KR20100017593A - 바이러스의 증식을 위한 ２-단계 온도 프로파일 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이러스 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은, 바이러스에 의해 감염된 숙주 세포를 제공하고, 감염된 숙주 세포를 2가지 상이한 온도에서 배양하는 것을 포함한다. 이어서, 배양 단계에 의해 생산된 바이러스를 수집한다. 이중 온도 배양 공정을 사용함으로써, 높은 역가 및 개선된 순도를 달성할 수 있다.
바이러스, 숙주 세포, 증식, 배양, 복제물, 역가

Description

바이러스의 증식을 위한 ２-단계 온도 프로파일 {TWO-STEP TEMPERATURE PROFILE FOR THE PROPAGATION OF VIRUSES}
본 출원은, 전문이 본원에 참고로 인용된, 2007년 5월 4일자로 출원된 미국임시특허출원 제60/927,693호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 바이러스 증식 분야에 관한 것이다.
동물 세포 배양액에서 바이러스 증식은, 증식을 위한 숙주 시스템 및 바이러스의 특성에 좌우되는 온도 조건 하에 수행된다. (세포 배양액 또는 배아 난자 생육지 중의) 세포의 성장을 위해 그리고 바이러스의 증식을 위해 특정 온도가 선택된다. 대부분의 경우, 바이러스 증식 온도는 세포 증식 온도보다 낮다. 온도-감수성 바이러스 증식은, 각각의 바이러스/숙주 세포 조합을 위한 특정 최적값으로 곤충류 세포 배양액 (예를 들어, 배쿨로바이러스(Baculovirus) 생산)의 경우 대략 20 ℃ 주변에 집중되는 온도 및 포유동물 세포 배양액 중의 바이러스 생산의 경우 약 37 ℃ 이하의 온도에서의 항원의 형성 및 바이러스 증식 속도에 영향을 미치는 것과 연관된다. 고온일수록 감염 속도 및 바이러스 안정성 둘 모두에 영향을 미친다. 37 ℃의 온도에서 바이러스를 증식시키는 경우, 감소된 바이러스 역가 및 낮 은 품질의 바이러스 항원이 바이러스 복제 후반기 동안 종종 관찰된다. 이러한 효과는 백신 생산을 위한 대규모 바이러스 증식에 악영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 목적은 백신접종을 목적으로 생산되는 항원의 품질에 영향을 미치지 않는 개선된 성장 조건을 제공하는 것이다.
<발명의 개요>
본 발명은, 하나 이상의 숙주 세포를 바이러스로 감염시킨 다음, 제1 온도 (예를 들어, 31 ℃ 내지 37 ℃의 온도에서 1 내지 48시간 동안)에서 배양시킨 후, 제1 온도에 비해 감소된 (예를 들어, 1 ℃ 내지 6 ℃ 만큼) 제2 온도에서 배양시키는, 바이러스 생산 방법을 제공한다. 이어서, 이러한 배양 단계에 의해 생산된 바이러스를 수집한다.
놀랍게도, 인플루엔자 (오르토믹소비리데(Orthomyxoviridae)), 로스 리버 바이러스 (Ross River Virus) (알파비리데(Alphaviridae)) 및 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus) (플라비비리데(Flaviviridae))를 비롯한 다수의 바이러스의 경우, 배양 조건은 2 단계 온도 프로파일을 사용함으로써 실질적으로 개선될 수 있음이 발견되었다. 바이러스 증식의 제1 단계에서 고온을 적용하여, 감염성 바이러스 입자의 형성을 가속화한다. 제2 단계에서, 저온을 적용하여, 고온 증식 기간에 수득된 초기의 높은 역가를 유지하고, 면역원성 백신을 제조하는데 사용될 수 있는 안정한 항원을 형성할 수 있다.
도 1은, (A) 32 ℃ 및 (B) 36 ℃에서 베로(Vero) 세포 중에 증식된 뉴 칼레 도니아(New Caledonia) 바이러스의 항원 밴딩 패턴이다.
도 2는, 감염 후 여러 시점 및 37 ℃에서의 로스 리버 바이러스 감염의 NaBr 플롯이다.
도 3은, 감염 후 여러 시점 및 35 ℃에서의 로스 리버 바이러스 감염의 NaBr 플롯이다.
도 4는, 감염 후 여러 시점 및 32 ℃에서의 로스 리버 바이러스 감염의 NaBr 플롯이다.
도 5는, 감염 후 여러 시점 및 35 ℃/32 ℃에서의 로스 리버 바이러스 감염의 NaBr 플롯이다.
도 6은, 37 ℃ 및 35 ℃/32 ℃에서의 로스 리버 바이러스 접종물(inocculum) 감염의 웨스턴 블롯(western blot)이다.
도 7은, 감염 후 여러 시점 및 35 ℃에서의 웨스트 나일 바이러스 감염의 NaBr 플롯과 현미경 이미지이다.
도 8은, 감염 후 여러 시점 및 32 ℃에서의 웨스트 나일 바이러스 감염의 NaBr 플롯과 현미경 이미지이다.
도 9는, 감염 후 여러 시점 및 35 ℃/32 ℃에서의 웨스트 나일 바이러스 감염의 NaBr 플롯과 현미경 이미지이다.
