JP4537709B2 - Ａ型肝炎ウイルスの大規模生成の方法 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、マイクロキャリアに結合したＶＥＲＯ細胞におけるＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）の大規模生成の方法に関連する。本発明はまた、ＨＡＶを感染させたＶＥＲＯ細胞の細胞培養物上清よりＨＡＶを単離する方法を提供する。

（発明の背景）
Ａ型肝炎は、感染の散発的症例、風土病、時折死を引き起こし続ける、全世界の公衆衛生問題である。感染は、小さなエンベロープで包まれていないＲＮＡウイルスの群であるピコナウイルス科のメンバーの、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）により引き起こされる。ウイルス粒子は、直径２７〜３２ｎｍであり、そして単一のポリペプチド前駆体分子から開裂した３つのポリペプチドからなる。成熟したウイルスは、ポリペプチドＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からなる。カプシドタンパク質ＶＰ１およびＶＰ３は、主要な抗原性部位を含み、そして中和抗体を誘導することができる（Ｓｅｍｌｅｒら編 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ ｐ１９３−２０８におけるＬｅｍｏｎら，１９８９）。

Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、細胞培養より単離され得る唯一の肝親和性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルスであるが、このウイルスは通常長いインキュベーション期間および細胞変性効果のない状態で増殖させることが難しい。Ｂｉｎｎら（１９８４．Ｊ．Ｃｌｉｎｃａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：２８−３３）は、ＨＡＶの複製についていくつかの霊長類細胞型ならびに大量のウイルスの単離および生成のための最適条件を試験した。ＨＡＶの無血清生成物は、ヘテロ二倍体細胞株であるＢＳＣ−１細胞において見られた。このＨＡＶの無血清生成物は、現在までヒトに使用するワクチンの生成に使用されていない。ローラーフラスコ中の培養の２１日後、ウイルス抗原は上清および細胞画分に見出され得た。無血清培地中で維持された細胞は、血清中で維持された細胞と等しいウイルス増殖を支持した。ＨＡＶワクチン候補は、無血清培地中で維持された感染ＢＳＣ−１細胞の細胞および上澄みより得られた（Ｂｉｎｎら，１９８６．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ１５３：７４９−７５６）。しかし、Ｓｉｍｍｏｎｄｓら（１９８５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：７４９−７５５）は、持続的に感染させた細胞（ＢＳＣ−１細胞またはＡＧＭＫ細胞）を用い、培地中の２％と１５％との間の異なる濃度の血清で、ＨＡＶ生成の有意な違いがないことを見出した。初代ＡＧＫＭ細胞におけるウイルス生成は、ＢＳＣ−１細胞におけるウイルス生成の２倍であるが、生成されたＨＡＶは大部分が細胞に結合し続け、そしていくらかのウイルスのみが培養液中に見出された。Ｎａｓｓｅｒら（１９８７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２９６７−２９７１）は、ＦＲｈＫ−４細胞培養において、ＢＳ−Ｃ１培養に必要とされる時間の２分の１以下で、約７倍多いＨＡＶが生成されたことを報告した。ここで、細胞に結合したＨＡＶの割合対ＨＡＶを放出したＢＳＣ−１細胞の割合は、それぞれ８０％対２０％であると計算された。

Ｆｌｅｈｍｉｇら（１９８７．Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌ．２２：７−１６）は、持続的に感染させた正常ヒト胚性線維芽細胞の細胞培養上清よりＨＡＶを調製した。この正常ヒト胚性線維芽細胞は、血清を含有する培地中で増殖させた。これらの方法を用いて、大量の上清がＮＵＮＣ細胞工場において生成され、そして上清より単離されて複数の工程で精製されたＨＡＶ抗原がワクチン接種試験に使用された。

いくつかの霊長類細胞型がＨＡＶの複製を支持すると報告されたにもかかわらず（例えば、胎児アカゲザル腎臓細胞株（ＦＲｈｋ−４）、初期アフリカミドリザル腎臓細胞（ＡＧＫＭ）、連続アフリカミドリザル腎臓細胞（ＢＣＳ−１））、これらの細胞は、サルの腎臓はよく潜在性シミアンウイルスの高含有量を有していることが知られているので、一般的にヒトのワクチンに使用されない。他の細胞株は、これらの細胞の腫瘍化性質のため使用され得ない。ＨＶＡを増殖するための初期ヒト上皮細胞または細胞株、初期ヒト線維芽細胞または細胞株あるいは初期ヒト腎臓細胞または細胞株の大量生産はまた、培養におけるこれらの細胞の低い継代数により制限される。実際、世界保健機関（ＷＨＯ）の適用指針は、わずかな細胞株のみがウイルスワクチン生成に認められることを示す。

