CN104962525A - 用于病毒增殖的两阶段温度分布 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于生产病毒的方法，该方法包括提供已经被病毒感染的寄主细胞并且在两种不同温度下培养被感染的寄主细胞。随后收集培养步骤中所产生的病毒。通过使用两阶段温度培养工艺，可以得到高滴度和改进的纯度。
Description
本申请是基于以下中国专利申请的分案申请：
原案申请日：2008年4月30日
原案申请号：200880021212.0(PCT/EP2008/003532)
原案申请名称：用于病毒增殖的两阶段温度分布
本申请要求申请日为2007年5月4日的美国临时专利申请No.60/927,693的优先权，现将其全部内容并入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及病毒增殖领域。
背景技术
在动物细胞培养基中的病毒增殖是在取决于病毒和用于增殖的宿主体系的特性的温度条件下进行的。选择特定的温度用于细胞的生长(在细胞培养基或者胚卵的繁殖中)，接着选定温度用于病毒的增殖。在大多数情况下，病毒增殖温度低于细胞增殖温度。对温度敏感的病毒增殖涉及到在大约围绕用于昆虫细胞培养(随着例如杆状病毒产生)的20℃的温度范围内、以及在用于哺乳动物细胞培养中的病毒制备的直至约37℃的温度下影响病毒增殖速度和抗原形成，使用对于每种病毒/寄主细胞组合的特定的最适条件。更高的温度会影响感染动力学和病毒的稳定性。当病毒在37℃温度下增殖时，在后续的病毒复制期间会经常观察到降低的病毒滴度和更低的病毒抗原质量。这种影响对于用于疫苗生产的大规模病毒增殖可能具有不利的后果。
本发明的目标在于提供改善的生长条件，其不会影响生产的用于疫苗目的的抗原质量。
发明内容
本发明提供了一种用于病毒生产的方法，其中，一种以上寄主细胞被病毒感染，然后在第一温度下培养(例如，在31℃至37℃的温度下培养1至48小时)；并且随后在第二温度下培养，该第二温度比第一温度低(例如，低1至6℃)。然后收集这些培养步骤中所产生的病毒。
现在令人惊讶地发现，对于许多病毒包括流感(正粘病毒)、罗斯河病毒(Alphaviridae)和西尼罗河病毒(黄病毒)，培养条件可以通过使用两阶段温度分布而被实质性地改进。更高的温度被应用于病毒增殖的第一阶段，其可促进传染性病毒颗粒的形成。在第二阶段，采用较低的温度，以便维持在更高温度的增殖期间中获得的初始高滴度，并且允许稳定的抗原的形成，该抗原可以被进一步用于免疫原性疫苗的生产。
附图说明
图1A-1B：在Vero细胞中于(A)32℃和(B)36℃下增殖的新喀里多尼亚(New Caledonia)病毒的抗原显带图形。
图2A-2D：在感染以后在37℃下不同时间点罗斯河病毒(Ross River Virus，RRV)感染的NaBr曲线图。
图3A-3D：在感染以后在35℃下不同时间点罗斯河病毒感染的NaBr曲线图。
图4A-4D：在感染之后在32℃下不同时间点的罗斯河病毒感染的NaBr曲线图。
图5A-5D：在感染之后在35℃/32℃下不同时间点的罗斯河病毒感染的NaBr曲线图。
图6：在37℃和35℃/32℃下感染的罗斯河病毒接种物的Western blot。
图7A-7D：在感染之后在35℃下不同时间点的西尼罗河病毒感染的NaBr曲线图，同时附有显微图像。
图8A-8D：在感染之后在32℃下不同时间点的西尼罗河病毒感染的NaBr曲线图，同时附有显微图像。
图9A-9D：在感染之后在35℃/32℃下不同时间点的西尼罗河病毒感染的NaBr曲线图，同时附有显微图像。
具体实施方式
本发明的一个方面是实现允许独立优化和控制下述条件的在此描述的两阶段温度分布：(1)用于寄主细胞多周期感染的活性病毒的形成；(2)在后续的复制阶段中获得高滴度的维持；以及(3)在后续的生产工艺阶段中的抗原形成。
在本发明的一种优选实施方式中，所述病毒是正粘病毒、α-病毒或黄病毒。
