CN100374552C - 大规模生产甲型肝炎病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在与微载体结合的VERO细胞中大规模生产甲型肝炎病毒(HAV)的方法。本发明也提供从HAV感染的VERO细胞的细胞培养物的上清液中分离HAV的方法。

Description

大规模生产甲型肝炎病毒的方法
发明领域
本发明涉及在与微载体结合的VERO细胞中大规模生产甲型肝炎病毒(HAV)的方法。本发明也提供从HAV感染的VERO细胞的细胞培养物上清液中分离HAV的方法。
发明背景
甲型肝炎持续引起传染病、地方病、偶然死亡的散发病例并且是全世界的公共卫生问题。感染是由一组小的无包膜RNA病毒，细小核糖核酸病毒家族的成员甲型肝炎病毒(HAV)引起的。病毒颗粒直径为27-32nm并由单个多肽前体分子切割而成的三个多肽组成。成熟的病毒由多肽VP1、VP2和VP3组成。衣壳蛋白VP1和VP3含有主要的抗原位点并能诱导中和抗体(Lemon等人，1989，在Semler等人编辑的细小核糖核酸病毒的分子状况和检测(Molecular aspects ofpicornavirus and detection.)华盛顿特区：ASM第193-208页中)。
甲型肝炎病毒(HAV)是可从细胞培养物中分离的唯一嗜肝病毒，但该病毒通常伴随较长的培养期和无致细胞病变效应而难以繁殖。Binn等人(1984，临床微生物学杂志(J.Clincal.Microbiol.)，20：28-33)测试了用于复制HAV的几种灵长类细胞类型和用于分离和生产大量病毒的最适条件。HAV的元血清生产显示在异双倍体细胞系BSC-1细胞中，该细胞系直到现在也未用于制备施用于人类的疫苗。在滚瓶中培养21天后，可在上清液和细胞部分中发现病毒抗原。培养在无血清培养基中的细胞与含血清培养的细胞同样支持病毒的生长。候选HAV疫苗从培养于无血清培养基的感染的BSC-1细胞的细胞和上清液体中获得(Binn等人，1986，传染疾病杂志(J.Infect.Diseases)，153：749-756)。然而，Simmonds等人(1985，环境微生物学应用(Appl.Enviromental Microbiol.)，49：749-755)发现在2％-15％的不同浓度血清的培养基中持续感染的细胞BSC-1或AGMK细胞的HAV产量没有显著差异。初级AGMK细胞中的病毒产量是BSC-1细胞中产量的两倍，但是产生的HAV主要保持细胞伴随状态并且只在培养液体中发现了少许病毒。Nasser等人(1987，环境微生物学应用(Appl.EnviromentalMicrobiol.)，53：2967-2971)报道在FRhK-4细胞培养物中以BSC-1培养物所需时间的一半或更少的时间产生了约七倍于BSC-1培养物的更多HAV，其中与细胞结合的HAV相对于BSC-1细胞释放的HAV的比率分别计算为80％对20％。
Flehmig等人(1987，医学病毒学杂志(J.Medical Virol.)，22：7-16)从生长于含血清的培养基中的持续感染的正常人胚胎成纤维细胞的细胞培养物上清液中制备HAV。使用这些方法，在NUNC细胞工厂里生产了大量的上清液并且从上清液分离和经多重步骤纯化的HAV抗原可用于接种疫苗测试。
即使已经报道了几种灵长类细胞类型支持HAV的复制，例如胎性恒河猴肾细胞系(FRhK-4)、原代非洲绿猴肾细胞(AGKM)、传代非洲绿猴肾细胞(BCS-1)，这些细胞通常不被用于人类疫苗，因为已知猴肾经常具有高含量的潜伏猿猴病毒。其他细胞系由于这些细胞的致瘤特性而不能使用。大量生产原代人上皮细胞、成纤维细胞或肾细胞或细胞株以繁殖HAV也受限于这些细胞在培养中的低传代数量。事实上，世界卫生组织(WHO)的适用方针指出只有少数的细胞系被允许用于病毒疫苗的生产。
目前被接受并被批准用于生产适用于人类的疫苗的细胞系是VERO细胞。VERO细胞是已被许可用于人类疫苗制造和目前用于生产脊髓灰质炎和狂犬病疫苗的传代猴肾细胞系。已经尝试利用VERO细胞生产HAV，但是已发现VERO细胞中HAV的复制受到限制，因为VERO具有病毒生长的温度限制。此外，从未在感染细胞的上清液体中发现病毒(Locarnini等人，1981，病毒学杂志(J.Virol.)，37：216-225)。美国专利号4,783,407公开了在不高于33℃的温度下于滚瓶中的VERO细胞中生产HAV以克服温度限制。通过冻融培养的细胞并释放细胞内生产的病毒而获得HAV。基于在VERO细胞中繁殖HAV的商业化疫苗从未被描述。