본 발명의 일 양태는, 본원에 기재된 2 단계 온도 프로파일이, (1) 숙주 세포의 멀티-싸이클 감염을 위한 활성 바이러스의 형성, (2) 복제 후반기에서 수득된 높은 역가의 유지, 및 (3) 생산 공정 후반기에서의 항원 형성의 독립적 제어 및 최적화를 허용한다는 인식이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 바이러스는 오르토믹소바이러스, 알파바이러스 또는 플라비바이러스이다.
바람직하게는, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이고, 특정 실시양태에서 인플루엔자 A 및 B, 로스 리버 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스로 이루어진 군 중에서 선택된다. 본원에 제공된 실시예는 본 발명의 2-단계 온도 방법을 사용하여 상기 바이러스의 개선된 항원 생산을 예시하였으나, 본 발명에서 고려되는 다른 바이러스의 비제한적 예로는 RNA 바이러스 계열, 예컨대 레오비리데(Reoviridae), 피코르나비리데(Picornaviridae), 칼리시비리데(Caliciviridae), 토가비리데(Togaviridae), 아레나비리데(Arenaviridae), 레트로비리데(Retroviridae), 플라비비리데, 오르토믹소비리데, 파라믹소비리데, 분야비리데(Bunyaviridae), 라브도비리데(Rhabdoviridae), 필로비리데(Filoviridae), 코로나비리데(Coronaviridae), 아스트로비리데(Astroviridae) 또는 보르나비리데, 및 DNA 바이러스 계열, 예컨대 아데노비리데(Adenoviridae), 파포바비리데(Papovaviridae), 파르보비리데(Parvoviridae), 헤르페스비리데(Herpesviridae), 폭스비리데(Poxviridae) 또는 헤파드나비리데(Hepadnaviridae)로 이루어진 군 중에서 선택된 바이러스를 들 수 있다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 인플루엔자 A/파나마(Panama)/2007/99, A/뉴 칼레도니아/20/99, B/샹동(Shangdong)/7/97, B/말레이시아(Malaysia)/2506/2004, A/히로시마(Hiroshima)/52/2005 및 A/솔로몬 아일랜즈(Solomon Islands)/3/2006으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
바이러스는 바이러스 생산에 적합한 임의의 세포에서 생산될 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 동물 세포 배양액 또는 세포주의 세포이다. 이러한 세포는 특정 조직 또는 배아 세포로부터 유래할 수 있다. 동물은 바람직하게는 포유동물 또는 조류이다. 본 발명의 여러 실시양태는 개 세포주, 설치류 세포주, 새 세포주 또는 영장류 조직 세포주를 이용할 수 있다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 세포는 MDCK 세포, CHO 세포, 퍼(per)C6 세포, HEK 293 세포, 또는 바이러스 증식에 통상적으로 사용되는 기타 세포일 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 세포는 상피 세포, 특히 신장 상피 세포, 예컨대 아프리카 녹색 원숭이(African green monkey)의 베로 세포이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 세포는, 동물 혈청 단백질을 함유하지 않는 배지에서 배양된다. 상기 배지는, 예를 들어 소 혈청 또는 그의 일부, 예컨대 태아 소 혈청을 포함하지 않는다. 이러한 배지는 "혈청 단백질 무함유 배지"라 지칭된다. 바이러스 증식 기간 동안에, 바이러스 증식에 필요한 프로테아제, 예컨대 트립신을 배지에 첨가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 프로테아제는 비(非)-동물 소스, 예컨대 박테리아 또는 재조합 소스로부터 유도될 수 있거나, 또는 동물 소스로부터 유도될 수 있다. 상기 보충된 배지는 본원에 사용된 용어의 의미 내에서 여전히 혈청 단백질 무함유 배지로 간주된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 산업적 규모로 수행된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 50 리터 초과의 세포 배양액, 50 내지 100 리터의 세포 배양액, 100 내지 500 리터의 세포 배양액, 500 내지 1000 리터의 세포 배양액, 또는 1000 리터 초과의 세포 배양액 (예를 들어, 6000 리터, 10,000 리터, 또는 훨씬 큰 생물반응기)에서 수행된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 교반 탱크 생물반응기에서 수행된다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 제1 바이러스 증식 온도는 소정의 숙주 세포 유형의 세포 배양액 증식 온도 미만이다. 일부 실시양태에서, 제1 온도는 32 ℃ 내지 37 ℃, 바람직하게는 33 ℃ 내지 36 ℃, 보다 바람직하게는 34 ℃ 내지 35.5 ℃, 특히 35 ℃이다. 다른 실시양태에서, 제1 온도는 30 ℃ 내지 36 ℃, 바람직하게는 30 ℃ 내지 35 ℃, 보다 바람직하게는 31 ℃ 내지 35 ℃, 보다 바람직하게는 31 ℃ 내지 34 ℃, 보다 바람직하게는 32 ℃ 내지 34 ℃, 보다 바람직하게는 32 ℃ 내지 33.5 ℃, 보다 더 바람직하게는 33 ℃ 내지 34 ℃, 가장 바람직하게는 33.5 ℃, 또는 일부 실시양태에서 33 ℃이다. 특히, 보다 큰 세포 배양액 부피 (1000 리터 이상)의 경우, 보다 낮은 제1 온도 범위가 바람직할 수 있다. 제1 온도는 30 ℃, 31 ℃, 32 ℃, 33 ℃, 34 ℃, 35 ℃ 또는 36 ℃ 이상, 또는 38 ℃, 37.5 ℃, 37 ℃, 36 ℃, 35.5 ℃ 또는 35 ℃ 미만일 수 있다. 제1 온도에서의 세포 배양은 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 또는 30시간 초과, 또는 60, 58, 56, 54, 52, 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14 또는 12시간 미만 동안 수행될 수 있다.
