JP2013537543A - インフルエンザウイルスを製造するための永久ヒト羊膜細胞株 - Google Patents

Abstract

本発明は、永久ヒト羊膜細胞を用いてインフルエンザウイルスをベースにするワクチンを製造する方法、及びインフルエンザウイルスをベースにするワクチンを製造するための永久ヒト羊膜細胞の使用に関する。
【選択図】 図２

Description

本発明は、永久ヒト羊膜細胞を用いたインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法、及びインフルエンザウイルスをベースにするワクチンを製造するための永久ヒト羊膜細胞の使用に関する。

予防接種は、毎年のインフルエンザ流行によって起こる疾患を予防するために重要な保健衛生制度における対策である。ワクチンの使用の成功は、可及的迅速に十分多量のワクチン、例えば、死滅したウイルスを安定で取り扱いの容易な供給源から提供できるかどうかに依存する。ワクチンの迅速な開発及びその十分な使用可能性は、ヒト及び動物の多くの疾患を予防するのに重要である。ワクチン製造の遅延及び量的損失により、疾患の大発生の予防に問題が生じるおそれがある。その結果として、最近は、ワクチンとして使用されるウイルスを細胞培養物中で培養することに努力が傾注されている。

従来、入手可能なインフルエンザワクチンは孵化鶏卵で製造される。これらの鶏卵は、証明されたように、特定のウイルス汚染及び細菌汚染がないものでなければならない。これらのいわゆる「特定病原体不在」（ＳＰＦ）鶏卵は市販されている。鶏卵は、動物及びヒトのウイルスの増殖に非常に適していることが判明したが、そのワクチン製造には幾つかの欠点が伴う。従来のワクチンの製造にはそのつど鶏卵が必要であるため、例えば、大流行した場合、ワクチン製造用の鶏卵の需要が高くなる。鶏卵の入手が限られることを考慮に入れて、十分な量の鶏卵を用意するのに約１年の準備作業を計算に入れなければならない。さらに、ニワトリにとって病原性の高いインフルエンザ亜型が存在するため、大流行した場合、鶏卵の供給不足に陥るおそれがある。さらに、この製造プロセスは非常にコストが大きく時間がかかる。鶏卵でワクチンを製造する際の他の欠点は、これらのワクチンがほとんどの場合、鶏卵白非含有ではなく、従って一部の患者でアレルギー反応が生じるおそれがあることである。とりわけ、天然に存在するウイルスと異なる亜群（Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）が選択される可能性があり、代替の宿主細胞系が必要となる。

鶏卵とは対照的に、細胞培養物をベースにするインフルエンザワクチン製造用の細胞は常に備蓄されている。それらは冷凍貯蔵され、常に、需要に応じて必要な量を短期間で解凍し、増殖させることができる。従って、所望の時点でワクチン製造を開始することができる。予想外の高い需要があった場合、又は不測（ｕｎｖｏｒｈｅｒｇｅｓｅｈｅｎ）の新型ウイルス株が増殖して伝播した場合でも、短期間で対応するワクチンを用意することができる。

細胞培養物を用いた製造プロセスにより、ワクチンとしてウイルスを、閉鎖され標準化された系内にて、規定され制御された条件下で製造することが可能となる。制御された製造方法により、抗生物質を添加することなくインフルエンザワクチンが完成される。細胞培養物によるインフルエンザワクチンの製造は全く鶏卵に依存することなく行われるため、このようにして製造されたワクチンは鶏卵白を有しておらず、従って、患者に鶏卵白に対する耐性がないことに起因するアレルギー反応を引き起こすおそれがない。

現在、主として、以下の３つの細胞株、即ち、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞、マディンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞及びオナガザル腎臓細胞（Ｖｅｒｏ）がインフルエンザワクチンの製造に使用されている。さらに、現在、アヒル網膜細胞株（ＡＧＥ１．ＣＲ）及び胚性トリ幹細胞株が開発されている。哺乳動物細胞でのワクチンの製造は確かに鶏卵をベースにするワクチン製造の代替となるが、これらの細胞は、その増殖のために血清及び／又は固体支持体への付着を必要とする。このことから、安全性の理由で血清を完全に分離しなければならず、固体支持体での増殖が制限され、それにより収量が減少するため、これらの細胞中でのワクチンの製造は困難になり、従って価格が上昇する。

哺乳動物細胞でのワクチンの製造の利点は、細胞培養物中でウイルスを単離及び複製する際に、臨床野生型と異なる表現型がパッセンジャー（Ｐａｓｓａｇｉｅｒ）依存的に選択されないことである。従って、感染される細胞への付着及び細胞へのウイルスの組込みを行うウイルス糖タンパク質であるヘマグルチニンは天然型で発現し、それにより改善された特異性と結合力を有し、従ってヒトにおける細胞媒介性免疫を可能にすることになる。

従って、本発明の課題は、インフルエンザウイルスをベースにするワクチンを製造するための、改善された永久ヒト細胞株を調製することである。

この課題は、特許請求の範囲に記載される対象によって解決される。

図は本発明を説明する。

図１Ａ〜図１Ｇは、１００ｍｌ振盪フラスコ内における、２９３ＳＦＭＩＩ培地（●）中での永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５の、ＰＥＭ培地（▲）中での永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５の、及びＳＭＩＦ８培地（◆）中での永久イヌ腎臓細胞株ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２（マディンダービーイヌ腎臓）の培養中の様々なパラメータの推移を概略的に示す。図１Ａには３つの細胞株の生細胞数の推移を、図１Ｂには細胞株の死細胞数の推移を、図１Ｃには細胞株の生存率の推移を、比較して図示している。図１Ｄ〜図１Ｇは、ｐＨ値（Ｄ）、グルコース濃度（明色の記号）とラクトース濃度（暗色の記号）（Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ）濃度（明色の記号）とアンモニウム濃度（暗色の記号）（Ｆ）、及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）濃度（明色の記号）とピルビン酸塩濃度（暗色の記号）（Ｇ）の推移を概略的に示している。 図２は、２９３ＳＦＭＩＩ培地及びＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）及びＡ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）の４継代にわたるＴＣＩＤ₅₀値として測定されたウイルス力価を表す棒グラフを示す。略称：Ａ／ＰＲ ２９３：２９３ＳＦＭＩＩ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／ＰＲ ＰＥＭ：ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／Ｕｒｕｇ ２９３：２９３ＳＦＭＩＩ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／Ｕｒｕｇ ＰＥＭ：ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）；ＴＣＩＤ₅₀値は、宿主細胞の約５０％に感染させるのに必要なウイルス力価（単位：ウイルス数／ｍｌ）である。 図３Ａ〜図３Ｆは、ｌｏｇ ＨＡ（ヘマグルチニン）単位／１００μｌとして記載されるウイルス粒子の量、ならびに、ＭＯＩ（感染多重度）値：ＭＯＩ：０．００２５（△）；ＭＯＩ：０．０２５（□）；ＭＯＩ：０．２５（○）として記載される様々なウイルス量を使用した場合の、細胞にインフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４を感染させた後、２９３ＳＦＭＩＩ培地中（Ａ、Ｂ）及びＰＥＭ培地中（Ｃ、Ｄ）で永久羊膜細胞ＣＡＰ−１Ｄ５を培養した場合、及びＳＭＩＦ８培地中（Ｅ、Ｆ）で永久イヌ腎臓細胞ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２を培養した場合の生細胞数の推移を概略的に示す。ＭＯＩ（感染多重度）は、感染性粒子対標的細胞の数の比を表す。 図４Ａ〜図４Ｄは、１Ｌバイオリアクター内にてＰＥＭ培地中で永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５を培養し、１１４時間後に、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（馴化）をＭＯＩ０．０２５として記載されるウイルス量で感染させた場合の様々なパラメータの推移を概略的に示す。図４Ａに、生細胞数（▲）、死細胞数（△）、及び細胞の生存率（▲^１）の概略的な推移を示す。図４Ｂに、ｌｏｇ ＨＡ（ヘマグルチニン）単位／１００μｌとして記載されるウイルス粒子の量（▲）、培地中のグルタミン酸塩濃度（△）とピルビン酸塩濃度（●）を概略的に示す。図４ＣはｐＨ値（△）の推移を概略的に示し、図４Ｄは感染性（単位：ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）の推移を示す。ＴＣＩＤ_５０値は、宿主細胞の５０％に感染させるのに必要なウイルス力価（単位：ウイルス数／ｍｌ）を表す。 図５Ａ及び図５Ｂは、２９３ＳＦＭＩＩ培地及びＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、ブタインフルエンザ（Ａ／ブタ（Ｈ１Ｎ２）Ｂａｋｕｍ／１８３２／００）及びウマインフルエンザ（Ａ／ウマ、Ａ／Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ／１／９３（Ｈ３Ｎ８））の４継代にわたるｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ（Ａ）又はＴＣＩＤ₅₀値（Ｂ）として測定されたウイルス力価を表す棒グラフを示す。略称：Ａ／Ｂｒｉｓ ２９３：２９３ＳＦＭＩＩ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７；Ａ／Ｂｒｉｓ ＰＥＭ：ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７；Ｂ／Ｆｌｏｒ ２９３：２９３ＳＦＭＩＩ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６；Ｂ／Ｆｌｏｒ ＰＥＭ：ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６；Ｓｃｈｗ ２９３：２９３ＳＦＭＩＩ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／ブタ（Ｈ１Ｎ２）Ｂａｋｕｍ／１８３２／００；Ｓｃｈｗ ＰＥＭ：ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／ブタ（Ｈ１Ｎ２）Ｂａｋｕｍ／１８３２／００；ウマ２９３：２９３ＳＦＭＩＩ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／ウマ、Ａ／Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ／１／９３（Ｈ３Ｎ８）；ウマＰＥＭ：ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞でのインフルエンザ株Ａ／ウマ、Ａ／Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ／１／９３（Ｈ３Ｎ８）；ＴＣＩＤ₅₀値は、宿主細胞の５０％に感染させるのに必要なウイルス力価（単位：ウイルス数／ｍｌ）である。 図６Ａ及び図６Ｂは、振盪フラスコ内にて１００ｍｌのＰＥＭ培地中で永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５を培養した場合の生細胞数濃度及びｐＨ値の推移を概略的に示し、ここで、出発細胞数は５×１０⁵個／ｍｌであり、培地はさらに４ｍＭピルビン酸塩を含有する（◆）か、又は出発細胞数は８×１０⁵個／ｍｌであり、培地はさらに４ｍＭピルビン酸塩を含有する（▲）か、又は出発細胞数は８×１０⁵個／ｍｌであり、培地はさらに１０ｍＭピルビン酸塩プラス他のアミノ酸を含有する（●）。 図７Ａ〜図７Ｃは、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞に馴化インフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４を感染させた場合の、ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ培養物の単位で測定されたウイルス力価の推移を概略的に示す。感染の前に、培地交換を行わなかった（Ａ）か、ＰＥＭ培地で１：２希釈（Ｂ）を行ったか、又は完全培地交換を行った。図７Ａは、培地交換を行わず、感染時に１×１０^-4Ｕ／細胞（◆）、３×１０^-5Ｕ／細胞（▲）及び５×１０^-5Ｕ／細胞（■）の様々なトリプシン濃度を使用した場合の、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物のウイルス力価の概略的な推移を示す。図７Ｂは、ＰＥＭ培地で１：２希釈を行い、感染時に１×１０^-4Ｕ／細胞（◆）、３×１０^-5Ｕ／細胞（▲）及び５×１０^-5Ｕ／細胞（■）の様々なトリプシン濃度を使用した場合の、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物のウイルス力価の概略的な推移を示す。図７Ｃは、完全培地交換を行い、感染時に、トリプシンを使用しなかった場合（＊）又は１×１０^-4Ｕ／細胞（▲）、１×１０^-5Ｕ／細胞（◆）、５×１０^-5Ｕ／細胞（■）及び１×１０^-6Ｕ／細胞（ｘ）の様々なトリプシン濃度を使用した場合の、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物のウイルス力価の概略的な推移を示す。 図８Ａ〜図８Ｆは、感染の前に培地交換を行った場合（Ａ〜Ｃ）又は行わなかった場合（Ｄ〜Ｆ）の、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７又はＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を感染させたＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物中のウイルス力価の推移を概略的に示す。インフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６による感染は、それぞれ、ＭＯＩ値０．２５、０．０２５及び０．００２５として記載されるウイルス量で行った。インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７による感染は、それぞれＭＯＩ値０．１、０．０２５及び０．００２５で行った。ＭＯＩ（感染多重度）は、感染性粒子対標的細胞の数の比を表す。 図９Ａ及び図９Ｂは、馴化インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させ、１ＬのスケールのＳＴＲバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）（Ｂ１６、Ｂ２６及びＭＤＣＫ）又はＷａｖｅバイオリアクター（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ）（Ｗａｖｅ）内で培養された、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物（Ｂ１６、Ｂ２６及びＷａｖｅ）及びイヌ腎臓細胞−ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２培養物（ＭＤＣＫ）の生細胞数濃度及びウイルス力価の推移を概略的に示す。Ｂ２６及びＷａｖｅ培養物では、感染の前に培地交換を行った。 図１０Ａ〜図１０Ｃは、馴化インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させ、振盪フラスコ内にて１００ｍｌのＰＥＭ培地中で培養されたＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物のｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌの単位で測定したウイルス力価、生細胞数及びｐＨ値の推移を概略的に示す。感染の前に、２９３ＳＦＭＩＩ培地（□）もしくはＰＥＭ培地（◇）で１：１培地交換（明色の記号）を行ったか、又は２９３ＳＦＭＩＩ−培地（■）もしくはＰＥＭ培地（◆）で完全培地交換（暗色の記号）を行った。

