CN104073477A - 一种低成本、工业化分离猪凝血酶原的方法 - Google Patents

一种低成本、工业化分离猪凝血酶原的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低成本、工业化分离猪凝血酶原的方法，包括以下步骤：a、用柠檬酸三钠作为抗凝剂获得猪全血，管式离心机离心获得血浆，按照5-7g/L血浆加柠檬酸钡吸附凝血酶原；b、液渣碟片离心机离心获得柠檬酸钡-凝血酶原复合物，生理盐水洗涤去除杂蛋白；c、用HCl调pH至1.8-2.3解除柠檬酸钡对凝血酶原吸附；d、超滤浓缩获得凝血酶原浓缩液，将滤出液调节pH至9.0重新沉淀成柠檬酸钡沉淀，重复使用。本发明方法简单，去除凝血酶原的血浆还能够提取其他产物，柠檬酸钡能反复使用，进一步降低了生产成本，增加了企业经济效益。

Description

一种低成本、工业化分离猪凝血酶原的方法
技术领域
一种低成本、工业化分离猪凝血酶原的方法，属生化技术领域。 
背景技术
凝血酶是具有高度专一性的丝氨酸蛋白水解酶，能直接促使血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，并促使血小板聚集，达到迅速止血的目的，临床上广泛用于消化道止血和外科手术止血。凝血酶由血液中的凝血酶原(prothrombin)前体水解活化而来，凝血酶产品由提取的凝血酶原活化而来，要获得高纯度凝血酶必先获得高纯度的凝血酶原，研究出简便、低成本的提纯凝血酶原方法对规模生产凝血酶十分重要。由于人血浆资源有限，临床用的凝血酶多来源于牛血或猪血。我国生猪产量居世界第一，年产猪血约10万吨，这些猪血除少量以简单的血粉形式被利用外，绝大部分以废物形式排放，造成极大的资源浪费和环境污染。从猪血中提取凝血酶原，既可以充分利用猪血资源，提高猪血的附加值，又可以减少因排放造成的环境污染，具有很高的环境效益。 
目前主要采取2种方法提取凝血酶原，第一种为等电点沉淀法；第二种为柠檬酸钡吸附法。 
等电点沉淀法是利用凝血酶原等电点沉淀凝血酶原，大致步骤如下：将血浆用去离子水稀释10倍，用2％醋酸调节pH5.3，4℃静置过夜，虹吸去除上清液，沉淀部分经过3500r/min离心15min，收集沉淀，沉淀中含凝血酶原。由于纤维蛋白原的等电点与凝血酶原接近，沉淀中多数为纤维蛋白原。凝血酶原通过CaCl2激活成为凝血酶，凝血酶和CaCl2都能够使纤维蛋白原变成纤维蛋白凝胶，妨碍了凝血酶的提取。 
柠檬酸钡吸附法是利用柠檬酸钡能够吸附凝血酶原的特性制备凝血酶原，大致步骤如下：边搅拌边缓慢加入BaCl2溶液，血浆中含抗凝剂柠檬酸三钠，BaCl2与柠檬酸三钠产生柠檬酸钡，柠檬酸钡能够吸附凝血酶原并一同沉淀。Na2EDTA能够螯合Ba2+，将收集的沉淀搅拌溶于pH8.00.2mol/L Na2EDTA溶液中，溶液用0.05mol/L pH7.2的Tris-HCl缓冲液透析，不断更换透析液至无Ba2+，获得凝血酶原粗样液。该方法制备的凝血酶原比等电点沉淀法制备的凝血酶原纯度高。柠檬酸钡吸附法只适合实验室制备，不适合规模生产，因为需要昂贵的Na2EDTA，柠檬酸钡不能重复使用，而且还要透析法去除Ba2+。 
发明内容
本发明旨在利用柠檬酸钡吸附猪血浆中的凝血酶原，液渣离心机离心获得柠檬酸钡-凝血酶原复合物，生理盐水洗涤去除非凝血酶原性杂蛋白。将柠檬酸钡-凝血酶原复合物加HCl调pH至1.8-2.3，柠檬酸钡溶解成Ba2+和柠檬酸离子，凝血酶原游离。通过超滤系统分离凝血酶原和Ba2+、柠檬酸离子。凝血酶原经过洗涤、浓缩最终获得较纯的凝血酶原浓缩液。含Ba2+ 和柠檬酸离子的溶液加NaOH调节pH至9.0后重新获得柠檬酸钡，自然沉淀后重复使用。本发明适合规模生产，因为不需要昂贵的Na2EDTA解吸附，柠檬酸钡又能够重复使用，因此大大降低了生产成本。 
本发明技术效果体现在几个方面： 
1、本发明制备的凝血酶原很纯(占总蛋白的80％以上)，又适合规模生产 
实验室采用柠檬酸钡吸附法制备较高纯度的凝血酶原，但要用透析袋将Ba2+透析消除，无法规模生产。本方法不用透析袋透析，采用工业设备超滤系统，能够实现规模化生产。 
2、降低了凝血酶原的生产成本，间接降低凝血酶的生产成本，提高了企业的经济效益 
实验室采用柠檬酸钡法制备凝血酶原要用Na2EDTA解除柠檬酸钡对凝血酶原的吸附。Na2EDTA将柠檬酸钡中的Ba2+螯合，柠檬酸钡-凝血酶原复合物被解离，去除BaEDTA后获得凝血酶原。由于柠檬酸钡和Na2EDTA都是昂贵的化工原料，这种方法制备凝血酶原的成本较高，由此制备的凝血酶成本也很高。本发明采用调节pH解除柠檬酸钡对凝血酶原的吸附，Ba2+和柠檬酸离子在碱性环境下重新生成柠檬酸钡重复使用。 