추가 실시양태에서, 제2 온도는 제1 온도에 비해 1.5 ℃ 내지 5 ℃ 만큼, 바람직하게는 2 ℃ 내지 4 ℃ 만큼, 보다 바람직하게는 2.5 ℃ 내지 3.5 ℃ 만큼, 가장 바람직하게는 3 ℃ 만큼 감소된다. 1 ℃, 2 ℃, 2.5 ℃, 3 ℃ 또는 4 ℃ 이상 만큼, 또는 6 ℃, 5 ℃, 4 ℃, 3.5 ℃, 3 ℃, 2.5 ℃ 또는 2 ℃ 미만 만큼 감소될 수 있다.
다른 실시양태에서, 제2 온도는 29 ℃ 내지 35 ℃, 바람직하게는 30 ℃ 내지 34 ℃, 보다 바람직하게는 31 ℃ 내지 33 ℃, 보다 바람직하게는 31.5 ℃ 내지 32.5 ℃ 범위이며, 가장 바람직하게는 32 ℃이다. 제2 온도는 28 ℃, 29 ℃, 30 ℃ 또는 31 ℃ 초과, 또는 35 ℃, 34 ℃, 33 ℃ 또는 32 ℃ 미만일 수 있다.
또한, 상기 방법은 바이러스 항원 생산에 사용될 수도 있다. 따라서, 추가 양태에서, 본 발명은, 바이러스를 본원에 기재된 바와 같이 생산하고, 바이러스 또는 바이러스 항원을 단리하는, 바이러스 또는 바이러스 항원의 생산 방법을 제공한다. 단리는, 세포를 분해하거나 또는 세포 상등액을 수거한 다음 항원을 단리 (예를 들어, 원심분리 또는 크로마토그래피)함으로써 단리 및 임의로 정제하는 표준 절차를 사용하여 수행될 수 있다.
추가 실시양태에서, 바이러스는 정제 전 또는 후에 단편화 또는 불활성화된다 (예를 들어, WO 05/11800호에 제시된 방법에 따름). 추가로, 바이러스 백신을 제조할 수 있다. 백신은, 비(非)-감염성 바이러스, 그의 외피(hull), 입자 또는 그의 항원일 수 있는 항원성 물질의 면역원성 조성물이다. 백신이 투여되는 경우, 숙주 (예를 들어, 인간과 같은 포유동물 또는 조류)의 면역화가 초래된다. 백신접종은 백신에 대한 특정 반응 및 일부 경미한 염증을 야기할 수 있으나, 일반적으로 백신접종에 대한 반응은, 완전히 생존가능한 바이러스에 의해 야기된 감염에 대한 반응에 비해 상당히 감소된다.
본 발명을, 단지 예시적이며 어떠한 식으로든 본 발명을 제한하도록 의도되지 않은 하기 실시예에 의해 추가로 예시한다.
다수의 바이러스 막 단백질은 복제-적격 바이러스를 생산하기 위해 번역후 변형을 필요로 한다. 인플루엔자 바이러스에서, 전구 적혈구응집소 (HA) 분자 (HAO)의 HAl 및 HA2 서브유닛으로의 단백질분해성 절단 (HA2의 아미노 말단 영역에 융합성(fusogenic) 도메인을 생성함)은, 바이러스가 세포 내로 진입하는데 필수적이다. 따라서, 세포 배양액에서 감염 싸이클의 개시는 프로테아제의 첨가에 의해 촉매화되어야 한다. 백신 제조 공정을 위해, 돼지 기원의 감마선 조사된 트립신을 사용하였다.
세포 배양액, 예컨대 베로 세포 중의 인플루엔자 성장을 위한 통상적인 온도 프로파일은, 온도가 예를 들어 33 ℃ (B-균주의 경우) 내지 37 ℃ (A-균주의 경우)로 일정한 프로파일이다 (예를 들어, 문헌 [Govorkava EA et al. Journal of Virology, Vol. 70, Nr. 8, Aug. 1996, p. 5519-5524] 참조). 본 발명의 양태는, 10 L 생물반응기 시스템에서의 소규모 실험을 통해, 초기 감염단계 동안의 승온 프로파일이 인플루엔자 생산 공정의 전체 싸이클 시간에 긍정적인 효과를 미칠 수 있다는 것의 인식이다. 또한, 베로 단백질/SRD 비율로 측정한 항원 순도에 미치는 긍적적인 효과를 달성할 수 있었다. 이러한 개념을 입증하기 위해, 본원에 기재된 바와 같이, 100 L 규모의 실험을 수행하였다.
