JPH08501058A - ８−メトキシプソラレンによる血液成分の汚染除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 in vivo使用を目的とした物質、特にヒトに用いるための血液および血液製剤に含まれる汚染物を処理するための方法および組成物。長期保存および輸血前の血液細胞製剤に含まれる汚染物の失活。

Description

【発明の詳細な説明】 ８−メトキシプソラレンによる血液成分の汚染除去発明の分野 本発明は、一般に、in vivo使用を目的とした物質に含まれる汚染物の失活に 関し、特に長期保存および輸血前の血液製剤に含まれる微生物の失活に関するも のである。背景 輸血を必要とするレシピエントのためにボランティアのドナーから集めた全血 は、通常その成分ごとに、すなわち赤血球、血小板、および血漿に分別される。 これらの画分はそれぞれ別個に保存されて、多くの特殊な症状および病気の治療 に用いられる。例えば、赤血球成分は貧血の治療に、濃厚血小板成分は出血の制 御に、そして血漿成分は血友病を治療するための血液凝固VIII因子の供給源とし て頻繁に用いられている。 理想的には、すべての血液細胞製剤は採血したばかりの血液から調製して、直 ちにレシピエントに輸血されるべきである。しかしながら、大部分のケースでは 血液供給センターを運営する後方業務のためにこの可能性が阻まれている。輸血 は昼夜を問わず必要とされるが、異常な時間帯に血液を提供してくれるドナーを 手配することは、不可能でないにしても困難である。その結果、現在の血液供給 センターは保存血液製剤を使用しなければならない。 米国では、血液保存処置が政府による規制を受けている。特に、 これらのシステムで集められた血液成分の最大保存期間を規定している。例えば 、“開放”（つまり、滅菌してない）システムで集められた全血成分は、政府規 約のもとで、２４時間以内に、大抵の場合は６〜８時間以内に輸血しなければな らない。対照的に、“密閉”（つまり、滅菌してある）システムで全血成分を集 めた場合は、赤血球は（用いる抗凝血剤および保存媒体の種類に応じて）最高４ ２日間保存することができ、血漿はさらに長期間凍結保存してもよいことになっ ている。 マーフィー(Murphy)とガードナー(Gardner)は、New Eng. J. Med. 280:1094 ( 1969)において、血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）として２２℃で保存した血小板が４ ℃で保存したものよりも良好なin vivo半減期を有することを実証した。かくし て、室温での保存後に、より許容される血小板濃厚液を輸血することができた。 最近まで、規約によって血小板濃厚液は（保存容器の型に応じて）最高７日間の 室温での保存が許されていた。ところが、７日経過した血小板濃厚液を用いると 、バクテリアの増殖やレシピエントのその後の輸血反応の発生率が許容できない レベルにまで増加することが認められた。こうして、現在では、血小板濃厚液は ５日間しか保存することができない。 血小板濃厚液製剤に用いられる血液バッグは、連結している付随バッグと同様 に、それ自体が滅菌されている。従って、血小板を濃縮するのに必要な操作の間 中血液製剤を無菌状態に保つことは比較的簡単なことであると考えるかもしれな い。しかしながら、バクテリアは少なくとも２つの異なる方法によって侵入しう る。まず第一に、ドナーが軽い菌血症にかかっている場合、その血液 は採血方法や保存方法の如何にかかわらず汚染されてしまう。適格なドナーの経 歴調査と身体検査によりこの問題を軽減できるだろうが、排除することはできな い。グロスマン(B.J. Grossman)ら，Transfusion 31:500 (1991)を参照されたい 。第二に、より広まっている汚染源は静脈穿刺である。たとえ皮膚の“殺菌”を 行っても、汗腺や毛嚢のまわりの陰窩を殺菌することは極めて難しい。静脈穿刺 の間に、この汚染された皮膚がしばしば鋭い針で小さい“コア”として切り取ら れる。このコアが血液バッグにバクテリアを“植えつける”ように働き、バクテ リアを増殖させてレシピエントに危険を及ぼすことがある。 実際、血小板の輸血を必要としている多くの患者は、化学療法や基礎的な血液 病のために、バクテリアの正常な浄化および破壊のための宿主防御機構を欠いて いる。保存血小板中に含まれる、見たところでは無害なように思える微生物の増 殖でさえ、レシピエント反応および死をもたらすことがある。例えば、ミーレ(B .A. Myhre JAMA 244:1333 (1980)およびヒール(J.M. Heal)ら，Transfusion 27: 2 (1987)を参照されたい。 血小板の汚染度を検査する報告は、それらの方法、サンプル量、およびバクテ リアの検出系が異なっていた。ブッコルツ(D.H. Buchholz)ら，Transfusion 13: 268 (1973)は、多数（＞１０００バッグ）のサンプルを試験し、かつバクテリア の培養のために十分な手段を講じた場合に、２．４％の総血小板汚染レベルを報 告した。一部のユニットがちょうど２４時間の保存後にひどく汚染されていたが 、全体としての出現率は濃厚液の保存期間により変化し、個々のユニットのプー ルが広範囲に実施されるにつれて 増加した（３０％以上のプールが３日で汚染された）。ブッコルツ(D.H. Buchho lz)ら，New Eng. J. Med. 285:429 (1971)も参照されたい。他の臨床医はより少 ない数を提起しているが、最近の研究は敗血症性血小板輸血が実際よりかなり低 く報告されていることを示している。例えば、モロウ(J.F. Morrow)ら，JAMA 26 6:555 (1991)を参照されたい。 前培養血小板はバクテリアの汚染問題の解決策とはならない。培養アッセイで 増殖を検査するには４８時間かかる。アッセイ結果を待つために血小板ユニット をさらに２日間保持することは、皮肉にも、安全性の限界をさらに狭めることに なろう。モロウ(J.F. Morrow)ら，JAMA 266:555 (1991)中の表２を参照されたい 。汚染のひどいユニットは開始時に検出されるが、汚染の軽いユニットは２日間 増殖させる必要がある。最後には、より古い、汚染の可能性のより大きいユニッ トが輸血されるはめになる。 血液細胞を（例えば、食塩水で）洗浄すること、あるいはバクテリアを濾過す ることも実際的な解決策ではない。これらの技法は時間がかかり、しかも輸血に 利用できる生存血液細胞の数を減らしてしまうので非効率的である。最も重要な 点として、それらは一般に貯蔵システムへの“参加”を必要とする。一度密閉シ ステムに参加しても、そのシステムは“開放”と見なされ、そして最初の場所で の血液の採集および加工方法にかかわりなく、すぐに輸血を行わねばならない。 最後に、抗生物質も理にかなった解決策ではない。汚染は広範囲の微生物から 生じる。抗生物質はこの範囲をカバーする必要があろう。多くのレシピエントは 抗生物質にアレルギーを示す。さ らに、失活されない薬剤耐性バクテリア株の数が次第に増加している。 要約すると、密閉システムでの使用にかなう方法で、貯蔵および輸血保存に先 立って血液成分からバクテリアを失活する手段を開発する必要がある。このアプ ローチは、血液製剤または輸血のレシピエントに害を及ぼすことなく、さまざま な生物を取り扱えるものでなければならない。発明の概要 本発明は、in vivo使用を目的とした物質、特にヒト用の血液および血液製剤 に含まれる汚染物を処理する方法に関する。本発明によれば、微生物による汚染 を処理するために核酸結合性化合物が選択的に用いられる。