优选病毒是流感病毒，并且在特定的实施方式中，优选选自下组：甲型流感和乙型流感、罗斯河病毒和西尼罗河病毒。虽然在此提供的实施例显示了通过使用本发明的两温度方法进行改进的针对这些病毒的抗原的生产，但本发明预期的其他病毒的非限制性例子包括：选自于由RNA病毒家族所构成的组的病毒，比如呼肠孤病毒(Reoviridae)、小RNA 病毒(Picornaviridae)、环状病毒(Caliciviridae)、披膜病毒(Togaviridae)、沙粒病毒(Arenaviridae)、反转录病毒(Retroviridae)、黄病毒(Flaviviridae)、正粘病毒(Orthomyxoviridae)、副粘病毒(Paramyxoviridae)、本雅病毒(Bunyaviridae)、弹状病毒(Rhabdoviridae)、纤丝病毒(Filoviridae)、冠状病毒(Coronaviridae)、星形病毒(Astroviridae)、或波纳病毒(Bornaviridae)；以及选自于由DNA病毒家族所构成的组，比如腺病毒(Adenoviridae)、乳多空病毒(Papovaviridae)、细小病毒(Parvoviridae)、疱疹病毒(Herpesviridae)、痘病毒或肝DNA病毒(Hepadnaviridae)。在特定的实施方式中，病毒选自下组：甲型流感/Panama(巴拿马)/2007/99、甲型流感/New Caledonia(新喀里多尼亚)/20/99、乙型流感/Shangdong(商东)/7/97、乙型流感/Malaysia(马来西亚)/2506/2004、甲型流感/Hiroshima(广岛)/52/2005、以及甲型流感/Solomon Islands(所罗门群岛)/3/2006。
能够在任何适合病毒产生的细胞中制备出病毒。优选细胞是动物细胞培养物或细胞系。这样的细胞可以来自特定的组织或胚细胞。动物优选是哺乳动物或鸟。本发明的各种具体实施方式可以利用犬科细胞系、啮齿动物细胞系、鸟类细胞系或灵长类动物组织细胞系。例如，在特定的实施方式中，细胞可以是MDCK细胞、CHO细胞、perC6细胞、HEK293细胞、或其他的通常在病毒增殖中使用的细胞。在一些特定的实施方式中，细胞是上皮细胞，尤其优选肾上皮细胞，比如非洲绿猴的Vero细胞。
在本发明特定的实施方式中，在不包含动物血清蛋白的培养基中培养细胞。这样的培养基不包括，例如，牛血清或其部分，比如胎牛血清。这样的培养基被称为“无血清蛋白培养基”。在病毒增殖期间，可以将病毒增殖所必需的蛋白酶比如胰蛋白酶加至培养基。在一些实施方式中，这样的蛋白酶可以由非动物来源衍生得到，比如来自细菌或重组体来源；或者可以由动物来源衍生得到。在在此使用的术语的意义内，这样的补加培养基仍然被认为是无血清蛋白培养基。
在本发明优选的实施方式中，本发明的方法以工业规模进行。在本发明的一些实施方式中，该方法在如下规模的细胞培养基中进行：大于50升的细胞培养基、50至100升的细胞培养基、100至500升的细胞培养基、500至1000升的细胞培养基、或者大于1000升的细胞培养基(例如，在6000升、10,000升、甚至更大的生物反应器中进行)。在本发明的一些实施方式中，本发明的方法在搅拌罐式生物反应器中进行。
在本发明优选的方法中，第一病毒增殖温度低于用于给定的寄主细胞类型的细胞培养增殖温度。在一些实施方式中，第一温度是在32℃至37℃之间，优选在33℃至36℃ 之间，更优选在34℃至35.5℃之间，并且尤其优选35℃。在其他实施方式中，第一温度是在30℃至36℃之间，优选在30℃至35℃之间，更优选在31℃至35℃之间，更优选在31℃至34℃之间，更优选在32℃至34℃之间，更优选在32℃至33.5℃之间，进一步优选在33℃和34℃之间，并且最优选33.5℃；在一些实施方式中为33℃。特别地，对于较大的细胞培养体积(1000升和更大)，较低的第一温度范围可以是优选的。第一温度可以是至少30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、或36℃；或者低于38℃、37.5℃、37℃、36℃、35.5℃、或35℃。在第一温度下的细胞培养可以超过1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30小时；或者少于60、58、56、54、52、50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14或12小时。
