JP2010525799A - ウイルスの増殖のための二段階温度プロフィール - Google Patents
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Abstract
Description
32℃および36℃でのInfluenza A/New Caledonia/20/99産生
32℃および36℃でのバイオリアクター運転のベロ培養を、A/New Caledonia/20/99ウィルスで感染させた。pH、pO2、細胞密度および培養に加えられるトリプシン量の設定パラメータは同等であり、インフルエンザ抗原の製造のためのラージスケール条件を反映した。ウィルス収量およびサイクル時間に対する温度上昇の効果が、表1において比較される。
32℃、33℃、および34℃でのInfluenza A/Panama/2007/99産生
パナマウィルス収量およびサイクル時間に対する培養温度上昇の効果を調査するために、三つの10Lバイオリアクターシステムが同時に、温度をそれぞれ32℃、33℃および34℃に設定して運転された。他の全てのパラメータ設定点は、実施例1の下に記載される実験と同等だった。
35℃での初期ウィルス増幅を伴うInfluenza A/New Caledonia/20/99産生
本実施例は、インフルエンザウィルス産生プロセスの最初の24時間の温度設定を上昇させた、培養実験に関する。ベロ細胞培養を、100リットルスケールでA/New Caledonia/20/99ウィルスで感染させた。
初期ウィルス増幅を35℃とするInfluenza A/Panama/2007/99産生
二温度プロセスにつき実施例3で観察された反応を確認するために、同じ温度プロフィールを用いて、100リットルのベロ培養においてInfluenza A/Panama/2007/99ウィルスを増殖させた。他の全ての条件およびパラメータは、実施例3にしたがって設定された。
初期ウィルス増幅を35℃でp.i.18時間対p.i.36時間行った後、ウィルス増殖終了まで32℃とする、Influenza A/Hiroshima/52/2005産生
本実施例は、Influenza A/Hiroshima/52/2005ウィルスで感染させた50Lベロ培養において、抗原収量、SRD/タンパク質比率、およびベロタンパク質/SRI比率に対する、高温サイクル継続時間の変更による影響を示す。二つの別々の試料で、35℃の温度を、それぞれp.i.18時間およびp.i.36時間維持した後、温度を32℃に低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
p.i.18時間の初期ウィルス増幅を異なる温度(34℃、35℃および36℃)で行った後、ウィルス増殖終了まで3℃低下させる(31℃、32℃および33℃へ)、Influenza B/Malaysia/2506/2004産生
本実施例は、Influenza B/Malaysia/2506/2004ウィルスで感染させた32リットル〜80リットルベロ培養における、ウィルス増殖中の異なる二重温度プロフィールの使用に関する。34℃、35℃および36℃の高温をp.i.18時間維持した後、31℃、32℃および33℃に、それぞれ3℃低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
p.i.18時間の初期ウィルス増幅を異なる温度(33.5℃、35℃および36.5℃)で行った後、ウィルス増殖終了まで3℃低下させる(30.5℃、32℃および33.5℃へ)、Influenza A/Solomon Islands/3/2006産生
本実施例は、Influenza A/Solomon Islands/3/2006ウィルスで感染させた32リットル〜50リットルベロ培養における、ウィルス増殖中の異なる温度プロフィールの使用に関する。33.5℃、35℃および36.5℃の高温をp.i.18時間維持した後、30.5℃、32℃および33.5℃に、それぞれ3℃低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
ロスリバーウィルスの産生
ロスリバーウィルス(「RRV」)が、2Lリアクターで、異なる温度で産生された。調査温度は、30時間37℃、35℃、32℃および35℃とした後、30時間以降はp.i.90時間の感染終了まで32℃とした。動力学的パラメータが決定され、試料が以下の時間間隔で集められた(時間)I−18、I−42、I−42、I−54、I−66、I−76およびI−90。NaBr分析のための試料が、1.85%の20μL/mLホルマリンで処置され、37℃で48時間インキュベートされた。感染細胞の代謝活性をモニタするために、ウィルス増殖の間に残留酸素吸収速度(OUR)が測定された。細胞剥離率が、微粒子担体培養の顕微鏡画像により定量された。TCID50(50%組織培養感染用量)も、決定された。
I−42〜I−66: 10000g
I−78〜I−90: 15000g
西ナイルウィルス実験
2Lリアクターにおいて、異なる温度で西ナイルウィルスが産生された。調査温度は、30時間35℃、32℃および35℃とした後、30時間以降感染終了まで32℃とした。90hの動力学的パラメータが、集められた。以下の時間的間隔で試料が集められた(時間)I−18、I−30、I−42、I−42、I−52、I−66、I−74およびI−90。NaBr分析のための試料は、1.85%の20μL/mLホルマリンで処置され、37℃で48時間インキュベートされた。条件は、pH7.1、20%pO2、および感染前グルコース1.0g/Lであった。I−18で、1.0g/Lのグルコースが加えられ、灌流が停止された。結果は表11に与えられ、図7〜9は、NaBrプロットおよび顕微鏡画像を示す。微粒子担体培養のこれらの顕微鏡画像により、細胞剥離率が定量された。
Claims (24)
- ウィルスの産生方法であり、前記方法が、
前記ウィルスに感染させた宿主細胞を提供するステップと、
前記感染した宿主細胞を、31℃〜37℃の範囲の第一温度で、1〜48時間培養するステップと、
その後、前記感染した宿主細胞を、前記第一温度より1℃〜6℃低い第二温度で培養するステップと、
前記培養ステップにより生成される前記ウィルスの複製を集めるステップ
を含む、方法。 - 前記ウィルスが、オルトミクソウィルス、アルファウィルスまたはフラビウィルスである、請求項1に記載の方法。
- 前記ウィルスが、インフルエンザウィルスである、請求項2に記載の方法。
- 前記ウィルスが、インフルエンザA型およびB型より選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記ウィルスが、ロスリバーウィルスである、請求項2に記載の方法。
- 前記ウィルスが、西ナイルウィルスである、請求項2に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、動物細胞培養または細胞系統である、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、上皮細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、腎臓上皮細胞である、請求項8に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、ベロ細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記第一温度が、32℃〜37℃の範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記第一温度が、33℃〜36℃の範囲である、請求項11に記載の方法。
- 前記第一温度が、34℃〜35.5℃の範囲である、請求項12に記載の方法。
- 前記第二温度が、前記第一温度と比較して1.5℃〜5℃低下される、請求項1に記載の方法。
- 前記第二温度が、前記第一温度に対して2℃〜4℃低下される、請求項14に記載の方法。
- 前記第二温度が、29℃〜35℃の範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記第二温度が、30℃〜34℃の範囲である、請求項16に記載の方法。
- 前記第二温度が、31℃〜33℃の範囲である、請求項17に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、接種後直接培養される、請求項1に記載の方法。
- ウィルスまたはウィルス抗原の産生方法であり、前記生成されたウィルスまたはウィルス抗原が、請求項1により産生されるウィルスから得られ、前記生成されたウィルスまたはウィルス抗原が、単離される、方法。
- 前記ウィルスが、断片化される、請求項1に記載の方法。
- 前記ウィルスが、不活性化される、請求項1に記載の方法。
- 前記ウィルスのワクチンを調製するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一温度での培養が、少なくとも二時間である、請求項1に記載の方法。
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