一つの態様において 、本発明は長期保存および輸血前の血液製剤に含まれる微生物の失活方法に関し 、該方法は：ａ）任意の順序で、ｉ）８−メトキシプソラレン、ii）８−メトキ シプソラレンを活性化する手段、iii）微生物で汚染されている疑いのあるin vi vo使用を意図した血液製剤、を用意し；ｂ）血液製剤に８−メトキシプソラレン を約３０μｇ／ｍｌまたはそれ以下の最終濃度で加え；そしてｃ）８−メトキシ プソラレンを活性化して、核酸結合性化合物を微生物の一部の核酸に共有結合で 結合させる；ことからなっている。 本発明の方法は、微生物が単細胞および多細胞の生物、例えばバクテリア、真 菌、マイコプラズマおよび原生動物である場合に特に有用である。本発明は血小 板および血漿に関して成功裏に用いられる。 好ましい態様において、活性化手段は、１８０〜４００ｎｍの波長を有する所 定の強度の電磁放射線スペクトルを発することができる光活性化装置を含む。強 度は２０ｍＷ／ｃｍ²より小さいことが好ましく、この強度に血液製剤を１０分 未満の間さらす。一つの態様では、血液製剤をこの強度に約５分間だけさらす。 他の態様において、本発明はin vivo使用を意図した物質の処理方法に関し、 該方法は：ａ）任意の順序で、ｉ）１種またはそれ以上の光反応性の核酸結合性 化合物、ii）該核酸結合性化合物を光活性化する手段、およびiii）微生物で汚 染されている疑いのあるin vivo使用を意図した物質、を用意し；ｂ）光反応性 の核酸結合性化合物を該物質に加え；そしてｃ）光反応性の核酸結合性化合物を 、３３０〜３５０ｎｍの波長で最大強度を有する電磁放射線スペクトルにより光 活性化して、該核酸結合性化合物を微生物の一部の核酸に共有結合で結合させる ；ことからなっている。好ましくは、光活性化手段が３２０ｎｍ（これ以下の放 射線を透過しない）および３６０ｎｍ（これ以上の放射線を透過しない）の波長 カットオフを有するフィルターを含む。その強度は２０ｍＷ／ ｃｍ²より小さ いことが好ましい。 本発明のこの態様も、血小板や血漿のような血液製剤に成功裏に用いられる。 血液製剤が不活化される場合は、この強度への露光を１０分未満にすることが好 ましい。 本発明は特定の核酸結合性化合物に限定されるものではない。一つの態様にお いて、本発明はフロクマリン類よりなる群から選ばれる光反応性の核酸結合性化 合物を意図している。好ましい態様では、フロクマリンは８−メトキシプソラレ ンのようなプソラ レンである。 本発明はまた、抗微生物特性を有する組成物を意図している。一つの態様にお いて、該組成物はヒトでのin vivo使用を目的とした物質および３０μｇ／ｍｌ より低い濃度の８−メトキシプソラレンの水溶液からなる。好ましくは、該濃度 はおよそ３μｇ／ｍｌである。 さらに、本発明は、核酸結合性化合物を他の試薬（特殊な保存媒体を含む）、 治療用の製剤、および薬剤と組み合わせて使用することを意図している。図面の説明 図１は、本発明装置の一態様の透視図である。 図２は、図１に示した装置の線２--２に沿った断面図である。 図３は、図１に示した装置の線３--３に沿った断面図である。 図４は、図１に示した装置の線４--４に沿った断面図である。 図５は、特に血液製剤に適用される本発明の汚染除去アプローチを図式的に示 す。 図６は、核酸への８−メトキシプソラレンの光付加を示すグラフである。 図７は、ＨＰＬＣで測定したときの４’−アミノメチル−４，５’，８−トリ メチルプソラレン（ＡＭＴ）の分解に対する８−メトキシプソラレン（８−ＭＯ Ｐ）の分解を示すグラフである。発明の開示 本発明は、in vivo使用を目的とした物質（特に血液および血 液製剤）に含まれる汚染物の処理方法に関する。一つの態様において、本発明の 方法は微生物による汚染について血小板濃厚液を処理することを含む。 前述のように、全血は採血後に一般には赤血球と血小板と血漿とに分別される 。これらの画分はそれぞれin vivo使用に先立って特殊な条件下で別個に保存さ れる。多くの場合、汚染度は増殖のため保存期間に関係してくる。採血時に微生 物を失活する方法は貯蔵中の増殖を防止することが期待されるだろう。 一つの態様において、本発明は分別後であるが貯蔵前に血液製剤を不活化する ことを意図している。この態様では、微生物による汚染を処理するために核酸結 合性化合物が選択的に用いられる。 一つの態様において、核酸結合性化合物はフロクマリン類よりなる群から選ば れる。好ましい態様では、フロクマリンが光活性化装置により活性化されるプソ ラレンである。 プソラレンはフラン環とクマリンとの線縮合により形成される三環式化合物で ある。プソラレンは二本鎖核酸の塩基対の間に入って、長波長紫外線（ＵＶＡ） の吸収によりピリミジン塩基との共有結合付加物を形成することができる。シミ ノ(G.D.Cimino)ら，Ann. Rev. Biochem. 54:1151 (1985)およびハースト(Hearst )ら，Quart. Rev. Biophys. 17:1 (1984)を参照されたい。プソラレン−ピリミ ジン一付加物に隣接して反対鎖に第２のピリミジンが存在すると、第２の光子の 吸収により鎖間架橋として機能する二付加物が形成される。イサックス (S.T. I saacs)ら，Biochemistry 16:1058 (1977)；イサックス (S.T. Isaacs)ら，Trend s in Photobiology (Plenum) pp. 279-294 (1982)；テスマ ン(J. Tessman)ら，Biochem. 24:1669 (1985)；ハースト(Hearst)ら，米国特許 第4,124,589号，同第4,169,204号および同第4,196,281号を参照されたい（参考 としてここに組み入れる）。 プソラレンはいくつかの血液製剤に含まれるウイルスを失活することが知られ ている。アルター(H.J.Alter)ら，The Lancet(ii:1446)(1988) ；リン(L.Lin)ら ，Blood 74:517(1989)；ヴィーゼハーン(G.P. Wiesehahn)ら，米国特許第4,727, 027号および同第4,748,120号を参照されたい（参考としてここに組み入れる）。 これらの文献は８−メトキシプソラレン（８−ＭＯＰ）と照射との併用を記載し ている。それらは、３００μｇ／ｍｌの８−ＭＯＰが１時間またはそれ以上の紫 外線照射との併用によりウイルスを効果的に失活し得ることを示している。しか しながら、これらの処理条件はエネルギー転移のため血液製剤に害を及ぼす。こ れらのアプローチは、酸素分子の濃度を制限することによって細胞への損傷が特 に抑制されているときだけ実行可能であるが、かかるプロセスは厄介で費用がか かる。 本発明の失活法は単細胞および多細胞の生物、特にバクテリア、真菌、マイコ プラズマおよび原生動物を失活する方法を提供する。従来法と対照的に、本発明 の方法は血液製剤に害を及ぼさない。細胞への有意な損傷が見られず、それ故酸 素分子の濃度を制限する必要がない。 本発明は、これまでの濃度よりはるかに低い濃度の核酸結合性化合物を使用す ることを意図している。例えば、本発明では３０μｇ／ｍｌまたはそれ以下の濃 度で８−ＭＯＰを使用する。実際 に、バクテリア汚染の除去に適した８−ＭＯＰの濃度は３μｇ／ｍｌまたはそれ 以下、つまりヴィーゼハーン(G.P.Wiesehahn)ら（前掲）が使用していた濃度よ り１００倍低い濃度である。 さらに、本発明は以前に記載された照射線量よりはるかに低い線量を使用する ことを意図している。これは、より低い強度の放射線源、波長カットオフフィル ター（下記参照）および／または比較的短い照射時間により達成される。好まし い態様において、照射時間は可変的であるが、１秒から９９分までの間で１秒の 増分で調整される。 