば、一重項酸素種を生じる酸素との
反応）は細胞の損傷を生じると考えられる。更に、それ
は単に基底状態誘導体（“［”）に内部転位（“異性
化”）し得る。

Ｃ^＊→［ 最後に、励起種は、ここに記載された以外のその他の反
応を受け得る。

本発明および“光生成物”の理解は、これらの反応の
一つ（たとえあったとして）が実際に起こることに依存
しない。“光生成物”は、その性質がどのようなもので
あろうとも、化合物と電磁放射線の活性化波長の反応後
に、反応環境のその他の成分と相互作用し得る生成物が
結果的に得られる場合に存在すると考えられる。

4'−ヒドロキシメチル−4,5',8−トリメチルプソラレ
ン（HMT）の如きプソラレンでは、HMTが電磁放射線の活
性化波長に暴露される場合に生成された幾つかの生成物
が得られる。HMTの得られる主生成物は２種のシクロブ
チル光二量体である。二量体の一つにおいて、二つのピ
ロン環がシス−シン配置で結合され、一方、その他の二
量体では、結合が再度シス−シン配置で一つの分子のフ
ラン末端と他のピロン末端の間に生じる。HMTの第三の
得られる生成物は単量体HMT光異性体である。この異性
体において、中央の環酸素は通常の1,3配向に代えて1,4
配向をとる。２種の光二量体は幾何学的形状を考慮して
介在活性を有するとは予測されないであろうが、光異性
体は平面のままであり、従って、それは二本鎖核酸とポ
ジティブな介在的会合を有し、こうして、突然変異誘発
物質であり得ることが意図されている。

この実施例において、８−MOPの光化学的分解がAMTと
比較される。試料を、ライネン・ダイナマックス（Rain
en Dynamax）300Aカラムを使用して逆相HPLCにより分析
した。勾配溶離を0.1Mの酢酸アンモニウム／アセトニト
リル（42分間で０〜70％のアセトニトリル）を用いて行
った。AMTは、これらの条件下で約24分で単一ピークと
して溶離する。検出は260nmまたは330nmにおける吸収に
よるものであった。後者の波長を、血漿を含む試料につ
き使用した。

それぞれの化合物の標準溶液を種々の濃度で調製し
た。次にこれらの溶液を水で1:10に希釈し、次に300μ
ｌを分析のために注入した。全ての試料を300nmで監視
した。ピークを、ピーク高さまたはピーク面積を測定す
ることにより分析し、次に標準プロットを使用してgh/m
lに換算した。ピーク面積は、そのトレースを複写し、
ピークのコピーを切断し、次に得られるトレースを計量
することにより測定した。二つの方法は実質的に同じ結
果を与えた。

結果を図７に示す。明らかに、AMTは８−MOPよりも迅
速に分解する。それ故、それは更に多くの光生成物（こ
れらは最終的に輸血レシピエント中に入るだろう）を生
成すると予測されるであろう。対照的に、８−MOPは有
意な量の光生成物を生成するとは予測されない。これ
は、権威者が活性化されていない８−MOPが非突然変異
誘発性であると結論したことを考える場合に重要であ
る。

実施例６ 血小板が活性化されたようになる時、GMP140と称され
るα顆粒膜糖タンパク質が血小板表面に露出されるよう
になる。新しい正常な刺激されていない血小板の５％未
満がフローサイトメトリーにより検出可能なGMP140レベ
ルを発現する。一般的にはM.J.Metzela−ar,Studies on
the Expression of Activation−Markers on Hu−man
Platelets（Thesis 1991）を参照のこと。

GMP140を測定するために、血小板に富む血漿の少量ア
リコートがGMP140結合性抗体または対照マウスIgGを含
むHEPES緩衝液に入れられる。CD62は、GMP140に結合す
る市販のモノクローナル抗体（オランダ、ウデンにある
サンビオ（Sanbio）；カリフォルニア州、サンフランシ
スコにあるカルタグ・ラブズ（Caltag Labs）およびカ
リフォルニア州、マウンチアン・ビューにあるベクトン
・ディキンソン（Becton Dickinson）から入手できる）
である。15分のインキュベーション後に、FITCに結合さ
れたヤギ抗マウスIgGを飽和量でチューブに添加する。
最後に、細胞を等張食塩水中で希釈し、パラホルムアル
デヒドで定着し、FACSCAN（カリフォルニア州、マウン
チアン・ビューにあるベクトン・ディキンソン）で分析
する。陽性対照を、フォルボールミリステートアセテー
ト（PMA）を試験系に10^-7Mの最終濃度で添加することに
よりつくる。