迄今为止，甲醛溶液灭活的HAV疫苗已被生产以用于临床试验(Andre等人，1990，在Melnick编辑的医学病毒学进展(Prog.Med.Virol.)，Basel，Karger 37：72-95中，Armstrong等人，1993，肝脏学杂志(J.Hepatology)，18：20-26)并且能从初次感染中诱导长时间持久免疫和保护的两种疫苗已是商业化适用的。目前适用的灭活HAV全病毒疫苗的生产方法使用人胚胎肺成纤维细胞系MRC-5作为Nunc细胞工厂(NCF)中的宿主细胞，其中用于疫苗生产的HAV抗原是从细胞内产生的病毒的细胞裂解物获得的，因为HAV抗原不能有效地释放到培养物的上清液中，而且浓缩大体积液体的方法是昂贵的(Bishop等人，1994，病毒学方法杂志(J.Virol.Meth.)，47：203-216)。来自细胞裂解物和细胞培养物上清液含有病毒体和原病毒体混合群HAV的大规模制剂(Bishop等人，1997，Arch.Virol.142：2147-2160)以及商业化适用的疫苗包含完全成熟的病毒体和空的原病毒体颗粒(Andre 1990同上，Armstrong 1993同上)。此外，MRC-5细胞在组织培养中生长缓慢且需要胎牛血清。
在细胞培养中使用血清和/或使用衍生自动物或人来源的蛋白质添加剂出现的问题(例如，不同批次的变化的品质和组成以及受支原体、病毒或BSE试剂污染的风险)是已知的。一般来说，血清或衍生自如白蛋白、运铁蛋白或胰岛素的物质的血清可能含有会污染培养物和衍生自它们的生物产品的不需要的试剂。此外，必须测试人血清衍生的添加剂中能够由血清传染的所有已知病毒，如肝炎或HIV。牛血清或其衍生产品，例如胰蛋白酶，要承受BSE污染的风险。此外，所有血清衍生产品都可能被未知试剂污染。因此，作出许多尝试以提供不需要血清或其他血清衍生的化合物的有效宿主系统和培养条件。
生产方法和培养基一样重要。经济上可行的唯一方法是反应器方法，因为可适应于市场的大小和所需疫苗的剂量按比例扩大规模。对于贴壁细胞使用经典微载体的载体方法是目前用于病毒繁殖所需的细胞的大规模培养的最好选择。目前基于微载体培养的方法容许使用高达几千升大小的发酵罐生产病毒抗原。
Widell等人(1984，病毒学方法杂志(J.Virol.Methods)，8：63-71)使用FRhK-4细胞的微载体细胞培养系统来大规模生产HAV并发现了细胞内和细胞外病毒。每个使用微载体系统的细胞的病毒产量与生长于培养瓶中的常规培养物相似。另一方面，Junker等人(1992，细胞工程学(Cytotechnol.)，9：173-187)显示HAV感染的与常规Cytodex微载体结合的MRC-5细胞由于MRC-5细胞倾向于形成微载体和细胞的凝集物而与生长于培养瓶中的细胞相比只生产30％的HAV抗原。WO 95/24468公开了在灌流系统中MRC-5细胞生长于凝集的玻璃包被的微载体上以用于HAV生产，其中在细胞中发现了大量的病毒。在所描述的系统中，2-10％的较高浓度的血清容许比0.5-2％的低水平浓度的血清生产更多的HAV。然而，当Aunins等人(1997，在Carrondo等人编辑的动物细胞工程学(Animal Cell Technology)第175-183页中)比较了不同的制造技术例如Nunc细胞工厂(NCF)、微载体、静置混合反应器和CellCubes，他们发现如WO95/24468中所描述的玻璃包被的微载体容许形成稳定的凝集物并生产HAV。但是单分散的微载体悬液不能维持培养物的生存期，并且在相似的条件下玻璃凝集微载体方法的生产率只有静置培养的大约一半。Aunins等人1997(同上)得出结论使用HAV毒株的微载体培养是不可行的。
世界范围的市场每年需要1亿剂量量级的HAV疫苗。有效的疫苗生产需要大规模数量的病毒的生长以从宿主系统中获得高产量。方法和病毒毒株生长的培养条件对于获得令人满意的高产量毒株极其重要。因此，为了获得所需病毒的最大产量，必须对系统和培养条件进行特异地调适以提供有利于所需病毒生产的环境。因此，存在对生产病毒和抗原的安全有效的方法的连续需求。此外，也需要病毒繁殖的方法，使用已经可利用的材料并且需要最少数量的耗时操作，其中对宿主细胞、培养基、生长条件和生产系统的组合进行筛选对于获得有效的生产方法是很重要的。
发明概述
本发明的一个目的是提供生产HAV抗原的方法。
本发明的另一个目的是提供在无血清或无血清和蛋白质的培养基中生产HAV的方法。
本发明的另一个目的是提供在细胞培养的传代培养和传代中不使用衍生自动物的蛋白酶的HAV生产。
本发明的另一个目的是提供完全HAV颗粒的分离。
本发明还有一个目的是提供用HAV感染的无血清或无血清和蛋白质的连续产生HAV抗原的VREO细胞培养物。
优选实施方案的详述