ヒトに適用可能なワクチンの生成に現在認められ、かつ有効とされている細胞株の一つは、ＶＥＲＯ細胞である。ＶＥＲＯ細胞は、ヒトワクチンの製造において使用を許可された連続サル腎臓細胞株であり、ポリオワクチンおよび狂犬病ワクチンの生成に現在使用されている。ＶＥＲＯ細胞をＨＡＶ生成に使用するための試みが行われたが、ＶＥＲＯはウイルス増殖の温度制限を有するため、ＶＥＲＯ細胞におけるＨＡＶの複製は制限されることが見出された。加えて、ウイルスは感染させた細胞の上澄み液に決して見出されない（Ｌｏｃａｒｎｉｎｉら， １９８１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：２１６−２２５）。米国特許第４，７８３，４０７号は、ＶＥＲＯ細胞において、ローラーボトル中、温度制限を克服するために３３℃より高くない温度でのＨＡＶの生成を開示する。ＨＡＶ抗原は、培養細胞の凍結融解および細胞内生成ウイルスの放出により得られた。ＶＥＲＯ細胞におけるＨＡＶの増殖に基づく市販のワクチンは、まだ記載されていない。

これまで、ホルマリン不活性化ＨＡＶワクチンは、臨床試験のために生成されてきており（Ａｎｄｒｅら、１９９０、Ｍｅｌｎｉｋ編；Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ ３７：７２−９５、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９３、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８：２０−２６）、そのうちの２つが市販されている。それらは、１次感染からの持続性免疫および防御を誘導する。現在入手可能な不活性化ＨＡＶ全体のウイルスワクチンの製造プロセスは、Ｎｕｎｃ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（ＮＣＦ）において宿主細胞としてヒト胚性肺線維芽細胞株ＭＲＣ−５を使用する。ＨＡＶ抗原は、培養液の上清に効率的に放出されず、大量を濃縮する方法は、高価であるので、ワクチン生成のために使用されるＨＡＶ抗原は、細胞内に生成されたウイルスの細胞破砕物から得られる（Ｂｉｓｈｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．４７：２０３−２１６）。細胞溶解物および細胞培養液の上清からのＨＡＶ大規模調製物は、ビリオンおよびプロビリオンの混合集団を含み（Ｂｉｓｈｏｐら、１９９７、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４２：２１４７−２１６０）、市販されているワクチンは、完全な成熟ビリオンおよび空のプロビリオン粒子を含む（Ａｎｄｒｅ １９９０ 前出、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ １９９３ 前出）。さらに、ＭＲＣ−５細胞は、組織培養液中でゆっくり成長し、ウシ胎仔血清を必要とする。

動物またはヒトの供給源に由来する細胞培養液および／またはタンパク質添加剤における血清の使用から生じる問題（例えば、異なるバッチの変化する質および組成ならびにマイコプラズマ、ウイルスまたはＢＳＥ薬剤による汚染の危険性）は、周知である。一般的に、血清および、アルブミン、トランスフェリンまたはインスリンのような物質由来の血清は、培養液およびそれらに由来する生物学的産物を汚染し得る望まれない薬剤を含み得る。さらに、添加剤由来のヒト血清は、血清によって伝達され得る周知のすべてのウイルス（肝炎またはＨＩＶのような）について試験されなければならない。ウシ血清およびそれら由来の産物（例えば、トリプシン）は、ＢＳＥ汚染の危険性を生じる。さらに、産物由来のすべての血清は、未知の薬剤により汚染され得る。従って、血清または化合物由来の他の血清を必要としない効果的な宿主系および培養条件を提供するために多くの試みがなされた。

その生成プロセスは、培地と同じくらい重要である。経済的に実現可能である唯一のプロセスは、リアクタープロセスである。なぜなら、市場規模のおよび必要とされるワクチン用量に適切であるようにスケールアップがなされ得るからである。接着細胞について、古典的なマイクロキャリアを伴うキャリアプロセスは、現在、ウイルス増殖のために必要な細胞の大規模培養についての最良の選択肢である。マイクロキャリア培養に基づく現在のプロセスは、数千リットルまでの発酵槽の大きさを使用してウイルス抗原の生成を可能にする。

Ｗｉｄｅｌｌら（１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：６３−７１）は、ＨＡＶの大規模生成のためにＦＲｈｋ−４細胞のマイクロキャリア細胞培養系を使用し、細胞内ウイルスおよび細胞外ウイルスを見出した。マイクロキャリア系を使用する細胞１個あたりのウイルス生成は、フラスコ中での従来型の培養増殖に類似した。他方の側面においては、Ｊｕｎｋｅｒら（１９９２、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１７３−１８７）は、従来型のＣｙｔｏｄｅｘマイクロキャリアに結合するＨＡＶ感染ＭＲＣ−５細胞は、ＭＲＣ−５細胞がマイクロキャリアおよび細胞凝集体を形成する傾向があるので、フラスコ内で培養された細胞と比較してたった３０％のＨＡＶ抗原しか得られなかったことを示した。ＷＯ９５／２４４６８は、灌流系におけるＨＡＶ生成について、凝集したガラスコーティングされたマイクロキャリア上で培養されたＭＲＣ５細胞を開示する。ここで、ウイルスのバルクは、細胞内に見出される。記載される系において、２〜１０％の間のより高濃度の血清は、０．５〜２％の低レベルな濃度の血清においてよりもＨＡＶのより高い生成を可能にする。しかし、Ａｕｎｉｎｓら（１９９７、Ｃａｒｒｏｎｄｏら（編）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｐ１７５−１８３）は、異なる製造技術（例えば、Ｎｕｎｃ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（ＮＣＦ）、マイクロキャリア、静的な混合リアクターおよびＣｅｌｌＣｕｂｅｓ）を比較した際、ＷＯ９５／２４４６８に記載されるようなガラスコーティングされたマイクロキャリアが、安定な凝集体の形成およびＨＡＶの生成を可能にすることを見出した。しかし、単分散のマイクロキャリア懸濁液は、培養の継続時間の間、維持され得ない。ガラス凝集マイクロキャリアプロセスの生産力は、同様の条件下の静的培養の約半分であった。Ａｕｎｉｎｓら１９９７（前出）は、使用したＨＡＶ株のマイクロキャリア培養が、実現可能でなかったことを結論付けた。