一つの態様において、本発明の装置は、可変振動数および振幅の水平で一方向 の正弦曲線運動を与える攪拌機上に設置される。他の態様では、ランプ、バラス トおよび他の源より発生する熱からバッグを遮断する。 本発明を失活の理論によって制限するつもりはないが、より低い化合物濃度お よび照射の使用は、本発明を（ウイルスに対して）単細胞や多細胞生物の汚染除 去に適用する場合、より低レべルの核酸結合により失活が達成されるだろう、と いう認識から出発している。さらに、失活は完全である必要はないという認識が ある。言い換えると、生きている生物が保存期間内に病気を起こすレベルにまで 増殖する能力を備えてさえいなければ、部分失活で十分であろう。 どのような場合にも、失活法が完全な失活を成し遂げても遂げなくてもよいこ とを理解するために、特定の例を挙げて説明することが役に立つだろう。バクテ リアの培養では、新たな培養プレートに移して増殖させたとき、培養物のアリコ ートがある一定の 期間後に検出不能であれば、滅菌されたと言える。この期間および成育条件（例 えば温度）が“増殖ファクター”を規定する。この増殖ファクターは検査法（例 えば、バクテリアコロニーの外観についての培養プレートの目視検査）とともに 失活法の感度を規定する。シグナルを検出可能にするために最小数の生存バクテ リアをプレートにまく必要がある。最適な検査法の場合、この最小数は１個のバ クテリア細胞である。次に適する検査法では、シグナルを観察できるようにまか れるバクテリア細胞の最小数が１より多くてもよい。検査法が“閾値”を決定し 、閾値以下では該方法は完全に有効であると考えられるが、実際に、閾値以上で は該方法は部分的に有効であるにすぎない。 アッセイの増殖ファクターと検査法を規定する閾値との相互関係を例示するこ とができる。例えば、バクテリア細胞をプレートにまき、検査法として目視検査 を任意に選択する。成育条件および期間は１０⁴の全面増殖が起こるようなもの であると仮定する。検出可能なシグナルは増殖後に実際に存在するバクテリア細 胞の数に比例するだろう。計算のために、検出閾値を１０⁶細胞とする。１０⁶よ り少ない細胞が増殖後に存在する場合は、細胞のコロニーを目視で検出すること ができず、失活法は有効であるように見えるだろう。１０⁴の増殖ファクターお よび１０⁶の検出閾値であると仮定すると、感度限界は１００のバクテリア細胞 となろう。１００個より少ない生存バクテリア細胞が滅菌法を行った後のバクテ リア培養物のもとのアリコート中に存在するならば、その培養物はなお滅菌され ているように見えるだろう。 このような状況がバクテリアの増殖アッセイでは一般的である。 アッセイの感度は、生きているバクテリア細胞が存在するのに、それらをアッセ イで検出できないような感度である。こうした事情により、少なくとも部分的に 、血液製剤のバクテリア汚染の程度を測定しようとした研究者が示した結果のバ ラツキを説明できる。ブッコルツ (D.H.Buchholz)ら，Transfusion 13:268(1973 )を参照されたい。そこには、このようなバラツキが論じられている。 多くの国では、細胞性生物による血液製剤の汚染がウイルスによる汚染よりも 広まっており、それ故重大な問題となっていることに注意すべきである。例えば 、南アメリカにおいて最も重要な血液由来の生物としてT. cruziがあり、これは シャーガス病(Chagas disease)の病因である。南アメリカでは約1600〜1800万人 の人達（チリの人口の１１％を含む）が感染している。本発明の汚染除去法はこ の原生動物の失活にうまく適合すると考えられる。 本発明は、光活性化、特に光反応性核酸結合性化合物の活性化のための装置お よび方法を意図している。本発明は１つのユニットに統合される電磁放射線の安 価な供給源を有する装置を含む。一般的には、本発明は、ａ）少なくとも１種の 光反応性化合物を活性化させるための適当な波長の電磁放射線を供給する手段； ｂ）活性化の間中、放射線供給手段との固定関係で複数の血液製剤を支持する手 段；およびｃ）活性化の間中、血液製剤の温度を所望の温度範囲内に維持する手 段；を含む光反応性化合物を処理するための光活性化装置を含む。また、本発明 は、ａ）電磁放射線の蛍光源との固定関係で、１種またはそれ以上の光反応性化 合 物を含む複数の血液製剤容器を支持し；ｂ）複数の血液製剤に同時に該電磁放射 線を照射して少なくとも１種の光反応性化合物を活性化させ；そしてｃ）活性化 の間中、血液製剤の温度を所望の温度範囲内に維持する；ことからなる方法を含 む。 本発明装置の一態様の主な特徴は、Ａ）サンプル容器を支持する手段と固定さ れた関係にある安価な紫外線源、Ｂ）迅速な光活性化、Ｃ）多数のサンプルの処 理、Ｄ）照射サンプルの温度制御、およびＥ）固有の安全性などである。 Ａ．電磁放射線源 本発明の好ましい光活性化装置は、サンプル容器を支持する手段と固定された 関係にある安価な紫外線源を有する。紫外線は電磁放射線スペクトル（宇宙線か ら電波までの範囲）の一部を占めるエネルギー形態である。紫外線は多くの天然 および人工の供給源から得られ、その供給源に応じて、他のタイプ（非紫外）の 電磁放射線（例えば、可視光線）が混じっていてもよい。 本明細書では、特定のタイプの紫外線を波長によって記載し、波長をナノメー トル（“ｎｍ”；１０^-9メートル）で表す。本発明の目的のためには、紫外線は 約１８０〜４００ｎｍの範囲である。放射線源が、フィルターや他の手段によっ て、特定の波長（例えば、３２０ｎｍ）以下の放射線を発生しない場合、それは その波長で下端“カットオフ（Cutoff）”（例えば、３００ｎｍでの波長カット オフ）を有すると言われる。同様に、放射線源が特定の波長（例えば、３６０ｎ ｍ）以下の放射線のみを発生する場合、それはその波長で上端“カットオフ”（ 例えば、３６０ｎｍでの波長カットオフ）を有すると言われる。 どのような光化学反応においても、有害な副反応を排除するか最小限にくい止 めることが望ましい。一部の副反応は光化学活性化法の間に存在しうる内因性の 発色団の励起によって起こり得る。核酸とプソラレンだけが存在する系では、内 因性の発色団は核酸塩基それ自体である。３２０ｎｍより大きい波長に活性化法 を限定すると、３１３ｎｍ以上では核酸による吸収がきわめてわずかしかないの で、核酸の直接的損傷が最小限に抑えられる。 血液製剤においては、一般に核酸が他の生物学的発色団とともに存在する。生 物学的液体がタンパク質のみである場合は、副反応を抑えるために３２０ｎｍの カットオフで十分であろう（芳香族アミノ酸は３２０ｎｍ以上を吸収しない）。 生物学的液体が細胞および／または細胞性成分を含む場合は、ヘムやフラビンな どの他の発色団が多く存在するだろう。 ヘムは赤血球の溶解により生じ、血液製剤中に豊富に存在する。フラビンは、 ヘムと同様、代謝呼吸に必要とされる。これらの内因性発色団は両方とも光照射 によって励起されると細胞に害を与えるだろう。 ヘムは３本の主要な吸収バンドを有し、２本は可視スペクトルの赤色領域にあ り、もう１本は約４００ｎｍに集まっている。フラビンは２本の主要な吸収ピー クを有し、１本は４５０ｎｍにあり、もう１本は３７０ｎｍにある。 これらの内因性発色団が血液製剤中に存在することを考慮して、本発明の装置 は狭い範囲の望ましい特定波長での照射を可能にするように設計されるものであ り、かくしてエネルギー転移によって起こる細胞損傷を避けることができる。好 ましい波長範囲は３ ２０〜３５０ｎｍである。 市販の照射源を選ぶことによってある種の選択性が達成される。例えば、典型 的な蛍光管は３００ｎｍから４００ｎｍ以上の範囲の波長を発する（幅広のピー クが３６０ｎｍ付近に集中する）が、ＢＬＢ型の蛍光灯は４００ｎｍ以上の波長 を除くように設計されている。しかし、これは上端カットオフをもたらすにすぎ ない。 