根据这些和其他目的，本发明提供用于连续生产甲型肝炎病毒生产的方法，包括下列步骤：提供与微载体结合的VERO细胞的无血清细胞培养物，用HAV感染该VERO细胞的无血清细胞培养物，孵育用HAV感染的该VERO细胞的无血清细胞培养物以繁殖所述的HAV，其中将HAV连续地释放到细胞培养基中；以及收获所述的释放到细胞培养基中的HAV。
根据本发明的方法，与微载体结合的VERO细胞于约37℃的温度下生长在无血清培养基的条件下。该细胞从原始安瓿瓶的VERO细胞生长至用于在无血清培养基中大规模生产的发酵罐中的大规模生物量。用HAV感染前，将细胞培养的温度减低至约34℃并且进一步在此温度下进行病毒的繁殖。
VERO细胞可在细胞培养物生长的过程中结合于球形或多孔的微载体上。该微载体可选自基于葡聚糖、胶原蛋白、塑料、明胶和纤维素以及其他如Butler描述(1988，在Cpier&Griffiths，动物细胞生物工程学(Animal cell Biotechnology)3：283-303中)的微载体。在细胞培养物生长和病毒感染过程中可使用相同的微载体类型。因此，根据本发明的一个实施方案，无血清VERO细胞在球形微载体上培养并感染。根据本发明的另一个实施方案，无血清VERO细胞在多孔的微载体上培养并感染。也可以在球形微载体上生长细胞至一定的生物量并且当其达到发酵罐的最终生物量时以及在多孔的微载体上感染之前传代培养细胞或反之亦然。根据本发明的这个方面，无血清的VERO细胞在球形微载体上培养并且当细胞结合到多孔的微载体上时用病毒感染该细胞。球形微载体选自有光滑表面的微载体，例如CytodexI、CytodexII、CytodexIII(都为Pharmacia)而多孔微载体选自例如Cytopore、Cytoline(都为Pharmacia)。
结合微载体的VERO细胞用HAV以约0.01-约5的感染复数(m.o.i.)感染。
已经发现在上述条件下，HAV连续释放到细胞培养基的上清液中。这是未预见到的，因为使用VERO细胞作为HAV宿主的现有技术公开了HAV只能在细胞内发现并且必须从细胞中才能获得所产生的病毒(US4,783,407)。
本发明的方法提供了HAV的生产，其中HAV连续产生并释放到细胞培养物的上清液中。在本发明的方法中HAV能生产至少60天。现有技术未描述可连续生产HAV如此长时间的细胞培养系统。通过使用微载体培养系统和细胞培养物灌流，含有病毒的培养基连续地从细胞培养物中移去，加入新鲜培养基并连续地灌流。本发明的方法提供了含有能从细胞培养物上清液中收获和纯化的HAV的大体积培养基。
最适细胞培养条件的参数是pH为约6.5-约8.0，O2浓度为约15％-约40％，搅拌速度为约20-约70rpm，以及温度为34℃±0.2℃或37℃±0.2℃。优选地，培养条件在病毒生产的整个过程中保持恒定。
使用直接从用于病毒疫苗生产的初级感染的细胞培养物获得的病毒分离物承受了被其他病毒或未知试剂污染的风险。病毒原种和细胞培养物的污染可通过使用衍生自确定的HAV原种的病毒原种而得以避免。
任何HAV毒株可根据本发明的方法生产。根据本发明的一个实施方案，用通过使用全长HAV cDNA体外转录成HAV RNA并感染VERO细胞而获得的HAV种病毒感染细胞。通过使用编码用于种病毒生产的HAV的cDNA，获得了确定的同种病毒原种。用作种病毒和病毒原种的HAV可以是例如HAV HM175/7。
除了用于细胞培养的血清或其他蛋白质添加剂外，添加衍生自动物来源的胰蛋白酶承受了未知试剂污染细胞培养物的风险。通常，在细胞培养物的传代培养和传代过程中使用来自动物来源的胰蛋白酶以获得细胞生物质。为了在HAV病毒的生产过程中避免衍生自未知试剂和来源的任何污染，在本发明的方法中，优选地使用源自于微生物来源的蛋白酶用于生产来自于原始安瓿瓶的细胞生物质。
根据本发明的一个方面，将用于本发明的HAV生产中的细胞培养物由原始安瓿瓶传代培养为工作细胞库并通过使用微生物蛋白酶或具有胰蛋白酶样活性的微生物蛋白酶进行传代。
根据一个优选的实施方案，使用纯化的微生物蛋白酶的胰蛋白酶样酶。特别的，该胰蛋白酶样酶是灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)胰蛋白酶(SGT)，使用链霉蛋白酶的纯化级分。纯化的SGT优选地通过在苯甲脒上的亲和层析方法和用含有约0.5-约1.2M精氨酸的洗脱剂洗脱纯化的SGT获得。已发现通过该方法纯化的SGT非常有效并且由于其高比活性，使用时可相应减少加入培养基的蛋白质。通过本领域公知的其他方法从链霉蛋白酶纯化所得的SGT也可以用于本发明的方法中。这样的方法包括由Yokosawa等人(1976，生物化学杂志(J.Biochem.)79：757-763)描述的方法或其他层析方法。