本明細書で使用する「インフルエンザウイルス」という用語は、ヒト及び動物に感染し得るオルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｍｙｘｏｖｉｒｅｎ）に属するものと理解される。ここで、Ａ型、Ｂ型及びＣ型のインフルエンザウイルスは区別される。Ａ型とＢ型のインフルエンザウイルスは１種類にまとめられている。Ｃ型インフルエンザウイルスは、７つのゲノムセグメントにより区別され、Ａ型及びＢ型のインフルエンザウイルスには８つのゲノムセグメントがある。さらに、Ａ型及びＢ型のインフルエンザウイルスは、それぞれヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードし、それに対してＣ型インフルエンザウイルスは、両方の特性を併せ持つ表面タンパク質であるヘマグルチニンエステラーゼ融合タンパク質（ＨＥＦ）をコードする。Ａ型インフルエンザウイルスは、さらに、ヘマグルチニン（Ｈ１−Ｈ１５）分子とノイラミニダーゼ（N１−N９）分子の配列に基づき亜型に細別される。

本明細書で使用する「インフルエンザウイルスタンパク質」という用語は、インフルエンザウイルスのタンパク質又は誘導体と理解される。インフルエンザウイルスの誘導体は、通常、免疫化の目的で使用することができるインフルエンザウイルスのタンパク質又はその一部である。インフルエンザウイルスのタンパク質又は誘導体は、ウイルスエンベロープのタンパク質又はその一部を含む。特に、インフルエンザウイルスタンパク質は、Ａ型インフルエンザタンパク質、Ｂ型インフルエンザタンパク質又はＣ型インフルエンザタンパク質、例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質（Ｍ１）及び（Ｍ２）、ポリメラーゼタンパク質（ＰＢ１）、（ＰＢ２）及び（ＰＡ）、ならびに非構造タンパク質（ＮＳ１）及び（ＮＳ２）、ならびにその一部を含む。インフルエンザウイルスタンパク質の一部は、Ａ型インフルエンザタンパク質、Ｂ型インフルエンザタンパク質又はＣ型インフルエンザタンパク質の１種類以上のエピトープを含む。エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩのクラスの結合モチーフを含み、ＭＨＣクラスＩＩの分子により抗原提示細胞の表面に発現されるペプチドであるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープであってもよく、又はＭＨＣクラスＩのクラスの結合モチーフを含み、ＭＨＣクラスＩの分子により抗原提示細胞の表面に発現されるペプチドであるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであってもよい。例えば、アルゴリズムモデル、ＭＨＣ結合試験、インシリコ抗原同定法及びＸ線結晶構造解析法により、様々なＭＨＣ分子に結合できる抗原の同定が可能となる。

本明細書で使用する「ワクチン」という用語は、タンパク質、タンパク質サブユニット、ペプチド、炭水化物、脂質、核酸、死滅又は弱毒化させたウイルス（これはウイルス粒子全体又はウイルス粒子の一部であってもよい）又はこれらの組み合わせを含む、生物学的又は遺伝子工学的に製造される抗原と理解される。抗原は、少なくとも１種類のエピトープ、例えば、Ｔ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープを提示することができる。これらの抗原は、Ｔ細胞受容体又はＢ細胞受容体などの免疫学的受容体によって認識される。ワクチンは、投与後、特定のウイルスに関する免疫系を特異的に活性化する役割を果たす。ここで、免疫反応を惹起するウイルス又はその特異的抗原が存在する場合、免疫系の反応が利用される。これは、各疾患に対して長期間持続する防御を提供することができる抗体及び特殊なヘルパーＴ細胞の形成につながり、その防御はウイルスに応じて数年〜生涯にわたり持続することができる。ワクチンには、生菌ワクチン又は死菌ワクチンが含まれる。生菌ワクチンは、例えば、疾患を引き起こすおそれがない、弱毒化された、まだ増殖能力のあるウイルスを含有する。それに対し、死菌ワクチンの場合、これらのウイルスは死滅されたか、又はそれはウイルス（抗原）の断片だけを含有する。ウイルスの不活化（死滅）は、例えば、化学物質、例えば、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン及びソラレンにより行われる。その場合、ウイルスエンベロープは保持される。ウイルスの毒素の生物学的に不活性な成分（トキソイド）だけを含有するトキソイドワクチン（例えば、破傷風−トキソイド）もあり、これも同様に死菌ワクチンに挙げられる。特に、死菌ワクチンは、ウイルスエンベロープタンパク質の断片からなるスプリットワクチンであってもよい。ウイルスエンベロープの破壊又は分解は、例えば、界面活性剤又は強有機溶媒で行うことができる。ウイルスはさらに化学物質で不活化又は死滅させることもできる。さらに、死菌ワクチンには、ウイルスの特異的成分、例えば、ヘマグルチニンタンパク質及びノイラミニダーゼタンパク質からなるサブユニットワクチンも挙げられる。

本明細書で使用される「インフルエンザウイルスをベースにするワクチン」という用語は、インフルエンザに対する免疫化の目的で使用することができる、インフルエンザウイルスの全タンパク質、ペプチド又はその一部、及びこれらのタンパク質、ペプチド又はその一部をコードする核酸、及びインフルエンザウイルス粒子自体、組換えインフルエンザウイルスタンパク質（インフルエンザエンベロープタンパク質を含む）、サブウイルス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＶＬＰ複合体、及び／又はその一部と理解される。

本明細書で使用される「アジュバント」という用語は、抗原の免疫原性を調整できる物質と理解される。アジュバントには、例えば、無機塩類、スクアレン混合物、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｋｔｅｒｉｅｎ）細胞壁調製物、特定のエマルション、モノホスホリル脂質Ａ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロック共重合体界面活性剤、クイルＡ（Ｑｕｉｌ Ａ）、コレラ毒素Ｂのサブユニット、ポリホスファゼン及びその誘導体、免疫賦活複合体、サイトカインアジュバント、Ｍ５９アジュバント、脂質アジュバント、粘膜アジュバント、特定の細菌外毒素、特定のオリゴヌクレオチド及びＰＬＧがある。

本明細書で使用される「羊膜細胞」という用語は、羊水中に存在し、羊水穿刺により得ることができる全ての細胞と理解される。それらは、羊膜又は羊水と接触している胎児組織に由来する。形態学的判断基準に基づいて区別される３種類の主要な羊膜細胞、即ち、線維芽細胞様細胞（Ｆ細胞）、類上皮細胞（Ｅ細胞）及び羊水細胞（Ａｍｎｉｏｔｉｃ Ｆｌｕｉｄ Ｃｅｌｌｓ、ＡＦ細胞）が記載された（Ｈｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔ．Ｒｅｓ．８：７４６−７５４，１９７４）。ＡＦ細胞は優勢な種類の細胞である。

本明細書で使用される「永久細胞株」という用語は、好適な培養条件で、細胞培養物中で永久的に増殖し続けることができるように遺伝子操作されている細胞と理解される。このような細胞は、不死化細胞とも称される。

本明細書で使用される「初代細胞」という用語は、生物又は組織から直接採取することにより得られ、培養に供された細胞と理解される。初代細胞は、非常に限られた寿命しか有していない。

本明細書で使用される「トランスフェクション」という用語は、前述の（１種類以上の）核酸を細胞内に導入するのに適したあらゆる方法と理解される。例として、従来のリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、あらゆる種類のリポソーム系、及びこれらの方法の組み合わせを挙げることができる。

本明細書で使用される「ＣＡＰ」という用語は、初代ヒト羊膜細胞をアデノウイルス遺伝子機能Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂで不死化することにより作製された永久ヒト羊膜細胞株と理解される。

本明細書で使用される「ＣＡＰ−T」という用語は、さらにＳＶ４０ラージＴ抗原の配列を含有する核酸分子が安定にトランスフェクションされたＣＡＰ細胞と理解される。

本発明の対象は、以下の工程：
（ｉ）インフルエンザウイルスを永久ヒト細胞と接触させる工程、
（ｉｉ）永久ヒト細胞を培養する工程、
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスの発現を可能にする工程、及び
（ｉｖ）インフルエンザウイルスを培地から単離する工程、
を含む、インフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法に関する。