3、使血液综合利用成为可能 
用柠檬酸钡吸附凝血酶原后血液其他成分没有改变，还可以分离纯化纤维蛋白原、白蛋白、清蛋白等产品。 
4、减少了企业的治污费用，间接提高了企业的经济效益和环境效益。 
附图说明
图1是制备的凝血酶原8％SDS-PAGE分析图。 
图注：1：蛋白质Marker；2：血浆；3：纯化的凝血酶原 
具体实施方式
按照3.8％柠檬酸三钠∶猪血1∶9获得猪全血，用GFX105型管式离心机(转速19000r/min)离心分别获得血浆和血球，血浆备用。 
实施例一： 
第一步：获得柠檬酸钡-凝血酶原复合物沉淀 
取100kg血浆，按照每升血浆加5g柠檬酸钡，4℃搅拌30min吸附凝血酶原形成复合物。用SZLDH5型蝶式分离机(转鼓转速为7500r/min离心获得柠檬酸钡-凝血酶原复合物沉淀。加5kg生理盐水洗涤柠檬酸钡-凝血酶原复合物，蝶式分离机离心获得较为纯净的柠檬酸钡-凝血酶原复合物。 
第二步：柠檬酸钡-凝血酶原解吸附 
用5L生理盐水悬浮柠檬酸钡-凝血酶原复合，用1mol/L HCl调节pH至1.8，此时柠檬酸钡溶解成Ba2+和柠檬酸离子，凝血酶原游离。含Ba2+和柠檬酸离子的溶液加NaOH调节pH至9.0后重新获得柠檬酸钡重复使用。 
第三步：超滤浓缩 
用截留60kd以上分子量的聚丙烯睛超滤系统浓缩凝血酶原(猪凝血酶原分子量为72kd)，加生理盐水稀释后进一步超滤浓缩，去除分子量低于60kd的杂蛋白，最终获得凝血酶原浓缩液200mL，测定A280，计算蛋白质含量为1050mg。 
第四步：纯度测定 
采用8％SDS-PAGE检测凝血酶原的纯度，纯度较高，如图1。通过Biosens sc805全自动凝胶成像系统分析，凝血酶原含量在80％以上。 
实施例二： 
按照3.8％柠檬酸三钠∶猪血1∶9获得猪全血，用GFX105型管式离心机(转速19000r/min)离心分别获得血浆和血球，血浆备用。 
第一步：获得柠檬酸钡-凝血酶原复合物沉淀 
取100kg血浆，按照每升血浆加6g柠檬酸钡，其他操作同实施例一。 
第二步：柠檬酸钡-凝血酶原解吸附 
除用1mol/L HCl调节pH至2.1外，其他操作同实施例一。 
第三步：超滤浓缩 
操作同实施例一。最终获得凝血酶原浓缩液210mL，测定A280，计算蛋白质含量为1020mg。 
第四步：纯度测定 
操作同实施例一。纯度与实施例一相似，凝血酶原含量在82％以上。 
实施例三： 
按照3.8％柠檬酸三钠∶猪血1∶9获得猪全血，用GFX105型管式离心机(转速19000r/min) 离心分别获得血浆和血球，血浆备用。 
第一步：获得柠檬酸钡-凝血酶原复合物沉淀 
取100kg血浆，按照每升血浆加7g柠檬酸钡，其他操作同实施例一。 
第二步：柠檬酸钡-凝血酶原解吸附 
除用1mol/L HCl调节pH至2.3外，其他操作同实施例一。 
第三步：超滤浓缩 
操作同实施例一。最终获得凝血酶原浓缩液220mL，测定A280，计算蛋白质含量为1040mg。 
第四步：纯度测定 
操作同实施例一。纯度与实施例一相似，凝血酶原含量在81％以上。 

Claims (1)

1.一种低成本、工业化分离猪凝血酶原的新方法，其特征包括以下步骤：
a、按照5-7g/L血浆加柠檬酸钡吸附凝血酶原，液渣碟片离心机离心获得柠檬酸钡-凝血酶原复合物，生理盐水洗涤杂蛋白。
b、用HCl将柠檬酸钡-凝血酶原复合物调pH至1.8-2.3，解除柠檬酸钡吸附凝血酶原。
c、超滤浓缩获得凝血酶原浓缩液，将滤出液调节pH至9.0重新生成柠檬酸钡沉淀，重复使用。
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CN1793350A (zh) * 2005-11-11 2006-06-28 高学军 猪凝血酶的制备方法
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Title
徐功华等: "超滤法从猪血中提取凝血酶", 《湘南学院学报(医学版)》, vol. 8, no. 1, 31 March 2006 (2006-03-31), pages 73 - 74 *

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