根据本发明的另一个优选的实施方案，无血清和蛋白质的培养基被用于细胞培养和生长中。通过只使用被确定过来源的，例如未添加用于细胞生物质生产和病毒繁殖的作为生长添加剂的血清或蛋白质的最小培养基，提供了安全的病毒疫苗的生产方法。
根据另一个方面，本发明提供了分离完全的甲型肝炎病毒颗粒的方法，包括下列步骤：提供与微载体结合的VERO细胞的无血清细胞培养物，用HAV感染该细胞培养物，孵育用HAV感染的细胞培养物以繁殖HAV，其中将HAV连续地释放到细胞培养基中；收获所产生的并释放到细胞培养基中的HAV，以及从所述细胞培养物的上清液的HAV收获物中分离完全的HAV颗粒。
术语“完全的HAV颗粒”是指含有RNA的HAV成熟颗粒，包含衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的感染性HAV病毒体颗粒，以及含有VP1、VP3和VP0前体多肽的未成熟原病毒体。
完全的HAV颗粒可通过本领域公知的方法，例如过滤、离心、沉降或层析方法分离。离心可在蔗糖梯度或CsCl梯度上进行。离心前可通过例如过滤除去较大的细胞碎片。
根据另一个方面，本发明提供了HAV感染的与微载体结合的无血清VERO细胞培养物，其中与载体结合的细胞连续地生产和释放HAV至细胞培养基中。本发明的HAV感染的细胞培养物可连续释放HAV至少60天。
根据本发明的一个优选方面，提供了HAV感染的与微载体结合的VERO细胞的无血清和蛋白质的细胞培养物，其中与载体结合的细胞连续地生产和释放HAV抗原至细胞培养基中。
现已大概描述了本发明，通过参考下述的实施例将理解本发明，除非特别指出，在此提供这些实施例的目的只是在于说明而不是想要限制本发明。
实施例1
在VERO宿主细胞系统中HAV的繁殖
检测HAV毒株HM175/7(由Robert Purcell提供，国家健康学院，Bethesda，马里兰州)在VERO细胞微载体培养物中的繁殖，该毒株最初分离自临床样本并已在原代非洲绿猴细胞中连续传代，这种传代导致了对该病毒毒株的减毒作用。
利用VERO细胞(非洲绿猴，Cercopthecus aethiops，肾)作为生产细胞系。该细胞从马里兰州洛克菲勒的美国典型培养物保藏中心获得，传代数为124，保藏号为ATCC CCL 81。如Kistner等人(1998，疫苗(Vaccine)16：960-968)或WO 96/15231中所描述的，细胞适应于生长在有血清、无血清或无血清和蛋白质的培养基中。对于在无血清培养基中的生长，使用补充有无机盐、氨基酸、碳酸氢钠(2g/l)和酵母或大豆提取物(1-10g/l)的DMEM HAM’s F12基本培养基。制备工作细胞库未使用任何动物衍生的培养基成分。
将存在于与Ham’s F12营养混合物以1∶1的比例混合的DMEM培养基中的一安瓿瓶工作细胞库(WCB)的VERO细胞重悬于含有血清的培养基中和补充有大豆或酵母提取物(0.1-10％)的无血清培养基中。利用纯化的灰色链霉菌胰蛋白酶(1μg/ml)进行传代培养以避免衍生自可能包含任何致病试剂的动物来源的任何试剂。在扁瓶(Roux)和滚瓶中传代培养后，6-8×107细胞/克微载体(CytodexIII，Pharmacia)被接种入12L搅拌的发酵罐中。细胞于37℃生长6-8天。氧饱和度为20％+/-10％，pH7.1+/-0.2的培养条件保持恒定以及搅拌速度为30-60rpm。接种后的第二天，细胞密度为6×105-1×106细胞/ml时将HAV HM175/7的病毒悬浮液以0.1-1.0的感染复数(m.o.i.)，以34℃或37℃的温度泵入发酵罐。两小时后，容许病毒吸附，开始灌流培养基。每天交换发酵罐一半体积的新鲜培养基。将微载体和贴附的细胞通过滤网保留在发酵罐中。在发酵过程中控制pH7.1，O2(30％)，搅拌速度(30-60rpm)以及温度为34℃或37℃。
图1A显示在无血清培养基和含血清(FCS)培养基中在34℃下VERO细胞中生产的HAV。图1B显示在无血清培养基和含血清(FCS)培养基中在37℃下VERO细胞中生产的HAV。感染后7、14、21和28天，在细胞培养物的上清液和细胞颗粒中的抗原产量通过HAV特异的ELISA测定(Mediagnost)的方式确定。确定细胞培养物上清液中每107个VERO细胞的抗原浓度。计算ELISA单位(EU)，以在ELISA检测中给出阳性反应的最高抗原稀释度的倒数值表示。