本発明の方法では、細胞の増殖に適した条件で永久ヒト細胞を培養する（例えば、温度、培地、ｐＨ値）。例えば、温度、培地、ｐＨ値及び他の増殖パラメータに関する条件は当業者に周知であるか、又は通常の方法で決定することができる。培養物が所望の増殖密度に達した場合、細胞に感染させるためにインフルエンザウイルスを添加する。ウイルスは、細胞内で増殖するのに数日要する。この複製過程中に細胞の大部分は死滅し、ウイルスが培地中に放出される。ウイルス含有溶液は、例えば、遠心分離により、細胞残部から分離される。次いで、ウイルスを培地溶液から、例えば、クロマトグラフィーカラムで分離し、容積を減少させることができる。続いて、ウイルスを、例えば、化学プロセスにより不活化することができる。その後、ウイルスの分解を引き続き行うことができる。さらに精製及び濃縮工程を行った後、ウイルス株の抗原濃縮物が得られる。

好ましい実施形態では、永久ヒト細胞に感染させるために、インフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、ブタインフルエンザ（Ａ／ブタ（Ｈ１Ｎ２）Ｂａｋｕｍ／１８３２／００）又はウマインフルエンザ（Ａ／ウマ、Ａ／Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ／１／９３（Ｈ３Ｎ８））を使用する。

他の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞に感染させるために使用されるインフルエンザウイルスを予め細胞に馴化させ、好ましくは、これは前述のインフルエンザウイルスである。好ましくは、このような馴化は４継代にわたり行われる。好ましくは、インフルエンザウイルスの馴化は、２９３ＳＦＭＩＩ培地又はＰＥＭ培地中で行われる。

本発明の別の対象は、次の工程：
（ｉ）インフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子を永久ヒト細胞と接触させる工程、
（ｉｉ）永久ヒト細胞を培養する工程、
（ｉｉｉ）インフルエンザタンパク質をコードする核酸分子の複製及び／又はインフルエンザタンパク質の発現を可能にする工程、及び
（ｉｖ）インフルエンザタンパク質をコードする核酸分子及び／又はインフルエンザウイルスタンパク質を培地から単離する工程、
を含む、インフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法に関する。

好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される永久ヒト細胞は永久ヒト羊膜細胞である。

本発明の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞は、振盪フラスコ又はバイオリアクター、好ましくはＳＴＲバイオリアクター又はＷａｖｅバイオリアクター内で培養される。永久ヒト細胞は、様々な培地中で、好ましくは２９３ＳＦＭＩＩ培地又はＰＥＭ培地中で培養することができる。さらに、培地にピルビン酸塩、グルタミン、グルコース及び他のアミノ酸を添加することができる。好ましくは、培地は４ｍＭ又は１０ｍＭピルビン酸塩及び他のアミノ酸を含有する。

本発明の他の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞の出発細胞数は、振盪フラスコ内で培養する場合、５×１０⁵個／ｍｌ、より好ましくは８×１０⁵個／ｍｌである。

本発明の他の好ましい実施形態では、感染時点での細胞培養物のｐＨ値は、７．１〜７．８の範囲、より好ましくは７．３〜７．５の範囲、さらにより好ましくは７．３〜７．５の範囲である。

本発明の他の好ましい実施形態では、ヒト永久細胞にインフルエンザウイルスを感染させる前に、完全培地交換又は培地による１：２希釈を行う。

本発明の好ましい実施形態では、ヒト永久細胞にインフルエンザウイルスを感染させるために、１×１０^-4Ｕ／細胞、１×１０^-5Ｕ／細胞、３×１０^-5Ｕ／細胞、５×１０^-5Ｕ／細胞又は１×１０^-6Ｕ／細胞のトリプシン濃度を使用する。ヒト永久細胞に感染させる前に培地交換を行わない場合、好ましくは、細胞にインフルエンザウイルスを感染させるとき、１×１０^-4Ｕ／細胞のトリプシン濃度を使用する。ヒト永久細胞に感染させる前に培地で１：２希釈を行う場合、好ましくは、細胞にインフルエンザウイルスを感染させるとき、５×１０^-5Ｕ／細胞のトリプシン濃度を使用する。ヒト永久細胞に感染させる前に完全培地交換を行う場合、好ましくは、細胞にインフルエンザウイルスを感染させるとき、５×１０^-6Ｕ／細胞のトリプシン濃度を使用する。

本発明の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞に感染させるために、０．００１〜０．３の範囲のＭＯＩ（感染多重度）値として記載されるウイルス量を使用する。本発明の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞に感染させるために、ＭＯＩ（感染多重度）値０．２５、０．１、０．０６、０．０２５又は０．００２５として記載されるウイルスを使用する。好ましくは、感染の前に培地交換を行うことなく永久ヒト細胞にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させる場合、ＭＯＩ値０．２５として記載されるウイルス量を使用し、感染の前に培地交換を行うことなくヒト永久細胞にインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７を感染させる場合、ＭＯＩ値０．１として記載されるウイルス量を使用する。好ましくは、感染の前に培地交換を行って永久ヒト細胞にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させる場合、ＭＯＩ値０．１又は０．２５として記載されるウイルス量を使用し、感染の前に培地交換を行って永久ヒト細胞にインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７を感染させる場合、ＭＯＩ値０．０６又は０．２５を使用し、感染の前に培地交換を行って永久ヒト細胞にインフルエンザウイルスＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を感染させる場合、ＭＯＩ値０．１、０．０２５又は０．００２５として記載されるウイルス量を使用する。

好ましい実施形態では、振盪フラスコ内で培養する場合、感染時点での細胞数は１×１０⁶〜６×１０⁶個／ｍｌの範囲内にある。好ましくは、感染時点での細胞数は２．３×１０⁶個／ｍｌ、４．５×１０⁶個／ｍｌ又は５×１０⁶個／ｍｌである。本発明の好ましい実施形態では、感染時点での細胞数は４．５×１０⁶個／ｍｌであり、感染の前に培地交換は行わない。本発明の他の好ましい実施形態では、感染時点での細胞数は２．３×１０⁶個／ｍｌであり、感染の前に新鮮ＰＥＭ培地で１：２希釈を行う。本発明の他の好ましい実施形態では、感染時点での細胞数は５×１０⁶個／ｍｌであり、感染の前に完全培地交換を行う。

本発明の特に好ましい実施形態では、永久ヒト細胞は１リットルのバイオリアクターＳＴＲ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）内にて、４ｍＭグルタミン及び４ｍＭピルビン酸塩を有するＰＥＭ培地中で培養され、ここで出発細胞数は５×１０⁵個／ｍｌであり、約２．１×１０⁶個／ｍｌの細胞数にＭＯＩ値０．０２５として記載されるウイルス量のインフルエンザウイルスを感染させ、感染の前に培地交換は行わない。好ましくは、最終濃度３×１０^-5Ｕ／ｍｌのトリプシンの存在下で感染を行う。

本発明の特に好ましい実施形態では、１リットルのバイオリアクターＳＴＲ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）内にてＰＥＭ培地中で永久ヒト細胞を培養し、ここで出発細胞数は８×１０⁵個／ｍｌであり、ＭＯＩ値０．０２５として記載されるウイルス量を使用してインフルエンザウイルスを感染させ、感染の前に培地交換を行う。好ましくは、最終濃度３×１０^-5Ｕ／ｍｌのトリプシンの存在下で感染を行う。

本発明の他の特に好ましい実施形態では、永久ヒト細胞を、１リットルのＷａｖｅバイオリアクター（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ）内にて、４ｍＭグルタミン、４ｍＭピルビン酸塩及び２０ｍＭグルコースを有するＰＥＭ培地中で培養し、ここで、出発細胞数は５×１０⁵個／ｍｌであり、感染前の細胞数は２．１×１０⁶個／ｍｌであり、ＭＯＩ値０．０２５として記載されるウイルス量を使用してインフルエンザウイルスを感染させ、感染の前に培地交換を行わない。好ましくは、３×１０^-5Ｕ／ｍｌの最終濃度のトリプシンの存在下で感染を行う。

本発明の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞を振盪フラスコ内にて４ｍＭグルタミン及び４ｍＭピルビン酸塩を有するＰＥＭ培地中で培養し、ここで、１×１０^-6Ｕ／細胞のトリプシン濃度の存在下でＭＯＩ値０．０２５として記載されるウイルス量を使用して細胞にインフルエンザウイルスを感染させる前に、培地交換を行う。

本発明の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞を振盪フラスコ内にて４ｍＭグルタミン及び４ｍＭピルビン酸塩を有するＰＥＭ培地中で培養し、ここで、１×１０^-5Ｕ／細胞のトリプシン濃度の存在下でＭＯＩ値０．０２５として記載されるウイルス量を使用して細胞にインフルエンザウイルスを感染させる前に、１：１培地交換を行う。

インフルエンザタンパク質及びインフルエンザタンパク質をコードする核酸分子を製造する場合、培養されたヒト細胞に、インフルエンザタンパク質をコードする核酸分子をトランスフェクションし、続いて、公知の方法を使用して、インフルエンザウイルスタンパク質又はインフルエンザタンパク質をコードする核酸分子を単離し、精製する。

他の好ましい実施形態では、本発明の方法においてウイルス粒子による感染時点で又はインフルエンザウイルスタンパク質又はその一部をコードする核酸分子をトランスフェクションする時点で、ヒト細胞は中間指数関数的増殖期及び静止増殖期にあるか、又はそれらの間にある。時間に対する細胞数をプロットする典型的な増殖曲線は、シグモイド曲線を示す。それは、いわゆる誘導期から始まり、対数期又は指数関数期、及び静止期がそれに続く。ここで、中間指数関数的増殖期は、典型的な増殖曲線の第１の変曲点に対応し、変曲点とは、曲線の形状が凹状から凸状に、又は凸状から凹状に変化する増殖曲線上の点である。静止期は、増殖曲線がプラトーに達するとき、従って細胞数が一定になるときに始まる。

本発明の方法で製造される、インフルエンザタンパク質をコードする核酸は、核酸免疫化のために、又はいわゆるＤＮＡワクチンとして使用することができる。核酸免疫化の場合、免疫原性抗原、即ち、ヒトに免疫反応を惹起する抗原が接種される。これらの免疫原性抗原はＤＮＡ又はＲＮＡによってコードされ、発現カセット又は発現ベクターとして存在するか、又はウイルスベクターに組み込まれており、遺伝子産物に対する免疫反応を誘導する。ＤＮＡワクチンは、様々な投与系に、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡとして、直線化された又は環状のプラスミド又は発現カセットの形態で存在することができ、ここで、これらは発現に必要な要素、例えば、プロモーター、ポリアデニル化部位、複製起点などを備えている。ＤＮＡを投与する場合、これらは、たいていの場合、アジュバントを有するもしくは有していない緩衝液中に、又はナノ粒子に結合した状態で、又はアジュバント含有化合物中に、又はウイルスもしくは細菌ベクターに組み込まれた状態で、存在している。ＤＮＡワクチンは、体液性免疫も細胞媒介性免疫も惹起する。ＤＮＡワクチンの利点は、抗原が天然型で発現し、従って免疫化の向上につながることである。ＤＮＡワクチンの他の利点は、弱毒化した生菌ワクチンとは対照的に、これらには感染性がなく、再度毒性を示すおそれがないことである。