ＨＡＶワクチンに対する世界中の市場の需要は、１年に１億用量の程度である。効率的なワクチン生成は、宿主系からの高収量で生成される大量のウイルスの増殖を必要とする。ウイルス株が増殖するプロセスおよび培養条件は、その株の受容可能な高収量を達成することに関して非常に重要である。従って、所望のウイルスの収量を最大にするために、システムおよび培養条件の両方は、所望のウイルス生成に対して有益である環境を提供するように特に適応されなければならない。従って、ウイルスおよび抗原を生成するための安全かつ効率的な方法に対する連続的な必要性が存在する。さらに、すでに入手可能な材料を使用して、最小数の時間消費操作を必要とする、ウイルス増殖に対するアプローチについての必要性が存在する。ここで、宿主細胞、培養培地、増殖条件および生成系の組み合わせの選択が、効率的な生成プロセスを達成するために不可欠である。

（発明の要旨）
本発明の目的は、ＨＡＶ抗原の生成方法を提供することである。

本発明の別の目的は、無血清培地または無血清かつ無タンパク質培地におけるＨＡＶの生成のための方法を提供することである。

本発明の別の目的は、細胞培養の二次培養および継代の間に動物由来のプロテアーゼを使用しないＨＡＶの生成のための方法を提供することである。

本発明の別の目的は、完全なＨＡＶ粒子の単離を提供することである。

持続的にＨＡＶ抗原を生成するＨＡＶに感染した無血清か、または無血清かつ無タンパク質ＶＥＲＯ細胞培養物を提供することもまた、本発明の目的である。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
これらの目的および他の目的に従って、本発明は、Ａ型肝炎ウイルスの持続的生成のための方法を提供し、この方法は、マイクロキャリアに結合されたＶＥＲＯ細胞の無血清細胞培養物を提供する工程、ＶＥＲＯ細胞の無血清細胞培養物をＨＡＶに感染させる工程、ＨＡＶに感染した細胞培養物をインキュベートし、ＨＡＶを伝播させる工程を包含し、これにより、ＨＡＶは、細胞培養培地に持続的に放出され；そしてその細胞培養培地に放出されたＨＡＶを回収する。

本発明の方法に従って、マイクロキャリアに結合されたＶＥＲＯ細胞は、約３７℃の温度の条件の無血清培地下で増殖される。これらの細胞は、ＶＥＲＯ細胞の元のアンプルから、無血清培地における大規模の生成のための醗酵槽において使用される大規模のバイオマスまで増殖される。ＨＡＶによる感染より前に、細胞培養温度を、約３４℃まで低下させ、そしてさらなるウイルス伝播が、この温度で実施される。

ＶＥＲＯ細胞は、細胞培養増殖の間に、球状または多孔性のマイクロキャリアに結合され得る。マイクロキャリアは、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチンおよびセルロースならびにＢｕｔｌｅｒ（１９８８．：ＳｐｉｅｒおよびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２８３〜３０３）に記載されるようなものに基づくマイクロキャリアの群から選択されるマイクロキャリアであり得る。細胞培養増殖について、そしてウイルス感染の間、同じ型のマイクロキャリアが、使用され得る。それゆえに、本発明の１つの実施形態に従って、無血清ＶＥＲＯ細胞を培養し、そして球状マイクロキャリア上で感染させる。本発明の別の実施形態に従って、無血清ＶＥＲＯ細胞を培養して、そして多孔性マイクロキャリア上で感染させる。球状マイクロキャリア上でのバイオマスへの細胞の増殖そしてそれらが最終発酵層バイオマスに達する時点かつ多孔性マイクロキャリア上での感染より前に細胞を二次培養することはまた可能であり、その逆もまた可能である。本発明のこの局面に従って、無血清ＶＥＲＯ細胞は、球状マイクロキャリア上で培養され、そして細胞が多孔性マイクロキャリアに結合される場合に、ウイルスに感染する。球状マイクロキャリアは、滑らかな表面（例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ Ｉ（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ＩＩ（登録商標）およびＣｙｔｏｄｅｘ ＩＩＩ（登録商標）（全てＰｈａｒｍａｃｉａ））ならびに多孔性マイクロキャリア（例えば、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（登録商標）（全てＰｈａｒｍａｃｉａ））の群から選択される球状マイクロキャリアである。