在附加的实施方式中，第二温度相比第一温度下降1.5℃至5℃，优选下降2℃至4℃，更优选下降2.5℃至3.5℃，并且最优选下降3℃。温度可以降低至少1℃、2℃、2.5℃、3℃、或4℃；或者降低小于6℃、5℃、4℃、3.5℃、3℃、2.5℃、或2℃。
在其他的实施方式中，第二温度的范围是29℃至35℃，优选30℃至34℃，更优选31℃至33℃，更优选31.5℃至32.5℃，并且最优选是32℃。第二温度可以高于28℃、29℃、30℃、或31℃；或者低于35℃、34℃、33℃或32℃。
该方法还可以用于病毒抗原的生产。因此，在另一个方面，本发明提供一种用于生产病毒或病毒抗原的方法，其中，按在此描述的方法生产病毒，并且分离病毒或病毒抗原。可以使用标准方法进行分离，所述标准方法用于分离并任选地用于提纯，包括分解细胞或者收获细胞上清液、然后分离抗原(例如，离心或层析)。
在另一个实施方式中，在纯化之前或之后使病毒破碎或失活(例如，根据WO 05/11800所述的方法)。另外，可以制备病毒疫苗。疫苗是抗原物质的免疫原性组合物，其中，抗原物质可以是非传染性的病毒、其外壳、颗粒或其抗原。当被给药疫苗时，其在宿主(例如，哺乳动物比如人类，或鸟)中导致免疫作用。疫苗接种或许会引起对疫苗的特定反应和一些较轻的炎症，但是与对于由完全存活的病毒所引起的感染的反应相比，通常对疫苗接种的反应被大大降低。
以下通过下述实施例，进一步阐明本发明，所述实施例仅是示例性的，并非是以任何方式限制本发明。
实施例
许多病毒膜蛋白要求翻译后修饰，以产生有复制能力的病毒。在流感病毒中，前体血球凝集素(HA)分子(HA0)蛋白水解裂解成HA1和HA2亚基，在HA2的氨基末端区域处产生致融融合功能区，该裂解对于病毒进入细胞而言是必不可少的。因此，在细胞培养物中传染周期的开始不得不被添加的蛋白酶催化。对于疫苗生产工艺，使用经γ射线照射的来自猪来源的胰蛋白酶。
普通的用于在细胞培养物比如Vero细胞中的流感生长的温度分布，是一种其中温度恒定在例如33℃(对于乙型流感菌株)至37℃(对于甲型流感菌株)处的曲线(参见，例如Govorkava EA et al.Journal of Virology,Vol.70,Nr.8,Aug.1996,p.5519-5524)。本发明的一个方面在于，通过10L生物反应器系统的小规模实验，实现在初始传染阶段期间升高的温度分布，这对于流感生产工艺总体周期时间而言具有积极的效果。另外，可以得到在测量为Vero蛋白质/SRD比率的抗原纯度上的积极效果。为证明这些思想，按照在此描述的方法，进行100L规模实验。
实施例1：在32和36℃下的甲型流感/New Caledonia/20/99生产
在32℃下和在36℃下生物反应器操作的Vero培养物用甲型流感/New Caledonia/20/99病毒感染。设定的参数pH、pO2、细胞密度以及加至培养物的胰蛋白酶含量相似，并且反映了用于流感抗原生产的大规模条件。上升的温度对病毒产率和周期时间的影响进行比较，结果见表1。
表1：HA和残留摄氧率((“残留OUR”)，与第0天的传染周期*相比)的对比。
在两天后，观察到36℃培养物的残留摄氧率为20％，其比第3天低5％。在36℃下流感病毒的增殖导致高传染性、以及因此与32℃条件下相比总培养时间的减少。相反，32℃培养导致分别在第2天和第3天更高的80％和50％残留摄氧率。最终的HA滴度是相似的。然而，从经过具有NaBr梯度的超速离心的抗原分离实验来看，显带图形的抗原性转变在36℃条件下在培养第3天出现(图1B)，反之通过UV254nm检测器测量的洗脱分布导致32℃培养下同等高的、但更对称的波峰(图1A)。就产品产率、尤其纯度而言，36℃的条件可能因此具有一些缺点。
对于当前的生产工艺，由蔗糖梯度来收获病毒抗原。对于36℃实验，可以因此推断：部分抗原将迁移至低密度部份(图1B)。
实施例2：在32、33、以及34℃下的甲型流感/Panama/2007/99生产
为了研究提高的培养温度对Panama病毒产率和周期时间的影响，并行操作三个10L生物反应器系统，温度分别设置在32℃，33℃和34℃。所有其他的参数设置点与实施例1中描述的相似。