粒子に結合している、ＤＮＡ又はＲＮＡ、プラスミド又は直線化されたＤＮＡフラグメントの形態のＤＮＡワクチンの投与は、注射により又は遺伝子銃を用いて行うことができる。この場合、注射用ＤＮＡワクチンは、例えば、食塩又は緩衝食塩溶液中に存在してもよい。

本発明の方法で製造される、インフルエンザタンパク質をコードする核酸、インフルエンザタンパク質及びインフルエンザウイルスは、Ａ型及び／又はＢ型及び／又はＣ型インフルエンザウイルスに対するワクチンとして使用することができる。

本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスをベースにするワクチンは、インフルエンザに対する免疫化の目的で使用することができる、インフルエンザウイルスの全タンパク質、ペプチド又はその一部、及びこれらのタンパク質、ペプチド又はその一部をコードする核酸、及びインフルエンザウイルス粒子自体、組換えインフルエンザウイルスタンパク質（インフルエンザエンベロープタンパク質を含む）、サブウイルス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＶＬＰ複合体、及び／又はその一部を含む。

好ましくは、本発明の方法で製造されるインフルエンザタンパク質は、インフルエンザウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、ブタインフルエンザ（Ａ／ブタ（Ｈ１Ｎ２）Ｂａｋｕｍ／１８３２／００）又はウマインフルエンザ（Ａ／ウマ、Ａ／Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ／１／９３（Ｈ３Ｎ８））のタンパク質又は誘導体である。

本発明の方法で製造される、インフルエンザウイルスタンパク質又はその一部をコードする核酸の単離及び精製は、一般的な方法で行われ、当業者に公知である。

本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスタンパク質の単離及び精製は、当業者に公知の方法で行われる。タンパク質の精製処理は、まず、その由来に依存する。細胞内タンパク質と細胞外タンパク質は区別される。タンパク質が細胞体内にある場合、まず、例えば、剪断力又は浸透圧溶解（Ｏｓｍｏｌｙｓｅ）による細胞の分解が必要である。その後、例えば、細胞膜及び細胞壁などの不溶性材料の分離を、例えば、遠心分離により行う。遠心分離は、細胞内小器官及びタンパク質の分離に標準的に使用される。分離能力に関して有効な方法は、パルス電気泳動である。さらに、他の細胞成分を分離した後、大きさの異なるタンパク質、ペプチド及びアミノ酸を分離する必要もある。タンパク質の分離は、一次元もしくは二次元ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動で行うことができる。アミノ酸及びペプチドの領域では、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）又は逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）などのクロマトグラフィー法を使用する。脂質の存在及びプロテアーセの分離又は失活の必要性は精製に悪影響を及ぼす。細胞外基質中に存在するタンパク質が細胞から抽出されてはならないが、全ての不溶性成分を分離した後、非常に希薄な状態で、通常は細胞内タンパク質より明らかに少量で存在する。

本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルス粒子の単離及び精製には、当業者に周知の方法が使用される。これらの方法の例としては、密度勾配−分画遠心分離又はゾーン遠心分離がある。

本発明の方法に使用される永久ヒト細胞は、初代ヒト細胞の不死化により生じる。初代ヒト細胞は、生物又は生物から採取した組織から直接採取することにより得られ、培養に供される。好ましくは、細胞形質転換因子を発現させることにより永久ヒト細胞株にうまく変化させることができるこのような初代ヒト細胞は、特に、羊膜細胞、胚性網膜細胞及び神経由来の胚性細胞である。

細胞形質転換因子は、ＳＶ４０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４００）のＴ抗原、ＨＰＶのＥ６及びＥ７遺伝子産物（例えば、ＨＰＶ１６、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｋ０２７１８）ならびにヒトアデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子産物（例えば、ヒトアデノウイルス血清型５、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０２９９６）であってもよい。ヒトアデノウイルスのＥ１の発現により不死化させるために、初代細胞にＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子産物の両方の核酸配列をトランスフェクションする。天然に存在するＨＰＶにより発現する場合、Ｅ６及びＥ７はＲＮＡ転写により発現し得る。天然に存在するアデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂの発現についても同様のことが言える。例えば、アデノウイルスＥ１遺伝子機能などの細胞形質転換因子により不死化又は形質転換が起こり、従って細胞が永続的に培養可能となる。

細胞形質転換因子の発現は、相同プロモーター又は転写終結要素、例えば、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子機能発現のための天然のＥ１Ａプロモーター及び天然のＥ１Ａポリアデニル化部位の制御下で行うことができる。これは、トランスフェクションに利用される核酸分子が、各ウイルスゲノム、例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂなどの前述の遺伝子機能を有するアデノウイルスゲノムのフラグメントを含有することにより達成することができる。しかし、細胞形質転換因子の発現は、非相同の、天然には使用されるコード領域と一緒に存在しないプロモーター又は転写終結要素の制御下で行うこともできる。非相同プロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター（Ｍａｋｒｉｄｅｓ（Ｈｒｓｇ．），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，２００３中のＭａｋｒｉｄｅｓ，９−２６）、ＥＦ−１αプロモーター（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ９１：２１７−２２３，１９９０）、ＣＡＧプロモーター（第１イントロンを有する、ヒトサイトメガロウイルスの最初期エンハンサーと改変ニワトリβ−アクチンプロモーターとに由来するハイブリッドプロモーター）（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０８：１９３−１９９，１９９１）、ヒト又はマウスｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター（Ａｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６０：６５−７４，１９８７）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，９−２６：Ｍａｋｒｉｄｅｓ（Ｈｒｓｇ．），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，２００３）又はＳＶ４０（シミアンウイルス４０）プロモーター（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，９−２６：Ｍａｋｒｉｄｅｓ（Ｈｒｓｇ．），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，２００３）を使用することができる。ポリアデニル化部位としては、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４００）又はヒトＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）遺伝子（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｕｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５３２２，１９９０）のポリアデニル化配列を使用することができる。

初代ヒト細胞に、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする核酸配列を含む核酸分子をトランスフェクションすることにより細胞を不死化する。初代ヒト細胞の不死化に使用される核酸分子は、好ましくはヒトアデノウイルス、特にヒトアデノウイルス血清型５に由来する、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ核酸配列を含む。好ましい実施形態では、不死化に使用される核酸分子は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする核酸配列の他に、アデノウイルスｐＩＸ遺伝子機能をコードする核酸配列も含む。ウイルス構造タンパク質であるｐＩＸポリペプチドは、様々なウイルス及び細胞プロモーター、例えば、チミジンキナーゼプロモーター及びβ−グロブリンプロモーターなどに対して転写活性化因子として作用する。組換えポリペプチドをコードする配列が前述のプロモーターの１つの制御下にある場合、さらに細胞内で発現されるｐＩＸ−ポリペプチドの転写活性化作用により、本発明の産生細胞株において組換えポリペプチドの発現率を上昇させることができる。例示的配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０２９９６にある。特に、核酸分子は、ヒトアデノウイルス血清型５のヌクレオチド１〜４３４４、５０５〜３５２２又はヌクレオチド５０５〜４０７９を含む。

好ましい実施形態では、初代細胞、特に羊膜細胞を不死化するための核酸分子は、アデノウイルス血清型５ヌクレオチド配列のヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド４０７９を含有する。他の特に好ましい実施形態では、初代細胞、特に羊膜細胞を不死化するための核酸分子は、アデノウイルス血清型５ヌクレオチド配列のヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド３５２２を含有する。他の特に好ましい実施形態では、初代細胞、特に羊膜細胞を不死化するための核酸分子は、ＨＥＫ２９３細胞のアデノウイルスＤＮＡに対応するアデノウイルス血清型５ヌクレオチド配列のヌクレオチド１〜ヌクレオチド４３４４を含有する（Ｌｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３３：４２３−４２９，１９９７）。さらに、不死化されたヒト細胞は、ウイルス複製因子を発現することができる。これらの複製因子は、トランスフェクションにより導入される核酸分子の複製起点（ｏｒｉ、「ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」）に結合し、それによりエピソーム核酸分子の複製を開始することができる。細胞中での核酸分子、特にプラスミドＤＮＡのエピソーム複製により、移入された核酸分子のコピー数が著しく増加し、それによりこの分子でコードされる組換えポリペプチドの発現が上昇すると共に多数の細胞分裂にわたりそれが維持される。このようなウイルス複製因子には、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のＴ抗原があり、これは、核酸分子、例えば、プラスミドＤＮＡ上のＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ ｏｒｉ、ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）と称される配列に結合した後、その複製を開始する。エプスタイン−バール（Ｅｂｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルスタンパク質ＥＢＮＡ−１（エプスタイン−バールウイルス核抗原−１）は、ｏｒｉ−Ｐと称される複製開始点を認識し、ｏｒｉ−Ｐを有する核酸分子の染色体外複製を触媒する。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のＴ抗原は、複製因子として複製を活性化するだけではなく、同様に幾つかのウイルス遺伝子及び細胞遺伝子の転写に対して活性化作用も有する（Ｂｒａｄｙ，Ｊｏｈｎ ａｎｄ Ｋｈｏｕｒｙ，Ｇｅｏｒｇｅ，１９８５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．６，ｐ．１３９１ ｔｏ １３９９）。

本発明の方法に使用される不死化されたヒト細胞は、特に、不死化されたヒト羊膜細胞である。好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される不死化されたヒト細胞は、ＳＶ４０のラージＴ抗原又はエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）を発現する。特に好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される不死化されたヒト羊膜細胞は、ＳＶ４０のラージＴ抗原又はエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）を発現する。他の特に好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される不死化されたヒト細胞、特に羊膜細胞は、ＣＡＧプロモーター、ＲＳＶプロモーター又はＣＭＶプロモーターの制御下でＳＶ４０のラージＴ抗原を発現する。

本発明の方法に使用される永久ヒト羊膜細胞は、特に特許明細書、欧州特許第１２３０３５４号明細書及び欧州特許第１９４８７８９号明細書に記載されている。特に好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される永久ヒト羊膜細胞は、ＣＡＰ又はＣＡＰ−Ｔである。

ＣＡＰ細胞の場合、初代羊膜細胞に、マウスｐｇｋプロモーター、Ａｄ５配列のｎｔ．５０５−３５２２（全Ｅ１領域を含有する）、ＳＶ４０の３’スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナル、ならびにＡｄ５のｐＩＸ領域（ｎｔ．３４８５−４０７９）を含有するプラスミドをトランスフェクションした。このプラスミドは、既に欧州特許第１９４８７８９号明細書に詳細に記載されている。

