CN102875669A - 卵转铁蛋白的分离提取的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卵转铁蛋白的分离提取的方法，而提供一种产品的纯度高，方法简单，能够实现工业化生产的分离提取方法。将无粘蛋白蛋清溶液的pH值调节至7.5-9.0，采用乙醇析出法提取得到卵转铁蛋白粗品；利用两步弱酸性阳离子交换树脂层析法纯化上述卵转铁蛋白粗品，纯化的卵转铁蛋白在1-10℃条件下经透析除盐得到高纯度的卵转铁蛋白。本发明的方法利用醇析法结合弱酸性阳离子交换法提取分离卵转铁蛋白，先让卵转铁蛋白在碱性条件下生成复合物，然后再通过醇析法提取分离得到卵转铁蛋白粗品，再利用两步弱酸性阳离子交换树脂层析法纯化，所得产品的纯度高，提高了卵转铁蛋白制备的规模和产量，方法简单，有利于实现产业化生产。

Description

卵转铁蛋白的分离提取的方法

技术领域

本发明涉及有机化合物提取领域技术领域，特别是涉及一种卵转铁蛋白的分离提取的方法。

背景技术

卵转铁蛋白又称为副卵白蛋白或者卵伴白蛋白，是禽蛋清中的一种含686个氨基酸残基的单亚基糖蛋白，约占蛋清蛋白的10-13%左右，分子质量为77-80ku，其pI值为6.0-6.7。卵转铁蛋白具可逆性结合三价铁离子的能力以及转铁的功能，还具有抑菌功能、抗病毒功能、调节生理功能以及抑制自由基生成等作用，在制药工业和食品工业极具广泛的应用前景。

目前国内外用于提取制备卵转铁蛋白方法有盐沉淀法、膜分离技术法、阴阳离子树脂交换法、固定化金属螯合亲和色谱法等。1948年Bain和Deutsch以及1951年的Warner和Weber利用水相和乙醇相分级分离法提取该蛋白，1954年Warner以及1967年Azari和Baugh利用硫酸铵的分级沉淀以及絮凝沉淀分离出了卵转铁蛋白。但上述方法容易造成卵转铁蛋白的变性，并且产品的纯度较低。后来作为方法的改进，很多研究者采用了色谱法，如离子交换层析、亲和色谱以及凝胶过滤色谱分离并纯化卵转铁蛋白：1958年Rhodes等人以及1967年Azari和Baugh利用羧甲基纤维素阳离子交换色谱，1960年Mandeles利用DEAE纤维素阴离子交换色谱，1995年Vachier等人利用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱,1992年Guerin和Brule利用Duolite C464和C476阳离子交换色谱用于工业制备卵转铁蛋白，1987年Al-Mashikhi和Nakai利用固定化金属亲和色谱法（铜离子Sepharose 6B）一步法制备卵转铁蛋白，1991年Chung等人利用双功能DEAE胶蓝亲和色谱分离该蛋白，1994年Awade等人利用Q-Superose Fast Flow阴离子交换色谱以及Superose-6制备级凝胶过滤色谱柱两步法分离纯化卵转铁蛋白。这些色谱分离方法在一定程度上为提取分离卵转铁蛋白提供了一定的方法，但是这些方法中有些虽然能使产品的纯度达到较高的水平，但其制备的规模很小，不适于工业化生产，特别是利用凝胶过滤色谱技术的方法，并且；有些制备出的产品纯度较低。而且这些方法制备成本较高，特别是所用的制备介质，很难扩大成为工业制备的方法。2008年K.Y.Ko和D.U.Ahn利用碱性条件下（pH=9.0）并有伴阴离子（HCO₃ ^-）的存在下，卵转铁蛋白可通过HCO₃ ^-与Fe³⁺形成三元复合体，即Fe³⁺ ₂-HCO₃ ^--卵转铁蛋白复合物，该复合物形成后整个蛋白分子结构变得更紧密、封闭、稳定，并且提高了其对乙醇沉淀作用的耐受性，因此先让卵转铁蛋白在碱性条件下生成复合物，然后再通过醇析法提取分离得到卵转铁蛋白，该法制备规模具有放大成工业级规模的可能，但是其产品纯度只有80%。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种产品的纯度高，方法简单，能够实现工业化生产的卵转铁蛋白的分离提取的方法。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