在VERO细胞中HAV毒株HM175/7在34℃的较低温度下比在37℃下复制得好，并且无血清的比有血清的好(图1A和1B)。在37℃的含血清的培养基中不能观察到病毒抗原生产，而在37℃的无血清的培养基中(较高的感染复数)产生了病毒。用0.1或1的HAV感染复数感染无血清VERO细胞后，从在34℃下感染后第三周的上清液和细胞颗粒中检测到抗原产量升高了(图1A)。在生长于34℃的含血清培养基中的细胞培养物中，病毒抗原绝大多数存在于细胞颗粒中，而于34℃的无血清培养基中培养的VERO细胞中病毒抗原连续地释放到细胞培养物的上清液中，其中约50％的病毒抗原出现在培养基上清液中。
实施例2
用于大规模生产的HAV病毒原种的制备
在细菌质粒pHAV/7(Cohen等人，1987，病毒学杂志(J.Virol.)61：3035-3039)中克隆的减毒毒株HN175/7基因组的全长cDNA经体外转录而被用于制备全长基因组RNA。将34℃的无血清VERO细胞用体外转录的HAV RNA转染以产生无外来试剂的病毒原种。6周后，在感染细胞的裂解物中检测到HAV的特异性抗原，该细胞被进一步用于在无血清条件下的VERO细胞中繁殖HAV。表1显示连续传代后所产生的抗原和病毒的滴度。感染细胞将大约50％的病毒抗原释放到细胞上清液中。在第4代后，病毒原种具有8×107TCID50/ml的滴度。
表1
HAV毒株HM175/7在转染无血清VERO细胞后连续传代的抗原和病毒的滴度
  转染后的传代数   总抗原(EU)   总滴度(TICD<sub>50</sub>)
  上清液   细胞颗粒   上清液   细胞颗粒
  传代1   n.d.   阳性   n.d.   n.d.
  传代2   16000   25600   n.d.   n.d.
  传代3   19200   25600   5.2×10<sup>8</sup>   4.7×10<sup>8</sup>
  传代4   38400   51200   1.5×10<sup>9</sup>   8.9×10<sup>8</sup>
将连续传代后获得的病毒原种HM175/7用于在微载体系统中大规模生产HAV抗原。
实施例3
在无血清培养基的VERO细胞中繁殖HAV HM175/7
将根据实施例2获得的HAV HM175/7于34℃在无血清VERO细胞中进行连续传代。在感染后7、14和21天测定感染性滴度和抗原的数量(表2)。
表2
在34℃无血清的VERO细胞中HAV毒株HM175/7的繁殖
  传代数   抗原(EU/5×10<sup>7</sup>细胞)   滴度(TICD<sub>50</sub>/5×10<sup>7</sup>细胞)
  上清液   细胞颗粒   上清液   细胞颗粒
  7天   阴性   1600   1.3×10<sup>7</sup>   1.1×10<sup>7</sup>
  14天   3200   25600   1.8×10<sup>8</sup>   2.3×10<sup>8</sup>
  21天   25600   51200   2.1×10<sup>9</sup>   5.1×10<sup>8</sup>
11
分别在细胞颗粒和细胞培养物的上清液中获得每5×107个细胞为5×108和2×109的病毒滴度。这证明病毒抗原由无血清VERO细胞持续不断地释放到细胞培养物的上清液中。感染后(p.i.)三周细胞培养物的上清液中病毒抗原的百分数为约50％，同时大约75％的感染性定位于此(表2)。
实施例4
在微载体上繁殖的无血清VERO细胞中生产HAV
将包含生长于微载体(Cytodex III，Pharmacia)上的无血清培养基中的2×1010VERO细胞的6L发酵罐用根据实施例2获得的HAV毒株HM175/7以0.5的m.o.i进行感染。在34℃的长时间发酵过程中重复检测细胞和细胞培养物上清液中的抗原数量。为了检测细胞内产生的HAV，收获来自细胞培养物的VERO细胞并在PBS中将细胞密度调节为2×107细胞/ml，再经三个循环的冻融裂解。低速离心后，经ELISA测定检测细胞碎片和细胞培养物的上清液中的感染性滴度和抗原数量。
从感染后11天起，在细胞培养物上清液中检测到HAV抗原数量逐步向上升高。发酵过程连续进行并且在35天期间内取样(表3)。此时细胞仍能存活并生产HAV抗原。汇合23至25天的上清液并经计算产生的HAV抗原总数量为2.5×106ELISA单位。
表3
感染的VERO微载体细胞培养物的抗原产量
  感染后的天数   细胞颗粒/mlEU/2×10<sup>7</sup>个细胞   上清液EU/ml
  1   80   10
  3   80   -
  7   160   -
  9   320
  11   1280   1
  14   1280   2
  16   1280   8
  18   1280   8
  21   2560   16
  23   2560   32