この実施例において、CD62を使用して血小板活性化に
関する照射単独の影響（存在する場合）を測定した。抗
体を使用前に−40℃で少量のアリコート（0.01mg/ml）
として貯蔵した。５倍に濃縮したマウスIgG対照（0.05m
g/ml）（カリフォルニア州、マウンチアン・ビュー＃90
40にあるベクトン・ディキンソン）を使用した。使用時
に、これをHEPES緩衝液中で1:5に希釈した。第二抗体は
FITCに結合されたヤギ抗マウスIgG（カリフォルニア
州、バーリンゲーム＃3506にあるタゴ（TAGO））であっ
た。これを−20℃で少量のアリコートとして貯蔵した。
フォルボールミリステートアセテート（PMA）（ミズー
リー州、セントルイスにあるシグマ（Sigma））を−40
℃で貯蔵した。使用時に、これをDMSOに溶解した（処理
濃度は1.62 x10^-5Mであった）。

16％のパラホルムアルデヒド（PFA）（ミズーリー
州、セントルイスにあるシグマ）を、パラホルムアルデ
ヒド16gを脱イオン水100mlに添加することにより調製し
た。これを70℃に加熱し、その後その溶液が透明になる
まで3MのNaOHを滴下して添加した。その溶液を冷却し、
pHを1NのHClで7.4に調節した。これを濾過し、貯蔵し
た。市販の等張緩衝液：ヘマトール・アイソトニック・
ディリューエント（Hematall Isotonic Diluent）（フ
ィッシャー（Fisher）＃CS 606−20）を使用した。

血小板濃厚液の血小板活性化を測定するために、ヒト
血小板のユニットをアラメダ−コントラ・コスタ・メデ
ィカル・アソシエーションの血液バンクから得た。アリ
コート5mlをバッグから取り出し、対照（これは照射室
中に入れること以外の処理を受けなかった）を除いて、
特定量のUVA照射を受けた。血小板濃厚液を循環水浴に
取り付けられた栓付きガラス製水ジャケット室に入れる
ことにより温度を照射中25℃に保った。照射装置（デル
マ・コントロール、ドルトン、Ill.;型番号1224−スペ
シャル）は、上記の実施例３に記載されたとおりであっ
た。照射後、血小板を５日間貯蔵した。特定の時点で、
アリコートを取り出し、処理した。

処理は血小板濃厚液のアリコート（例えば、５マイク
ロリットル）を抗体および適当な試薬を含むそれぞれの
微小遠心分離管に添加することを伴い、そしてこれを非
常に穏やかにボルテックス混合した。試料を室温で15分
間インキュベートした。

ヤギ抗マウスIgG−FITC（HEPES緩衝液中1:10に希釈）
をそれぞれの管に添加し（５μｌ）、その溶液を穏やか
なボルテックスにより混合した。試料を室温で更に15分
間インキュベートした。

イソトン（Isoton）II（1ml）をそれぞれの管に添加
し、ポリプロピレン製の使い捨てピペットで穏やかに混
合した。HEPES（150マイクロリットル）中８％のPFAを
それぞれの希釈試料に最終１％となるように添加した。
血小板をFACSCANで分析した。結果を表２に示す。

活性化は％として表される。明らかに、10分間の照射
（UV10'）は貯蔵血小板にかなりの負の影響を与えた。
血小板が高度に活性化された。対照的に、５分間の照射
（UV5'）は、照射を受けなかった対照以上に有意な活性
化を生じなかった。

実施例７ 実施例６の結果が与えられたとすると、短い照射時間
またはフィルターの使用がUV照射による細胞の損傷を避
けるために必要とされることが明らかである。この実施
例において、CD62を使用して血小板活性化に関するプソ
ラレンの存在下の照射の影響を測定する。短い照射時間
および波長フィルターを別々に使用する。