ＣＡＰ−Ｔ細胞を製造するために、ＳＶ４０由来のイントロンとポリアデニル化部位が隣接したＳＶ４０のＴ抗原用発現カセットを含むプラスミドをＣＡＰ細胞にトランスフェクションした。さらに、プラスミドは、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターとからなるハイブリッドプロモーター）（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０８：１９３−１９９，１９９１）、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス由来のプロモーター）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＱ０７５９３５）又はＣＭＶプロモーター（ヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーター）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含有することができる。安定な細胞株を作製するために、プラスミドは、ユビキチンプロモーターを有するブラストサイジン発現カセット（ｐＵＢ／Ｂｓｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｖ５１２−２０）を含有する。

さらに、本発明は、ヒト細胞、特に羊膜細胞を懸濁液中で増殖させることができる本発明の方法も提供する。さらに、本発明の方法では、ヒト細胞、特に羊膜細胞を血清非含有培地中で培養することができる。

本発明の他の対象は、インフルエンザウイルスをベースにするワクチンを製造するための永久ヒト細胞、特に羊膜細胞の使用である。

好ましい実施形態では、インフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造に使用される永久ヒト羊膜細胞はＣＡＰ細胞又はＣＡＰ−Ｔ細胞である。

本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスをベースにするワクチンは、インフルエンザウイルス及び／又はインフルエンザウイルスタンパク質もしくはインフルエンザタンパク質をコードする核酸分子であってもよい。ワクチンは、注射器で非経口投与することができる。この場合、皮内、皮下又は筋肉内注射は区別される。皮内注射は噴射式注射器又はランセットで行うことができる。筋肉内注射は、上腕、上腿、又は臀筋に行うことができる。さらに、ワクチンは経口投与また経鼻投与することができる。ワクチンは、例えば、ヒト及び動物に投与することができる。

本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスをベースにするワクチンは、能動免疫化でも受動免疫化でも、１種類以上のインフルエンザウイルスに対する耐性を付与することができる。能動免疫化の場合、ワクチンは、投与後、特定のウイルスに関してヒト及び動物の免疫系を特異的に活性化する役割を果たす。ここで、免疫反応を惹起するウイルス又はその特異的抗原が存在する場合、免疫系の反応が利用される。これにより抗体及び特殊なヘルパーＴ細胞が形成され、この後、それらはウイルスに応じて数年〜生涯持続し得る、各疾患に対する長期間持続する防御を提供する。

本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスをベースにするワクチンは、例えば、生菌ワクチン又は死菌ワクチンであってもよい。生菌ワクチンは、例えば、疾患を引き起こすおそれがない弱毒化された、まだ増殖能力のあるウイルスを含有する。それに対して、死菌ワクチンの場合、これらのウイルスは死滅されたか、又はそれはウイルス（抗原）の断片だけを含有する。ウイルスの不活化（死滅）は、例えば、化学物質／物質の組み合わせ、例えば、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン及びソラレンで行う。その場合、ウイルスエンベロープは保有されている。また、ウイルスの毒素の生物学的に不活性な成分（トキソイド）だけを含有するトキソイドワクチン（例えば、破傷風トキソイド）もあり、これも同様に死菌ワクチンに挙げられる。特に、死菌ワクチンは、ウイルスエンベロープタンパク質の断片からなるスプリットワクチンであってもよい。ウイルスエンベロープの破壊（分解）は、例えば、界面活性剤又は強有機溶媒で行うことができる。また、ウイルスをさらに化学物質で不活化（死滅）させることもできる。さらに、例えば、ヘマグルチニンタンパク質及びノイラミニダーゼタンパク質などのウイルスの特異的成分からなるサブユニットワクチンも死菌ワクチンに挙げられる。

受動免疫化の場合、本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスをベースにするワクチンを宿主（例えば、哺乳動物）に投与し、惹起された抗血清を得、少なくとも１種類のインフルエンザウイルスに感染しているレシピエントに投与する。

さらに、ワクチンは、投与するために、安定化剤、中和剤、担体、及び保存剤などの１種類以上の添加剤と混合される。これらの物質には、とりわけ、ホルムアルデヒド、チオメルサール、リン酸アルミニウム、アセトン、及びフェノールが挙げられる。さらに、ワクチンを、ワクチンの作用を増強するための補助剤と混合することができる。これらのいわゆるアジュバントは、できるだけそれ自体薬理学的作用を有していないものとし、特に、可溶化剤、エマルション又はそれらの混合物として使用される。アジュバントは、例えば、無機塩類、スクアレン混合物、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｋｔｅｒｉｅｎ）細胞壁調製物、特定のエマルション、モノホスホリル脂質Ａ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロック共重合体界面活性剤、Ｑｕｉｌ Ａ、コレラ毒素Ｂのサブユニット、ポリホスファゼン及びその誘導体、免疫賦活複合体、サイトカインアジュバント、ＭＦ５９アジュバント、脂質アジュバント、粘膜アジュバント、特定の細菌外毒素、特定のオリゴヌクレオチド及びＰＬＧである。

以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明を限定するものと解釈すべきではない。他の記載がない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２．Ａｕｆｌａｇｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているような、分子生物学の標準的方法を使用した。

実施例１：ＰＥＭ培地又は２９３ＳＦＭＩＩ培地中での永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５の培養実験
永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５を、１００ｍｌの血清非含有２９３ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＰＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、８％ＣＯ₂及び１００ｒｐｍで培養した。対照として、永久イヌ腎臓細胞株ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２（マディンダービーイヌ腎臓、懸濁液中での増殖に馴化）（Ｌｏｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１０，２８（３８）：６２５６−６４）を１００ｍｌ振盪フラスコ内にて１００ｍｌの血清非含有ＳＭＩＦ８培地中で使用した。

時点０（＝培養開始点）及び各２４時間の時間間隔で、生細胞数、死細胞数、細胞株の生存率、ならびにｐＨ値、培地中のグルコース、ラクトース、グルタミン、アンモニウム、グルタミン酸及びピルビン酸塩の濃度を測定した（生化学的マルチパラメータ解析システム）（Ｌｏｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００９，２７（３７），４９７５−４９８２；Ｇｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，８８（２）：４６１−７５）。

２９３ＳＦＭＩＩ培地及びＰＥＭ培地中での永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５の生細胞数、ならびにＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞は、培養開始時の培養物１ｍｌ当たり約２×１０⁵個から類似の推移を示し、１６８時間後に１ｍｌ当たり約２×１０⁶個の生細胞数に達した。ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の生細胞数は１９２時間以降１ｍｌ当たり９×１０⁵個に減少し、増殖曲線の開始後２４０時間まで一定のままであった。２９３ＳＦＭＩＩ培地中の永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５の生細胞数は、２１６時間の時点でようやく培養物１ｍｌ当たり２×１０⁵個の開始値に減少し、それに対してＰＥＭ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の生細胞数は、２４０時間まで安定して培養物１ｍｌ当たり約２．５×１０⁶個のままであり、３１２時間後にようやく２×１０⁵個の生細胞数の開始値に達した。

２９３ＳＦＭＩＩ培地及びＰＥＭ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の生存率、ならびにＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の生存率は、増殖曲線の開始時及び１６８時間までは、８０〜９０％の間であった。ＰＥＭ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の生存率は、２４０時間まで８０％のままであったが、その後減少し、３１２時間後にはさらに１０％を示した。２９３ＳＦＭＩＩ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の生存率は１６８時間後には既に徐々に減少し、２１６時間後には約１０％を示した。ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の生存率は、１６８時間後には減少し続け、２４０時間後には約４５％に達した。

ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の培養物のｐＨ値は、２４０時間にわたり比較的安定して７．７〜７．６のままであった。それに対して、２９３ＳＦＭＩＩ培地及びＰＥＭ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物のｐＨ値（開始時７．４）は低下し続け、２４０時間後（２９３ＳＦＭＩＩ培地）又は３１２時間（ＰＥＭ培地）後にはｐＨ６．４になった。

ラクトース濃度は、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞の各培養物の２９３ＳＦＭＩＩ培地及びＰＥＭ培地中で５ｍＭ未満の初期濃度から、２４０時間まで３０〜３５ｍＭに増加した。ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の培養物では、ラクトース濃度はあまり著しく増加しなかったが、２４０時間の時点で、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物と類似の値に達した。グルコース濃度は、２９３ＳＦＭＩＩ培地中及びＰＥＭ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養開始時点の２０〜２５ｍＭから、及びＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の培養物中でも１０ｍＭ未満に減少したが、２９３ＳＦＭＩＩ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物では最も著しい減少が認められた。

２９３ＳＦＭＩＩ培地中とＰＥＭ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物中のアンモニウム濃度の増加は、非常に類似した推移を示した（＜０．５から４〜５ｍＭ）。これと対照的に、ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の培養物中のアンモニウム濃度は、明らかに、より著しく増加した（７ｍＭ）。グルタミン濃度の減少は、２９３ＳＦＭＩＩ培地中及びＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物中で非常に類似した推移を示し、ＰＥＭ培地中では最も著しい減少が認められた。

ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の培養物は最も高いグルタミン酸濃度を有し、これは僅かしか上昇しなかった。グルタミン酸濃度は、ＰＥＭ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物中における培養の開始時には２９３ＳＦＭＩＩ培地中のものとは対照的に比較的高く、且つ上昇し続けた。ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の培養物中のピルビン酸塩濃度は、１４４時間以降、ゼロに減少した。それに対して、ＰＥＭ培地又は２９３ＳＦＭＩＩ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物では、ピルビン酸塩は４８時間後には既に消費した。

従って、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞は、ＰＥＭ培地中では２９３ＳＦＭＩＩ培地中よりも良好な増殖を示す。ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞は、最も著しいグルコース消費及び最も著しいラクトース生成を示す。１９２時間以降のグルコースの限界は、ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞の細胞数の急激な低下を説明することができる。ＰＥＭ培地又は２９３ＳＦＭＩＩ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物の培養条件を最適化するために、ｐＨ値の安定化、ピルビン酸塩及びグルタミンならびにグルコースの添加が重要な可能性がある。

実施例２：非馴化ウイルスによるウイルス感染
非馴化ウイルスによる感染実験では、羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５を５５ｍｌの血清非含有２９３ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、８％ＣＯ₂、１００ｒｐｍで振盪フラスコ内にて培養した。対照として、イヌ腎臓細胞株ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２（マディンダービーイヌ腎臓、懸濁液に馴化）を使用した。

それぞれ表１に記載した細胞密度に、ウイルスＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ＮＩＢＳＣ、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）又はＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（ＲＫＩ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｋｏｃｈ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）を、培地交換を行うことなく且つ５×１０^-6Ｕ／ｍＬのトリプシンを添加して感染させた。産生したウイルス粒子の量をヘマグルチニンの滴定（ＨＡ、標準的方法によるヘマグルチネーション試験）により測定した（ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌで表す；表１）（Ｋａｌｂｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３６（３）：１４５−６１）。表１には同様にその時点での培地の各ｐＨ値も記載している。