  25   2560   40
  28   5120   64
  30   5120   128
  32   5120   160
  35   5120   320
实施例5
大规模HAV生产方法的建立
为了建立大规模的发酵方法，研究了繁殖HAV的不同策略。
将在无血清条件下繁殖并分汇合的VERO细胞接种于不同类型的球形或多孔的微载体上，例如Cytodex III、Cytoline或Cytopore上，所有的类型都适于长期培养过程。
在将细胞接种于不同类型的微载体上两天后，将VERO细胞用HAV以1.0的m.o.i.感染。在10L发酵罐中在34℃用无血清或无血清和蛋白质的生长培养基连续灌流进行细胞繁殖。在培养期间针对细胞培养物的上清液测试HAV抗原。
将数据总结在表4中。
表4
在不同的微载体上VERO繁殖后HAV抗原的产量(EU/ml)
  感染接种后的天数   微载体
  Cytodex3   Cytopore2   Cytoline2
  16   阴性   阴性   阴性
  18   阴性   10   4
  21   2   40   2
  23   4   80   8
  25   4   80   16
  28   8   80   8
  30   8   80   10
  32   8   160   20
  35   32   160   20
  37   128   160   40
  39   256   160   40
  42   160   160   40
  44   160   160   40
  46   320   160   40
  49   320   160   80
  51   640   160   80
  53   640   160   80
  56   640   160   160
  58   1280   160   80
  60   1280   320   160
  64   1280   160   320
  67   640   160   160
  67   160   160
  70   160   160
  72   160   320
  74   160   160
  77   160   80
  79   160   80
  71   320   160
  83   320   80
表4的数据显示与多孔微载体结合的细胞连续生产HAV抗原至少83天的长时间。接种于光滑微载体上的细胞最初生产较高的病毒抗原滴度，但在一段时间后细胞表现得趋向于凝集。
实施例6
与微载体结合的无血清或无血清和蛋白质的VERO细胞的长期繁殖
为了大规模地生产HAV病毒，在无血清或无血清和蛋白质的培养基条件下生长至1×1011生物量的VERO细胞被接种于多孔微载体上。用HAV以0.1的m.o.i.感染细胞。于34℃用细胞培养基持续灌流，感染细胞的繁殖进行了多达350天。当在培养基中检测到病毒抗原时，收集含有病毒的上清液并于4℃保存。在感染后35-45天开始收获无血清细胞培养物的上清液。计算所得病毒抗原在100 1发酵罐中每升培养基每60天的疫苗剂量的平均产量并总结在表5中。
表5
VERO细胞中HAV的产量和100L规模的生产率的计算
  批号#   1   2   3   平均值
  平均滴度(EU/ml)   640   978   461   693
  容量生产速率(EU/1/天)   160.000   276.000   128.000   188.00
  剂量数/1/天(总重)   160   276   128   188
  剂量数/1/天(净重)   32   55   26   38
  100天的剂量数(净重)   320.000   552.000   260.00   380.000
实施例7
从细胞培养物的上清液中纯化HAV抗原
将从实施例6中所描述的灌流培养基收集的包含HAV抗原的细胞培养物的上清液通过低速离心或深度过滤器从细胞碎片中分离，并通过利用50K Omega膜(截止值50000Da，Filtron)超过滤浓缩。浓缩物通过20％-60％蔗糖梯度离心进一步纯化并分级分离。通过定性的ELISA测定(Mediagnost)每个级分来测试HAV抗原。HAV抗原汇集在两个峰级分中。分别汇集各个峰级分并通过高速离心浓缩。
在上述过程中，确定抗原的数量和蛋白质的含量。将两个峰的汇集级分通过使用HAV多肽VP0、VP1和VP3及其混合物的特异性抗体的蛋白质印迹分析进行检测。峰的汇集级分12-19由成熟病毒体组成(由于存在衣壳蛋白VP2和缺失VP0)。峰汇集级分22-25含有原病毒体和/或前原病毒体。