マイクロキャリアに結合したＶＥＲＯ細胞は、約０．０１〜約５の多重感染度（ｍ．ｏ．ｉ．）でＨＡＶに感染する。

上記の条件下で、ＨＡＶは、細胞培養培地の上清に持続的に放出されることが見出された。このことは、予期しないものであった。なぜなら、ＨＡＶについての宿主としてＶＥＲＯ細胞を用いる先行技術は、ＨＡＶが、細胞内に見出され得るのみであり、そして生成されたウイルスは、細胞から得られる必要はない（米国特許第４，７８３，４０７号）からである。

本発明の方法は、ＨＡＶの生成を提供し、ここで、ＨＡＶは、細胞培養上清へ持続的に生成および放出される。本発明の方法において、ＨＡＶは少なくとも６０日間生成され得る。先行技術は、このような長い期間にわたってＨＡＶを持続的に生成する細胞培養系を記載していない。マイクロキャリア培養系および細胞培養灌流を用いることによって、ウイルスを含む培地は、細胞培養物から持続的に除去され、そして新鮮な培養培地が加えられ、そして持続的に灌流される。本発明の方法は、細胞培養上清から回収および精製され得るＨＡＶを含む大容量の培養培地を提供する。

最適な細胞培養条件についてのパラメータは、約６．５〜約８．０のｐＨ、約１５％〜約４０％のＯ_２濃度、約２０ｒｐｍ〜約７０ｒｐｍの撹拌速度、ならびに３４℃±０．２℃または３７℃±０．２℃の温度である。細胞培養条件は、好ましくは、ウイルス生成の完全な期間にわたって一定に保たれる。

ウイルスワクチン生成のための一次感染細胞培養物から直接得られるウイルス単離体の使用は、別のウイルスまたは未知の因子による汚染の危険性を有する。ウイルスストックおよび細胞培養物の汚染は、規定されたＨＡＶストック由来のウイルスストックを用いることによって避けられ得る。

ＨＡＶの任意の菌株が、本発明の方法に従って産生され得る。本発明の１つの実施形態に従って、これらの細胞が、全長ＨＡＶ ｃＤＮＡをインビトロで転写されたＨＡＶ ＲＮＡおよび感染性ＶＥＲＯ細胞に用いることによって得られるＨＡＶ接種ウイルスで感染される。接種ウイルスの産生のためのＨＡＶをコードするｃＤＮＡを用いることによって、明確にされた、均質のウイルスストックが得られる。接種ウイルスおよびウイルスストックとして用いられるＨＡＶは、例えば、ＨＡＶ ＨＭ１７５／７であり得る。

細胞培養のために用いられる血清または他のタンパク質添加物に加えて、動物源由来のトリプシンの添加は、未知の薬剤によって細胞培養を汚染する危険を帯びる。普通、動物源からのトリプシンは、細胞バイオマスを得るために、継代および細胞培養の接種の間、用いられる。本発明の方法における、ＨＡＶウイルス産生プロセスの間、未知の薬剤または源由来の任意の汚染を避けるために、微生物源から生じるプロテアーゼが、好ましくは元のアンプルから細胞バイオマスの産生のために用いられる。

本発明の１つの局面に従って、本発明のＨＡＶの産生のために用いられる細胞培養は、元のアンプルから作業細胞バンクに継代培養され、微生物プロテアーゼまたは微生物プロテアーゼのトリプシン様活性により、継代される。

好ましい実施形態に従って、微生物プロテアーゼの精製されたトリプシン様酵素が、用いられる。特に、トリプシン様酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）、プロナーゼの精製されたフラクションが用いられる。精製されたＳＧＴは、好ましくは、ベンズアミジンでアフィニティークロマトグラフィーおよび約０．５〜約１．２Ｍアルギニンを含む溶出剤での精製されたＳＧＴの溶出の方法により、得られる。この方法により精製されたＳＧＴが、非常に効率的であり、その高い特異的な活性に起因して、培地に対して減少したタンパク質容量で用いられ得ることが見出されてきた。当該分野で公知の他の方法によってプロナーゼから精製されたＳＧＴは、同様に本発明の方法において用いられ得る。このような方法としては、Ｙｏｋｏｓａｗａら（１９７６．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：７５７−７６３）によって記載された方法または他のクロマトグラフィー法が挙げられる。

本発明の他の好ましい実施形態に従って、血清およびタンパク質を含まない培養培地が、細胞培養および細胞増殖のために用いられる。規定された源（例えば、血清またはタンパク質の添加なしの最小培養）のみを、細胞バイオマス産生およびウイルス増殖のための増殖添加剤として用いることによって、安全なウイルスワクチン産生プロセスが、提供される。

別の局面に従って、本発明は、完全なＡ型肝炎ウイルス粒子を単離する方法を提供し、この方法は、マイクロキャリアに結合したＶＥＲＯ細胞の無血清細胞培養を提供する工程、ＨＡＶで前記細胞培養を感染する工程、ＨＡＶに感染した細胞培養をインキュベートして、ＨＡＶを増殖させ、これによりＨＡＶは、連続して細胞培養培地中に放出される工程；産生され、細胞培養培地中に解放されたＨＡＶを採取する工程、および細胞培養上清の前記ＨＡＶ採取から完全なＨＡＶ粒子を単離する。

用語「完全ＨＡＶ粒子」は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む成熟した感染性ＨＡＶビリオン粒子、ならびにＶＰ１、ＶＰ３およびＶＰ０ポリペプチド前駆物質を含む未成熟なプロビリオンの、ＲＮＡを含むＨＡＶ粒子を意味する。

