RU2181295C1 - Вирионная цитомегаловирусная вакцина и способ ее получения - Google Patents
Вирионная цитомегаловирусная вакцина и способ ее получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2181295C1 RU2181295C1 RU2000132685A RU2000132685A RU2181295C1 RU 2181295 C1 RU2181295 C1 RU 2181295C1 RU 2000132685 A RU2000132685 A RU 2000132685A RU 2000132685 A RU2000132685 A RU 2000132685A RU 2181295 C1 RU2181295 C1 RU 2181295C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cytomegalovirus
- virus
- cells
- vaccine
- virion
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Для получения цельновирионной вакцины против цитомегаловируса человека используют штамм АД-169, вирус выращивают на монослое дипломных клеток, предварительно помещенных в среду роста. Адсорбцию вируса осуществляют на клетках с последующим добавлением среды поддержки. Высвобождение вируса из клеток происходит в однократном цикле замораживания монослоя и оттаивания. Очистку вакцины от детрита производят при низкоскоростном центрифугировании. В качестве клеточной культуры используются диплоидные клетки фибробластов человека (линия М-22) или культура клеток почек зеленых мартышек Vero-B. Цитомегаловирус инактируют формалином в концентрации 1: 2000 при 37oС в течение 3 сут при 4±1oС в течение 10 сут или кобальтом-60 в течение 2 ч при 19-21oС. Иммуногенность препарата оценивают по В клеточному показателю активности лимфоцитов (синтез вируснейтрализующих антител при вакцинации экспериментальных животных). Вакцину используют в виде суппозитория, содержащего помимо суспензии цитомегаловируса 20,0 мл (106 тканевых цитопатогенных доз ЦМВ) полиоксидоний 0,02 г, гиалуроновую кислоту - 1,0 г. В суппозитарную основу добавляют кондитерский жир, парафин и эмульгаторы - до 100,0 г массы. Вакцина в инъекционной форме или в виде суппозитория вызывает вирусоспецифический иммунитет у экспериментальных животных. 2 с. и 1 з.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к производству противовирусных вакцин, а также к лекарственным формам на их основе.
Известен способ получения живой, ослабленной цитомегаловирусной (ЦМВ) вакцины (US 4689225, А 61 К 39/12, 1987), которая используется для вакцинации взрослых пациентов при пересадке органов от доноров. Однако широкому применению этой вакцины помешало то, что при ее изготовлении используется живой вирус, онкогенность которого исключить нельзя, а также возможна реактивация инфекции при рекомбинации с "диким" вариантом ЦМВ, персистирующим в организме больного ЦМВ инфекцией.
Субъединичные цитомегаловирусные вакцины, разработанные ранее исследователями в Европе (ЕРА 0180288, МПК А 61 К 39/245, 1986; ЕРА 0236145, МПК С 12 N 15/100, 1987), и рекомбинантные цитомегаловирусные вакцины ЕРА 0389286, МПК А 61 К 39/245, С 12 N 15/38, 1990), содержащие гликопротеиды ЦМВ, оказались мало иммуногенными и чрезвычайно дорогими и поэтому в практику здравоохранения внедрены не были.
В России вакцина к ЦМВ пока не разработана, а зарубежные разработки на российский рынок не поступают. Аналогами убитой вирионной цитомегаловирусной вакцины являются вакцины против вирусов простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ-1 и ВПГ-2). По способу получения вакцины против вируса простого герпеса согласно патенту US 4816250 (424/89, опубликованного в бюллетене 28.03.89 г.) инфицированные клетки - фибробласты человека MRC-5 после инкубирования обрабатывают поверхностно-активным веществом, полипептидные цепи цитоплазматической фракции фиксируют и проводят центрифугирование при 650 g. Метод довольно сложен и включает использование антител, иммобилизованных на сефарозе.
Получение вакцины против вируса простого герпеса по заявке ЕРА 48201 (МКИ: А 61 К 39/245, опубликовано в бюллетене 1985 г.) предполагает экстракцию инфицированных клеток мочевиной в концентрации 2М-8М, центрифугирование или фильтрацию, воздействие ультразвуком, концентрирование фильтрацией через особые сорбенты, обработку ферментом ДНК-азой и очистку гель - хроматографией. Очевидно, что столь сложный метод едва ли применим к крупномасштабным наработкам.