这显示通过上述的方法，在大规模的生产过程中HAV被生长在无血清或无血清和蛋白质的培养基中的持久感染的VERO细胞连续地释放到细胞培养基中。
分别收集级分12-19和22-25，让病毒制品接受病毒灭活方法处理并且将灭活的制品配制在疫苗组合物中。
实施例8
从链霉蛋白酶纯化灰色链霉菌(Streptomyces griseus)胰蛋白酶
a)离子交换层析
将30g链霉蛋白酶(Boehringer Ingelheim)溶解于缓冲液A(0.02吡啶，pH5.0)中至链霉蛋白酶的终浓度为40mg/ml。将25ml该溶液在用缓冲液A平衡的CM Sepharose C1 6B(Pharmacia)上接受阳离子交换层析处理。利用5倍于柱体积的缓冲液A(0.02M吡啶)和缓冲液B(0.75M吡啶pH5.0)的线性梯度在室温下进行洗脱。
通过以1∶1的比例混合级分样品和大豆抑制剂(例如1mg大豆抑制剂/100μg蛋白质)随后使用S2222进行层析底物测定来测试所收集的级分的抑制特性。结果以每分钟的Δ吸光度单位(ΔA/min)表示。对大豆抑制剂具有最高抑制活性的级分经SDS-PAGE进一步分析并用考马斯染色。
胰蛋白酶的活性通过使用N-苯甲酰基-精氨酸乙酯(BAEE，Tris缓冲液pH 8.0，20mM CaCl2中，25℃)作为底物的显色测定法进行检测并确定每分钟的Δ吸光度单位。使用具有13×103U/mg比活性的猪胰蛋白酶溶液(1mg/ml)作为对照参考。将比活性定义为每mg蛋白质的胰蛋白酶酶活力单位。结果总结在表1中。
胰凝乳蛋白酶活性通过使用3-羧甲氧基丙酰基-L-精氨酰基-L-丙基-L-酪氨酸-对-硝基苯胺盐酸盐(S-2586，Chromogenix)的显色测定法进行检测。结果以每分钟的Δ吸光度单位表示(ΔA/min)。
表6
通过离子交换层析纯化链霉蛋白酶
  灰色链霉菌链霉蛋白酶   未纯化的链霉蛋白酶   纯化的级分
  蛋白质(g)   1   0.08
  比活性U/mg   1.6×10<sup>3</sup>   16.5×10<sup>3</sup>
  回收的U％   100   70
  经SDS-PAGE测得的稳定性   n.d.   不稳定，低分子量片段
  经大豆抑制剂测得的抑制率(抑制％)   n.d.   90±0.1
  胰凝乳蛋白酶的活性(ΔA/分钟)   450   38
*n.d.不确定
表6显示经用大豆抑制剂进行的抑制试验测定，含有具有胰蛋白酶样活性的蛋白质的级分可通过离子交换层析纯化并具有高于链霉蛋白酶约10倍的比活性且回收率约为70％。然而，该蛋白质不稳定并且在SDS-PAGE中不显示为单一条带，而是多条带。这指示了蛋白质的断裂和自动切割。
b)在固定化的苯甲脒上的亲和层析
在用缓冲液A(50mM Tris，0.5M NaCl pH 7.0)平衡的苯甲脒琼脂糖凝胶6B速流(Pharmacia)柱上加载40ml链霉蛋白酶溶液(75mg/ml，缓冲液A)。用缓冲液B(50mM Tris，0.5M NaCl pH 7.0，10mM苯甲脒盐酸盐pH 7.0)、缓冲液C(0.5M NaCl，0.6M精氨酸，pH 5.5)或缓冲液D(0.5M NaCl，1M精氨酸，pH 5.5)进行洗脱。
如实施例8A中所描述，利用大豆抑制剂测试所收集级分的抑制特性，以及胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性。确定比活性，以每mg蛋白质的酶活力单位表示。
表7
通过在固定化的苯甲脒上的亲和层析来纯化链霉蛋白酶并用苯甲脒洗脱
  亲和层析并用苯甲脒洗脱(缓冲液B)
  灰色链霉菌链霉蛋白酶   未纯化的链霉蛋白酶   纯化的级分
  蛋白质(g)   3   0.13
  比活性U/mg   1.6×10<sup>3</sup>   19×10<sup>3</sup>
  回收的U％   100   60
  经SDS-PAGE测得的稳定性   稳定   稳定
  经大豆抑制剂测得的抑制率(抑制％)   n.d.   99.98±0.1％
  胰凝乳蛋白酶的活性(ΔA/分钟)   n.d.   0.1
表7中总结的结果显示通过用苯甲脒进行竞争性洗脱，回收到60％的纯化的链霉蛋白酶的胰蛋白酶样活性，比活性为约140U/μg蛋白质。然而，优选地进一步纯化含有纯化的胰蛋白酶样蛋白酶的级分并且在用于涉及细胞培养生长或应用于人的生物制品的生产过程之前除去苯甲脒。
表8
通过在固定化的苯甲脒上的亲和层析纯化链霉蛋白酶并用0.6M精氨酸和1M精氨酸洗脱
  亲和层析并用0.6M精氨酸洗脱(缓冲液C)
  灰色链霉菌的链霉蛋白酶   未纯化的链霉蛋白酶   纯化的级分