一种卵转铁蛋白的分离提取的方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）将无粘蛋白蛋清溶液的pH值调节至7.5-9.0，采用乙醇析出法提取得到卵转铁蛋白粗品；

（2）利用两步弱酸性阳离子交换层析法纯化上述卵转铁蛋白粗品，纯化的卵转铁蛋白在1-10℃条件下经透析除盐得到高纯度的卵转铁蛋白。

所述无粘蛋白蛋清溶液通过下述方法制备：将新鲜蛋清中加入三倍体积的去离子水或pH值为5.0-6.0缓冲液稀释，过滤除去不溶性物质，并调节所得滤液的pH值至5.0-6.0，在1-10℃低速搅拌过夜，然后在1-10℃、2500-5000×g离心5-20min，除去蛋清溶液中的粘性蛋白，减低溶液的粘度，便于以后的操作，离心获取的上清液即为无粘蛋白蛋清溶液。上述低速搅拌的速度选择10-30rpm。所得滤液的pH值可以使用1.00mol/L的HCl溶液进行调节。

所述乙醇析出法提取卵转铁蛋白粗品的步骤如下：

a、将pH值为7.5-9.0的无粘蛋白蛋清溶液中加入NaHCO₃、NaCl和FeCl₃至NaHCO₃、NaCl和FeCl₃的终浓度分别为40-70mmol/L、100-250mmol/L和15-30mmol/L，低速搅拌20-40min后，蛋清溶液呈橙红色；

b、之后，加入乙醇至乙醇终浓度为40-45%v/v，并在1-25℃下静置20-40min，然后在1-10℃、2500-5000×g条件下离心10-30min，使得蛋清中除卵转铁蛋白的其它蛋白沉淀；

c、取上清液，并用40-45%v/v乙醇将沉淀洗涤1-2次，每次洗涤后离心取上清液；

d、将上述多次离心所得上清液合并，继续加入乙醇至乙醇的终浓度为55-60%v/v；

e、在1-25℃下低速搅拌15-40min后，在1-10℃、2500-4500×g条件下离心10-35min；

f、取离心所得沉淀复溶于20-50mmol/L的柠檬酸缓冲液中，并调节pH值至3.0-5.0，加入已处理的pH值为4.7的阴离子交换树脂，在室温下低速搅拌3h，过滤去除吸附HCO₃ ^-的阴离子交换树脂，所得滤液经冻干后得到脱辅基-卵转铁蛋白粗品。

所述阴离子交换树脂为大孔D296型阴离子树脂。

步骤f中所述已处理的pH值为4.7的阴离子交换树脂的处理过程为：将阴离子交换树脂经常规处理除去树脂常残存的有机溶剂、低分子聚合物及有机杂质，然后用HCl处理，使该阴离子交换树脂成为pH4.7的Cl型阴离子交换树脂。

所述的利用两步弱酸性阳离子交换层析法纯化卵转铁蛋白粗品的步骤如下：

g、将卵转铁蛋白粗品中加入pH值为7.5-9.0、20-40mmol/L的磷酸缓冲液溶解，至卵转铁蛋白的终浓度为50-100mg/mL，得到卵转铁蛋白粗品溶液，并用NaOH溶液调节卵转铁蛋白粗品溶液的pH值至7.5-9.0，之后，在1-10℃、4000-6000×g条件下离心20-40min，取上清液；

h、将上述上清液在pH值为7.5-9.0操作范围内，用Na型弱酸性阳离子交换树脂层析去除碱性蛋白，收集层析法得到的峰1组分；

i、用pH值为5.0-5.6的H型弱酸性阳离子交换树脂层析收集峰2组分即为高纯度的卵转铁蛋白。

步骤h中所用层析柱的平衡缓冲液为pH值为7.5-9.0、浓度为10-30mmol/L的磷酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl、pH值为7.5-9.0、浓度为10-30mmol/L的磷酸缓冲液，其中，所述NaCl的浓度为0.3-1.0mol/L；流速为10-25mL/min。

步骤i中所用层析柱平衡缓冲液为pH值为5.0-5.6、浓度为10-20mmol/L的柠檬酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl、pH值为5.0-5.6、浓度为10-20mmol/L的柠檬酸缓冲液，其中，所述NaCl的浓度为0.3-1.0mol/L；流速为10-25mL/min。

所述阳离子交换树脂为交联葡聚糖系、琼脂糖系或大孔弱酸丙烯酸系弱酸型阳离子交换树脂。

步骤h和i中所述弱酸型阳离子交换树脂通过下述方法得到：将阳离子交换树脂经常规处理除去树脂常残存的有机溶剂、低分子聚合物及有机杂质，然后用NaOH处理调整阳离子交换树脂的pH值成为7.5-9.0，使该阳离子交换树脂成为Na型阳离子交换树脂；用HCl处理调整阳离子交换树脂的pH值成为5.0-5.6的H型阳离子交换树脂，提供两步层析操作之用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的方法利用醇析法结合弱酸性阳离子交换法提取分离卵转铁蛋白，先让卵转铁蛋白在碱性条件下生成三元复合物，稳定了该蛋白的结构，使其更能够抵抗≤43%乙醇的沉淀作用，于是通过两步醇析法可有效地提取分离得到卵转铁蛋白粗品（含量≥80%）；然后将卵转铁蛋白粗品复溶于缓冲液中，在pH7.5-9.0操作pH范围内，由于卵转铁蛋白的等电点在6.0-6.7，因此在该pH范围内，卵转铁蛋白带负电荷，为阴离子，因而无法吸附在阳离子层析柱上，成为收集得到的组分1，直接穿柱而出，而蛋清中大多数的碱性蛋白的等电点均高于pH值9.0，这些碱性蛋白带有正电荷，因而为阳离子，因此会被吸附到阳离子层析柱上，达到了除去这些碱性蛋白的目的；然后进一步在pH5.0-5.6范围内，此时卵转铁蛋白带有正电荷，因而为阳离子，因此会被吸附到阳离子层析柱上，而粗品中的剩下其他蛋白为阴离子因而会随着此操作步骤的分离出的第一组分穿柱而出，留下的吸附在柱子上的卵转铁蛋白经含有NaCl的洗脱缓冲液的洗脱，会从阳离子吸附柱上被洗脱下来，再经透析会得到卵转铁蛋白的制品；由于此前经醇析法所得粗品即有一定纯度，使得此两步离子交换法操作会相对较为容易得到纯度更高产品。本发明的方法即提高了卵转铁蛋白制备的规模和产量，又使得产品的纯度得到了有效地提高。方法简单，有利于实现产业化生产。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

（1）将大孔D296型阴离子树脂经常规处理除去树脂常残存的有机溶剂、低分子聚合物及有机杂质，然后用HCl处理，使该阴离子交换树脂成为Cl型，并调整阴离子交换树脂的pH值为4.7备用。

将D152大孔弱酸性阳离子交换树脂经常规处理除去树脂常残存的有机溶剂、低分子聚合物及有机杂质，然后用NaOH处理调整阳离子交换树脂的pH值成为8.0，此时该阳离子交换树脂为Na型阳离子交换树脂，用HCl处理调整阳离子交换树脂的pH值成为5.2，此时该阳离子交换树脂为H型阳离子交换树脂，以分别提供两步层析操作之用。

（2）将新鲜蛋清量取体积后，加入三倍体积的去离子水混合均匀稀释，用滤布过滤除去不溶性物质，所得滤液用1.00mol/L的HCl溶液调pH值至6.0，在4℃低速搅拌过夜后在4℃、3000×g离心10min，离心获取的上清液即为“无粘蛋白”蛋清溶液。

（3）使用NaOH溶液将上述无粘蛋白蛋清溶液的pH值调节至9.0左右，分别加入NaHCO₃、NaCl和FeCl₃至NaHCO₃、NaCl和FeCl₃的终浓度分别为50mmol/L、150mmol/L和20mmol/L，低速搅拌30min，此时蛋清溶液呈橙红色。

（4）在上述橙红色的蛋清溶液中加入乙醇至乙醇终浓度为43%(v/v)，并在25℃下静置20min，然后在4℃、3220×g条件下离心20min，此时蛋清中除卵转铁蛋白外其它蛋白大多沉淀，经离心后可除去大部分除了卵转铁蛋白的其他杂蛋白，而大部分形成三元复合体的卵转铁蛋白则存在于呈亮橙红色的上清液中。取上清液，沉淀部分再用43%(v/v)乙醇洗涤2次，每次洗涤后3220×g离心。将3次离心所得取上清液合并，继续加入乙醇至乙醇的终浓度为59%(v/v)，4℃下低速搅拌40min后于4℃、3220×g条件下离心20min。

取离心所得沉淀复溶于50mmol/L的柠檬酸缓冲液（pH值为4.7）中，并使用HCl溶液调节沉淀复溶溶液的pH值至4.7左右，再加入步骤（1）中已处理的pH为4.7的大孔D296型阴离子树脂并室温下低速搅拌3h，过滤去除吸附HCO₃ ^-的阴离子树脂，所得滤液经冻干后可得到脱辅基-卵转铁蛋白粗品。

（5）利用两步弱酸性阳离子交换树脂层析法纯化得到高纯度的卵转铁蛋白的步骤如下：将步骤（3）得到的卵转铁蛋白粗品中加入pH值为8.0、浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液溶解得到卵转铁蛋白粗品溶液，卵转铁蛋白粗品溶液的终浓度为50mg/mL，并用NaOH溶液调节卵转铁蛋白粗品溶液的pH值至8.0，卵转铁蛋白粗品溶液在4℃、6000×g条件下离心30min，除去不溶性物质，所得上清液为含有卵转铁蛋白的溶液。上述含有卵转铁蛋白的溶液再经两步离子交换层析：第一步为：将上述含有卵转铁蛋白的溶液在pH值为8.0的条件下，使用步骤（1）备用的Na型的pH8.0弱酸性D152大孔阳离子交换树脂层析去除碱性蛋白，收集层析法得到的峰1组分,第一步中所用层析柱的平衡缓冲液为pH值为8.0、20mmol/L的磷酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl的pH值为8.0、浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液，其中NaCl的浓度为1.0mol/L；流速为20mL/min；层析柱规格为25cm×3cm。第二步为：第一步收集的峰1组分经步骤（1）备用的pH值为5.2的H型弱酸性D152大孔阳离子交换树脂层析并收集峰2组分，即为纯度较高的卵转铁蛋白,第二步所用层析柱平衡缓冲液为pH值5.2、浓度为10mmol/L柠檬酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl的pH值为5.2、浓度为10mmol/L柠檬酸缓冲液，其中，所述NaCl的浓度为1.0mol/L；流速为15mL/min。

（6）将含有卵转铁蛋白的峰2组分在4℃条件下经去离子水透析24h除盐得到高纯度的卵转铁蛋白。

最终得到的产品的纯度经高效液相色谱的测定以及SDS-PAGE电泳测定，其结果为95.31%，明显高于2008年K.Y.Ko和D.U.Ahn的方法。

实施例2

（1）将大孔D296型阴离子树脂经常规处理除去树脂常残存的有机溶剂、低分子聚合物及有机杂质，然后用HCl处理，使该阴离子交换树脂成为Cl型，并调整阴离子交换树脂的pH值为4.7备用。

将CM-sapharose CL-6B阳离子交换树脂经常规处理除去树脂常残存的有机溶剂、低分子聚合物及有机杂质，然后用NaOH处理调整阳离子交换树脂的pH值成为7.5，此时该阳离子交换树脂为Na型;用HCl处理调整阳离子交换树脂的pH值为5.5，此时该阳离子交换树脂为H型，以分别提供两步阳离子交换层析操作之用。

（2）将新鲜蛋清量取体积后，加入三倍体积的pH值为5.5的磷酸缓冲液混合均匀稀释，用纱布过滤除去不溶性物质，所得滤液用HCl溶液调pH值至5.5，置于10℃下低速搅拌过夜，然后在10℃、5000×g条件下离心10min，离心获取的上清液即为“无粘蛋白”蛋清溶液。

（3）使用NaOH溶液将上述无粘蛋白蛋清溶液的pH值调节至8.0左右，分别加入NaHCO₃、NaCl和FeCl₃至NaHCO₃、NaCl和FeCl₃的终浓度分别为70mmol/L、250mmol/L和30mmol/L，低速搅拌40min，此时蛋清溶液呈橙红色。