完全なＨＡＶ粒子は、当該分野で周知の方法（例えば、濾過、遠心分離、沈降分離またはクロマトグラフィー法）によって単離され得る。遠心分離は、スクロース勾配またはＣｓＣｌ勾配において実施され得る。遠心分離の前に、大きな細胞フラグメントが、例えば、濾過によって、取り除かれ得る。

別の局面に従って、本発明は、マイクロキャリアに結合したＨＡＶに感染した無血清ＶＥＲＯ細胞培養を提供し、ここでキャリアに結合した細胞は、ＨＡＶを連続して産生し、細胞培養培地中に放出する。本発明のＨＡＶに感染した細胞培養は、少なくとも６０日間の間、連続してＨＡＶを放出し得る。

本発明の好ましい局面に従って、ＨＡＶに感染されたマイクロキャリアに結合したＶＥＲＯ細胞培養の血清およびタンパク質を含まない細胞培養が、提供され、ここでキャリアに結合したこれらの細胞は、ＨＡＶ抗原を連続して産生し、細胞培養培地中に解放する。

これまで本発明にほぼ記載されたように、本発明は、ただ例示の目的のために本明細書中で提供され、別に述べない限り、限定することを意図しない以下の実施例の参照によって理解される。

（実施例１：）
（ＶＥＲＯ宿主細胞系におけるＨＡＶ増殖）
臨床的標本によって最初に単離し、初代アフリカミドリザル細胞において連続継代し、ウイルス菌株の弱毒化を導いた、ＨＡＶ菌株ＨＭ１７５／７（Ｒｏｂｅｒｔ Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．の厚意により提供された）を、ＶＥＲＯ細胞マイクロキャリア培養上で増殖について試験する。

ＶＥＲＯ細胞（アフリカ緑ザル、Ｃｅｒｃｏｐｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ、腎臓）を産生細胞株として使用する。細胞を、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８１の名称の下、継代番号１２４で、Ａｍｅｎｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから得た。細胞を、Ｋｉｓｔｎｅｒら（１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ １６：９６０−９６８）またはＷＯ９６／１５２３１に記載のような血清含有培地、無血清培地、または無血清無タンパク質培地中で、増殖するように適合させた。無血清培地中での増殖のために、無機塩、アミノ酸、重炭酸ナトリウム（２ｇ／ｌ）および酵母または大豆抽出物（１〜１０ｇ／ｌ）を補充した、基本ＤＭＥＭ ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地を、使用する。作業細胞バンクを、いかなる動物由来の培地成分を使用することなく調製する。

ＤＭＥＭ培地をＨａｍ’ｓＦ１２栄養素混合物と１：１の比で混合した培地中で培養したＶＥＲＯ細胞の作業細胞バンク（ＷＣＢ）の１つのアンプルを、血清を含む培地あるいは大豆抽出物または酵母抽出物（０．１〜１０％）のいずれかを補充した無血清培地中で、再懸濁した。継代培養を、精製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を使用して実施し、あらゆる病原性原因因子を含み得る動物供給源由来のあらゆる因子を除く。Ｒｏｕｘおよびローラーボトル中で継代培養した後、６〜８×１０^７細胞／ｇマイクロキャリア（Ｃｙｔｏｄｅｘ ＩＩＩ（商標登録）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、１２ｌ攪拌タンク発酵層中に接種する。細胞を、３７℃、６〜８日間、増殖させる。２０％＋／−１０％の酸素飽和、ｐＨ７．１＋／−０．２の培養条件を、一定に保ち、かつ、３０〜６０ｒｐｍの攪拌速度を保つ。６×１０^５〜１×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度で接種した後２日目に、０．１と１．０との間の感染効率（ｍ．ｏ．ｉ．）を有するＨＡＶ ＨＭ１７５／７のウイルス懸濁液を、３４℃または３７℃のいずれかの温度で発酵層にくみ上げる。ウイルスの吸着を可能にする２時間の後、培地の灌流を開始する。発酵層容量の半分の量を、毎日新鮮な培地と交換する。マイクロキャリアーおよび接着細胞を、ふるいによって発酵層中に保持する。発酵工程の間、ｐＨ７．１、Ｏ_２（３０％）、攪拌速度（３０〜６０ｒｐｍ）および３４℃または３７℃の温度を、制御する。

図１Ａは、無血清培地中および血清含有（ＦＣＳ）培地中３４℃における、ＶＥＲＯ細胞にて産生されるＨＡＶを示す。図１Ｂは、無血清培地および血清含有（ＦＣＳ）培地中３７℃で、ＶＥＲＯ細胞にて産生されるＨＡＶを示す。感染後、７、１４、２１および２８日目に、産生される抗原の量を、ＨＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｍｅｄｉａｇｎｏｓｔ）によって細胞培養上清、および細胞ペレットにおいて、決定する。１０^７ＶＥＲＯ細胞あたりの抗原濃度を、細胞培養上清において決定する。ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性反応を与える最も高い抗原希釈物の逆数値として計算する。