在表2中，提供了三个生物反应器系统的工艺周期时间。在达到20％残留摄氧率(代谢耗氧量减小80％)之后，停止培养，并且比较传染周期动力学。对于34℃实验，可以实现周期时间减少21小时(hrs)。
表2：要求达到20％残留摄氧率的作为工艺温度函数的工艺时间的对比(与传染周期第0天相比)。
| 温度 | 达到20％残留摄氧率的工艺时间(hrs) |
| 32℃ | 90 |
| 33℃ | 79 |
| 34℃ | 69 |
将培养上清液离心，根据标准方案用Benzonase核酸酶和福尔马林处理。失活的收获物(MVHs)通过蔗糖梯度超速离心法进行纯化(参见表3)。
表3：由来自温度实验的蔗糖梯度纯化病毒所获得的甲型流感/Panama/2007/99抗原产率、SRD/蛋白质比率和Vero-蛋白质杂质的对比。
从表2中可以得出结论：升高的温度条件导致减少的周期时间。然而，如表3所示，升高的温度条件(例如，33℃和34℃)对总体病毒抗原产率和纯化的病毒的质量具有消极影响，如同通过SRD/蛋白质比率和Vero-蛋白质/SRD比率验证的那样。因此观察到在更高温度下病毒抗原下降的纯度。
实施例3：具有在35℃下早期病毒扩增的甲型流感/New Caledonia/20/99生产
该实施例涉及的培养试验中，对于流感病毒生产工艺的第一个24小时设置为提高的温度。在100升规模处用甲型流感/New Caledonia/20/99病毒感染Vero细胞培养物。
普通的温度分布(即，整个发酵工艺的32℃温度设置点)与具有在35℃下的早期病毒扩增的改进工艺的对比被进行。该新工艺的特点在于在35℃下初始病毒复制24小时感染后(post infection，p.i.)，接着在32℃下培养直到91hrs感染后。在表4中，给出了来自100升规模操作的蔗糖梯度纯化病毒的甲型流感/New Caledonia/20/99抗原纯度(SRD/蛋白质比率)和Vero-蛋白质杂质的对比。
表4：甲型流感/New Caledonia/20/99抗原纯度(SRD/蛋白质比率)和Vero-蛋白质杂质作为不同的温度分布的的函数的对比。使用蔗糖梯度来纯化来自温度实验的病毒。
这些数据清楚地显示，对于发酵工艺中第一个24小时的35℃温度设置不仅对SRD/蛋白质比率、而且对Vero-蛋白质杂质都具有积极的影响。随着类似的感染时间，可以得到具有明显改进的杂质分布的类似的产率。
实施例4：具有35℃下早期病毒扩增的甲型流感/Panama/2007/99生产
为了证实在用于两温度工艺的实施例3中观察到的特性，使用相同的温度分布用于在100升Vero培养物中增殖甲型流感/Panama/2007/99病毒。所有其他的条件和参数根据实施例3设定。
在表5中，比较了来自100升规模操作的蔗糖梯度纯化的病毒的甲型流感/Panama/2007/99抗原纯度(SRD/蛋白质比率)和Vero-蛋白质杂质。
表5：甲型流感/Panama/2007/99抗原纯度(SRD/蛋白质比率)和Vero-蛋白质杂质的对比。使用蔗糖梯度来纯化来自温度实验的病毒。
病毒复制的第一个24小时期间在35℃下、随后温度降低至32℃的甲型流感/Panama/2007/99病毒生产与当前的32℃恒温工艺相比具有数个优点。一般来讲，流感病毒抗原的质量可以得到改善，如同被SRD/蛋白质比率和Vero-蛋白质/SRD比率证实的那样。随着感染时间的明显下降，产率略微较低，但是杂质分布明显更好，尤其是对于Vero细胞蛋白质的相对含量而言。
流感病毒抗原纯度在流感疫苗生产中是个因素。普遍接受的是，对于在Vero细胞中流感病毒的复制，用于前体血球凝集素裂解的蛋白水解条件和适当的温度条件是一些重要因素。在本发明的示例性实验中，表明在病毒复制早期阶段期间具有升高的温度的温度分布导致在蔗糖梯度步骤中抗原的改进。另外，就周期时间而论，第一个24小时在35℃下的流感病毒生产对应于更好的工艺性能。甲型流感/Panama/2007/99和甲型流感/NewCaledonia/20/99被用作模型体系，用于证明两温度病毒增殖是有用的。以10和100升规模进行的培养试验结果显示了病毒增殖工艺的第一个24小时由32℃改变为35℃的益处。
实施例5：在35℃下早期病毒扩增18hrs p.i.的甲型流感/Hiroshima/52/2005生产比对在35℃下36hrs p.i.、接着32℃直至病毒增殖结束的甲型流感/Hiroshima/52/2005生产