永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５では、ＰＥＭ培地中で培養したとき、ウイルスＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ）を感染させた場合も、ウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させた場合も、ウイルス粒子の産生を検出することはできなかった。２９３ＳＦＭ培地中におけるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）の最大ＨＡ値は、ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２中で達成される最大ＨＡ値未満である。最大ＨＡでのｐＨ値は、ＣＡＰ−１Ｄ５では全ての感染で同等であったが（ｐＨ６．６）、感染したＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞（ｐＨ７．７）より明らかに低かった。

従って、試験した条件では、永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５の感染はウイルスＢ／Ｆｌｏｒｉｄａでしか起こらなかった。それに対して、永久イヌ腎臓細胞株ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２（マディンダービーイヌ腎臓）の場合、ウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）に関してのみ感染を検出することができた。以下の実験では、ウイルスをＣＡＰ−１Ｄ５細胞に予め馴化させることにより、感染の向上、従ってウイルス収量の増加を達成できるかどうかを試験することを目的とした。

実施例３：振盪フラスコ内でのＰＥＭ培地及び２９３ＳＦＭＩＩ培地中におけるＣＡＰ−１Ｄ５細胞へのウイルス馴化
インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（ＲＫＩ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｋｏｃｈ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）、Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）（ＮＹＭＣ Ｘ−１７５Ｃ、ＮＩＢＳＣ、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）又はＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ＮＩＢＳＣ、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）のウイルス馴化は、４継代にわたり、振盪フラスコ内にてＰＥＭ培地及び２９３ＳＦＭＩＩ培地中でＣＡＰ−１Ｄ５に感染させることにより行った。各感染の前に培地交換を行った。個々の継代中のウイルス収量は、ヘマグルチニン（ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ）の滴定により、及び５０％組織培養感染量アッセイ（ＴＣＩＤ₅₀、ウイルス数／ｍｌ）により定量化した（Ｇｅｎｚｅｌ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ−ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｎｅｅｄｓ ｉｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｅｄｓ．Ｒ．Ｐｏｅｒｔｎｅｒ；ＨＵＭＡＮＡ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００７，４５７−４７３；Ｋａｌｂｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３６（３）：１４５−６１）。

ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）及びＡ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）を感染させると、ＰＥＭ培地中でも２９３ＳＦＭＩＩ−培地中でも、４継代後にウイルス力価が明らかに上昇した。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を感染させると、２９３ＳＦＭＩＩ培地中で培養した場合も、ＰＥＭ培地中で培養した場合も、第２継代でウイルス力価が明らかに上昇した。また、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）又はＡ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）を感染させた場合、ＰＥＭ培地中でも２９３ＳＦＭＩＩ培地中でも、ＨＡ値の滴定は同等の増加を示した。

馴化中にウイルス力価が上昇する他に、どの継代でもウイルスの複製が速くなり、最終的に明らかにウイルス力価を上昇させることができた。一般的に、２９３ＳＦＭＩＩ培地では、ＰＥＭ培地と比較してわずかに高いウイルス力価が達成される。

実施例４：ＣＡＰ−１Ｄ５細胞及びＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞に馴化インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４を感染させたときのＭＯＩ（感染多重度）依存性
ここで、馴化インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１；ＲＫＩ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｋｏｃｈ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）で、３つの異なるＭＯＩ（感染多重度）値（宿主細胞当たりのウイルス粒子数）０．００２５、０．０２５及び０．２５でのＭＯＩ依存性を調べた。２９３ＳＦＭＩＩ培地又はＰＥＭ培地中の永久羊膜細胞ＣＡＰ−１Ｄ５に、及びＳＭＩＦ８培地中の永久イヌ腎臓細胞ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２に、振盪フラスコ内にて馴化インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を異なるＭＯＩで感染させた。さらに感染時に培地交換を行い、それによりｐＨ＝約７．５のほぼ一定のｐＨ値にした。続いて、９６時間にわたり生細胞数を、１４４時間にわたりウイルス粒子の量（ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ）を、ヘマグルチネーション試験のヘマグルチニン滴定により標準的方法に従って測定した。

２９３ＳＦＭ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物及びＳＭＩＦ８培地中でのＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の培養物中の生細胞数の推移及び形成されたウイルス粒子の量の推移は、ＭＯＩ値に対する依存性を示さなかった。ウイルス力価は、両方の培養物で２．５ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ超に上昇した。ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物は、３つのＭＯＩ値全てについて、ウイルス粒子量の減少（約２．０ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ）を示した。それに対応して、ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物の生細胞数は、４８時間にわたり１×１０⁶個／ｍｌで一定のままとなり、その後、１×１０⁴個／ｍｌ未満に減少した。それと対照的に、２９３ＳＦＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物及びＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞培養物中の生細胞数は、一様に１×１０⁶個／ｍｌから９６時間後に１×１０⁴個／ｍｌ未満に減少した。全ての培養物で、ＭＯＩが０．００２５の場合は、ＭＯＩ値がそれより高い場合と比較して、ｌｏｇ ＨＡ単位の上昇が時間的に遅延することにより、ウイルス複製が少し遅延することが明らかに確認できた。

実施例５：感染（Ａ／ＰＲ／８／３４馴化）を行った場合の１Ｌのスケールでの培養
ＣＡＰ−１Ｄ５細胞を１リットルのバイオリアクター内にて、４ｍＭグルタミン及び４ｍＭピルビン酸塩を有するＰＥＭ培地中、８５ｒｐｍ、ｐＨ＝７．２、及び純酸素の酸素分圧ｐＯ₂４０％で培養した。出発細胞数は５×１０⁵個／ｍＬであった。

１１４時間増殖させ、細胞数２．４×１０⁶個／ｍｌとなった後、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（馴化：ＰＥＭ中、第４継代、１．７８×１０⁷ウイルス／ｍＬ）を感染させた。このとき培地交換は行わなかったが、８０ｍｌのＰＥＭ培地ならびにグルタミン及びピルビン酸塩を最終濃度各２ｍＭで添加した。ＭＯＩ値は０．０２５であり、それにトリプシンを最終濃度１×１０^-5Ｕ／ｍｌで添加した。２４０時間にわたり、各２４時間の時間間隔で、生細胞数、死細胞数、細胞株の生存率、ならびにｐＨ値、培地中のグルコース、ラクトース、グルタミン、アンモニウム、グルタミン酸及びピルビン酸塩の濃度を測定した。さらに、感染時点（１１４時間）以降、ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ及びＴＣＩＤ₅₀値を測定した（Ｇｅｎｚｅｌ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ−ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｎｅｅｄｓ ｉｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｅｄｓ．Ｒ．Ｐｏｅｒｔｎｅｒ；ＨＵＭＡＮＡ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００７，４５７−４７３；Ｋａｌｂｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３６（３）：１４５−６１）。

ＣＡＰ−１Ｄ５細胞の生細胞数は、まずインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させる時点まで６×１０⁵個／ｍｌから２．４×１０⁶個／ｍｌに増加し、感染後は、多少減少した。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞の生存率は、全時間にわたり８０〜９０％であり、２４０時間後にようやく７０％に減少した。培養物中のピルビン酸塩濃度は７２時間内にゼロに減少し、インフルエンザウイルスを感染させた場合、添加したピルビン酸塩の量も同様に１０時間内に消費した。グルタミン酸塩濃度は、全時間にわたり約１ｍＭから約１．８ｍＭに上昇した。培養物のｐＨ値は、観察時間中、７．１〜７．４で僅かに変動した。達した最大のＴＣＩＤ₅₀力価は、２．４×１０⁷ウイルス／ｍＬであり、最大ＨＡ力価は２．２ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌであった。

この増殖実験の結果から、ピルビン酸塩の添加により、グルコースの制限が起こらず、従って生細胞数が落ち込まないことが分かる。

実施例６：５０ｍｌファルコン内でのＰＥＭ培地及び２９３ＳＦＭＩＩ培地中におけるＣＡＰ−１Ｄ５細胞へのウイルス馴化
インフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１様ＨＧＲ；ＩＶＲ−１４８、ＮＩＢＳＣ、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ＮＩＢＳＣ、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ブタインフルエンザ（Ａ／ブタ（Ｈ１Ｎ２）Ｂａｋｕｍ／１８３２／００；ＩＤＴ Ｂｉｏｌｏｇｉｋａ）及びウマインフルエンザ（Ａ／ウマ２（Ｈ３Ｎ８）；Ａ／Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ／１／９３；ＮＩＢＳＣ、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）のウイルス馴化は、５０ｍｌファルコン容器内にてＰＥＭ培地及び２９３ＳＦＭＩＩ培地中でＣＡＰ−１Ｄ５に４継代にわたり感染させることにより行った。各感染の前に培地交換を行った。個々の継代中のウイルス収量をヘマグルチニン滴定（ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ）により、及び５０％組織培養感染量アッセイ（ＴＣＩＤ₅₀、ウイルス数／ｍｌ）により定量化した（Ｇｅｎｚｅｌ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ−ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｎｅｅｄｓ ｉｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｅｄｓ．Ｒ．Ｐｏｅｒｔｎｅｒ；ＨＵＭＡＮＡ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００７，４５７−４７３；Ｋａｌｂｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３６（３）：１４５−６１）。

ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を感染させると、ＰＥＭ培地中でも２９３ＳＦＭＩＩ培地中でも４継代後にウイルス力価が明らかに上昇したが、２９３ＳＦＭＩＩ培地中のウイルス力価の上昇の方が著しい。また、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７又はＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を感染させた場合、ＰＥＭ培地でも２９３ＳＦＭＩＩ培地でも、ＨＡ値の滴定は同等の増加を示した。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にブタインフルエンザウイルスを感染させた場合、ＰＥＭ培地でも２９３ＳＦＭＩＩ培地でも、ＨＡ値の滴定が増加する。

馴化中にウイルス力価が上昇する他に、各継代でウイルスの複製も速くなり、最終的にウイルス力価を明らかに上昇させることができた。一般的に、２９３ＳＦＭＩＩ培地では、ＰＥＭ培地と比較してわずかに高いウイルス力価が達成される。

実施例７：出発細胞数を増加した場合の永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５の培養実験
永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５を、１００ｍｌのＰＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、８％ＣＯ₂及び１８５ｒｐｍで培養した。出発細胞数は、５×１０⁵個／ｍｌ又は８×１０⁵個／ｍｌであった。さらに、出発細胞数を増加した調製物（Ａｎｓａｅｔｚ）にピルビン酸塩を最終濃度４ｍＭ又は１０ｍＭで、及び他のアミノ酸を添加した。