ＨＡＶ株ＨＭ１７５／７は、３７℃においてよりも低い温度である３４℃にて良好に、血清の存在下よりも良い無血清下で良好に、ＶＥＲＯ細胞にて複製する（図１Ａおよび図１Ｂ）。３７℃で、血清を含む培地中に、ウイルス抗原の産生は、観察され得ず、ここで、３７℃、無血清培地中で（高いｍ．ｏ．ｉ．で）ウイルスが産生される。０．１または１のｍ．ｏ．ｉ．のＨＡＶによる無血清ＶＥＲＯ細胞の感染の後、増加した量の抗原が、３４℃での感染後３週間目由来の上清および細胞ペレットにおいて検出される（図１Ａ）。血清を含む培地中、３４℃で増殖された細胞培養においてウイルス抗原は、主に細胞ペレットにおいて認められる一方、無血清培地中、３４℃で培養されるＶＥＲＯ細胞で、ウイルス抗原は連続的に細胞培養上清に放出され、ここで、ウイルス抗原の約５０％は、培養培地の上清に認められる。

（実施例２）
（大規模産生のためのＨＡＶウイルスストックの調製）
細菌プラスミドｐＨＡＶ／７（Ｃｏｈｅｎら、１９８７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０５３−３０３９）中でクローン化された弱毒化株ＨＭ１７５／７のゲノムの全長ｃＤＮＡを、インビトロでの転写による全長ゲノムＲＮＡを調製するため使用する。３４℃での無血清ＶＥＲＯ細胞を、インビトロで転写したＨＡＶ ＲＮＡを用いてトランスフェクトし、外来因子を含まないウイルスストックを生成する。６週間後、ＨＡＶ特異的抗原が、無血清条件下でＶＥＲＯ細胞にてＨＡＶをさらに増殖させるように使用する感染細胞の細胞溶解液において検出される。表１は、連続継代後に産生される抗原力価およびウイルス力価を示す。感染細胞は、細胞上清中で、ウイルス抗原の約５０％を放出した。４回の継代後、ウイルスストックは、８×１０^７ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの力価を有する。

連続継代の後得られたウイルスストックＨＭ１７５／７を、マイクロキャリアーシステムにおいて、ＨＡＶ抗原の大規模産生のために使用する。

（実施例３）
（無血清培地中でのＶＥＲＯ細胞におけるＨＡＶ ＨＭ１７５／７の増殖）
実施例２に従って得られるようなＨＡＶ ＨＭ１７５／７を、３４℃で、無血清ＶＥＲＯ細胞中で連続的に継代する。感染後、７、１４および２１日目に、感染力価および抗原の量を決定する（表２）。

５×１０^７細胞につき、５×１０^８および２×１０^９のウイルス力価が、それぞれ細胞のペレットおよび細胞培養の上清において獲得された。このことは、ウイルス抗原は、無血清のＶＥＲＯ細胞によって持続的に細胞培養の上清に放出されることを示す。感染後（ｐ．ｉ．）３週間、細胞培養液の上清中のウイルス抗原の％は、約５０％であり、一方約７５％の感染率がそこに位置する（表２）。

（実施例４）
マイクロキャリア上に増殖する無血清のＶＥＲＯ細胞におけるＨＡＶの精製
無血清の培地において、マイクロキャリア（Ｃｙｔｏｄｅｘ ＩＩＩ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で増殖した、２×１０^１０のＶＥＲＯ細胞を含むＡ６ｌ発酵槽に、０．５のｍ．ｏ．ｉ．で実施例２に従って得られたＨＡＶ株ＨＭ１７５／７を感染させる。３４℃での長い期間の発酵工程の間に、細胞における抗原の量および細胞培養上清中の抗原の量を、繰り返して決定する。細胞内で生成されるＨＡＶを決定することに関して、細胞培養からのＶＥＲＯ細胞を収集し、ＰＢＳ中で２×１０^７の細胞濃度に調節し、そして３サイクルの凍結／解凍によって溶解した。低速の遠心分離の後、細胞残骸および細胞培養の上清における感染力価を、抗原の量に加えて、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。

感染から１１日後、ＨＡＶ抗原の量の前方への増加が、細胞培養上清中に検出された。発酵工程は、継続的に実行し、そしてサンプルは３５日期間にわたって採集した（表３）。この時点で、細胞はなお生存しており、ＨＡＶ抗原を生成する。２３日〜３５日からの上清を蓄積し、そして生成したＨＡＶ抗原の全量を２，５×１０^６ＥＬＩＳＡ単位に計算した。

（実施例５）
大規模でのＨＡＶ生成工程の確立
大規模でのＨＡＶ生成工程を確立することに関して、ＨＡＶの増殖に関した異なる方法を調査した。

コンフルエントになるまでのＶＥＲＯ細胞は、無血清の条件下で増殖させ、そして、ＣｙｔｏｄｅｘＩＩＩ（登録商標）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（登録商標）またはＣｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）のような、異なる型の球状のマイクロキャリアまたは多孔性のマイクロキャリア上に播種し、その全ての型が長期間の培養工程に適している。