该实施例显示了高温周期持续时间的变化对50L被甲型流感/Hiroshima/52/2005病毒感染的Vero培养物的抗原产率、SRD/蛋白质比率、以及Vero蛋白质/SRD比率的影响。对于两个单独的样本，在温度下降至32℃以前，35℃温度分别地保持18hrs p.i.和36hrs p.i.。对包含病毒的上清液进行收获、失活、并通过超速离心进行纯化。
在表6中，比较了来自50升规模操作的蔗糖梯度纯化病毒的甲型流感/Hiroshima/52/2005抗原纯度(SRD/蛋白质比率)和Vero-蛋白质杂质。
表6：甲型流感/Hiroshima/52/2005抗原产率、纯度(SRD/蛋白质比率)和Vero-蛋白质杂质的对比。使用蔗糖梯度来纯化来自温度实验的病毒。
在35℃下18hrs p.i.和36hrs p.i.的甲型流感/Hiroshima/52/2005病毒生产分别得到类似的产率和纯度分布(表6)。从该结果看，可得出如下结论：在早期病毒增殖期间提高的温度的持续时间和降低温度直至收获的持续时间能在两阶段温度分布中被较大地改变。
实施例6：在不同温度(34℃，35℃和36℃)下早期病毒扩增18hrs p.i.、接着降低3℃(至31℃，32℃和33℃)直至病毒增殖结束的乙型流感/Malaysia/2506/2004生产
该实施例涉及在32升至80升Vero培养物的病毒增殖期间不同的两阶段温度分布的应用，所述培养物用乙型流感/Malaysia/2506/2004病毒感染。在降低3℃以前(即，分别为31℃、32℃、以及33℃)，较高温度34℃、35℃和36℃保持18hrs p.i.。对包含病毒的上清液进行收获、失活、并通过超速离心进行纯化。
在表7中，比较了不同温度分布下的来自32升至80升规模操作的蔗糖梯度纯化病毒的乙型流感/Malaysia/2506/2004抗原产率、纯度(SRD/蛋白质比率)和Vero-蛋白质杂质。
表7：乙型流感/Malaysia/2506/2004抗原产率、纯度(SRD/蛋白质比率)和Vero-蛋白质杂质的对比。使用蔗糖梯度来纯化来自温度实验的病毒。
在34℃至36℃下18hrs p.i.、接着降低3℃直到病毒增殖结束的乙型流感/Malaysia/2506/2004病毒的生产得到类似的产率和纯度分布(表7)。从该结果看，可得出如下结论：在早期病毒增殖期间提高的温度的范围和降低温度直至收获时间的范围能在两阶段温度分布中被较大地改变。
实施例7：在不同温度(33.5℃，35℃和36.5℃)下早期病毒扩增18hrs p.i.、接着降低3℃(至30.5℃，32℃和33.5℃)直至病毒增殖结束的甲型流感/Solomon Islands/3/2006生产
该实施例涉及在32升至50升Vero培养物的病毒增殖期间不同的温度分布的应用，所述培养物用甲型流感/Solomon Islands/3/2006病毒感染。在降低3℃(即，分别为30.5℃、32℃和33.5℃)以前，较高的温度33.5℃、35℃和36.5℃保持18hrs p.i.。对包含病毒的上清液进行收获、失活、并通过超速离心进行纯化。
在表8中，比较了来自32升至50升规模操作的蔗糖梯度纯化病毒的甲型流感/Solomon Islands/3/2006抗原产率、纯度(SRD/蛋白质比率)和Vero-蛋白质杂质。
表8：甲型流感/Solomon Islands/3/2006抗原产率、纯度(SRD/蛋白质比率)和Vero-蛋白质杂质的对比。使用蔗糖梯度来纯化来自温度实验的病毒。
分别在33.5℃、35℃、以及36.5℃下18hrs p.i.、接着降低3℃直至病毒增殖结束的甲型流感/Solomon Islands/3/2006病毒生产得到类似的产率和纯度分布(表8)。在升高的温度下的更高产率还得到降低的纯度，然而，随着降低3℃在病毒增殖的未尾，这些杂质保持在相对低的水平。使用具有降低的温度的两阶段温度分布(例如33.5℃/30.5℃)，能够取得类似的产率。然而需要更长的病毒增殖周期时间(仍然少于70hrs)方可达到这些类似的产率。纯度分布，尤其对于寄主细胞特异性的Vero-蛋白质，随着较低的温度范围(包括3℃温度变化)而被典型地改进(参见表7中在34℃/31℃下乙型流感/Malaysia的结果)。从该结果看，可得出如下结论：对于甲型流感和乙型流感两类菌株，在早期病毒增殖期间提高的温度的范围和降低温度直至收获时间的范围能在两阶段温度分布中被较大地改变。