Известен далее выбранный в качестве наиболее близкого аналога - прототипа заявляемого изобретения способ получения вирионной герпетической вакцины против вирусов простого герпеса 1 и 2 типов, выращиваемых на поверхности стационарного микроносителя при использовании первичной культуры клеток почек кролика (Андонов П. и соавт., "Вопросы вирусологии", 1979, 6, с. 665-671). Этот способ однако не позволяет получить высокой концентрации антигена указанных вирусов, требует подкожного введения достаточно больших объемов инактивированных формалином вирусов, что сопровождается чувством жжения (из-за присутствия формалина).
Целью настоящего изобретения является создание такого способа получения вирионной цитомегаловирусной вакцины, который
- не требовал бы сложного аппаратурного оформления;
- позволял бы увеличить урожай и концентрацию вирусов;
- позволял бы благодаря использованию отечественного иммуномодулятора увеличить иммуногенную активность вакцины;
- обеспечивал бы возможность масштабного получения убитой цитомегаловирусной вакцины.
- не требовал бы сложного аппаратурного оформления;
- позволял бы увеличить урожай и концентрацию вирусов;
- позволял бы благодаря использованию отечественного иммуномодулятора увеличить иммуногенную активность вакцины;
- обеспечивал бы возможность масштабного получения убитой цитомегаловирусной вакцины.
Решение этой задачи достигаются благодаря тому, что для получения вирионной ЦМВ вакцины используется штамм АД-169, вирус выращивается на монослое диплоидных клеток, предварительно помещенных в среду роста. Адсорбция вируса осуществляется на клетках с последующим добавлением среды поддержки. Высвобождение вируса из клеток происходит в однократном цикле замораживания монослоя и оттаивания. Очистка вакцины от остатков разрушенных клеток (детрита) осуществляется при низкоскоростном центрифугировании. В качестве клеточной культуры используются диплоидные клетки фибробластов человека (линия М-22) или культура клеток почек зеленых мартышек VERO-В, сертифицированные Государственным институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Министерства здравоохранения Российской Федерации (МЗ РФ) для производства вирусных вакцин. Инактивация ЦМВ осуществляется формалином в концентрации 1:2000 при 37oС в течение 3-х суток, и при 4o±1oС в течение 10 суток. В качестве стабилизатора используют 0,22% альбумин человека. Применение в качестве иммуностимулятора коммерческого лекарственного препарата полиоксидония (000 "Иммофарма") необходимо для повышения иммуногенности вакцины. В частности, использование полиоксидония в способе получения вакцины против вируса гриппа позволило значительно увеличить иммуногенность и резко снизить дозу препарата (патент РФ 1580617, приоритет от 13.05.88 г., МКИ А 61 К 39/145). Изучение иммуногенности препарата оценивается по В клеточному показателю активности лимфоцитов (синтез вируснейтрализующих антител в опытах вакцинации крыс, массой 100,0-120,0 г).
Выше отмечалось, что при подкожном введении инактивированных формалином вакцин нередко возникают нежелательные побочные реакции (жжение, покраснение и даже отек). По этой причине не раз предпринимались попытки найти иной путь введения вакцины, отличный от инъекции, так, например, в заявке ЕРА 640347(МКИ А 61 К 39/00, опубликованной 01.03.95 г.) описана композиция антигенов для перорального введения, содержащая фосфатидилсирин и манозу; в заявке ЕРА 242205 (МКИ А 61 К 39/00, опубликованной 06.10.93) предложена вакцинная композиция, включающая масло и сапонин и применяемая перорально в виде эмульсии. В работе И.Ф. Баринского (Российские медицинские вести, 1999 г. , т.IV, 3, с. 64-66) предложен внутрикожный метод введения герпетической вакцины. Вакцина для интраназального введения описана в патентах US 4800078 (кл. 424/86, опубликованном 29.01.89 г.; US 5124148, кл. 424/86, опубликованном 23.06.92). Использование вакцины в виде спрея предложено в ветеринарии для борьбы с чумкой собак (патент US 3420934, кл. 424/89, 1968 г.). В предлагаемом нами изобретении цельновирионная вакцина против цитомегаловируса человека предложена для использования в двух лекарственных формах: a) жидкая форма - по 0,3 мл, в ампулах для внутрикожных инъекции; б) в виде свечи (суппозитория), содержащей помимо суспензии цитомегаловируса 20,0 мл (106 тканевых цитопатогенных доз ЦМВ) иммуностимуляторы: полиоксидоний и гиалуроновую кислоту, а также кондитерский жир, парафин и поверхностно-активные вещества:
- полиоксидоний 0,02 г
- гиалуроновая кислота - 1,0 г
- суппозиторная основа, в которую входят кондитерский жир, парафин и эмульгаторы - до 100,0 г массы.