好ましい態様において、本発明の装置は追加のフィルター手段を含むものであ る。一つの態様では、このフィルター手段が１枚のコバルトガラスのようなガラ ス製のカットオフフィルターからなる。他の態様では、このフィルター手段がCo (No₃)₂の水溶液のような特定領域の電磁スペクトルしか透過しない液体フィルタ ー溶液からなる。この塩溶液は３２０〜４００ｎｍの透過窓をもたらす。好まし い態様では、Co(No₃)₂の水溶液をNiS0₄とともに使用して、用いる蛍光またはア ーク源の発光スペクトルの３６５ｎｍ成分を除くようにする。Co-Ni溶液は、高 エネルギー源の直接光に何十時間も露光した後でさえ、その初期透過性をきわめ て良好に保持する。 本発明は用いる特定のフィルターによって制限されるものではない。数種類の 無機塩類およびガラスがこれらの必要条件を満たしている。例えば、紫外線だけ を取り出そうとする場合、硫酸銅は赤外線を除くのに最も有効な一般用フィルタ ーである。強烈なエネルギー源におけるその安定性は非常に優れている。他の塩 類も当業者には知られている。開口部や反射ランプも特定の波長および強度を得 るために使用し得る。 本明細書において紫外線を放射照度によって記載する場合、そ れは強度フラックス（平方センチメートル当たりのミリワット、すなわち“ｍＷ ／ｃｍ²”）で表される。“出力”は紫外線の放射（あり又はなし；オン又はオ フ）と放射照度のレベルの両方を含むと定義される。好ましい態様では、強度を ４箇所（照射面のそれぞれの側について２箇所ずつ）でモニターする。 好ましい紫外線源は蛍光源である。蛍光は発光の特殊なケースである。発光は 物質による電磁放射線の吸収および異なる波長の放射線へのエネルギーの変換を 伴う。蛍光の場合は、電磁放射線によって励起された物質が多量の電磁放射線を 発生することによってその基底状態に戻る。これまで、蛍光源は光活性化に用い るには強度が低すぎると考えられてきたが、一つの態様において、本発明は今ま では高価な装置でのみ達成できた結果を得るために蛍光源を採用している。 本明細書中で用いるとき、固定された関係とは、サンプル照射中にサンプルと 光源との間に一定の距離および幾何学的配列（ジオメトリー）を含むことと定義 される。距離は支持されるときのサンプルと光源の間の距離に関係する。点光源 からの光の強度は点光源からの距離の二乗と逆の関係にあることが知られている 。従って、光源からの距離のわずかな変化が強度に劇的な影響を及ぼすことがあ る。強度の変化は光活性化の結果に影響するので、本発明の装置では距離の変化 がないようにしてある。これにより再現性と反復性が達成される。 幾何学的配列は光源の位置決定に関係がある。例えば、光源はサンプルホルダ ーのまわりにいろいろな方法で（例えば両側面に、底部に、または環状に）配置 し得ることが想像できよう。本発明 の好ましい態様で用いられる幾何学的配列は、迅速な光活性化のために適当な強 度の均一な露光を可能にするものである。本発明の好ましい装置の幾何学的配列 は１つの点光源と対照的に線状ランプの複数の光源を含む。さらに、いくつかの 反射面といくつかの吸収面を備えている。この複雑な幾何学的配列ゆえに、照射 されるサンプルの位置に対するランプの位置または数の変化（かかる変化は強度 の変化をもたらすだろう）が回避されるようになっている。 Ｂ．迅速な光活性化 本発明の好ましい態様の光源は迅速な光活性化を可能にする。照射装置の強度 特性は、多数のサンプルセットを処理する必要があるかもしれないと予測して、 便利なように選択されている。この予測によると、１５分またはそれ以下の露光 時間が実際的な目標となる。 本発明の装置を設計する際には、照射時間が１５分となるように該装置の部材 の相対的位置を最適化した。こうして、３２０〜３５０ｎｍの波長について測定 するとき、約１ｍＷ／ｃｍ²より大きい強度フラックスがサンプル容器にそそが れる。好ましい態様では、該装置はバッグの両面を照射する。 Ｃ．多数のサンプルの処理 上記のように、本発明の光活性化装置の他の重要な特徴は多数のサンプルを処 理できる点にある。これに関して、本発明装置の１つの部材は複数の血液製剤、 特に血液バッグを支持する手段からなる。本発明の好ましい態様において、支持 手段は、一度に、６つの５０ｍｌバッグ（Dupont Stericellバッグに相当）を収 容 することができる２列の光源の間のガラスプレート、コネクター、それにチュー ブからなる。普通に用いられる市販の血液バッグを受け入れることによって、本 発明の装置は多数のサンプルを簡便に処理することができる。 Ｄ．温度制御 上記のように、本発明の光活性化装置の重要な特徴の１つは温度を制御できる 点にある。温度制御は、露光時のサンプルの温度が結果に大きく影響するので重 要である。例えば、核酸の二次構造を促進する条件は多くのプソラレン誘導体の 核酸への親和定数をも高める。ハイド (Hyde)およびハースト (Hearst)，Bioche mistry, 17, 1251 (1978)を参照されたい。これらの条件には溶媒の組成と温度 の両方が関係している。一本鎖の５ＳリボソームＲＮＡの場合は、低温での照射 がＨＭＴの５ＳｒＲＮＡへの共有結合付加を促進し、４℃では２０℃のときとの ２倍である。トンプソン (Thompson)ら，J. Mol. Biol. 147:417 (1981)を参照 されたい。合成ポリヌクレオチドに関しても、温度により誘導されるプソラレン 結合の増強が報告されている。トンプソン(Thompson)ら，Biochemistry, 21:136 3 (1982)を参照されたい。 バクテリアについては照射の間に架橋の修復が起こることに注意すべきである 。しかし、照射の際に比較的低い温度を用いると、バクテリアの修復過程が抑制 される。かくして、観察される失活のレベルには１５℃での照射がかなりの効果 を及ぼす。 Ｅ．固有の安全性 紫外線はひどい火傷を起こすことがあり、露光の状態によっては発癌性もある 。本発明の好ましい態様の光源は使用者から遮蔽 されている。これは手で支持する市販の紫外線源や大型で高強度の紫外線源と対 照的である。好ましい態様では、放射エネルギーの透過を遮断する材料でできて いるハウジング（すなわち、不透明なハウジング）の中に照射源を収容し、使用 者には放射線が透過しないようにする。これにより使用者への安全性が確保され る。実験 下記の実施例は本発明の或る好ましい実施態様および側面を説明するのに役立 ち、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。 下記の実験の開示において、次の略号が適用される。eq（当量）；Ｍ（モル） ；μM（マイクロモル）；Ｎ（規定）；モル（モル数）；mモル（ミリモル数）； μモル（マイクロモル数）；nモル（ナノモル数）；g（グラム）；mg（ミリグラ ム）；μg（マイクログラム）；L（リットル）；ml（ミリリットル）；μｌ（マ イクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイク ロメートル）；nm（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；HPLC（高速液体クロマト グラフィー）実施例１ 上記のように、本発明は光反応性の核酸結合性化合物の活性化のための装置お よび方法を意図している。この実施例では、本発明の方法により血液製剤を汚染 除去するための光活性化装置が記載される。この装置は、ａ）適当な波長の電磁 放射線を与えて少なくとも一種の光反応性化合物の活性化を生じさせるための装 置；ｂ）活性化中に放射線供給装置と固定した関係で多数の血液製剤を支持する ための装置；およびｃ）血液製剤の温度を活性化中に所望の温度範囲内に保つた めの装置を含む。 