实施例8：罗斯河病毒生产
在2L反应器中于不同温度下生产罗斯河病毒(“RRV”)。研究的温度是37℃、35℃、32℃以及35℃下30hrs和30hrs后32℃下直至感染结束。在90hrs p.i.之后， 确定动力学参数，并且在下述时间间隔(单位：小时)处收集样本：I-18、I-42、I-42、I-54、I-66、I-76和I-90。用于NaBr分析的样本用20μL/mL福尔马林1.85％处理，并且于37℃下保温48hrs。在病毒增殖期间测量残留摄氧率(OUR)，以便监控受感染细胞的代谢活性。通过微载体培养物的显微图像来定量细胞脱附率(cell detachment rate)。还确定了TCID50(50％组织培养感染剂量)。
实验条件是，在感染前，pH 7.1的PBS和20％pO2、1.0g/L葡萄糖。在I-18时加入1.0g/L葡萄糖，并且停止灌注。在I-42后，如果葡萄糖降低到小于1.0g/L，则加入葡萄糖。结果如表9所示。
离心情况：I-18：5000g；I-42～I-66：10000g；I-78～I-90：15000g。
表9：
所有四个培养的NaBr曲线图以4个间隔时间(A：54h；B：66h；C：78h；D：90h)显示于图2至5中。
用下述抗体进行Western blot：(I)RR(ATCCVR373)，超免疫腹水液，小鼠；N.I.H.(1:1000)；以及(2)抗小鼠IgG，Sigma，Cat#：A-4656，Lot#：63H8830(1：5000)。结果根据表10提供于图6中。
表10：
| 泳道 | 探针 | 体积(μL) |
| 1 | Marker(标记物) | 10 |
| 2 | RRV阳性对照 | 20 |
| 3 | RRV 37℃ I-54 | 20 |
| 4 | RRV 37℃ I-66 | 20 |
| 5 | RRV 37℃ I-78 | 20 |
| 6 | RRV 35℃/32℃ I-54 | 20 |
| 7 | RRV 35℃/32℃ I-66 | 20 |
| 8 | RRV 35℃/32℃ I-78 | 20 |
| 9 | RRV 35℃/32℃ I-90 | 20 |
| 10 | 阴性对照(团粒) | 20 |
在两个高温(37℃和35℃)下的接种中，感染动力学相当大地增加，同时在42hrs后细胞脱离比率为100％，并且在53hrs之后残留的O2为大约50％。在较低温度(32℃和35℃/32℃)下的方法相对较慢。这在I-18时的滴度分析中也是显而易见的。然而，在I-42以后，所有的方法都达到大约1E09TCID50/mL。在较低温度下的方法显示出接近感染结束时更稳定的滴度(>1EO9TCID50/mL，直至I-76)。在两种方法中，直至I-76，能够测量出20％的残留OUR。在所有的实验中，在I-53以后，达到在NaBr梯度中的最大峰高。反之，在35℃接种中，对于所有的I-66样本以及I-90样本，测量出较低的波峰。因为温度的提高，使得在37℃和35℃实验期间葡萄糖水平下降更快。因为感染动力学的提高，后来没有代谢活性是可测定的。在所有的实验中，葡萄糖水平最后都类似。
开始时快速的病毒增殖并且直至感染结束时的稳定的滴度仅在两阶段温度实验(35℃直至I-30，然后32℃)期间被建立。在这些条件下，在NaBr梯度实验中测量到最高波峰，其直至I-78时也是稳定的。而且，对于35℃/32℃实验，在Western blot中检测到更多稳定的条带。
实施例9：西尼罗河病毒实验
在2L反应器中于不同温度下生产西尼罗河病毒。研究的温度是35℃、32℃、以及35℃下30hrs和30hrs后32℃直至感染结束。收集90h内的动力学参数。在下述时间间隔处(单位为hrs)收集样本：I-18、I-30、I-42、I-42、I-52、I-66、I-74以及I-90。用于 NaBr分析的样本用20μL/mL福尔马林1.85％处理，并且在37℃下保温48hrs。条件是，在感染前pH 7.1，20％pO2，以及1.0g/L葡萄糖。在I-18时加入1.0g/L葡萄糖，并且停止灌注。结果提供在表11中，并且图7-9显示了NaBr曲线图和显微图像。通过微载体培养物的这些显微图像来定量细胞脱附率。