실시예 1: 32 및 36 ℃에서의 인플루엔자 A/뉴 칼레도니아/20/99 생산
32 ℃ 및 36 ℃에서 생물반응기 실험의 베로 배양액을 A/뉴 칼레도니아/20/99 바이러스로 감염시켰다. pH, pO2, 세포 밀도, 및 배양액에 첨가된 트립신 양의 설정 파라미터들은 유사하였고, 인플루엔자 항원의 제조를 위한 대규모 조건을 반영하였다. 증가된 온도가 바이러스 수율 및 싸이클 시간에 미치는 영향을 표 1에 비교하였다.
<표 1>: 감염성 싸이클의 0일째와 비교한 잔여 산소 흡수율 ("잔여 OUR")과 HA의 비교*)
온도 HA 2일 (2n HAU/50 ㎕) HA 3일 (2n HAU/50 ㎕) 잔여 OUR (%)* 2일 잔여 OUR (%)* 3일
32 ℃ 6 8 80 50
36 ℃ 7 8 20 <5
2일 후, 36 ℃ 배양액의 경우 20%의 잔여 산소 흡수율이 관찰되었고, 이는 3일째에 5% 미만으로 떨어졌다. 36 ℃에서의 인플루엔자 바이러스의 증식은 32 ℃ 조건에 비해 높은 감염력 및 이에 따른 총 배양 시간의 감소를 초래하였다. 그와 반대로, 32 ℃ 배양은 2일째 및 3일째에 각각 80% 및 50%의 보다 높은 잔여 OUR을 초래하였다. 최종 HA 역가는 유사하였다. 그러나, NaBr 구배를 사용한 초원심분리에 의한 항원 분리 실험으로부터, 밴딩 패턴의 항원성 시프트가 배양 3일 째 36 ℃ 조건 하에 발생한 반면 (도 1B), UV 254 nm 검출기에 의해 측정된 용리 프로파일은 32 ℃ 배양액의 경우 필적할만큼 높지만 보다 대칭적인 피크를 초래하였다 (도 1A). 따라서, 생성물 수율 및 특히 순도의 측면에서, 36 ℃ 조건은 몇가지 단 점을 가질 수 있다.
통용되고 있는 생산 공정의 경우, 바이러스 항원은 수크로스 구배로부터 수거된다. 따라서, 36 ℃ 실험의 경우, 항원의 일부가 저밀도 분획으로 이동된다고 결론지을 수 있다 (도 1B).
실시예 2: 32, 33 및 34 ℃에서의 인플루엔자 A/파나마/2007/99 생산
증가된 배양 온도가 파나마 바이러스 수율 및 싸이클 시간에 미치는 영향을 조사하기 위해, 3개의 10 L 생물반응기 시스템을 각각 온도를 32 ℃, 33 ℃ 및 34 ℃로 설정하여 병렬로 작동시켰다. 모든 다른 파라미터 설정 점들은 실시예 1에 기재된 실험과 유사하였다.
표 2에, 상기 3개의 생물반응기 시스템의 공정 싸이클 시간을 제시하였다. 20%의 잔여 산소 흡수율 (대사성 산소 소비에서 80% 감소)에 도달한 후 배양을 종결하고, 감염성 싸이클의 속도를 비교하였다. 34 ℃ 실험의 경우, 싸이클 시간을 21시간 감소시킬 수 있었다.
<표 2>: 공정 온도에 따른 (감염성 싸이클의 0일째에 비해) 20%의 잔여 OUR에 도달하는데 필요한 공정 시간의 비교
온도 20% 잔여 OUR에 도달하기 위한 공정 시간 (시간)
32 ℃ 90
33 ℃ 79
34 ℃ 69
배양액 상등액을 원심분리하고, 벤조나제(Benzonase) 및 포르말린으로 표준 프로토콜에 따라 처리하였다. 불활성화된 수거물 (MVH)을 수크로스 구배 초원심분리에 의해 정제하였다 (표 3 참조).
<표 3>: 온도 실험으로부터의 수크로스-구배-정제 바이러스로부터 수득된 베로-단백질 불순물, 인플루엔자 A/파나마/2007/99 항원 수율 및 SRD/단백질 비율의 비교
생산 조건 수율 (mg SRD) SRD/단백질 비율 (mg/mg) 베로-단백질/SRD 비율 (mg/mg)
32 ℃ 13.8 0.79 0.25
33 ℃ 12.2 0.70 0.38
34 ℃ 12.4 0.67 0.45
표 2로부터, 승온 조건은 싸이클 시간의 감소를 초래한다고 결론지을 수 있다. 그러나, 표 3에 나타난 바와 같이, 승온 조건 (예를 들어, 33 ℃ 및 34 ℃)은 SRD/단백질 비욜 및 베로-단백질/SRD 비율 둘 모두에 의해 입증되는 바와 같이 전체 바이러스 항원 수율 및 정제 바이러스의 품질에 부정적인 영향을 미쳤다. 따라서, 보다 높은 온도에서 감소된 바이러스 항원 순도가 관찰되었다.
실시예 3: 35 ℃에서 초반 바이러스 증폭에 의한 인플루엔자 A/뉴 칼레도니아/20/99 생산
본 실시예는 인플루엔자 바이러스 생산 공정의 처음 24시간 동안 온도를 증가시키는 배양액 실험에 관한 것이다. 베로 세포 배양액을 100 리터 규모로 A/뉴 칼레도니아/20/99 바이러스로 감염시켰다.