（4）在上述橙红色的蛋清溶液中加入乙醇至乙醇终浓度为45%（v/v），并在15℃下静置30min，然后在10℃、4000×g条件下离心10min，此时蛋清中除卵转铁蛋白外其它蛋白大多沉淀，经离心后可除去大部分除了卵转铁蛋白的其他杂蛋白，而大部分形成三元复合体的卵转铁蛋白则存在于呈亮橙红色的上清液中。取上清液，沉淀部分再用45%（v/v）乙醇洗涤2次，每次洗涤后离心。将3次离心所得取上清液合并，继续加入乙醇至乙醇的终浓度为60%（v/v），10℃下低速搅拌40min后于10℃、4000×g条件下离心20min。

取离心所得沉淀复溶于30mmol/L的柠檬酸缓冲液中，并用HCl溶液调节pH值至4.7左右，再加入步骤（1）已处理的pH为4.7的大孔D296型阴离子树脂并室温下低速搅拌3h，过滤去除吸附HCO₃ ^-的阴离子树脂，所得滤液经冻干后可得到脱辅基-卵转铁蛋白粗品。

（5）利用两步弱酸性阳离子交换树脂层析法纯化得到高纯度的卵转铁蛋白的步骤如下：将步骤（3）得到的卵转铁蛋白粗品中加入pH值7.5、浓度为30mmol/L的磷酸缓冲液溶解得到卵转铁蛋白粗品溶液，卵转铁蛋白粗品溶液的终浓度为50.00mg/mL，并用NaOH溶液调节卵转铁蛋白粗品溶液的pH值至8.5，卵转铁蛋白粗品溶液在10℃、5000×g条件下离心30min，除去不溶性物质，所得上清液为含有卵转铁蛋白的溶液。上述含有卵转铁蛋白的溶液再经两步离子交换层析：第一步为：将上述含有卵转铁蛋白的溶液在pH值为7.5的条件下，使用步骤（1）备用的pH值7.5的Na型弱酸性CM-sapharose CL-6B阳离子交换树脂层析去除碱性蛋白，收集层析法得到的峰1组分,第一步中所用层析柱的平衡缓冲液为pH值为7.5、浓度为30mmol/L的磷酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl的pH值为7.5、浓度为30mmol/L的磷酸缓冲液，其中NaCl的浓度为0.5mol/L；流速为20mL/min；层析柱规格为25cm×3cm。第二步为：第一步收集的峰1组分经步骤（1）备用的pH值为5.5的H型弱酸性CM-sapharoseCL-6B阳离子交换树脂层析收集峰2组分，即为纯度较高的卵转铁蛋白,第二步所用层析柱平衡缓冲液为pH5.5、浓度为20mmol/L柠檬酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl的pH值为5.5、浓度为20mmol/L柠檬酸缓冲液，其中，所述NaCl的浓度为0.5mol/L；流速为10mL/min。

（6）将含有卵转铁蛋白的峰2组分在6℃条件下经去离子水透析24h除盐得到高纯度的卵转铁蛋白。

最终得到的产品的纯度经高效液相色谱的测定以及SDS-PAGE电泳测定，其结果纯度为94.51%，明显高于2008年K.Y.Ko和D.U.Ahn的方法。

实施例3

（1）将大孔D296型阴离子树脂经常规处理除去树脂常残存的有机溶剂、低分子聚合物及有机杂质，然后用HCl处理，使该阴离子交换树脂成为Cl型，并调整阴离子交换树脂的pH值为4.7备用。

将CM-sephadex A-50阳离子交换树脂经常规处理除去树脂常残存的有机溶剂、低分子聚合物及有机杂质，然后用NaOH处理调整阳离子交换树脂的pH值成为8.0，使该阳离子交换树脂分别成为Na型；用HCl处理调整阳离子交换树脂的pH值成5.0，使该阳离子交换树脂成为H型，以分别提供两步阳离子交换层析操作之用。

（1）将新鲜蛋清量取体积后，加入三倍体积的去离子水混合均匀稀释，用纱布过滤除去不溶性物质，所得滤液用HCl溶液调pH值至5.0，并在4℃下低速搅拌过夜，然后在4℃、3000×g离心10min，除去蛋清溶液中的粘性蛋白，离心获取的上清液即为“无粘蛋白”蛋清溶液。

（2）使用NaOH溶液将上述无粘蛋白蛋清溶液的pH值调节至8.5左右，分别加入NaHCO₃、NaCl和FeCl₃至NaHCO₃、NaCl和FeCl₃的终浓度分别为50mmol/L、200mmol/L和15mmol/L，低速搅拌30min，此时蛋清溶液呈橙红色。

（3）在上述橙红色的蛋清溶液中加入乙醇至乙醇终浓度为40%（v/v），并在10℃下静置20min后，在4℃、2500×g条件下离心30min，此时蛋清中除卵转铁蛋白外其它蛋白大多沉淀，经离心后可除去大部分除了卵转铁蛋白的其他杂蛋白，而大部分形成三元复合体的卵转铁蛋白则存在于呈亮橙红色的上清液中。去上清液，沉淀部分再用40%（v/v）乙醇洗涤2次，每次洗涤后离心。将3次离心所得取上清液合并，继续加入乙醇至乙醇的终浓度为55%（v/v），10℃下低速搅拌40min后于10℃、2500×g条件下离心20min。

取离心所得沉淀复溶于50mmol/L的柠檬酸缓冲液中，并柠檬酸调节pH值至4.7左右，再加入步骤（1）已处理的pH为4.7的阴离子树脂并室温下低速搅拌3h，过滤去除吸附HCO₃ ^-的阴离子树脂，所得滤液经冻干后可得到脱辅基-卵转铁蛋白粗品。

（4）利用两步弱酸性阳离子交换树脂层析法纯化得到高纯度的卵转铁蛋白的步骤如下：将步骤（3）得到的卵转铁蛋白粗品中加入pH值8.0、浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液溶解得到卵转铁蛋白粗品溶液，卵转铁蛋白粗品溶液的终浓度为50mg/mL，并用1.00mol/L的NaOH溶液调节卵转铁蛋白粗品溶液的pH值至8.0，卵转铁蛋白粗品溶液在4℃、6000×g条件下离心30min，除去不溶性物质，所得上清液为含有卵转铁蛋白的溶液。上述含有卵转铁蛋白的溶液再经两步离子交换层析：第一步为：将上述含有卵转铁蛋白的溶液在pH值为8.0的条件下，使用步骤（1）备用的pH8.0 Na型弱酸性CM-sephadex A-50阳离子交换树脂层析去除碱性蛋白，收集层析法得到的峰1组分,第一步中所用层析柱的平衡缓冲液为pH值为8.0、20mmol/L的磷酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl的pH值为8.0、浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液，其中NaCl的浓度为1.0mol/L；流速为20mL/min；层析柱规格为25cm×3cm。第二步为：第一步收集的峰1组分经使用步骤（1）备用的pH 5.0的H型CM-sephadex A-50弱酸性阳离子交换树脂层析收集峰2组分，即为纯度较高的卵转铁蛋白,第二步所用层析柱平衡缓冲液为pH5.0、浓度为10mmol/L柠檬酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl的pH值为5.0、浓度为10mmol/L柠檬酸缓冲液，其中，所述NaCl的浓度为1.0mol/L；流速为25mL/min。

（5）将含有卵转铁蛋白的峰2组分在4℃条件下经去离子水透析24h除盐得到高纯度的卵转铁蛋白。

最终得到的产品的纯度经高效液相色谱的测定以及SDS-PAGE电泳测定，其结果纯度为93.56%，明显高于2008年K.Y.Ko和D.U.Ahn的方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种卵转铁蛋白的分离提取的方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）将无粘蛋白蛋清溶液的pH值调节至7.5-9.0，采用乙醇析出法提取得到卵转铁蛋白粗品；

（2）利用两步弱酸性阳离子交换层析法纯化上述卵转铁蛋白粗品，纯化的卵转铁蛋白在1-10℃条件下经透析除盐得到高纯度的卵转铁蛋白。

2.根据权利要求1所述的卵转铁蛋白的分离提取的方法，其特征在于，所述无粘蛋白蛋清溶液通过下述方法制备：将新鲜蛋清中加入三倍体积的去离子水或pH值为5.0-6.0缓冲液稀释，过滤除去不溶性物质，并调节所得滤液的pH值至5.0-6.0，在1-10℃低速搅拌过夜，然后在1-10℃、2500-5000×g离心5-20min，除去蛋清溶液中的粘性蛋白，便于以后的操作，离心获取的上清液即为无粘蛋白蛋清溶液。

3.根据权利要求1所述的卵转铁蛋白的分离提取的方法，其特征在于，所述乙醇析出法提取卵转铁蛋白粗品的步骤如下：

a、将pH值为7.5-9.0的无粘蛋白蛋清溶液中加入NaHCO₃、NaCl和FeCl₃至NaHCO₃、NaCl和FeCl₃的终浓度分别为40-70mmol/L、100-250mmol/L和15-30mmol/L，低速搅拌20-40min后，蛋清溶液呈橙红色；

b、之后，加入乙醇至乙醇终浓度为40-45%v/v，并在1-25℃下静置20-40min，然后在1-10℃、2500-5000×g条件下离心10-30min，使得蛋清中除卵转铁蛋白的其它蛋白沉淀；

c、取上清液，并用40-45%v/v乙醇将沉淀洗涤1-2次，每次洗涤后离心取上清液；

d、将上述多次离心所得上清液合并，继续加入乙醇至乙醇的终浓度为55-60%v/v；

e、在1-25℃下低速搅拌15-40min后，在1-10℃、2500-4500×g条件下离心10-35min；

f、取离心所得沉淀复溶于20-50mmol/L的柠檬酸缓冲液中，并调节pH值至3.0-5.0，加入已处理的pH值为4.7的阴离子交换树脂，在室温下低速搅拌3h，过滤去除吸附HCO₃ ^-的阴离子交换树脂，所得滤液经冻干后得到脱辅基-卵转铁蛋白粗品。

4.根据权利要求3所述的卵转铁蛋白分离提取的方法，其特征在于，所述阴离子交换树脂为大孔D296型阴离子树脂。

5.根据权利要求3所述的卵转铁蛋白分离提取的方法，其特征在于，步骤f中所述已处理的pH值为4.7的阴离子交换树脂的处理过程为：将阴离子交换树脂经常规处理除去树脂常残存的有机溶剂、低分子聚合物及有机杂质，然后用HCl处理，使该阴离子交换树脂成为pH值为4.7的Cl型阴离子交换树脂。

6.根据权利要求1所述的卵转铁蛋白的分离提取的方法，其特征在于，所述的利用两步弱酸性阳离子交换层析法纯化卵转铁蛋白粗品的步骤如下：

g、将卵转铁蛋白粗品中加入pH值为7.5-9.0、20-40mmol/L的磷酸缓冲液溶解，至卵转铁蛋白的终浓度为50-100mg/mL，得到卵转铁蛋白粗品溶液，并用NaOH溶液调节卵转铁蛋白粗品溶液的pH值至7.5-9.0，之后，在1-10℃、4000-6000×g条件下离心20-40min，取上清液；

h、将上述上清液在pH值为7.5-9.0操作范围内，用Na型弱酸性阳离子交换树脂层析去除碱性蛋白，收集层析法得到的峰1组分；

i、用pH值为5.0-5.6的H型弱酸性阳离子交换树脂层析收集峰2组分即为高纯度的卵转铁蛋白。

7.根据权利要求6所述的卵转铁蛋白分离提取的方法，其特征在于，步骤h中所用层析柱的平衡缓冲液为pH值为7.5-9.0、浓度为10-30mmol/L的磷酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl、pH值为7.5-9.0、浓度为10-30mmol/L的磷酸缓冲液，其中，所述NaCl的浓度为0.3-1.0mol/L；流速为10-25mL/min。

8.根据权利要求6或7所述的卵转铁蛋白分离提取的方法，其特征在于，步骤i中所用层析柱平衡缓冲液为pH值为5.0-5.6、浓度为10-20mmol/L的柠檬酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl、pH值为5.0-5.6、浓度为10-20mmol/L的柠檬酸缓冲液，其中，所述NaCl的浓度为0.3-1.0mol/L；流速为10-25mL/min。

9.根据权利要求7所述的卵转铁蛋白分离提取的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂为交联葡聚糖系、琼脂糖系或大孔弱酸丙烯酸系弱酸型阳离子交换树脂。

10.根据权利要求6所述的卵转铁蛋白分离提取的方法，其特征在于，步骤h和i中所述弱酸型阳离子交换树脂通过下述方法得到：将阳离子交换树脂经常规处理除去树脂常残存的有机溶剂、低分子聚合物及有机杂质，然后用NaOH处理调整阳离子交换树脂的pH值成为7.5-9.0，使该阳离子交换树脂分别成为Na型阳离子交换树脂；用HCl处理调整阳离子交换树脂的pH值成为5.0-5.6的H型阳离子交换树脂，提供两步层析操作之用。