異なる型のマイクロキャリア上で、播種して２日後、ＶＥＲＯ細胞を、１．０のＨＡＶ ｍ．ｏ．ｉで感染させる。細胞増殖は、１０ｌ発酵槽中、３４℃で無血清の増殖培地または無血清かつ無タンパク質の増殖培地を連続的に灌流した状態で実行した。培養段階の間、細胞培養上清をＨＡＶ抗原に関して試験する。データは、表４に簡潔にまとめた。

表４のデータは、多孔性のマイクロキャリアに結合する細胞が、少なくとも８３日の長期間にわたって、継続的にＨＡＶ抗原を生成することを示す。滑面マイクロキャリア上に播種した細胞は、最初は、より高いウイルス抗原力価を生成するが、数時間後には、細胞が凝集する傾向が見られた。
（実施例６）
マイクロキャリアに結合する無血清または無血清かつ無タンパク質のＶＥＲＯ細胞の長期の増殖
ＨＡＶウイルスの大規模の生成に関して、無血清または無血清かつ無タンパク質の培養培地条件下で、１×１０^１１のバイオマスまで増殖させたＶＥＲＯ細胞を、多孔性マイクロキャリア上に播種する。細胞を、ＨＡＶと０．１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させる。感染細胞を３４℃で３５０日まで、細胞培養培地を継続的に還流させて実行する。ウイルス抗原が培地中に検出された場合、ウイルス含有上清を収集し、そして４℃で保管する。無血清細胞の培養上清の収集を、感染の３５〜４５日後に開始した。得られたウイルス抗原を、６０日につきリットル培養液につき１００リットルの発酵槽からワクチン用量の平均的な生成について計算し、そして表５に示す。

（実施例７）
細胞培養上清からのＨＡＶ抗原の精製
ＨＡＶ抗原を含む、実施例６において記載したように灌流培養培地から収集した細胞培養上清を、低速の遠心分離またはデプスフィルターにより細胞残骸から分離し、そして５０ＫΩ膜（５０ ０００Ｄａカットオフ、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を使用した限外濾過によって濃縮する。濃縮物を、さらに、２０％〜６０％のスクロース勾配に対する遠心分離によって精製し、分画する。各々の画分は、定性的なＥＬＩＳＡアッセイ（Ｍｅｄｉａｇｎｏｓｔ）によってＨＡＶ抗原に関して試験する。ＨＡＶ抗原は、２つのピーク画分をアセンブリした。このピーク画分は、別々に蓄積し、そして高速の遠心分離によって濃縮する。

上記のプロセスの間、抗原およびタンパク質の含有量を決定する。２つのピークプール画分を、ＨＡＶポリペプチドＶＰ０、ＶＰ１およびＶＰ３ならびにこれらの混合物に特異的な抗体を用いるウェスタンブロット分析により分析する。ピークプール画分１２〜１９は、成熟なビリオンからなる（カプシドタンパク質ＶＰ２が存在し、ＶＰ０が存在しないため）。ピークプール画分２２〜２５は、プロビリオンおよび／またはプレプロビリオンを含む。

このことは、記載されるプロセスによって、大量製造プロセスの間に、血清を含まないかまたは血清もタンパク質も含まない培地で増殖させたＶＥＲＯ細胞を持続的に感染させることによって、ＨＡＶが細胞培養培地中で持続的に放出されることを示す。

個々の画分１２〜１９および２２〜２５を収集し、ウイルス調製物がウイルス不活化法に供され、そしてこの不活化調製物をワクチン組成物中に処方する。

（実施例８：）
（プロナーゼからのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓのトリプシンの精製）
ａ） イオン交換クロマトグラフィー
３０ｇのプロナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を、４０ｍｇ／ｍｌプロナーゼの終濃度となるように、緩衝液Ａ（０．０２ピリジン、ｐＨ５．０）中に溶解した。この溶液の２５ｍｌを、緩衝液Ａで平衡化したＣＭセファロースＣｌ ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカチオン交換クロマトグラフィーに供した。線形勾配を使用して、カラム容積の５倍量の緩衝液Ａ（０．０２Ｍピリジン）および緩衝液Ｂ（０．７５Ｍピリジン（ｐＨ５．０））で、溶出を室温で行った。

収集した画分を、画分のサンプルを１：１０の割合で（例えば、１００μｇタンパク質あたり、１ｍｇのダイズインヒビター）ダイズインヒビターと混合することにより、阻害特性について試験し、その後、Ｓ２２２２を使用してクロマトグラフィー基質アッセイを続けた。結果を１分あたりのΔ吸光度単位（ΔＡ／分）として表した。ダイズインヒビターに対して最も高い阻害活性を有する画分を、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、クマシーで染色した。

基質としてＮ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２、２５℃中、ＢＡＥＥ）を使用し、色素生産性アッセイによりトリプシンの活性を測定し、１分あたりのΔ吸光度単位を決定する。参照コントロールとして、１３×１０^３Ｕ／ｍｇの比活性を有するブタトリプシン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を使用した。この比活性を、１ｍｇタンパク質あたりのトリプシン酵素活性単位として定義した。結果を表１にまとめる。

３−カルボキシメトキシプロピオニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−チロシン−ｐ−ノトロアニリンヒドロクロリド（Ｓ−２５８６、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を用いる色素生産性アッセイにより、キモトリプシン活性を測定した。結果は、１分あたりのΔ吸光度単位（ΔＡ／分）として表した。