통상의 온도 프로파일 (즉, 발효 공정 전반에 걸쳐 온도를 32 ℃로 설정함)과 35 ℃에서 초반 바이러스 증폭으로 변형된 공정을 비교하였다. 상기 새로운 공정은, 후감염 (p.i.) 24시간 동안 35 ℃에서의 초기 바이러스 복제에 이어 p.i. 91시간 까지 32 ℃에서 인큐베이션하는 것을 특징으로 한다. 표 4에, 100 리터 규모의 실험으로부터의 수크로스 구배 정제 바이러스의 베로-단백질 불순물과 인플루엔 자 A/뉴 칼레도니아/20/99 항원 순도 (SRD/단백질 비율)를 비교하였다.
<표 4>: 여러 온도 프로파일에 따른 베로-단백질 불순물과 인플루엔자 A/뉴 칼레도니아/20/99 항원 순도 (SRD/단백질 비율)의 비교 (바이러스는 수크로스 구배를 사용하여 온도 실험으로터 정제되었음)
생산 조건 수율 (mg SRD/L 수거물) SRD/단백질 비율 (mg/mg) 베로-단백질/SRD 비율 (mg/mg)
p.i. 95시간까지 32 ℃ 1.4 0.24 0.59
p.i. 24시간까지 35 ℃/ p.i. 91시간까지 32 ℃ 1.3 0.32 0.29
상기 데이타는 발효 공정의 처음 24시간 동안 온도를 35 ℃로 설정하는 것은 SRD/단백질 비율 뿐만 아니라 베로-단백질 불순물에 긍정적인 영향을 미침을 입증한다. 유사한 감염 시간으로, 현저히 개선된 불순물 프로파일로 필적하는 수율이 달성될 수 있었다.
실시예 4: 35 ℃에서 초반 바이러스 증폭에 의한 인플루엔자 A/파나마/2007/99 생산
2-단계 온도 공정에 대해 실시예 3에서 관찰된 거동을 확인하기 위해, 동일한 온도 프로파일을 100 리터 베로 배양액 중에서 인플루엔자 A/파나마/2007/99 바이러스를 증식시키는데 사용하였다. 모든 다른 조건 및 파라미터 설정은 실시예 3에 따른다.
표 5에, 100 리터 규모의 실험으로부터, 수크로스 구배 정제 바이러스의 베로-단백질 불순물과 인플루엔자 A/파나마/2007/99 항원 순도 (SRD/단백질 비율)를 비교하였다.
<표 5>: 인플루엔자 A/파나마/2007/99 항원 순도 (SRD/단백질 비율)와 베로- 단백질 불순물의 비교 (바이러스는 수크로스 구배를 사용하여 온도 실험으로터 정제되었음)
생산 조건 수율 (mg SRD/L 수거물) SRD/단백질 비율 (mg/mg) 베로-단백질/SRD 비율 (mg/mg)
p.i. 88시간까지 32 ℃ 2.3 0.31 0.84
p.i. 24시간까지 35 ℃/ p.i. 67시간까지 32 ℃ 1.9 0.45 0.11
바이러스 복제의 처음 24시간 동안 35 ℃에서 A/파나마/2007/99 바이러스를 생산한 후, 온도를 32 ℃로 감소시키는 것은, 통용되고 있는 32 ℃의 일정한 온도에서의 처리에 비해 몇가지 이점을 갖는다. 일반적으로, 인플루엔자 바이러스 항원의 품질은 SRD/단백질 및 베로-단백질/SRD 비율에 의해 입증되는 바와 같이 개선될 수 있다. 현저히 감소된 감염 시간으로, 수율은 약간 감소되었지만, 특히 베로 세포 단백질의 상대적 양의 경우에 불순물 프로파일은 현저히 우수하였다.
인플루엔자 바이러스 항원 순도는 인플루엔자 백신 제조의 한 요소이다. 일반적으로 베로 세포에서의 인플루엔자 바이러스의 복제의 경우, 전구 적혈구응집소 절단을 위한 단백질분해성 조건 및 적절한 온도 조건은 중요한 요소라고 인정된다. 본원에 제시된 예시적 실험에서, 바이러스 복제 조기 단계 동안 승온을 갖는 온도 프로파일은 수크로스 구배 단계에서 개선된 항원을 초래함이 입증되었다. 또한, 처음 24시간 동안 35 ℃에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는 것은 싸이클 시간에 대해 보다 우수한 공정 성능에 해당하였다. 인플루엔자 A/파나마/2007/99 및 A/뉴 칼레도니아/20/99를 모델 시스템으로 사용하여 2-단계 온도 바이러스 증식의 유용성을 입증하였다. 따라서, 10 및 100 리터 규모로 수행된 배양액 실험의 결과는 바이러스 증식 공정의 처음 약 24시간 동안 32 ℃에서 35 ℃로 변화시키는 것의 이점을 나타낸다.