図１は、上記の特徴を統合した装置の一実施態様の透視図である。この図は、 プレート集成装置103、104の間に配置された複数の代表的な血液製剤を含む手段 102の上下にバルブ101のアレ イを含む不透明のハウジング100（その一部が除去されている）を示す。プレー ト集成装置103、104は続いて更に充分に説明される。 バルブ101（これらは電源（図示されていない）に接続可能である）は、電磁 放射線の源として利用できる。特別なバルブの型に限定されないが、その実施態 様は工業規格の二重ビピン(dualbipin)ランプを受け入れるような形状にされて いる。 ハウジング101は、血液製剤を適切に入れることができるようにラッチ105によ り開放し得る。図１に示されるように、ハウジング100は、閉じられた場合に、 バルブ101からの放射線を完全に含む。照射中に、使用者は、安全ビューポート1 06（これは使用者への紫外線の透過を許さない）を通してながめることによりそ の装置が作動していることを確かめることができる。 また、ハウジング100は、例えば、電源スイッチ、カウントダウンタイマー、 および時間メーターを含む制御板107の幾つかの電子部品の取付装置として利用 できる。便宜上、電源スイッチはカウントダウンタイマーに配線でき、これは順 に時間メーターおよび電磁放射線の源に並列に配線される。カウントダウンタイ マーは、使用者が照射時間を所望の露光のレベルにすることを可能にする。時間 メーターは、電磁放射線の源により与えられる照射時間の合計数の記録を維持す る。この特徴は、バルブの出力が迅速な光活性化に必要な最小レベルより下に減 少する前に、バルブ101を監視して、それを変化させる。 図２は２--２の線に沿った図１に示された装置の断面図である。図２は、ハウ ジング100が開放された場合のバルブ101の配置を 示す。リフレクタ108A、108Bがバルブ101のそれぞれのアレイを完全に包囲する 。血液製剤を含む手段102が上部プレート集成装置103と下部プレート集成装置10 4の間に置かれる。それぞれのプレート集成装置は上部プレート103A、104Aおよ び下部プレート103B、104Bを含む。プレート集成装置103、104は、血液製剤を含 む手段102により生じた空間を収容するように設計されるヒンジ109を介して連結 される。上部プレート集成装置103は、下部プレート集成装置104の下部プレート 104Bにより支持された血液製剤を含む手段102の上に静かに載るようにされる。 検出器110A、110B、110C、110Dは、プレート集成装置103、104のプレート103A 、103B、104A、104Bの間に都合良く置くことができる。それらは印刷回路板111 に配線でき、これは順に制御板107に配線される。 図３は３--３の線に沿った図１に示された装置の断面図である。６個の血液製 剤を含む手段102（例えば、テフロン血小板ユニットバッグ）が、バルブ101のア レイの上に固定関係で置かれる。血液製剤の温度が、ファン112単独により、ま たは、更に好ましくは、冷却源（図示されていない）に連結された冷却入口114 および冷却出口115を有する熱交換器113を使用することにより調節し得る。 図４は４--４の線に沿った図１に示された装置の断面図である。図４は、その 装置の好ましい実施態様の温度調節方法を更に明らかに示す。上部プレート集成 プレート103A、103Bおよび下部プレート集成プレート104A、104Bのそれぞれが、 温度調節室103C、104Cをそれぞれ形成する。ファン112が室103C、104Cの中およ びその間に空気を循環し得る。熱交換器113が使用される場合、循環空気が冷却 され、プレート103A、103B、104A、104Bの間に通される。実施例２ 図５は、血小板が本発明の方法により処理される実施態様を示す。分別後に、 血小板が、核酸結合性化合物を含むバッグ（陰をつけたバッグとして図１に示さ れる）に移される。次に、このバッグ（これは本発明に適した透過性およびその 他の特性を有する）が照射装置（例えば、上記の実施例１に記載された装置）中 に入れられ、そして照射される。遊離化合物が回収されてもよく、または所望に より捕捉装置により“捕捉されてもよい”。このような場合、バッグは細胞中に 含まれる化合物のみを含むであろう。すなわち、そのバッグは遊離の化合物を含 まないであろう（このバッグは陰をつけていないものとして図１に示される）。実施例３ この実施例では、本発明の汚染除去方法がエルジニア・エンテロコリチカ(Yer sinia enterocolitica)、野生型、血清型３、生物型４を失活するのに適用され る。この生物は血液製剤中に見られる。一般には、R. Y. Dodd、Transfusion Me dicine in the1990's （American Assoc. Blood Banks 1990）（S.J.Nance, 編集 ）を参照のこと。また、B.J.Grossmanら，Transfusion 31:500(1991)を参照のこ と。 その生物の一夜培養物を、運動性穿刺(motility stab)からの ブレインハートインフュージョン(BHI) ブロス10mlに接種することにより行った 。これを35℃に保ち、その0.1mlを使用して実験用のBHI ブロス20mlに接種した 。35℃で一夜インキュベートした後、静置培養物を1900gで15分間にわたってぺ レット化し、上澄みを捨て、そしてバクテリアペレットを熱不活化した普通の血 清プール１ml中に懸濁させた。これをアラメダ−コントラ・コスタ・メディカル ・アソシエーション(Alameda-Contra Costa Medical Association)の血液バンク から得られたヒト血小板の期限が切れたばかりのユニットに注入した。バクテリ アを含む血小板濃厚液のアリコート5mlをバッグから取り出し、対照（これはプ ソラレンを使用せずに照射されたか、または処理を受けていなかった）以外は、 特定量の８−MOPおよびUVA照射を受け取った（表１を参照のこと）。血小板濃厚 液を循環水浴に取り付けた栓付きガラス製水ジャケット室に入れることにより温 度を照射中に25℃に保った。照射装置（デルマ・コントロール(Derma Control) 、ドルトン(Dolton)、I11.；型番号1224- スペシャル）は二つのアレイ（2.5イ ンチで隔置された６個のランプ／アレイ）を使用し、一つのアレイは試料の上に あり、そしてもう一つのアレイは試料の下にあった（こうして、試料はランプか ら約３インチのところにある）。各アレイは約６インチだけ他のものから分離さ れており、その背後に研磨された金属リフレクタを有し、そしてUVA透過性アク リルプラスチックシートで覆われている。処理すべき試料（例えば、血小板バッ グ）は下部シートの上に置かれる。 デルマ・コントロールF587T12-BL-HO型バルブを使用した。これらは長さ24イ ンチの“ブラックライト”チューブ（内部蛍光被覆物により特定の波長を放出す るように工作されている）である。最大波長は、簡単な水銀ランプまたは普通の “BLB"蛍光バルブと異なり、360nm未満である。全強度は20mW/cm²未満である。 BHI ブロス中の連続10倍希釈液0.1 mlを、BHI 寒天を含む100mmのペトリ皿に プレートすることによりバクテリアを定量化した。35℃で24時間のインキュベー ション後に、コロニーをカウントし、バクテリア濃度を１ml当たりの基準で計算 した。結果（表１）は３μg/ml程度に少量の8-MOPが６logのバクテリアを殆ど失 活することができることを示す。10μg/mlでは、10分が充分すぎる照射を与える 。実際に、10μg/mlでは、５分間の照射が適当である。