（表６：イオン交換クロマトグラフィーによるプロナーゼの精製）

^＊ｎ．ｄ． 決定されず
表６は、ダイズインヒビターを用いる阻害試験によって決定した、トリプシン様活性を有するタンパク質を含む画分が、プロナーゼの比活性よりも約１０倍高い比活性および約７０％の回収率で、イオン交換クロマトグラフィーによって精製され得ることを示す。しかし、このタンパク質は不安定で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一のバンドではなく種々のバンドを示す。このことは、このタンパク質の断片化および自己切断を示す。

ｂ） 固定化ベンズアミジン上のアフィニティークロマトグラフィー
緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０））で平衡化したベンズアミジンセファロース６Ｂ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに４０ｍｌのプロナーゼ溶液（７５ｍｇ／ｍｌ、緩衝液Ａ）をロードした。緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ 塩酸ベンズアミジン（ｐＨ７．０））、緩衝液Ｃ（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．６Ｍ アルギニン（ｐＨ５．５））または緩衝液Ｄ（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ アルギニン（ｐＨ５．５））を用いて溶出を行った。

収集した画分を、実施例８Ａに記載されるように、ダイズインヒビターを使用して阻害特性について、ならびにトリプシン活性およびキモトリプシン活性について試験した。比活性を、１ｍｇタンパク質あたりの酵素活性単位として決定した。

（表７：固定化ベンズアミジンでのアフィニティークロマトグラフィーおよびベンズアミジンでの溶出によるプロナーゼの精製）

表７にまとめられた結果は、ベンズアミジンを用いる競合溶出によって、約１４０Ｕ／μｇタンパク質の比活性でプロナーゼの精製されたトリプシン様活性の６０％が回収されたことを示す。しかし、この精製トリプシン様プロテアーゼを含む画分は、好ましくはさらに精製され、そして細胞培養物増殖またはヒトにおける適用のための生物学的生成物に関するプロセスにおける使用に先立って、ベンズアミジンが除去される。

（表８：固定化ベンズアミジン上のアフィニティークロマトグラフィーならびに０．６Ｍアルギニンおよび１Ｍアルギニンでの溶出によるプロナーゼの精製）

表８の結果から見られ得るように、０．６Ｍアルギニンを含有する緩衝液を使用した場合、プロナーゼの最初のトリプシン様活性の６３％を回収した一方で、１Ｍアルギニンを含有する緩衝液を使用した場合、約７１％を回収した。ベンズアミジンアフィニティーキャリアからアルギニンで溶出された精製ＳＧＴはまた、イオン交換クロマトグラフィーにより得られたＳＧＴまたはベンズアミジンキャリアからベンズアミジンで溶出して得られたＳＧＴと比べ、より高い比活性を有した。さらに、漸増するモル濃度のアルギニンを含有する緩衝液を使用した場合、より高い純度および比活性の生成物を得た。

上記の実施例は、本発明を例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の他の改変は当業者に容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲に包含される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的で本明細書中に参考として援用される。

記載なし。 記載なし。

Claims (11)

1. Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）の連続生成のための方法であって、該方法は、
   （ｉ）球状マイクロキャリアおよび多孔性マイクロキャリアからなる群より選択されるマイクロキャリアに結合したＶＥＲＯ細胞の無血清細胞培養物を提供する工程、
   （ｉｉ）無血清細胞培養培地において該ＶＥＲＯ細胞を増殖させる工程、
   （ｉｉｉ）該マイクロキャリアに結合した該ＶＥＲＯ細胞の無血清細胞培養物にＨＡＶを感染させる工程、
   （ｉｖ）該ＨＡＶに感染した、該マイクロキャリアに結合したＶＥＲＯ細胞の無血清細胞培養物をインキュベートして、該ＨＡＶを増殖させ、それによって、該ＨＡＶが該細胞培養培地中に連続的に放出される、工程、および
   （ｖ）該細胞培養培地から該ＨＡＶを回収する工程、
   を包含し、
   該培養の温度は、ＨＡＶによる感染の前に３４℃まで低下される、方法。
2. 前記細胞が、３７℃の温度で増殖される、請求項１に記載の方法。
3. 前記マイクロキャリアが、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、プラスチックまたはセルロースを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ＶＥＲＯ細胞が、ＨＡＶ株ＨＭ１７５／７の種ウイルスにより感染される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記ＶＥＲＯ細胞が、０．０１〜５．０の感染多重度で前記ＨＡＶにより感染される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記細胞培養物が、作業細胞バンクから継代培養され、そして微生物プロテアーゼもしくは微生物起源のトリプシン様酵素の使用によって継代される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記微生物プロテアーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓのトリプシン様酵素プロナーゼである、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＨＡＶが、少なくとも６０日間にわたって、連続的に生成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. ＶＥＲＯ細胞の前記無血清細胞培養物が、ＶＥＲＯ細胞の無血清かつ無タンパク質の細胞培養物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. （ｖｉ）前記細胞培養培地から回収された前記ＨＡＶから、完全なＨＡＶ粒子を単離する工程
    をさらに包含する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記完全なＨＡＶ粒子が、等密度遠心法によって単離される、請求項１０に記載の方法。

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