  蛋白质(g)   3   0.13
  比活性U/mg   1.6×10<sup>3</sup>   26×10<sup>3</sup>
  回收的U％   n.d.   63
  经SDS-PAGE测得的稳定性   稳定   稳定
  经大豆抑制剂测得的抑制率(抑制％)   n.d.   99.89±0.1％
  胰凝乳蛋白酶的活性(ΔA/分钟)   n.d.   ＜0.1
  亲和层析并用1M精氨酸洗脱(缓冲液D)
  灰色链霉菌的链霉蛋白酶   未纯化的链霉蛋白酶   纯化的级分
  蛋白质(g)   3   0.13
  比活性U/mg   1.6×10<sup>3</sup>   46.5×10<sup>3</sup>
  回收的U％   n.d.   71％
  经SDS-PAGE测得的稳定性   稳定   稳定
  经大豆抑制剂测得的抑制(％抑制)   n.d.   99.99±0.1％
  胰凝乳蛋白酶的活性(ΔA/分钟)   n.d.   ＜0.1
  LAL(EU/1000U)   88   ＜4
从表8的结果中可以看出，当使用含有0.6M精氨酸的缓冲液时回收到约63％的链霉蛋白酶的最初胰蛋白酶样活性，而当使用含有1M精氨酸的缓冲液时回收到约71％。用精氨酸从苯甲脒亲和载体洗脱的纯化的SGT与通过离子交换层析或用苯甲脒从苯甲脒载体洗脱获得的SGT相比，具有较高的比活性。进一步地，当使用含有增加的摩尔浓度的精氨酸的缓冲液时，获得了具有较高纯度和比活性的产品。
提供上述实施例以举例说明本发明，但并不限制本发明的范围。本发明的其他变化形式对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的并包括在所附的权利要求书中。为所有发明的目的，将在此引用的所有出版物、专利和专利申请引入作为参考。

Claims (14)

1.一种用于连续生产甲型肝炎病毒(HAV)的方法，包括下列步骤：
(i)提供与微载体结合的VERO细胞的无血清细胞培养物，所述微载体选自球形和多孔的微载体，
(ii)在无血清细胞培养基中生长所述VERO细胞，
(iii)用HAV感染与所述微载体结合的VERO细胞的无血清细胞培养物，
(iv)孵育与所述微载体结合并且用所述HAV感染的VERO细胞的所述无血清细胞培养物以繁殖所述的HAV，从而所述HAV被连续地释放到所述细胞培养基中，并且其中所述VERO细胞产生的大部分总HAV被释放到所述细胞培养基中；以及
(v)从所述细胞培养基收获所述HAV.
2.根据权利要求1的方法，其中所述VERO细胞在37℃的温度下生长.
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述温度在感染前降低到34℃.
4.根据权利要求1至3中任意一项的方法，其中所述的微载体选自葡聚糖、明胶、胶原蛋白、塑料或纤维素.
5.根据权利要求1至4中任意一项的方法，其中用HAV毒株HM175/7的接种病毒感染所述的VERO细胞.
6.根据权利要求1至5中任意一项的方法，其中用所述HAV以0.01-5.0的感染复数感染所述的VERO细胞.
7.根据权利要求1至6中任意一项的方法，其中从工作细胞库中传代培养所述的细胞培养物，并通过使用微生物蛋白酶或微生物来源的胰蛋白酶样的酶对所述的细胞培养物进行传代.
8.根据权利要求7的方法，其中所述的微生物蛋白酶是灰色链霉菌链霉蛋白酶的胰蛋白酶样的酶.
9.根据权利要求1至8中任意一项的方法，其中连续生产所述HAV至少60天.
10.根据权利要求1至9任意一项的方法，其中所述VERO细胞的无血清细胞培养物是VERO细胞的无血清和蛋白质的细胞培养物.
11.根据权利要求1至10中任意一项的方法，进一步包括步骤：
(vi)从收获自所述细胞培养基的所述HAV分离完全的HAV颗粒.
12.根据权利要求11的方法，其中所述的完全的HAV颗粒是通过等密度离心而得到分离的.
13.一种HAV感染的与微载体结合的VERO细胞的无血清细胞培养物，其中与所述微载体结合并且用HAV感染的所述VERO细胞连续地将HAV释放到所述细胞培养基中，其中所述的微载体选自球形和多孔的微载体，并且其中所述VERO细胞产生的大部分总HAV被释放到所述细胞培养基中.
14.一种HAV感染的与微载体结合的VERO细胞的无血清和蛋白质的细胞培养物，其中与所述微载体结合并且用HAV感染的所述VERO细胞连续地将HAV释放到所述细胞培养基中，其中所述的微载体选自球形和多孔的微载体，并且其中所述VERO细胞产生的大部分总HAV被释放到所述细胞培养基中.
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