実施例４ アルタック(Artuc)とその共同研究者らがヒトおよびウシの血清タンパク質中 の8-MOPの溶解性を試験し、100〜1000ng/mlの範囲の8-MOP濃度、即ち、乾癬のプ ソラレン紫外線Ａ(PUVA)治療を受けている患者で観察された濃度と同様の濃度で は、8-MOPの75％〜80％がアルブミンに結合されることを示した。M.Artucら，Br it.J.Derm.101:669 (1979)。 この実施例では、本発明の汚染除去方法のもとにプソラレン−核酸相互作用の 有効性を実証するために、血漿およびタンパク質不含媒質を使用して、ウシ胸腺 DNAへの8-MOPの結合が比較される。この測定はバクテリア核酸ではなく真核生物 核酸を使用したが、それはバクテリアに関する付加物生成の程度の有益な指標と なる。 ³H-8-MOPを4.7 x 10⁶CPM／マイクログラムの比活性でエタノール中115μg/ml の濃度に調製した（以下、“8-MOP原液”）。その後、DNAを含む試料（“+DNA” )につき8-MOP原液130.5μｌまたは22μｌ（それぞれ２つ）、またDNAを含まない 試料（“-DNA”)につき52.2μｌまたは8.7μｌを乾燥させた。+DNA試料に、DNA 原液(7.7mg/ml)40μｌを添加しただけでなく、血漿（１日経過の凍結したもの） 460μｌまたはトリス-EDTA(“TE”)緩衝液450μｌを添加した。後者には5MのNaC l 10μｌも添加した。-DNA料（即ち、対照）につき、血漿184μｌおよび水16μ ｌを添加した。 試料を約１時間にわたって軽くボルテックス混合し、カウントをチェックして 8-MOPが溶解したことを確かめた。 それぞれの試料(100μｌ)を25℃で０分、２分、４分、８分、および16分にわ たってHRI-100(HRI リサーチ社、コンコード、CA)で照射した。試料を照射後４ ℃に一夜保った。その後、試料を抽出した。最初に、フェノール溶液を0.1Mのト リスpH8で平衡にすることによりpH8に調整した。次にそれぞれの試料をフェノー ル100μｌで抽出した。それぞれの試料を５分間遠心分離して水相を新しいチュ ーブに移した。２回目の抽出を100μｌのフェノール：クロロホルム(1:1)で行っ た。最後の抽出を100μｌのクロロホルムで行った。 最後の水相を、0.2MのNaClの最終濃度を得るように調節されたNaCl 50μｌを 添加し、次にエタノール250μｌを添加することにより沈殿させた。再度、試料 を遠心分離した（10分間）。上澄みを除去し、ペレットを乾燥させた。ペレット をTE100μｌに再度懸濁させ、そして沈殿させた。これを合計３回の沈殿につき 繰り返した。最後のペレットを水600μｌに入れ、100μｌをカウントした。それ ぞれの試料を、吸光度(260nm)を測定することによりDNAにつき分析した。8-MOP レベルを1000の塩基対当たりの付加物としてプロットした（“8-MOP:kBP”）。 結果（図６）は、血漿がDNAへの8-MOPの付加速度論を殆ど変化させないことを示 す。 8-MOP-DNA付加物生成の頻度はバクテリアゲノムの高度の修飾を予告する。更 に、この型の生化学的測定は、光化学失活方法の効率を監視する手段を与える可 能性を有する。実施例５ プソラレンおよびイソプソラレンの光活性化は種々の光生成物を生じ得る。“ 光生成物”は、電磁放射線の活性化波長に暴露された場合の光反応性化合物の可 能な反応を考えることにより最も良く理解される。正確な機構に限定されないが 、基底状態（“Ｃ”）の光反応性化合物と電磁放射線の活性化波長の反応は短命 励起種（“Ｃ^*”）を生じると考えられる。 Ｃ→Ｃ^* 次に起こることは、主として、潜在的な反応体が励起種に利用される作用である 。それは短命であるので、この種と核酸（“NA”）の反応は、励起種が生成され る時に核酸が存在する場合にのみ可能であると考えられる。こうして、その反応 は、操作に関して、電磁放射線の活性化波長の存在下にある必要があり、即ち、 それは“光結合性”である。それは暗結合性ではない。その反応は以下のように 表し得る。 Ｃ^*＋NA→NA：Ｃ この反応の生成物は、以下、“光付加生成物”と称され、“光生成物”とは区別 されるべきである。 記載されるこの反応により、その化合物が電磁放射線の活性化波長に暴露され る時に核酸が結合に利用されない状況を今考えることができる。励起種は短命で あり、反応する核酸を有しないので、励起種は単にその基底状態に戻ることがあ る。 Ｃ^*→Ｃ 一方、励起種はそれ自体（即ち、基底状態または励起種）と反応して基底状態複 合体（“Ｃ：Ｃ”）を生じ得る。２種の化合物が 反応するこれらの自己反応の生成物は“光二量体”または単に“二量体”と称さ れる。しかしながら、自己反応は２種の化合物に限定されない。種々の多量体（ 三量体、等）が生成し得る。 励起種はそれ自体と反応することに限定されない。それはその環境、例えば、 溶媒の要素（“Ｅ”）（例えば、イオン、ガス、等）と反応してその他の生成物 を生成し得る。 Ｃ^*＋Ｅ→Ｅ：Ｃ この種の反応（例えば、一重項酸素種を生じる酸素との反応）は細胞の損傷を生 じると考えられる。更に、それは単に基底状態誘導体（“［”）に内部転位（“ 異性化”）し得る。 Ｃ^*→［ 最後に、励起種は、ここに記載された以外のその他の反応を受け得る。 本発明および“光生成物”の理解は、これらの反応の一つ（たとえあったとし て）が実際に起こることに依存しない。“光生成物”は、その性質がどのような ものであろうとも、化合物と電磁放射線の活性化波長の反応後に、反応環境のそ の他の成分と相互作用し得る生成物が結果的に得られる場合に存在すると考えら れる。 4'-ヒドロキシメチル-4,5',8-トリメチルプソラレン(HMT)の如きプソラレンで は、HMTが電磁放射線の活性化波長に暴露される場合に生成された幾つかの生成 物が得られる。HMTの得られる主生成物は２種のシクロブチル光二量体である。 二量体の一つにおいて、二つのピロン環がシス−シン配置で結合され、一方、そ の他の二量体では、結合が再度シス−シン配置で−つの分子のフ ラン末端と他のピロン末端の間に生じる。HMTの第三の得られる生成物は単量体H MT光異性体である。この異性体において、中央の環酸素は通常の１，３配向に代 えて１，４配向をとる。２種の光二量体は幾何学的形状を考慮して介在活性を有 するとは予測されないであろうが、光異性体は平面のままであり、従って、それ は二本鎖核酸とポジティブな介在的会合を有し、こうして、突然変異誘発物質で あり得ることが意図されている。 この実施例において、8-MOPの光化学的分解がAMTと比較される。試料を、ライ ネン・ダイナマックス(Rainen Dynamax)300Aカラムを使用して逆相HPLCにより分 析した。勾配溶離を0.1Mの酢酸アンモニウム／アセトニトリル（42分間で０〜70 ％のアセトニトリル）を用いて行った。AMTは、これらの条件下で約24分で単一 ピークとして溶離する。検出は260nmまたは330nmにおける吸収によるものであっ た。後者の波長を、血漿を含む試料につき使用した。 それぞれの化合物の標準溶液を種々の濃度で調製した。次にこれらの溶液を水 で1:10に希釈し、次に300μｌを分析のために注入した。全ての試料を300nmで監 視した。ピークを、ピーク高さまたはピーク面積を測定することにより分析し、 次に標準プロットを使用してgh/mlに換算した。ピーク面積は、そのトレースを 複写し、ピークのコピーを切断し、次に得られるトレースを計量することにより 測定した。二つの方法は実質的に同じ結果を与えた。 結果を図７に示す。明らかに、AMTは8-MOPよりも迅速に分解する。それ故、そ れは更に多くの光生成物（これらは最終的に輸 血レシピエント中に入るだろう）を生成すると予測されるであろう。