時点０（＝培養開始点）及び各２４時間の時間間隔で、生細胞数、死細胞数、細胞株の生存率、ならびにｐＨ値、培地中のグルコース、ラクトース、グルタミン、アンモニウム、グルタミン酸及びピルビン酸塩の濃度（生化学的マルチパラメータ解析システム）を測定した（Ｌｏｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００９，２７（３６），４９７５−４９８２；Ｇｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，８８（２）：４６１−７５）。

培養開始時点の出発細胞数を、ＰＥＭ培地中の永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５の培養物１ｍｌ当たり約５×１０⁵個から、培養物１ｍｌ当たり８×１０⁵個に増加することにより、９０時間後に培養物１ｍｌ当たり１×１０⁶個の高収量を達成した。それにより、通常の感染時点（培養開始点の約９６時間後〜１２０時間後）で培養物１ｍｌ当たり５〜６×１０⁶個の細胞数を達成した。

培養物のｐＨ値は、通常の感染時点（培養開始点の約９６時間後〜１２０時間後）では、どちらかと言えば臨界域の６．６〜６．８であった。好ましくは、感染時のｐＨ値は約７．２〜７．４である。

実施例８：トリプシン活性の変化及び培地交換又は培地による１：２希釈の実施のウイルス力価に対する影響
この実験では、ウイルス感染時の様々なトリプシン濃度の使用及び培地交換又は培地での１：２希釈がウイルス力価にどのような影響を及ぼすかを調べることを目的とした。

永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５を、各４ｍＭのピルビン酸塩及びグルタミンを有する１００ｍｌのＰＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、８％ＣＯ₂及び１８５ｒｐｍで、振盪フラスコ内にて培養した。培養開始時点で細胞株に、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞に馴化させたＡ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１；ＲＫＩ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｋｏｃｈ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）を感染させた。培養物中の細胞数は、感染前に培地交換を行わなかった場合、感染時点で４．５×１０⁶個／ｍｌ培養物であり、又は感染前にＰＥＭ培地で１：２希釈を行った場合、２．３×１０⁶個／ｍｌ培養物であり、感染前に完全培地交換を行った場合、５×１０⁶個／ｍｌであった。さらに、培地交換を行わず、ＰＥＭ培地で１：２希釈した培養物では、１×１０^-4Ｕ／細胞、３×１０^-5Ｕ／細胞及び５×１０^-5Ｕ／細胞のトリプシン濃度を使用した。完全培地交換を行った培養物では、１×１０^-4Ｕ／細胞、１×１０^-5Ｕ／細胞、５×１０^-5Ｕ／細胞及び１×１０^-6Ｕ／細胞のトリプシン濃度を使用したか又はトリプシンを使用しなかった。

培地交換を行わなかった培養物の２．３０ｌｏｇ ＨＡに対し、新鮮ＰＥＭ培地で１：２希釈するとＨＡの上昇が早くなり（２４時間ではなく約１２時間になり）、且つＨＡの最大値が２．７０ｌｏｇ ＨＡと高くなる。完全培地交換を行うと、３．０ｌｏｇ ＨＡを超える高いＨＡ値になった。

培地交換を行わない培養物とＰＥＭ培地で１：２希釈を行った培養物では、ｌｏｇ ＨＡ値は、トリプシン濃度に依存せず非常に類似した推移を示す。完全培地交換を行った培養物では、トリプシン濃度が１×１０^-5Ｕ／細胞、５×１０^-5Ｕ／細胞及び１×１０^-6Ｕ／細胞の場合、ｌｏｇ ＨＡ値の推移は非常に類似している。トリプシンを含まない培養物では、ｌｏｇ ＨＡ値は約２ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌの値にしか達せず、１×１０^-4Ｕ／細胞のトリプシンを感染に使用した培養物では、ｌｏｇ ＨＡ値は１ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ未満であった。

実施例９：感染の前に培地交換を行った場合と行わなかった場合の、様々な馴化インフルエンザウイルス株をＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞に感染させたときのＭＯＩ（感染多重度）依存性
本実験で、ＭＯＩ値、即ち、感染に使用されるウイルス粒子数と感染されるＣＡＰ−１Ｄ５細胞数の数比と、ウイルス力価（培養物１００μｌ当たりのｌｏｇ ＨＡ単位で表す）との依存性を調べた。

このために、永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５を、各４ｍＭのピルビン酸塩及びグルタミンを有する５０ｍｌのＰＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、８％ＣＯ₂及び１８５ｒｐｍで、振盪フラスコ内にて培養した。感染の前に培養物の培地交換を行わなかった場合と、培地交換を行った場合の両方についてＭＯＩ依存性を調べた。３つの異なる馴化インフルエンザ株：Ａ／ＰＲ／８／３４（ＲＫＩ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｋｏｃｈ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（ＩＶＲ−１４８、ＮＩＢＳＣ、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ＮＩＢＳＣ、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を使用した。感染は、５０ｍＬ振盪フラスコ内で、接種時の細胞濃度４．９×１０⁶個／ｍＬ（培地交換を行わなかった場合）及び５．０×１０⁶個／ｍＬ（培地交換を行った場合）で行った。感染は、培地交換を行わなかった場合、ＭＯＩ値０．２５又は０．１０（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅインフルエンザウイルスの場合）、０．０２５及び０．００２５で、培地交換を行った場合、ＭＯＩ値０．１０又は０．０６（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅインフルエンザウイルスの場合）、０．０２５及び０．００２５で行った。トリプシン活性は、培地交換を行わなかった場合、１×１０^-4Ｕ／細胞であり、培地交換を行った場合、１×１０^-6Ｕ／細胞であった。続いて、１４４時間にわたり、ウイルス粒子の量（ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ）を測定した（Ｋａｌｂｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３６（３）：１４５−６１）。

培地交換を行うと、ウイルス複製の結果が比較的一様になる。培地交換を行わずにンフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させた細胞の場合と、培地交換を行ってインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅを感染させた細胞の場合だけ低いＭＯＩ依存性が認められた。培地交換を行った場合の方が、明らかに、より高いｌｏｇ ＨＡ値を達成できる。ｐＨ値は、培地交換を行わなかった場合、一部臨界域の６．６〜６．８であり、培地交換を行った場合、７．３〜７．５である。

実施例１０：感染（Ａ／ＰＲ／８／３４馴化）を行った場合の１ＬのスケールのＳＴＲバイオリアクター及びＷａｖｅバイオリアクター内での継続的培養
一調製物（Ｂ１６）では、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞を１リットルのバイオリアクターＳＴＲ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）内にて、４ｍＭグルタミン及び４ｍＭピルビン酸塩を有するＰＥＭ培地中、１２０ｒｐｍ、ｐＨ＝７．２、及び純酸素の酸素分圧ｐＯ₂４０％で培養した。出発細胞数は５×１０⁵個／ｍＬであった。７２．７５時間増殖させ、細胞数が２．１×１０⁶個／ｍｌとなった後、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（馴化：ＰＥＭ中、第４継代、２．０１×１０⁶ウイルス／ｍＬ）を感染させた。その場合、培地交換は行わなかった。ＭＯＩ値は０．０２５であり、それにトリプシンを最終濃度３×１０^-5Ｕ／ｍＬで添加した。

別の調製物（Ｂ２６）では、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞を１リットルのバイオリアクターＳＴＲ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）内にて、ＰＥＭ培地中、１２０ｒｐｍ、ｐＨ＝７．４〜７．２及び純酸素の酸素分圧ｐＯ₂４０％で培養した。出発細胞数は８×１０⁵個／ｍＬであった。９２時間増殖させた後、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（馴化：ＰＥＭ中、第４継代、３．７５×１０⁶ウイルス／ｍＬ）を感染させた。予め完全培地交換を行い、ｐＨ値を７．６に調整した。ＭＯＩ値は０．０２５であり、それにトリプシンを最終濃度３×１０^-5Ｕ／ｍｌで添加した。

第３の調製物（ｗａｖｅ）では、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞を、１リットルのＷａｖｅバイオリアクター（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ）内にて、４ｍＭグルタミン、４ｍＭピルビン酸塩及び２０ｍＭグルコースを有するＰＥＭ培地中、回転数（Ｗｉｐｐｆｒｅｑｕｅｎｚ）１３ｒｐｍ、角度７°、ｐＨ＝７．３〜６．９、純酸素の酸素分圧ｐＯ₂４０％及びＣＯ₂分圧７．５％で培養した。出発細胞数は５×１０⁵個／ｍＬであった。７２時間増殖させた後、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（馴化：ＰＥＭ中、第４継代、１．８７×１０⁶個／ｍｌ）を感染させた。感染前の細胞数は２．１×１０⁶個／ｍｌであった。この場合、培地交換は行わなかった。ＭＯＩ値は０．０２５であり、それにトリプシンを最終濃度３×１０^-5Ｕ／ｍＬで添加した。

第４の調製物では、ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞を１リットルのバイオリアクターＳＴＲ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）内にてＡＥＭ培地中で培養した。出発細胞数は５×１０⁵個／ｍＬであった。１１８．２５時間増殖させた後、ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させた（Ｌｏｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１０，２８（３８）：６２５６−６４）。

１９２時間にわたり、生細胞数及び死細胞数、ならびにｐＨ値、培地中のグルコース、ラクトース、グルタミン、アンモニウム、グルタミン酸及びピルビン酸塩の濃度を測定した。さらに、感染時点以降、ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ及びＴＣＩＤ₅₀値を測定した（Ｇｅｎｚｅｌ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ−ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｎｅｅｄｓ ｉｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｅｄｓ．Ｒ．Ｐｏｅｒｔｎｅｒ；ＨＵＭＡＮＡ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００７，４５７−４７３；Ｋａｌｂｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３６（３）：１４５−６１）。

ＣＡＰ−１Ｄ５細胞は、３つの全ての調製物で、ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞と比較して、速く、高密度に増殖する。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物中のウイルス力価は、ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌの値が最大で約２．５に達する。ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞培養物のウイルス力価は、ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌの最大値が約３に達する。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物中のウイルス力価は、ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞培養物中のウイルス力価と比較して、明らかに早く上昇した。

実施例１１：感染前に完全培地交換又は１：１培地交換を行った場合の、振盪フラスコ内におけるＰＥＭ培地又は２９３ＳＦＭＩＩ培地中でのウイルス収量を増加させるための培養実験
振盪フラスコ内で培養されるＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物中でのウイルス収量を最適化するために、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞を２９３ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、１：１培地交換又は完全培地交換を行った。

永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５を、４ｍＭグルタミン及び４ｍＭピルビン酸塩を有する５０ｍｌのＰＥＭ培地中、３７℃、８％ＣＯ₂及び１００ｒｐｍで、１００ｍｌ振盪フラスコ内にて培養した。細胞に馴化インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４をＭＯＩ０．０２５で感染させる前に、培地交換を行った。１：１培地交換を行う場合、細胞の感染時に、トリプシンを１×１０^-5Ｕ／細胞の濃度で使用する。完全培地交換を行う場合、細胞の感染時に、トリプシンを１×１０^-6Ｕ／細胞の濃度で使用する。培地交換は、ＰＥＭ培地でも、２９３ＳＦＭＩＩ培地でも行った。感染時の細胞濃度は、５×１０⁶個／ｍｌであった。