- полиоксидоний 0,02 г
- гиалуроновая кислота - 1,0 г
- суппозиторная основа, в которую входят кондитерский жир, парафин и эмульгаторы - до 100,0 г массы.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами его осуществления:
Пример 1. Путем серийного пассирования цитомегаловирус (штамм АД-169) адаптируют к культуре диплоидных клеток фибробластов человека (линия М-22) или к культуре клеток почек зеленых мартышек VERO-B. Названную культуру, например, М-22 с посевной концентрацией 250 клеток/мл, выдерживают в матрацах при температуре 37o±1oС в течение 48 часов для образования плотного монослоя клеток. Затем вносят инфицирующий материал цитомегаловиpуca (штамм АД-169) в дозе 0,1 ТЦД50/клетку и проводят адсорбцию вируса. Зараженную культуру инкубируют 6-7 суток до полного разрушения монослоя клеток в результате цитопатического действия вируса. После этого содержимое матрацов подвергают однократно замораживанию при температуре -20o±1oС и оттаиванию при комнатной температуре для полного высвобождения цитомегаловируса из клеток и их перехода в культуральную жидкость. Низкоскоростным центрифугированием (1500 об/мин, 10 мин, при 4o±1oС) отделяют остатки разрушенных клеток (детрит), и затем ЦМБ в культуральной жидкости инактивируют формалином в концентрации 1: 2000 сначала при 36o±loC в течение 72 часов, а затем при 4o±1oС в течение 10 дней. В суспензию цитомегаловируса вводится иммуностимулятор полиоксидоний (Polyoxidonium), в виде коммерческого препарата для инъекции в дозе 0,1 мг/мл. Полученная вакцина способна индуцировать у крыс синтез антител, нейтрализующих ЦМВ при индексе нейтрализации 3,0 lg ТЦД50/мл, где ТЦД50 означает дозу, вызывающую цитопатический эффект 50% инфицированных вирусом флаконов с монослоем вышеуказанных чувствительных клеток.
Пример 1. Путем серийного пассирования цитомегаловирус (штамм АД-169) адаптируют к культуре диплоидных клеток фибробластов человека (линия М-22) или к культуре клеток почек зеленых мартышек VERO-B. Названную культуру, например, М-22 с посевной концентрацией 250 клеток/мл, выдерживают в матрацах при температуре 37o±1oС в течение 48 часов для образования плотного монослоя клеток. Затем вносят инфицирующий материал цитомегаловиpуca (штамм АД-169) в дозе 0,1 ТЦД50/клетку и проводят адсорбцию вируса. Зараженную культуру инкубируют 6-7 суток до полного разрушения монослоя клеток в результате цитопатического действия вируса. После этого содержимое матрацов подвергают однократно замораживанию при температуре -20o±1oС и оттаиванию при комнатной температуре для полного высвобождения цитомегаловируса из клеток и их перехода в культуральную жидкость. Низкоскоростным центрифугированием (1500 об/мин, 10 мин, при 4o±1oС) отделяют остатки разрушенных клеток (детрит), и затем ЦМБ в культуральной жидкости инактивируют формалином в концентрации 1: 2000 сначала при 36o±loC в течение 72 часов, а затем при 4o±1oС в течение 10 дней. В суспензию цитомегаловируса вводится иммуностимулятор полиоксидоний (Polyoxidonium), в виде коммерческого препарата для инъекции в дозе 0,1 мг/мл. Полученная вакцина способна индуцировать у крыс синтез антител, нейтрализующих ЦМВ при индексе нейтрализации 3,0 lg ТЦД50/мл, где ТЦД50 означает дозу, вызывающую цитопатический эффект 50% инфицированных вирусом флаконов с монослоем вышеуказанных чувствительных клеток.