短い照射時間：ヒト血小板のユニットを再度アラメダ
−コントラ・コスタ・メディカル・アソシエーションの
血液バンクから得る。アリコート5mlをバッグから取り
出し、対照（これは照射室中に入れること以外の処理を
受けなかった）を除いて、10μg/mlの８−MOPの存在下
で５分間（5'）のUVA照射を受ける。血小板濃厚液を循
環水浴に取り付けられた栓付きガラス製水ジャケット室
に入れることにより温度を照射中25℃に保つ。照射装置
（デルマ・コントロール、ドルトン、Ill.;型番号1224
−スペシャル）は、上記の実施例３に記載されたとおり
である。

照射後、血小板を実施例６のように再度５日間貯蔵す
る。特定の時点で、アリコートを取り出し、CD62抗体で
検定し、そしてFACSCANで分析する。これらの条件下で
は、細胞に損傷を与えないで血小板を不活化でき、かつ
輸血の前に５日間貯蔵できることがわかった。

波長フィルター:Co（NO₃）_２）の水溶液をNiSO₄と組
み合わせて使用して、使用した光源の発光スペクトルの
365nm成分を実質的に除去する。そのCo−Ni溶液は、照
射中に冷媒として水に代えて都合良く使用し得る。

フィルターを用いる10分間の照射後に、血小板を貯蔵
し、そしてFACSCANを使ってCD62抗体で分析する。これ
らの条件下では、細胞に損傷を与えないで血小板を不活
化でき、かつ輸血の前に５日間貯蔵できることがわかっ
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アイザックス，ステファン ティー. アメリカ合衆国 94563 カリフォルニ ア州 オリンダ，ロマ ヴィスタ ドラ イブ 79 (72)発明者 ハンソン，カール ヴァイス アメリカ合衆国 94703 カリフォルニ ア州 バークレイ，エディス ストリー ト 1427 (72)発明者 チミノ，ジョージ ディー. アメリカ合衆国 94803 カリフォルニ ア州 リッチモンド，フル ムーン ド ライブ 4839 (56)参考文献 特開 昭60−16930（ＪＰ，Ａ) Ｂｌｏｏｄ，1989，Ｖｏｌ．74，Ｎ ｏ．１，517−525 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A01N 1/02 A61J 3/00 300 A61K 35/14

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】長期保存および投与に先立って血小板製剤
   に含まれる微生物を失活する方法であって、 ａ）任意の順序で、ｉ）フロクマリン、ii）20mW/cm²よ
   り低い強度の電磁放射線スペクトルを発する紫外線の蛍
   光源を含むフロクマリン光活性化手段、iii）バッグの
   中に収納されており、バクテリア、真菌、マイコプラズ
   マおよび原生動物からなる群より選択される微生物で汚
   染されている疑いのあるin vivo使用を目的とした血小
   板製剤、を用意し； ｂ）該バッグの中の血小板製剤にフロクマリンを加え；
   そして ｃ）フロクマリンを10分未満の間光活性化して、フロク
   マリンを微生物の一部の核酸に共有結合で結合させる； ことからなる上記方法。
2. 【請求項２】血小板製剤が血小板濃厚液からなる、請求
   項１記載の方法。
3. 【請求項３】血小板製剤が血小板に富む血漿からなる、
   請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】フロクマリンを３〜30μg/mlの最終濃度で
   加える、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 【請求項５】活性化手段が180〜400nmの波長を有する所
   定の強度の電磁放射線スペクトルを発することができる
   光活性化装置からなる、請求項１〜４のいずれか１項記
   載の方法。
6. 【請求項６】光活性化手段が320nm以下の放射線を透過
   しない320nmでの波長カットオフおよび360nm以上の放射
   線を透過しない360nmでの波長カットオフを有するフィ
   ルターを含む、請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】血小板製剤を前記強度に５分間さらす、請
   求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 【請求項８】フロクマリンがプソラレンである、請求項
   １〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 【請求項９】プソラレンが８−メトキシプソラレンであ
   る、請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】工程（ｃ）の活性化後、投与に先立って
    血小板製剤を室温で貯蔵する、請求項１〜９のいずれか
    １項記載の方法。
11. 【請求項１１】血小板製剤中の酸素分子の濃度を制限す
    ることなく光活性化工程ｃ）を実施する、請求項１〜10
    のいずれか１項記載の方法。