실시예 5: p.i. 18시간 및 p.i. 36시간 동안 35 ℃에서 초반 바이러스 증폭에 이어 바이러스 증식 말엽까지 32 ℃로 인플루엔자 A/히로시마/52/2005 생산
본 실시예는, 고온 싸이클의 기간의 변화가 인플루엔자 A/히로시마/52/2005 바이러스로 감염된 50 L 베로 배양액의 베로 단백질/SRD 비율, 항원 수율 및 SRD/단백질 비율에 미치는 영향을 보여준다. 2개의 별개의 샘플에 대해 각각 p.i. 18시간 및 p.i. 36시간 동안 35 ℃의 온도를 유지한 후, 온도를 32 ℃로 감소시켰다. 바이러스-함유 상등액을 수거하고, 불활성화시키고, 초원심분리에 의해 정제하였다.
표 6에, 50 리터 규모의 실험으로부터의 수크로스 구배 정제 바이러스의 베로-단백질 불순물 및 인플루엔자 A/히로시마/52/2005 항원 순도 (SRD/단백질 비율)를 비교하였다.
<표 6>: 인플루엔자 A/히로시마/52/2005 항원 수율, 순도 (SRD/단백질 비율) 및 베로-단백질 불순물의 비교 (바이러스는 수크로스 구배를 사용하여 온도 실험으로터 정제되었음)
생산 조건 수율 (mg SRD/L 수거물) SRD/단백질 비율 (mg/mg) 베로-단백질/SRD 비율 (mg/mg)
p.i. 18시간 동안 35 ℃/ 말엽 (p.i. 58시간)까지 32 ℃ 3.7 1.16 0.02
p.i. 36시간 동안 35 ℃/ 말엽 (p.i. 58시간)까지 32 ℃ 4.8 1.12 0.02
각각 p.i. 18시간 및 36시간 동안 35 ℃에서 인플루엔자 A/히로시마/52/2005 바이러스를 생산하는 것은 필적하는 수율 및 순도 프로파일을 초래하였다 (표 6). 이러한 결과로부터, 이중 온도 프로파일에서 초반 바이러스 증식 동안의 증가된 온도의 기간 및 수거때까지의 감온의 기간은 광범위하게 변할 수 있다고 결론지을 수 있다.
실시예 6: 여러 온도 (34 ℃, 35 ℃ 및 36 ℃)로 p.i. 18시간 동안 초반 바이러스 증폭에 이어 바이러스 증식 말엽까지 3 ℃씩 감소 (31 ℃, 32 ℃ 및 33 ℃ 까지)로 인플루엔자 B/말레이시아/2506/2004 생산
본 실시예는, 인플루엔자 B/말레이시아/2506/2004 바이러스로 감염된 32 리터 내지 80 리터의 베로 배양액에서의 바이러스 증식 동안 여러 이중 온도 프로파일을 사용하는 것에 관한 것이다. 34 ℃, 35 ℃ 및 36 ℃의 고온을 p.i. 18시간 동안 유지한 후, 각각 3 ℃ 만큼, 31 ℃, 32 ℃ 및 33 ℃로 감소시켰다. 바이러스 함유 상등액을 수거하고, 불활성화시키고, 초원심분리로 정제하였다.
표 7에, 32 리터에서 80 리터 규모의 실험까지 수크로스 구배 정제 바이러스의 베로-단백질 불순물, 인플루엔자 B/말레이시아/2506/2004 항원 수율 및 순도 (SRD/단백질 비율)를 여러 온도 프로파일에 대해 비교하였다.
<표 7>: 인플루엔자 B/말레이시아/2506/2004 항원 수율, 순도 (SRD/단백질 비율) 및 베로-단백질 불순물의 비교 (바이러스는 수크로스 구배를 사용하여 온도 실험으로터 정제되었음)
생산 조건 수율 (mg SRD/L 수거물) SRD/단백질 비율 (mg/mg) 베로-단백질/SRD 비율 (mg/mg)
p.i. 18시간 동안 35 ℃/ 말엽 (p.i. 69시간)까지 33 ℃ (32 L 생물반응기) 7.3 0.31 0.06
p.i. 18시간 동안 35 ℃/ 말엽 (p.i. 70시간)까지 32 ℃ (80 L 생물반응기) 8.0 0.39 0.05
p.i. 18시간 동안 34 ℃/ 말엽 (p.i. 70시간)까지 31 ℃ (32 L 생물반응기) 7.3 0.36 0.04
p.i. 18시간 동안 34 ℃ 내지 36 ℃에서 인플루엔자 B/말레이시아/2506/2004 바이러스를 생산한 후, 바이러스 증식 말엽까지 3 ℃ 만큼 감소시키면 필적하는 수율 및 순도 프로파일이 초래되었다 (표 7). 이러한 결과로부터, 이중 온도 프로파일에서 초반 바이러스 증식 동안의 승온 범위 및 수거 때까지의 감온 범위는 광범위하게 변할 수 있다고 결론지을 수 있다.
실시예 7: 여러 온도 (33.5 ℃, 35 ℃ 및 36.5 ℃)로 p.i. 18시간 동안 초반 바이러스 증폭에 이어 바이러스 증식 말엽까지 3 ℃ 만큼 감소 (30.5 ℃, 32 ℃ 및 33.5 ℃ 까지)로 인플루엔자 A/솔로몬 아일랜드/3/2006 생산
본 실시예는, 인플루엔자 A/솔로몬 아일랜드/3/2006 바이러스로 감염된 32 리터 내지 50 리터의 베로 배양액에서의 바이러스 증식 동안 여러 온도 프로파일을 사용하는 것에 관한 것이다. 33.5 ℃, 35 ℃ 및 36.5 ℃의 고온을 p.i. 18시간 동안 유지한 후, 각각 3 ℃ 만큼, 30.5 ℃, 32 ℃ 및 33.5 ℃로 감소시켰다. 바이러스 함유 상등액을 수거하고, 불활성화시키고, 초원심분리로 정제하였다.