表11：
Claims (24)
1.一种用于生产病毒的方法，该方法包括：
提供已经被病毒感染的寄主细胞；
在31℃至37℃的第一温度下培养感染的寄主细胞1至48小时，其中所述第一温度低于用于病毒感染前的寄主细胞的增殖温度；
随后在比所述第一温度低1℃至6℃的第二温度下培养感染的寄主细胞；以及
收集上述培养步骤中所产生的病毒拷贝。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒是正粘病毒、α-病毒或黄病毒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒是流感病毒。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述病毒选自下组：甲型流感和乙型流感。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒是罗斯河病毒。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒是西尼罗河病毒。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述寄主细胞来自动物细胞培养物或细胞系。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述寄主细胞是上皮细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述寄主细胞是肾上皮细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述寄主细胞是Vero细胞。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一温度的范围为32℃至37℃。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述第一温度的范围是33℃至36℃。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一温度的范围是34℃至35.5℃。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二温度比所述第一温度低1.5℃至5℃。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第二温度比所述第一温度低2℃至4℃。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二温度的范围是29℃至35℃。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第二温度的范围是30℃至34℃。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述第二温度的范围是31℃至33℃。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述寄主细胞在接种以后直接培养。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括从收集的所述病毒拷贝中分离所述病毒或病毒抗原的步骤。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒被破碎。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒被失活。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括制备所述病毒的疫苗的步骤。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在第一温度下的培养是至少两个小时。
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