７２時間にわたり、生細胞数、生存率、ｐＨ値、及び、標準的方法に従ったヘマグルチニンの滴定によるｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌを測定した（Ｌｏｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００９，２７（３６），４９７５−４９８２；Ｇｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，８８（２）：４６１−７５）。

インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させる前に完全培地交換を行った細胞培養物中では、１：１培地交換を行った細胞培養物と比較して、ウイルス力価が速く増加した。さらに、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させる前に完全培地交換を行った細胞培養物のウイルス力価は、１：１培地交換を行った細胞培養物と比較して、高い最大ウイルス力価に達した。

感染前に完全培地交換を行った細胞培養物の生細胞数は、２４時間後に５×１０⁶個／ｍｌから急に減少し、４８時間後にはさらに約２×１０⁴個／ｍｌとなった。ＰＥＭ培地を用い、感染前に１：１培地交換を行った細胞培養物では減少が最も隠微であり、このとき７２時間後の生細胞数はまだ約７×１０⁵個／ｍｌであった。

ｐＨ値は、全ての細胞培養物中で、７２時間の全時間にわたり７．６〜７．２であった。

結果を図１に示す。２９３ＳＦＭＩＩ培地及びＰＥＭ培地中での永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５の生細胞数、ならびにＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞は、培養開始時の培養物１ｍｌ当たり約２×１０⁵個から類似の推移を示し、１６８時間後に１ｍｌ当たり約２×１０⁶個の生細胞数に達した。ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の生細胞数は１９２時間以降１ｍｌ当たり９×１０⁵個に減少し、増殖曲線の開始後２４０時間まで一定のままであった。２９３ＳＦＭＩＩ培地中の永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５の生細胞数は、２１６時間の時点でようやく培養物１ｍｌ当たり２×１０⁵個の開始値に減少し、それに対してＰＥＭ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の生細胞数は、２４０時間まで安定して培養物１ｍｌ当たり約２．５×１０⁶個のままであり、３１２時間後にようやく２×１０⁵個の生細胞数の開始値に達した。

結果を図２に示す。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）及びＡ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）を感染させると、ＰＥＭ培地中でも２９３ＳＦＭＩＩ−培地中でも、４継代後にウイルス力価が明らかに上昇した。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を感染させると、２９３ＳＦＭＩＩ培地中で培養した場合も、ＰＥＭ培地中で培養した場合も、第２継代でウイルス力価が明らかに上昇した。また、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）又はＡ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）を感染させた場合、ＰＥＭ培地中でも２９３ＳＦＭＩＩ培地中でも、ＨＡ値の滴定は同等の増加を示した。

結果を図３に示す。２９３ＳＦＭ培地中でのＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物及びＳＭＩＦ８培地中でのＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞の培養物中の生細胞数の推移及び形成されたウイルス粒子の量の推移は、ＭＯＩ値に対する依存性を示さなかった。ウイルス力価は、両方の培養物で２．５ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ超に上昇した。ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物は、３つのＭＯＩ値全てについて、ウイルス粒子量の減少（約２．０ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌ）を示した。それに対応して、ＰＥＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞の培養物の生細胞数は、４８時間にわたり１×１０⁶個／ｍｌで一定のままとなり、その後、１×１０⁴個／ｍｌ未満に減少した。それと対照的に、２９３ＳＦＭ培地中のＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物及びＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞培養物中の生細胞数は、一様に１×１０⁶個／ｍｌから９６時間後に１×１０⁴個／ｍｌ未満に減少した。全ての培養物で、ＭＯＩが０．００２５の場合は、ＭＯＩ値がそれより高い場合と比較して、ｌｏｇ ＨＡ単位の上昇が時間的に遅延することにより、ウイルス複製が少し遅延することが明らかに確認できた。

結果を図４に示す。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞の生細胞数は、まずインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させる時点まで６×１０⁵個／ｍｌから２．４×１０⁶個／ｍｌに増加し、感染後は、多少減少した。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞の生存率は、全時間にわたり８０〜９０％であり、２４０時間後にようやく７０％に減少した。培養物中のピルビン酸塩濃度は７２時間内にゼロに減少し、インフルエンザウイルスを感染させた場合、添加したピルビン酸塩の量も同様に１０時間内に消費した。グルタミン酸塩濃度は、全時間にわたり約１ｍＭから約１．８ｍＭに上昇した。培養物のｐＨ値は、観察時間中、７．１〜７．４で僅かに変動した。
達した最大のＴＣＩＤ₅₀力価は、２．４×１０⁷ウイルス／ｍＬであり、最大ＨＡ力価は２．２ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌであった。

結果を図５に示す。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を感染させると、ＰＥＭ培地中でも２９３ＳＦＭＩＩ培地中でも４継代後にウイルス力価が明らかに上昇したが、２９３ＳＦＭＩＩ培地中のウイルス力価の上昇の方が著しい。また、ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７又はＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を感染させた場合、ＰＥＭ培地でも２９３ＳＦＭＩＩ培地でも、ＨＡ値の滴定は同等の増加を示した。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞にブタインフルエンザウイルスを感染させた場合、ＰＥＭ培地でも２９３ＳＦＭＩＩ培地でも、ＨＡ値の滴定が増加する。

結果を図６に示す。培養開始時点の出発細胞数を、ＰＥＭ培地中の永久羊膜細胞株ＣＡＰ−１Ｄ５の培養物１ｍｌ当たり約５×１０⁵個から、培養物１ｍｌ当たり８×１０⁵個に増加することにより、９０時間後に培養物１ｍｌ当たり１×１０⁶個の高収量を達成した。それにより、通常の感染時点（培養開始点の約９６時間後〜１２０時間後）で培養物１ｍｌ当たり５〜６×１０⁶個の細胞数を達成した。

結果を図７に示す。培地交換を行わなかった培養物の２．３０ｌｏｇ ＨＡに対し、新鮮ＰＥＭ培地で１：２希釈するとＨＡの上昇が早くなり（２４時間ではなく約１２時間になり）、且つＨＡの最大値が２．７０ｌｏｇ ＨＡと高くなる。完全培地交換を行うと、３．０ｌｏｇ ＨＡを超える高いＨＡ値になった。

結果を図８に示す。培地交換を行うと、ウイルス複製の結果が比較的一様になる。培地交換を行わずにンフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させた細胞の場合と、培地交換を行ってインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅを感染させた細胞の場合だけ低いＭＯＩ依存性が認められた。培地交換を行った場合の方が、明らかに、より高いｌｏｇ ＨＡ値を達成できる。ｐＨ値は、培地交換を行わなかった場合、一部臨界域の６．６〜６．８であり、培地交換を行った場合、７．３〜７．５である。

結果を図９に示す。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞は、３つの全ての調製物で、ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞と比較して、速く、高密度に増殖する。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物中のウイルス力価は、ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌの値が最大で約２．５に達する。ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞培養物のウイルス力価は、ｌｏｇ ＨＡ単位／１００μｌの最大値が約３に達する。ＣＡＰ−１Ｄ５細胞培養物中のウイルス力価は、ＭＤＣＫ．ＳＵＳ２細胞培養物中のウイルス力価と比較して、明らかに早く上昇した。

結果を図１０に示す。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させる前に完全培地交換を行った細胞培養物中では、１：１培地交換を行った細胞培養物と比較して、ウイルス力価が速く増加した。さらに、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４を感染させる前に完全培地交換を行った細胞培養物のウイルス力価は、１：１培地交換を行った細胞培養物と比較して、高い最大ウイルス力価に達した。

Claims (15)

1. インフルエンザウイルスをベースとするワクチンの製造方法であって、
   ａ）インフルエンザウイルスを永久ヒト羊膜細胞と接触させる工程、
   ｂ）前記永久ヒト羊膜細胞を培養する工程、
   ｃ）前記インフルエンザウイルスの発現を可能にする工程、及び
   ｄ）前記インフルエンザウイルスを前記培地から単離する工程、
   を含むことを特徴とする方法。
2. インフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法であって、
   ａ）インフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子を永久ヒト羊膜細胞と接触させる工程、
   ｂ）前記永久ヒト羊膜細胞を培養する工程、
   ｃ）インフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子の複製、及び／又は前記インフルエンザウイルスタンパク質の発現を可能にする工程、及び
   ｄ）前記インフルエンザタンパク質をコードする核酸分子及び／又は前記インフルエンザウイルスタンパク質を前記培地から単離する工程、
   を含むことを特徴とする方法。
3. 前記永久ヒト羊膜細胞が、前記インフルエンザウイルス又は前記インフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子と接触する時点で、指数関数的増殖期及び静止増殖期にあるか、又はそれらの間にある、請求項１又は２に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。
4. 前記工程ｄ）の前記インフルエンザウイルスを前記培地から単離する工程が、密度勾配−分画遠心分離又はゾーン遠心分離で行われる、請求項１に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。
5. 前記工程ｄ）の前記インフルエンザウイルスタンパク質を前記培地から単離する工程が、電気泳動法又はクロマトグラフィー法を用いて行われる、請求項２に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。
6. 前記永久ヒト羊膜細胞が、前記アデノウイルス遺伝子産物Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。
7. 前記アデノウイルス遺伝子産物Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂが、前記ヒトアデノウイルス血清型５のヌクレオチド１〜４３４４、５０５〜３５２２又はヌクレオチド５０５〜４０７９を含む、請求項４に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。
8. 前記永久ヒト羊膜細胞が、前記アデノウイルス遺伝子産物ｐＩＸを発現する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。
9. インフルエンザウイルス又はインフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子と接触させる前に、完全培地交換又は培地による１：２希釈を行う、請求項１〜８のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。
10. インフルエンザウイルス又はインフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子と接触させるとき、１×１０^-4Ｕ／細胞、１×１０^-5Ｕ／細胞、３×１０^-5Ｕ／細胞、５×１０^-5Ｕ／細胞又は１×１０^-6Ｕ／細胞のトリプシン濃度を添加する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。
11. インフルエンザウイルスと接触させるとき、０．００１〜０．３の範囲のＭＯＩ値として記載されるウイルス量を使用する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。
12. インフルエンザウイルスをベースにするワクチンを製造するための永久ヒト羊膜細胞の使用。
13. 前記永久ヒト羊膜細胞が前記アデノウイルス遺伝子産物Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現する、請求項５に記載の使用。
14. 前記永久ヒト羊膜細胞が前記アデノウイルス遺伝子産物ｐＩＸを発現する、請求項５又は６に記載の使用。
15. 前記アデノウイルス遺伝子産物Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂが前記ヒトアデノウイルス血清型５のヌクレオチド１〜４３４４、５０５〜３５２２又はヌクレオチド５０５〜４０７９を含む、請求項６に記載の使用。