Пример 2 (сравнительный). Поступают, как описано в примере 1.
Далее к инактивированной формалином суспензии цитомегаловируса в количестве 20,0 мл, что соответствует 106 тканевых цитопатических доз ЦMB, добавляют полиоксидоний 0,02 г, гиалуроновую кислоту 1,0 г, суппозиторную основу, в которую входят кондитерский жир, парафин, эмульгатор до общей массы 100,0 г. Из полученной массы изготавливают известным способом свечи с указанным соотношением ингредиентов. Каждая свеча имеет массу от 1,1 г до 2,0 г. Свеча содержит до 500 мкг/г белка, имеет температуру плавления не более 37oС, РН от 6,8 до 7,2, специфически безопасна и способна индуцировать синтез антител у экспериментальных животных, нейтрализующих вирус с индексом нейтрализации для исходной суспензии цитомегаловируса не менее 2 lg ТЦД50/мл.
Таким образом, предлагаемый способ получения вирионной цитомегаловирусной вакцины является оригинальным, позволяет увеличивать иммуногенность и тем самым снизить дозу вакцины, и не требует введения достаточно больших объемов препарата в инъекционной форме. Предлагаемая вакцина в инъекционной форме или в виде суппозитория способна вызывать вирусспецифический иммунитет у экспериментальных животных.
Пример 3 (сравнительный). Поступают как в примере 1.
Далее очищенную низкоскоростным центрифугированием суспензию цитомегаловируса инактивируют облучением. В качестве источника гамма-излучателя используют кобальт-60 в дозе 15-20 кГр в течение 2 ч при температуре 19-21oС. В инактивированную облучением суспензию цитомегаловируса вводят иммуностимулятор полиоксидоний в виде коммерческого препарата для инъекции в дозе 1 мг/мл. Полученная инактивированная вакцина способна индуцировать у крыс синтез антител, нейтрализующих цитомегавирус при индексе нейтрализации 3 lg TCD 50/мл.
Claims (2)
1. Вирионная цитомегаловирусная вакцина, содержащая инактивированную суспензию цитомегаловируса, отличающаяся тем, что дополнительно содержит полиоксидоний, гиалуроновую кислоту и суппозиторную основу при следующем соотношении ингредиентов:
Инактивированная суспензия цитомегаловируса - 20,0 мл
Полиоксидоний - 0,02 г
Гиалуроновая кислота - 1,0 г
Суппозиторная основа - До 100 г
2. Вирионная цитомегаловирусная вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что суппозиторная основа содержит кондитерский жир, парафин и эмульгатор.
Инактивированная суспензия цитомегаловируса - 20,0 мл
Полиоксидоний - 0,02 г
Гиалуроновая кислота - 1,0 г
Суппозиторная основа - До 100 г
2. Вирионная цитомегаловирусная вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что суппозиторная основа содержит кондитерский жир, парафин и эмульгатор.
3. Способ получения вирионной цитомегаловирусной вакцины, включающий культивирование чувствительных к вирусу клеток человека или животных, внесение инфицирующего материала цитомегаловируса штамма АД-169 и его адсорбцию на клетках, инкубирование инфицированных клеток в среде поддержки, высвобождение вируса из клеток путем замораживания - отталкивания, отделение разрушенных клеток низкоскоростным центрифугированием, инактивацию вируса в культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве чувствительных клеток используют диплоидные клетки человека культуры М-22 или клетки почек зеленых мартышек Vero-B, культивируют их при температуре 36-38oС в течение 48 ч, инкубирование инфицированных клеток осуществляют в течение 6-7 суток, а инактивацию вируса в культуральной жидкости проводят формалином в концентрации 1: 2000 в течение 72 ч при температуре 35-37oС, а затем - при 3-5oС в течение 10 дней или кобальтом-60 в течение 2 ч при температуре 19-21oС, при этом кобальт-60 добавляют в количестве 15-20 кГр, затем в полученную суспензию последовательно вводят полиоксидоний, гиалуроновую кислоту и суппозиторную основу.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2000132685A RU2181295C1 (ru) | 2000-12-27 | 2000-12-27 | Вирионная цитомегаловирусная вакцина и способ ее получения |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2000132685A RU2181295C1 (ru) | 2000-12-27 | 2000-12-27 | Вирионная цитомегаловирусная вакцина и способ ее получения |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2181295C1 true RU2181295C1 (ru) | 2002-04-20 |