표 8에, 32 리터에서 50 리터까지의 규모의 실험으로부터 수크로스 구배 정 제 바이러스의 베로-단백질 불순물, 인플루엔자 A/솔로몬 아일랜드/3/2006 항원 수율 및 순도 (SRD/단백질 비율)를 비교하였다.
<표 8>: 인플루엔자 A/솔로몬 아일랜드/3/2006 항원 수율, 순도 (SRD/단백질 비율) 및 베로-단백질 불순물의 비교 (바이러스는 수크로스 구배를 사용하여 온도 실험으로터 정제되었음)
생산 조건 수율 (mg SRD/L 수거물) SRD/단백질 비율 (mg/mg) 베로-단백질/SRD 비율 (mg/mg)
p.i. 18시간 동안 36.5℃/ 말엽 (p.i. 54시간)까지 33.5 ℃ (32 L 생물반응기) 4.0 0.53 0.05
p.i. 18시간 동안 35 ℃/ 말엽 (p.i. 55시간)까지 32 ℃ (50 L 생물반응기) 3.2 0.72 0.03
p.i. 18시간 동안 33.5℃/ 말엽 (p.i. 69시간)까지 30.5 ℃ (50 L 생물반응기) 3.0 0.74 0.02
p.i. 18시간 동안 33.5 ℃, 35 ℃ 및 36.5 ℃에서 인플루엔자 A/솔로몬 아일랜드/3/2006 바이러스를 생산한 후, 바이러스 증식 말엽까지 각각 3 ℃ 만큼 감소로 필적하는 수율 및 순도 프로파일을 초래하였다 (표 8). 또한, 승온에서의 보다 높은 수율은 순도 감소를 초래하였으나, 이들 불순물은 바이러스 증식 말엽의 3 ℃ 감소로 비교적 낮은 수준으로 잔류하였다. 감온을 갖는 이중 온도 프로파일 (예를 들어 33.5 ℃/30.5 ℃)로 필적하는 수율이 달성될 수 있었지만, 이러한 필적하는 수율에 도달하기 위해 더 긴 (여전히 70시간 미만임) 바이러스 증식 싸이클 시간이 필요하였다. 특히 숙주 세포 특이적 베로-단백질에 대한 순도 프로파일은 전형적으로 3 ℃ 온도 이동을 비롯한 보다 낮은 온도 범위로 개선되었다 (또한, 34 ℃/31 ℃에서 B/말레이시아를 사용한 표 7 참조). 상기 결과로부터, 인플루엔자 A 및 B 균주 둘 모두에 대해, 이중 온도 프로파일에서 초반 바이러스 증식 동안의 승온 범위 및 수거 때까지의 감온 범위는 광범위하게 변할 수 있다고 결론지을 수 있다.
실시예 8: 로스 리버 바이러스 생산
로스 리버 바이러스 ("RRV")를 2 L 반응기 내에서 여러 온도에서 생산하였다. 조사한 온도는 30시간 동안 37 ℃, 35 ℃, 32 ℃ 및 35 ℃였고, p.i. 90시간 후 감염 말엽까지 30시간 동안 32 ℃였다. 속도 파라미터를 결정하고, 샘플을 I-18, I-42, I-42, I-54, I-66, I-76 및 I-90 시간 간격 (시간)으로 수집하였다. NaBr 분석용 샘플을 20 ㎕/mL 포르말린 (1.85%)으로 처리하고, 37 ℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 바이러스 증식 동안의 잔여 산소 흡수율 (OUR)을 측정하여, 감염된 세포의 대사 활성을 모니터링하였다. 세포 박리 속도를 마이크로캐리어(microcarrier) 배양액의 현미경 이미지에 의해 정량화하였다. 또한, TCID50 (50% 조직 배양액 감염 용량)을 결정하였다.
조건은 감염 전 1.0 g/L 글루코스, pH 7.1 PBS 및 20% pO2였다. I-18에서, 1.0 g/L 글루코스를 첨가하고, 관류를 중단하였다. I-42 후, 글루코스가 1.0 g/L 미만으로 저하될 경우 글루코스를 첨가하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다.
원심분리 조건: I-18: 500O g
I-42 - I-66: lOOOO g
I-78 - I-90: 15000 g
<표 9>
Figure 112009074614139-PCT00001
Figure 112009074614139-PCT00002
모든 4가지 인큐베이션의 NaBr 플롯을 4개의 간격 (A: 54h, B: 66h, C: 78h, D: 9Oh)으로 도 2 내지 5에 제시하였다.
다음의 항체로 웨스턴 블롯을 수행하였다: (I) RR (ATCCVR373), 과다면역 복수 유체(Hyperimmune Ascites Fluid), 마우스; N.I.H. (1:1000), 및 (2) 항(anti)-마우스 IgG, 시그마(Sigma), Cat#: A-4656, Lot#: 63H8830 (1:5000). 그 결과를 표 10에 따라 도 6에 제시하였다.
<표 10>
Figure 112009074614139-PCT00003
고온 접종물 (37 ℃ 및 35 ℃) 둘 모두에서, 42시간 후 100% 세포 박리율 및 53시간 후 약 50% 잔여 O2와 함께 감염 속도가 상당히 증가하였다. 보다 저온 (32 ℃ 및 35 ℃/32 ℃)을 사용한 접근법은 비교적 더 느렸다. 이는 I-18에서의 역가 분석에서도 명백하였다. 그러나, I-42 후, 모든 접근법은 약 1E09 TCID50/mL에 도달하였다. 보다 저온을 사용한 접근법은 감염 말엽 근처에서 보다 안정한 역가 (I-76까지 >1EO9 TCID50/mL)를 나타내었다. I-76까지 두 접근법 모두에서, 20%의 잔여 OUR을 측정할 수 있었다. I-53 이후 모든 실험에서, NaBr-구배로 최대 피크 높이가 달성된 반면, 모든 I-66 샘플 뿐만 아니라 I-90의 경우 35 ℃ 접종물에서 보다 낮은 피크가 측정되었다. 승온으로 인해, 글루코스 수준은 37 ℃ 및 35 ℃ 실험 동안 빠르게 떨어졌다. 증가된 감염 속도로 인해, 나중에 대사 활성을 결정할 수 없었다. 모든 실험에서, 글루코스 수준은 말엽에 비슷하였다.
처음의 빠른 바이러스 증식 및 감염 말엽까지의 안정한 역가는 오로지 2 단계 온도 실험 (I-30 까지 35 ℃, 이후 32 ℃)에서만 달성되었다. 이러한 조건 하에, I-78까지 안정한 가장 높은 피크를 NaBr 구배 실험으로 측정하였다. 또한, 웨스턴 블롯에서, 35 ℃/32 ℃ 실험에서 보다 안정한 밴드가 검출되었다.
실시예 9: 웨스트 나일 바이러스 실험
웨스트 나일 바이러스를 여러 온도에서 2 L 반응기에서 생산하였다. 조사한 온도는 30시간 동안 35 ℃, 32 ℃ 및 35 ℃였고, 30시간 후 감염 말엽까지 32 ℃였다. 속도 파라미터를 9O시간 동안 수집하였다. 샘플을 I-18, I-30, I-42, I-42, I-52, I-66, I-74 및 I-90 시간 간격 (시간)으로 수집하였다. NaBr 분석용 샘플을 20 ㎕/mL 포르말린 (1.85%)으로 처리하고, 37 ℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 조건은 감염 전 1.0 g/L 글루코스, pH 7.1 및 20% pO2였다. I-18에서, 1.0 g/L 글루코스를 첨가하고, 관류를 중단하였다. 그 결과를 표 11에 제시하였고, 도 7 내지 9는 NaBr 플롯 및 현미경 이미지를 나타낸다. 세포 박리 속도를 마이크로캐리어 배양액의 현미경 이미지에 의해 정량화하였다.
<표 11>
Figure 112009074614139-PCT00004
Figure 112009074614139-PCT00005

Claims (24)

  1. 바이러스에 의해 감염된 숙주 세포를 제공하는 단계,
    감염된 숙주 세포를 31 ℃ 내지 37 ℃ 범위의 제1 온도에서 1 내지 48시간 동안 배양시키는 단계,
    감염된 숙주 세포를 후속적으로 상기 제1 온도보다 1 ℃ 내지 6 ℃ 낮은 제2 온도에서 배양시키는 단계, 및
    배양 단계에 의해 생성된 바이러스 복제물을 수집하는 단계
    를 포함하는, 바이러스 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스가 오르토믹소바이러스, 알파바이러스 또는 플라비바이러스인 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자 바이러스인 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자 A 및 B 중에서 선택된 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 바이러스가 로스 리버 바이러스(Ross River Virus)인 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 바이러스가 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus)인 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포가 동물 세포 배양액 또는 세포주의 숙주 세포인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상피 세포인 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 숙주 세포가 신장 상피 세포인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 숙주 세포가 베로(Vero) 세포인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제1 온도가 32 ℃ 내지 37 ℃ 범위인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 온도가 33 ℃ 내지 36 ℃ 범위인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제1 온도가 34 ℃ 내지 35.5 ℃ 범위인 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 제2 온도가 상기 제1 온도에 비해 1.5 ℃ 내지 5 ℃ 감소된 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제2 온도가 상기 제1 온도에 비해 2 ℃ 내지 4 ℃ 감소된 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 제2 온도가 29 ℃ 내지 35 ℃ 범위인 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제2 온도가 30 ℃ 내지 34 ℃ 범위인 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2 온도가 31 ℃ 내지 33 ℃ 범위인 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포를 접종 직후 배양하는 방법.
  20. 제1항에 따라 생성된 바이러스로부터 바이러스 또는 바이러스 항원을 수득하고, 생성된 바이러스 또는 바이러스 항원을 단리시키는, 바이러스 또는 바이러스 항원의 생산 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 바이러스를 단편화시키는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 바이러스를 불활성화시키는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 바이러스의 백신을 제조하는 단계를 더 포함하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 제1 온도에서의 배양을 2시간 이상 동안 지속하는 방법.
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