対照的に、 8-MOPは有意な量の光生成物を生成するとは予測されない。これは、権威者が活 性化されていない8-MOPが非突然変異誘発性であると結論したことを考える場合 に重要である。実施例６ 血小板が活性化されたようになる時、GMP140と称されるα顆粒膜糖タンパク質 が血小板表面に露出されるようになる。新しい正常な刺激されていない血小板の ５％未満がフローサイトメトリーにより検出可能なGMP140レベルを発現する。一 般的にはM.J.Metzela-ar, Studies on the Expression of Activation-Markers on Hu-man Platelets (Thesis 1991)を参照のこと。 GMP140を測定するために、血小板に富む血漿の少量アリコートがGMP140結合性 抗体または対照マウスIgGを含むHEPES緩衝液に入れられる。CD62は、GMP140に結 合する市販のモノクローナル抗体（オランダ、ウデンにあるサンビオ(Sanbio)； カリフォルニア州、サンフランシスコにあるカルタグ・ラブズ(Caltag Labs)お よびカリフォルニア州、マウンチアン・ビューにあるベクトン・ディキンソン(B ecton Dickinson)から入手できる）である。15分のインキュベーション後に、FI TCに結合されたヤギ抗マウスIgGを飽和量でチューブに添加する。最後に、細胞 を等張食塩水中で希釈し、パラホルムアルデヒドで定着し、FACSCAN（カリフォ ルニア州、マウンチアン・ビューにあるベクトン・ディキンソン）で分析する。 陽性対照を、フォルボールミリステートアセテート（PMA）を試験系に10^-7Mの最 終濃度で添加することによりつくる。 この実施例において、CD62を使用して血小板活性化に関する照射単独の影響（ 存在する場合）を測定した。抗体を使用前に-40℃で少量のアリコート(0.01mg/m l)として貯蔵した。５倍に濃縮したマウスIgG対照(0.05mg/ml)（カリフォルニア 州、マウンチアン・ビュー#9040にあるベクトン・ディキンソン）を使用した。 使用時に、これをHEPES緩衝液中で1:5に希釈した。第二抗体はFITCに結合された ヤギ抗マウスIgG（カリフォルニア州、バーリンゲーム#3506にあるタゴ(TAGO)） であった。これを-20℃で少量のアリコートとして貯蔵した。フォルボールミリ ステートアセテート (PMA)（ミズーリー州、セントルイスにあるシグマ(Sigma) ）を-40℃で貯蔵した。使用時に、これをDMSOに溶解した（処理濃度は 1.62 xl 0^-5Mであった）。 16％のパラホルムアルデヒド(PFA)（ミズーリー州、セントルイスにあるシグ マ）を、パラホルムアルデヒド16gを脱イオン水100mlに添加することにより調製 した。これを70℃に加熱し、その後その溶液が透明になるまで3MのNaOHを滴下し て添加した。その溶液を冷却し、pHを1NのHClで7.4に調節した。これを濾過し、 貯蔵した。市販の等張緩衝液：ヘマトール・アイソトニック・ディリューエント (Hematall Isotonic Diluent)(フィッシャー(Fisher)#CS 606-20) を使用した。 血小板濃厚液の血小板活性化を測定するために、ヒト血小板のユニットをアラ メダ−コントラ・コスタ・メディカル・アソシエーションの血液バンクから得た 。アリコート5mlをバッグから取り出し、対照（これは照射室中に入れること以 外の処理を受けなかった）を除いて、特定量のUVA照射を受けた。血小板濃厚液 を 循環水浴に取り付けられた栓付きガラス製水ジャケット室に入れることにより温 度を照射中25℃に保った。照射装置（デルマ・コントロール、ドルトン、I11.； 型番号1224- スペシャル）は、上記の実施例３に記載されたとおりであった。照 射後、血小板を５日間貯蔵した。特定の時点で、アリコートを取り出し、処理し た。 処理は血小板濃厚液のアリコート（例えば、５マイクロリットル）を抗体およ び適当な試薬を含むそれぞれの微小遠心分離管に添加することを伴い、そしてこ れを非常に穏やかにボルテックス混合した。試料を室温で15分間インキュベート した。 ヤギ抗マウスIgG-FITC(HEPES緩衝液中1:10に希釈) をそれぞれの管に添加し（ ５μｌ）、その溶液を穏やかなボルテックスにより混合した。試料を室温で更に 15分間インキュベートした。 イソトン(Isoton)II（１ml）をそれぞれの管に添加し、ポリプロピレン製の使 い捨てピペットで穏やかに混合した。HEPES(150マイクロリットル）中８％のPFA をそれぞれの希釈試料に最終１％となるように添加した。血小板をFACSCANで分 析した。結果を表２に示す。 活性化は％として表される。明らかに、10分間の照射(UV10')は貯蔵血小板に かなりの負の影響を与えた。血小板が高度に活性化された。対照的に、５分間の 照射(UV5')は、照射を受けなかった対照以上に有意な活性化を生じなかった。実施例７ 実施例６の結果が与えられたとすると、短い照射時間またはフィルターの使用 がUV照射による細胞の損傷を避けるために必要とされることが明らかである。こ の実施例において、CD62を使用して血小板活性化に関するプソラレンの存在下の 照射の影響を測定する。短い照射時間および波長フィルターを別々に使用する。 短い照射時間： ヒト血小板のユニットを再度アラメダ−コントラ・コスタ・ メディカル・アソシエーションの血液バンクから得る。アリコート５mlをバッグ から取り出し、対照（これは照射室中に入れること以外の処理を受けなかった） を除いて、10μg/mlの8-MOPの存在下で５分間(5')のUVA照射を受ける。血小板濃 厚液を循環水浴に取り付けられた栓付きガラス製水ジャケット室に入れることに より温度を照射中25℃に保つ。照射装置（デルマ・コントロール、ドルトン、I1 1.；型番号1224- スペシャル）は、上記の実施例３に記載されたとおりである。 照射後、血小板を実施例６のように再度５日間貯蔵する。特定の時点で、アリ コートを取り出し、CD62抗体で検定し、そしてFACSCANで分析する。これらの条 件下では、細胞に損傷を与えないで血小板を不活化でき、かつ輸血の前に５日間 貯蔵できることがわかった。 波長フィルター： Co(NO₃)₂の水溶液をNiS0₄と組み合わせて使用して、使用 した光源の発光スペクトルの365nm成分を実質的に除去する。そのCo-Ni溶液は、 照射中に冷媒として水に代えて都合良く使用し得る。 フィルターを用いる10分間の照射後に、血小板を貯蔵し、そしてFACSCANを使 ってCD62抗体で分析する。これらの条件下では、細胞に損傷を与えないで血小板 を不活化でき、かつ輸血の前に５日間貯蔵できることがわかった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９３年１１月１７日 【補正内容】 請求の範囲 １．長期保存および投与に先立って血小板製剤に含まれるバクテリアを失活する 方法であって、 ａ）任意の順序で、ｉ）８−メトキシプソラレン、ii）８−メトキシプソラレ ンを活性化する手段、iii）バクテリアで汚染されている疑いのあるin vivo使用 を目的とした血小板製剤、を用意し； ｂ）該血小板製剤に８−メトキシプソラレンを約３〜３０μｇ／ｍｌの最終濃 度で加え；そして ｃ）８−メトキシプソラレンを活性化して、該血小板製剤に有意な損傷を与え ることなく、８−メトキシプソラレンをバクテリアの一部の核酸に共有結合で結 合させる； ことからなる方法。 ２．バクテリアがエルジニア・エンテロコリチカ (Yersinia enterocolitica) である、請求項１記載の方法。 ３．血小板製剤が血小板濃厚液からなる、請求項１記載の方法。 ４．血小板製剤が血小板に富む血漿からなる、請求項１記載の方法。 ５．活性化手段が１８０〜４００ｎｍの波長を有する所定の強度の電磁放射線ス ペクトルを発することができる光活性化装置からなる、請求項１記載の方法。 ６．活性化手段が１〜２０ｍＷ／ｃｍ²の強度の電磁放射線スペクトルを発する ことができる光活性化装置からなる、請求項５記載の方法。 ７．血小板製剤を前記の強度に１秒〜１０分間さらす、請求項６記 載の方法。 ８．血小板製剤を前記の強度に約５分間さらす、請求項７記載の方法。 ９．in vivo使用を目的とした血小板製剤の処理方法であって、 ａ）任意の順序で、ｉ）８−メトキシプソラレン、ii）８−メトキシプソラレ ンを光活性化する手段、iii）微生物で汚染されている疑いのあるin vivo使用を 目的とした血小板製剤、を用意し； ｂ）該血小板製剤に８−メトキシプソラレンを加え；そして ｃ）８−メトキシプソラレンを３３０〜３５０ｎｍの波長で最大強度を有する 電磁放射線スペクトルにより光活性化して、該血小板製剤の有意な活性化を生じ ることなく、８−メトキシプソラレンを微生物の一部の核酸に共有結合で結合さ せる； ことからなる方法。 10．光活性化手段が３２０ｎｍ（これ以下の放射線を透過しない）および３６０ ｎｍ（これ以上の放射線を透過しない）の波長カットオフを有するフィルターを 含む、請求項９記載の方法。 11．前記の強度が１〜２０ｍＷ／ｃｍ²である、請求項９記載の方法。 12．血小板製剤が血小板濃厚液からなる、請求項９記載の方法。 13．血小板製剤を前記の強度に約１０分間さらす、請求項９記載の方法。 14．in vivo使用に適する血小板、およびＤＭＳＯの非存在下で約３〜３０μｇ ／ｍｌの濃度の８−メトキシプソラレンの水溶液からなる、抗微生物特性を有す る組成物。 15．前記の濃度が約３μｇ／ｍｌである、請求項14記載の組成物。 16．長期保存および投与に先立って血小板製剤に含まれるバクテリアを失活する 方法であって、 ａ）任意の順序で、ｉ）８−メトキシプソラレン、ii）８−メトキシプソラレ ンを活性化する手段、iii）バクテリアで汚染されている疑いのあるin vivo使用 を目的とした血小板製剤、を用意し； ｂ）該血小板製剤に８−メトキシプソラレンを約３〜３０μｇ／ｍｌの最終濃 度で加え；そして ｃ）酸素分子の濃度を制限することなく８−メトキシプソラレンを活性化して 、８−メトキシプソラレンをバクテリアの一部の核酸に共有結合で結合させる； ことからなる方法。 17．血小板製剤が血小板濃厚液からなる、請求項16記載の方法。 18．血小板製剤が血小板に富む血漿からなる、請求項16記載の方法。 19．活性化手段が１〜２０ｍＷ／ｃｍ²の強度の電磁放射線スペクトルを発する ことができる光活性化装置からなる、請求項16記載の方法。 20．血小板製剤を前記の強度に１秒〜１０分間さらす、請求項19記載の方法。 21．工程(c)の活性化後、投与に先立って血小板製剤を室温で貯蔵する、請求項1 6記載の方法。 22．長期保存および投与に先立って血小板製剤に含まれるバクテリアを失活する 方法であって、 ａ）任意の順序で、ｉ）フロクマリン、ii）フロクマリンを活 性化する手段、iii）バクテリアで汚染されている疑いのあるin vivo使用を目的 とした血小板製剤、を用意し； ｂ）該血小板製剤にフロクマリンを３〜３０μｇ／ｍｌの最終濃度で加え；そ して ｃ）酸素分子の濃度を制限することなくフロクマリンを活性化して、フロクマ リンをバクテリアの一部の核酸に共有結合で結合させる； ことからなる方法。 23．血小板製剤が血小板濃厚液からなる、請求項22記載の方法。 24．血小板製剤が血小板に富む血漿からなる、請求項22記載の方法。 25．活性化手段が１〜２０ｍＷ／ｃｍ²の強度の電磁放射線スペクトルを発する ことができる光活性化装置からなる、請求項22記載の方法。 26．血小板製剤を前記の強度に１秒〜１０分間さらす、請求項25記載の方法。 27．工程(c)の活性化後、投与に先立って血小板製剤を室温で貯蔵する、請求項2 2記載の方法。 28．前記のフロクマリンがプソラレンである、請求項22記載の方法。 29．前記のプソラレンが８−メトキシプソラレンである、請求項28記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アイザックス，ステファン ティー. アメリカ合衆国 94563 カリフォルニア 州 オリンダ，ロマ ヴィスタ ドライブ 79 (72)発明者 ハンソン，カール ヴァイス アメリカ合衆国 94703 カリフォルニア 州 バークレイ，エディス ストリート 1427 (72)発明者 チミノ，ジョージ ディー. アメリカ合衆国 94803 カリフォルニア 州 リッチモンド，フル ムーン ドライ ブ 4839

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．長期保存および輸血に先立って血液製剤に含まれる微生物を失活する方法で あって、 ａ）任意の順序で、ｉ）８−メトキシプソラレン、ii）８−メトキシプソラレ ンを活性化する手段、iii）微生物で汚染されている疑いのあるin vivo使用を意 図した血液製剤、を用意し； ｂ）該血液製剤に８−メトキシプソラレンを約３０μｇ／ｍｌまたはそれ以下 の最終濃度で加え；そして ｃ）８−メトキシプソラレンを活性化して、該核酸結合性化合物を微生物の一 部の核酸に共有結合で結合させる； ことからなる方法。 ２．微生物が単細胞および多細胞の生物である、請求項１記載の方法。 ３．生物がバクテリア、真菌、マイコプラズマおよび原生動物である、請求項２ 記載の方法。 ４．血液製剤が血小板を含む、請求項１記載の方法。 ５．血液製剤が血漿を含む、請求項１記載の方法。 ６．活性化手段が１８０〜４００ｎｍの波長を有する所定の強度の電磁放射線ス ペクトルを発することができる光活性化装置からなる、請求項１記載の方法。 ７．前記の強度が２０ｍＷ／ｃｍ²より小さい、請求項６記載の方法。 ８．血液製剤を前記の強度に１０分未満の間さらす、請求項７記載の方法。 ９．血液製剤を前記の強度に約５分間さらす、請求項８記載の方法。 10．in vivo使用を意図した物質の処理方法であって、 ａ）任意の順序で、ｉ）１種またはそれ以上の光反応性の核酸結合性化合物、 ii）該核酸結合性化合物を光活性化する手段、およびiii）微生物で汚染されて いる疑いのあるin vivo使用を意図した物質、を用意し； ｂ）光反応性の核酸結合性化合物を該物質に加え；そして ｃ）光反応性の核酸結合性化合物を、３３０〜３５０ｎｍの波長で最大強度を 有する電磁放射線スペクトルにより光活性化して、該核酸結合性化合物を微生物 の一部の核酸に共有結合で結合させる； ことからなる方法。 11．光活性化手段が３２０ｎｍ（これ以下の放射線を透過しない）および３６０ ｎｍ（これ以上の放射線を透過しない）の波長カットオフを有するフィルターを 含む、請求項10記載の方法。 12．前記の強度が２０ｍＷ／ｃｍ²より小さい、請求項10記載の方法。 13．前記の物質が血液製剤である、請求項10記載の方法。 14．血液製剤を前記の強度に１０分間さらす、請求項８記載の方法。 15．光反応性の核酸結合性化合物がフロクマリン類よりなる群から選ばれる、請 求項10記載の方法。 16．フロクマリンがプソラレン類よりなる群から選ばれる、請求項15記載の方法 。 17．プソラレンが８−メトキシプソラレンである、請求項16記載の方法。 18．in vivo使用を目的とした物質および３０μｇ／ｍｌより低い濃度の８−メ トキシプソラレンを含む水溶液からなる、抗微生物特性を有する組成物。 19．前記の物質がヒトに用いるものである、請求項18記載の組成物。 20．前記の濃度が約３μｇ／ｍｌである、請求項18記載の組成物。