Family
ID=20244020
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2000132685A RU2181295C1 (ru) | 2000-12-27 | 2000-12-27 | Вирионная цитомегаловирусная вакцина и способ ее получения |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2181295C1 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2476594C2 (ru) * | 2007-05-04 | 2013-02-27 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Двухстадийный температурный профиль для культивирования вирусов |
RU2616245C2 (ru) * | 2015-12-29 | 2017-04-13 | Сейфаддин Гашим Оглы Марданлы | Композиция для профилактики заболеваний, вызываемых цитомегаловирусной инфекцией |
RU2800361C2 (ru) * | 2017-11-01 | 2023-07-20 | МЕРК ШАРП И ДОУМ ЭлЭлСи | Стабильные составы цитомегаловируса |
-
2000
- 2000-12-27 RU RU2000132685A patent/RU2181295C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
АНДОНОВ П. и др. Конструирование инактивированных поливалентных противогерпетических вакцин. - Вопросы вирусологии, 1979, № 6, с. 665-671. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2476594C2 (ru) * | 2007-05-04 | 2013-02-27 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Двухстадийный температурный профиль для культивирования вирусов |
RU2616245C2 (ru) * | 2015-12-29 | 2017-04-13 | Сейфаддин Гашим Оглы Марданлы | Композиция для профилактики заболеваний, вызываемых цитомегаловирусной инфекцией |
RU2800361C2 (ru) * | 2017-11-01 | 2023-07-20 | МЕРК ШАРП И ДОУМ ЭлЭлСи | Стабильные составы цитомегаловируса |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PT1427817E (pt) | Multiplicação de vírus numa cultura celular | |
CA2664799C (en) | Ipv-dpt vaccine | |
RU2405568C2 (ru) | Иммуногенная композиция | |
NO153692B (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av en antigen, immunogen subenhet av herpes simplex type 1 (hsv1) eller type 2 subenhet (hsv2) | |
Francis | Peptide vaccines for viral diseases | |
RU2603003C1 (ru) | Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов а, о, азия-1 | |
Perez et al. | Production methods for rabies vaccine | |
RU2181295C1 (ru) | Вирионная цитомегаловирусная вакцина и способ ее получения | |
EA025624B1 (ru) | Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения | |
Li et al. | Immunogenicity assessment of rift valley fever virus virus-like particles in BALB/c mice | |
KR20120131725A (ko) | 고병원성 조류인플루엔자 a h5n1 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 가금용 백신 | |
RU2142816C1 (ru) | Способ получения антигерпетической вакцины и лекарственная форма на ее основе | |
CN1414861A (zh) | 通过皮肤途径接种诱导粘膜免疫性 | |
RU2616245C2 (ru) | Композиция для профилактики заболеваний, вызываемых цитомегаловирусной инфекцией | |
KR920010872B1 (ko) | Dna 비루스에 대한 백신의 제조방법 | |
RU2158304C2 (ru) | Штамм "внивип-деп" для получения вакцины против реовирусного теносиновита кур | |
RU2652889C1 (ru) | Способ изготовления вакцины инактивированной эмульсионной против ящура и вакцина инактивированная эмульсионная против ящура | |
RU2173344C2 (ru) | Вакцинный штамм вируса краснухи "орлов-д" и способ получения вакцины против краснухи | |
RU2279474C1 (ru) | Штамм тк-а/к вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота для изготовления вакцинных и диагностических препаратов | |
RU2064303C1 (ru) | Способ приготовления инактивированной вакцины против чумы крупного рогатого скота | |
KR20100017593A (ko) | 바이러스의 증식을 위한 2-단계 온도 프로파일 | |
RU2631129C1 (ru) | Способ изготовления вакцины против ящура и вакцина против ящура | |
RU2404804C2 (ru) | Инактивированная вакцина против вируса гепатита а | |
RU2140288C1 (ru) | Способ получения живой коревой вакцины | |
RU2123331C1 (ru) | Способ получения живой коревой вакцины |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20150415 |
|
QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20150724 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner |