CN110204609A - 一种工业化提取卵转铁蛋白的方法及其蛋白铁产品 - Google Patents

一种工业化提取卵转铁蛋白的方法及其蛋白铁产品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蛋白质提取技术领域，具体为一种工业化提取卵转铁蛋白的方法及其蛋白铁产品，主要使用高压脉冲电场辅助处理蛋清降低黏度和表面张力，电场分子极化作用诱导更多带电极性基团暴露，带电分子产生反复剧烈运动，这种运动破坏了卵黏蛋白纤维状结构，使卵黏蛋白与卵类黏蛋白、溶菌酶等可等可溶性蛋白质形成的复合物解体，浓厚蛋白稀薄化，粘度进一步降低，分子分散起到很好的辅助分离的效果，有助于后期超滤分离，提高蛋白得率；通过改用亚铁与鸡蛋清中卵转铁蛋白进行鳌合，不仅可以增强卵转铁蛋白的结构稳定性使其后期可以加入高浓度乙醇进行进一步纯化，而且人体更易于吸收二价铁。

Description

一种工业化提取卵转铁蛋白的方法及其蛋白铁产品
技术领域
本发明涉及蛋白质提取技术领域，具体为一种工业化提取卵转铁蛋白的方法及其蛋白铁产品。
背景技术
将蛋清中加入亚铁离子进行鳌合，不仅可以使卵转铁蛋白结构更加稳定，足以抵抗高浓度的乙醇而不会变性，而且鳌合了亚铁的卵转铁蛋白可以提高蛋白的含铁量并作为铁补充剂。鸡蛋清中的卵转铁蛋白可以作为铁的载体运输铁进入人体，与铁结合后可以降低其致敏性，在补铁的同时并具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性。
国内外研究的主要是将卵转铁蛋白与三价铁鳌合，考虑到提取鳌合铁的卵转铁蛋白可以作为铁强化剂这一用途，且人体更易于吸收二价铁，因而选用二价铁与鸡蛋清中卵转铁蛋白进行鳌合。传统的补铁剂大多会刺激人体胃肠道，长期服用会对人的身体造成不适，于是很多研究者开始将目光转向为开发更多新型的补铁剂。由于我国是最大的禽蛋生产国和消费国，在食品行业中对蛋黄的需求量很大，往往蛋清会作为废弃物丢弃，那么充分利用蛋清中蛋白质资源具有一定的意义。蛋清中的卵转铁蛋白具有结合金属离子的特性，那么以卵转铁蛋白作为载体将铁运输进人体，可以减少铁对人体胃肠道的直接刺激。将卵转铁蛋白铁配合中药成分可以健脾益气，补血活血，更有利于人体对铁的吸收。
目前国内外提取纯度较高的卵转铁蛋白采用较多的方法主要是对蛋清进行前处理后再联合阴阳离子树脂交换、固定化金属鳌合亲和色谱、离子交换色谱等方法。虽然提取的蛋白纯度很高，甚至可以达到98％以上，但所用的树脂、色谱柱、蛋白分离纯化仪成本较高，若大量提取也耗时耗力。
发明内容
为了解决上述的问题，本发明提供一种工业化提取卵转铁蛋白的方法及其蛋白铁产品，主要使用高压脉冲电场辅助处理蛋清降低黏度和表面张力，电场分子极化作用诱导更多带电极性基团暴露，带电分子产生反复剧烈运动，这种运动破坏了卵黏蛋白纤维状结构，使卵黏蛋白与卵类黏蛋白、溶菌酶等可等可溶性蛋白质形成的复合物解体，浓厚蛋白稀薄化，粘度进一步降低，分子分散起到很好的辅助分离的效果，有助于后期超滤分离，提高蛋白得率；使用有机溶剂无水乙醇和超滤装置来提取纯化，超滤除去的废液可以旋蒸回收乙醇并重复利用，绿色环保、成本很低且可以大规模工业化生产。
本发明解决其技术问题采用以下技术方案来实现：
一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)蛋清的预处理：将鸡蛋清洗干净后分离出蛋清，采用电动搅拌器缓慢搅拌蛋清至浓厚蛋白变均匀；
(2)高压脉冲电场处理：将(1)中蛋清进行高压脉冲电场处理，电场分子极化作用诱导更多带电极性基团暴露，诱导带电分子产生反复剧烈运动，破坏了卵黏蛋白纤维状结构，使卵黏蛋白与卵类黏蛋白、溶菌酶等可溶性蛋白质形成的复合物解体，浓厚蛋白稀薄化，粘度进一步降低，分子分散；
(3)加入FeSO4或FeCl2溶液进行鳌合：将搅拌均匀的蛋清加双蒸水进行等体积稀释后，加入NaHCO3和NaCl充分溶解后加入FeSO4或FeCl2溶液进行充分鳌合；
(4)初次加入无水乙醇：缓慢加入无水乙醇(终浓度30％～50％)后立即离心取上清液，并用纱布将上清液中悬浮的杂质滤过；
(5)二次加入无水乙醇：将(4)中的上清液中缓慢加入无水乙醇(终浓度52％～66％)后静置于4℃冰箱后进行离心取沉淀并充分溶解；
(6)抽滤：抽滤装置连接真空泵进行抽滤(5)中的溶液；
(7)两次超滤：将抽滤后的溶液进行两次超滤，不断加水进行浓缩，除去乙醇、盐分、未与卵转铁蛋白鳌合的多余的亚铁离子以及分子量小于卵转铁蛋白的部分杂蛋白；
(8)真空冷冻干燥：将浓缩后的卵转铁蛋白溶液装入冻干盒并放入-20℃冰箱先进行预冻后，再放入冻干机冻干，冷冻干燥的条件为温度-50℃，真空度0.1Pa，时间为36h；
(9)回收乙醇：步骤(7)中小于超滤膜分子量一端的液体采用旋转蒸发仪进行悬蒸回收乙醇，旋转蒸发仪的参数设定为压力1Mpa，温度40～45℃；
(10)粉碎：用粉碎机将冻干的蛋白打碎成细粉后过筛，过筛目数为100目。
优选的，步骤(1)中所述的缓慢搅拌的转速为300～400r/min，时间10～15min。
优选的，步骤(2)中所述的高压脉冲电场处理条件为场强20～30kv/cm，脉冲数为6～10，时间5～10min。
优选的，步骤(3)中所述加入的NaHCO3和NaCl终浓度分别为20mmol/L、50mmol/L，配制50mmol/L的FeSO4或FeCl2溶液加入量为每100mL稀释的蛋清液中加入0.8～1.2mL。搅拌转速为200～300r/min，时间20～30min。
优选的，步骤(4)所述缓慢加入无水乙醇是边加边搅拌，转速500～600r/min，至终浓度为40％～45％，离心条件为离心力3000×g，离心时间20min。
优选的，步骤(5)所述上清液中加入的无水乙醇是至终浓度为54％～58％，边加边搅拌的条件是300～400r/min，静置时间为6～7h，离心条件为离心力3000×g，离心时间20min。
优选的，步骤(6)抽滤先安装滤纸进行初步除杂后分别选用微米级的水系膜5um、1.2um、0.2um依次过滤溶解的沉淀溶液，抽滤的真空泵压力调为0.8～1Mpa。
优选的，步骤(7)中抽滤后的蛋白溶液尽可能多加入几次水不断稀释，超滤先过30KDa超滤膜除掉乙醇、盐分、多余亚铁离子和分子量小于30KDa的蛋白，收集大于30KDa的蛋白溶液后再过50KDa的超滤膜收集大于50KDa这边浓缩的卵转铁蛋白溶液，超滤完后加入水进行完全回流来收集管道、超滤膜间残留的蛋白。
一种工业化提取卵转铁蛋白的蛋白铁产品，其生产过程包括以下步骤：
(1)将鳌合亚铁的卵转铁蛋白与乳酸亚铁、维生素C、叶酸、益气补血的中药粉混合；鳌合二价铁的卵转铁蛋白、乳酸亚铁、维生素C、叶酸、益气补血中药成分重量比为30:(0.1～0.3):(0.5～0.7):(0.005～0.01):(6～10)；所述的益气补血的中药粉为当归、黄芪、党参、阿胶、大枣、枸杞、白芍、茯苓、熟地黄等中的两至三种中药(生药粉或提取物)组方；
(2)辅料及片剂成型：将(1)中的主料与药用辅料填充剂、崩解剂、润滑剂混合后压片成产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，通过改用亚铁与鸡蛋清中卵转铁蛋白进行鳌合，不仅可以增强卵转铁蛋白的结构稳定性使其后期可以加入高浓度乙醇进行进一步纯化，而且人体更易于吸收二价铁。
2、本发明所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，通过将搅拌后的蛋清进行高压脉冲电场辅助处理，电场分子极化作用诱导更多带电极性基团暴露，电荷数增多诱导带电分子产生反复剧烈运动，这种运动破坏了卵黏蛋白纤维状结构，使卵黏蛋白与卵类黏蛋白、溶菌酶等可溶性蛋白质形成的复合物解体，浓厚蛋白稀薄化，粘度降低，分子分散，起到很好的辅助分离的效果，同时提高蛋白得率。
3、本发明所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，通过采用有机试剂无水乙醇，成本低，在除杂过程中相比盐析法更容易将乙醇除干净，在超滤过程中除去的乙醇可以通过旋蒸回收利用，绿色环保。
4、本发明所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，通过使用两次超滤进一步分离纯化，可以大批量的生产纯度和得率较高的卵转铁蛋白，生产周期短，1～2d就可以完成该提取工艺。
5、本发明所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的蛋白铁产品，通过将提取的卵转铁蛋白中加入维生素C、叶酸、几种中药粉来更好地促进人体对铁的吸收，短期内就具有很好的补铁效果。
附图说明
图1为实施例1～实施例5初次加入无水乙醇后上清液和沉淀的电泳图。
图2为实施例6～实施例10经二次加入无水乙醇后沉淀和上清液的电泳图。
图3为铁标准曲线。
图4为实施例11与实施例12提取的卵转铁蛋白的电泳图。
表1为实施例11与实施例12提取的两种鳌合不同亚铁源的卵转铁蛋白的纯度、得率、含铁量。
表2为实施例14中3建立IDA模型的血常规值。
表3为实施例11与实施例13各组大鼠血液的RBC值。
表4为实施例11与实施例13各组大鼠血液的Hb值。
表5为实施例11与实施例13各组大鼠血液的HCT值。
具体实施例
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)蛋清的预处理：
将鸡蛋表面清洗干净，分离出蛋清，用电动搅拌器缓慢匀速的搅拌，条件为：搅拌速度300r/min，时间10min；
2)高压脉冲电场辅助处理：
将1)中蛋清进行PEF处理，条件为场强25kv/cm，脉冲数6，时间7min；
3)加入FeSO4溶液进行鳌合：
搅拌均匀后的蛋清中加入双蒸水等体积稀释后，缓慢加入NaHCO3和NaCl至终浓度20mmol/L和50mmol/L，充分溶解后再加入配制的50mmol/L的FeSO4溶液进行鳌合，按每100mL等体积稀释的蛋清液中加入亚铁溶液1mL，使卵转铁蛋白与亚铁离子充分鳌合，搅拌条件为300r/min，时间20min；
4)初次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度30％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为600r/min，搅拌均匀后立即离心取上清液，离心条件为3000×g，时间20min。
实施例2
1)与实施例1中1)相同；
2)与实施例1中2)相同；
3)与实施例1中3)相同；
初次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度35％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为600r/min，搅拌均匀后立即离心取上清液，离心条件为3000×g，时间20min。
实施例3
1)与实施例1中1)相同；
2)与实施例1中2)相同；
3)与实施例1中3)相同；
初次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度40％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为600r/min，搅拌均匀后立即离心取上清液，离心条件为3000×g，时间20min。
实施例4
1)与实施例1中1)相同；
2)与实施例1中2)相同；
3)与实施例1中3)相同；
4)初次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度45％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为600r/min，搅拌均匀后立即离心取上清液，离心条件为3000×g，时间20min。
实施例5
1)与实施例1中1)相同；
2)与实施例1中2)相同；
3)与实施例1中3)相同；
4)初次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度50％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为600r/min，搅拌均匀后立即离心取上清液，离心条件为3000×g，时间20min。
实施例6
1)与实施例1中1)相同；
2)与实施例1中2)相同；
3)与实施例1中3)相同；
4)初次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度40％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为600r/min，搅拌均匀后立即离心取上清液，离心条件为3000×g，时间20min；
5)二次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度52％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为400r/min，搅拌均匀后放置4℃条件下静置7h后离心，离心条件为3000×g，时间20min。
实施例7
1)与实施例1中1)相同；
2)与实施例1中2)相同；
3)与实施例1中3)相同；
4)与实施例6中4)相同；
5)二次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度54％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为400r/min，搅拌均匀后放置4℃条件下静置7h后离心，离心条件为3000×g，时间20min。
实施例8
1)与实施例1中1)相同；
2)与实施例1中2)相同；
3)与实施例1中3)相同；
4)与实施例6中4)相同；
5)二次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度58％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为400r/min，搅拌均匀后放置4℃条件下静置7h后离心，离心条件为3000×g，时间20min。
实施例9
1)与实施例1中1)相同；
2)与实施例1中2)相同；
3)与实施例1中3)相同；
4)与实施例6中4)相同；
5)二次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度62％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为400r/min，搅拌均匀后放置4℃条件下静置7h后离心，离心条件为3000×g，时间20min。
实施例10
1)与实施例1中1)相同；
2)与实施例1中2)相同；
3)与实施例1中3)相同；
4)与实施例6中4)相同；
5)二次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度66％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为400r/min，搅拌均匀后放置4℃条件下静置7h后离心，离心条件为3000×g，时间20min。
实施例11
1)蛋清的预处理：
将鸡蛋表面清洗干净，分离出蛋清，用电动搅拌器缓慢匀速的搅拌，条件为：搅拌速度300r/min，时间20min；
2)PEF辅助处理：
将搅拌后的蛋清进行PEF处理进一步降低黏度和表面张力，场强25kv/cm，脉冲数6，时间7min；
3)加入FeSO4溶液进行鳌合：
搅拌均匀后的蛋清中加入双蒸水等体积稀释后，缓慢加入NaHCO3和NaCl至终浓度20mmol/L和50mmol/L，充分溶解后再加入配制的50mmol/L的FeSO4溶液进行鳌合，按每100mL等体积稀释的蛋清液中加入亚铁溶液1.2mL，使卵转铁蛋白与亚铁离子充分鳌合，搅拌条件为300r/min，时间20min；
4)初次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度40％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为600r/min，搅拌均匀后立即离心取上清液，离心条件为3000×g，时间20min。离心后用纱布将上清液过滤一次；
5)二次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇至终浓度58％(按体积比计算)，边加时边搅拌，搅拌条件为400r/min，搅拌均匀后放置4℃条件下静置7h后离心，离心条件为3000×g，时间20min；
6)抽滤：
沉淀加水充分溶解后，先用抽滤装置安装滤纸，蛋白溶液先过一次滤纸除去不溶的杂质后，再依次安装微米级的水系膜，孔径大小分别为5um、1.2um、0.2um，使蛋白溶液分别过滤一次；
7)两次超滤：
将抽滤后的蛋白溶液加水稀释后进行两次超滤除杂，先通过30KDa的超滤膜，收集大于30KDa一边的蛋白溶液，小于30KDa一边的溶液保存用于回收乙醇。再将蛋白溶液通过50KDa的超滤膜二次超滤，收集大于50KDa一边的蛋白溶液。超滤完后加水将管道、超滤膜上的蛋白溶液完全回收；
8)真空冷冻干燥：
将浓缩除杂后的蛋白溶液分装冻干盒中于-20℃冰箱进行预冻后再进行真空冷冻干燥，干燥条件为温度-50℃，真空度0.1Pa，36h；
9)回收乙醇：
将7)中小于30KDa一边的废液收集后，采用旋转蒸发仪旋蒸回收乙醇，旋蒸条件为1Mpa，温度40～45℃；
10)粉碎：
将冻干的蛋白用粉碎机打碎并过100目筛；
11)加工片剂：
鳌合二价铁的卵转铁蛋白60g，乳酸亚铁0.6g，维生素C1.4g，叶酸0.01g，当归粉4g，黄芪粉12g，阿胶粉4g，微晶纤维素22.08g，交联聚乙烯吡咯烷酮5.52g，硬脂酸镁0.77g混合均匀后压片。
实施例12
1)与实施例11中1)相同；
2)与实施例11中2)相同；
加入FeCl2溶液进行鳌合：
搅拌均匀后的蛋清中加入双蒸水等体积稀释后，缓慢加入NaHCO3和NaCl至终浓度20mmol/L和50mmol/L，充分溶解后再加入配制的50mmol/L的FeSO4溶液进行鳌合，按每100mL等体积稀释的蛋清液中加入亚铁溶液1.2mL，使卵转铁蛋白与亚铁离子充分鳌合，搅拌条件为300r/min，时间20min；
4)与实施例11中4)相同；
5)与实施例11中5)相同；
6)与实施例11中6)相同；
7)与实施例11中7)相同；
8)与实施例11中8)相同。
实施例13
1)与实施例11中1)相同；
2)与实施例11中2)相同；
3)与实施例11中3)相同；
4)与实施例11中4)相同；
5)与实施例11中5)相同；
6)与实施例11中6)相同；
7)与实施例11中7)相同；
8)与实施例11中8)相同；
9)与实施例11中9)相同；
10)与实施例11中10)相同；
加工片剂：
鳌合二价铁的卵转铁蛋白60g，乳酸亚铁0.6g，维生素C1.4g，叶酸0.01g，大枣水醇提取物5.56g，枸杞水醇提取物4.44g，阿胶粉10g，微晶纤维素22.08g，交联聚乙烯吡咯烷酮5.52g，硬脂酸镁0.77g混合均匀后压片。
以下为对上述实施例1至实施例13的测定方法与结果的说明：
1.纯度测定
安装夹心式玻璃板：将干燥的玻璃板装入配套的夹套中，垂直固定在卡槽上，检查装置是否漏水，若漏水则需重新固定。
配胶：采用SDS-PAGE不连续系统，分离胶浓度12％、浓缩胶浓度5％。
制备凝胶：先将配置好的分离胶缓慢沿长玻璃板加到两块玻璃板之间，加至距短板上沿2-3cm处，以少量双蒸馏进行水封，待胶体凝固后倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。然后加入配置好的浓缩胶，直至距离短玻璃板上沿约0.3cm处，插入梳子，用少量蒸馏水覆盖，待胶体凝固后，加入电极缓冲液，然后拔去梳子。
样品处理及上样：取适量Holo-OTf粉末溶于双蒸水中，使其浓度为2mg/mL。用移液枪取80μL蛋白质溶液，加入20μL的上样缓冲液，混匀，置于沸水中煮沸3-5min，冷却置室温，然后用微量进样器上样。Marker用微量进样器直接上样。
电泳：将制备好的凝胶连同玻璃板一起放入电泳槽中，在电泳槽外侧及上槽中注入电极缓冲液，外侧电极缓冲液淹没电极约2mm，链接电极，打开电泳仪，设置相关参数(浓缩胶电压80V，分离胶电压120V)，开始电泳。当溴酚蓝染料迁移至玻璃板底部时，停止电泳。
固定、染色及脱色：将配置好的固定液倒入培养皿中，固定30min；然后弃去固定液，加入染色液，室温下在振荡器上染色30-40min；染色完成之后先用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色3-4次，直至背景色去除。
分析及计算：采用Gel-pro analyzer对电泳图进行分析，鉴定蛋白质纯度。
2、铁含量测定
硝酸溶液(5+95)：量取50mL硝酸，倒入950mL超纯水中，混匀。
铁标准中间液(100mg/L)，准确吸取铁标准储备液(1000mg/L)10mL于100mL容量瓶中，加硝酸溶液(5+95)定容至刻度，混匀。此铁溶液质量浓度为100mg/L。
铁标准系列溶液：分别准确吸取铁标准中间液(100mg/L)0mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL于100mL容量瓶中，加硝酸溶液(5+95)定容至刻度，混匀。此铁标准系列溶液中铁的质量浓度分别为0mg/L、1.00mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L。
样品处理：准确称取固体试样0.5g于消化管中，加入10mL硝酸和0.5mL高氯酸，在消化炉上消解(120℃/0.5～1h，升至180℃/2～4h，升至200～220℃)。若消化液呈棕褐色，再加硝酸，消解至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色，取出消化管，冷却后将消化液转移至100mL容量瓶中，用少量水洗涤2～3次，合并洗涤液于容量瓶中并用水定容至刻度，混匀备用，同时做试样空白试验(GB5009.90—2016)。
3.建立IDA大鼠模型
SPF级雌性初断乳Wistar大鼠68只，21天初断乳，健康状况良好，血象正常，平均体重62.13±6.54g。所有大鼠均采用不锈钢笼饲养，动物房温度维持在25±1℃，相对湿度维持在50％±5％，光暗周期为12h，自由进食和饮水。随机分出12只作为正常组，饲喂普通饲料，另外56只作为缺铁组，饲喂缺铁饲料。第29d用戊巴比妥钠麻醉，从尾静脉取血测定血常规并称重后进行重新分组，从56只中选出建模成功的48只分成4个组。各组灌胃剂量为2mg/(kg.d)(按铁计量)，正常对照组灌胃自来水，阴性对照组灌胃超纯水，补铁组灌胃体积均为1.2mL/100g，每日灌胃一次，连续27天。补铁恢复期间所有大鼠每5天称量一次体重，根据体重调整灌胃剂量。
4.全血指标测定
采集的全血置于0.5mLEDTAK2抗凝管中，反复颠倒5-10次。采血过程中血液保存于4℃冰箱，待全部动物采血完毕后马上送检(当天)，送检过程中血液保存于冰盒中；全血RBC、Hb、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW均使用Sysmex xs-1000i全自动血液分析仪进行测定。
实施例11与实施例12提取的两种鳌合不同亚铁源的卵转铁蛋白的纯度、得率、含铁量
种类 纯度(％) 得率(％) 含铁量(mg/g)
FeSO<sub>4</sub>-OTf 90.6 82.33±2.05 1.85±0.03
FeCl<sub>2</sub>-OTf 85.2 81.82±1.81 1.48±0.06
表1
实施例14中3建立IDA模型的血常规值
表2
实施例11与实施例13各组大鼠血液的RBC值
表3
实施例11与实施例13各组大鼠血液的Hb值
表4
实施例11与实施例13各组大鼠血液的HCT值
表5
虽然在上文中已经参考实施例对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施例中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims (9)

1.一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)蛋清的预处理：
将鸡蛋清洗干净后分离出蛋清，采用电动搅拌器缓慢搅拌蛋清至浓厚蛋白变均匀；
(2)高压脉冲电场处理：
将(1)中蛋清进行高压脉冲电场处理，电场分子极化作用诱导更多带电极性基团暴露，诱导带电分子产生反复剧烈运动，破坏了卵黏蛋白纤维状结构，使卵黏蛋白与卵类黏蛋白、溶菌酶等可溶性蛋白质形成的复合物解体，浓厚蛋白稀薄化，粘度进一步降低，分子分散；
(3)加入FeSO4或FeCl2溶液进行鳌合：
将搅拌均匀的蛋清加双蒸水进行等体积稀释后，加入NaHCO3和NaCl充分溶解后加入FeSO4或FeCl2溶液进行充分鳌合；
(4)初次加入无水乙醇：
缓慢加入无水乙醇(终浓度30％～50％)后立即离心取上清液，并用纱布将上清液中悬浮的杂质滤过；
(5)二次加入无水乙醇：
将(4)中的上清液中缓慢加入无水乙醇(终浓度52％～66％)后静置于4℃冰箱后进行离心取沉淀并充分溶解；
(6)抽滤：
抽滤装置连接真空泵进行抽滤(5)中的溶液；
(7)两次超滤：
将抽滤后的溶液进行两次超滤，不断加水进行浓缩，除去乙醇、盐分、未与卵转铁蛋白鳌合的多余的亚铁离子以及分子量小于卵转铁蛋白的部分杂蛋白；
(8)真空冷冻干燥：
将浓缩后的卵转铁蛋白溶液装入冻干盒并放入-20℃冰箱先进行预冻后，再放入冻干机冻干，冷冻干燥的条件为温度-50℃，真空度0.1Pa，时间为36h；
(9)回收乙醇：
步骤(7)中小于超滤膜分子量一端的液体采用旋转蒸发仪进行悬蒸回收乙醇，旋转蒸发仪的参数设定为压力1Mpa，温度40～45℃；
(10)粉碎：
用粉碎机将冻干的蛋白打碎成细粉后过筛，过筛目数为100目。
2.根据权利要求1所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的缓慢搅拌的转速为300～400r/min，时间10～15min。
3.根据权利要求1所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的高压脉冲电场处理条件为场强20～30kv/cm，脉冲数为6～10，时间5～10min。
4.根据权利要求1所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，其特征在于：步骤(3)中所述加入的NaHCO3和NaCl终浓度分别为20mmol/L、50mmol/L，配制50mmol/L的FeSO4或FeCl2溶液加入量为每100mL稀释的蛋清液中加入0.8～1.2mL。搅拌转速为200～300r/min，时间20～30min。
5.根据权利要求1所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，其特征在于：步骤(4)所述缓慢加入无水乙醇是边加边搅拌，转速500～600r/min，至终浓度为40％～45％，离心条件为离心力3000×g，离心时间20min。
6.根据权利要求1所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，其特征在于：步骤(5)所述上清液中加入的无水乙醇是至终浓度为54％～58％，边加边搅拌的条件是300～400r/min，静置时间为6～7h，离心条件为离心力3000×g，离心时间20min。
7.根据权利要求1所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，其特征在于：步骤(6)抽滤先安装滤纸进行初步除杂后分别选用微米级的水系膜5um、1.2um、0.2um依次过滤溶解的沉淀溶液，抽滤的真空泵压力调为0.8～1Mpa。
8.根据权利要求1所述的一种工业化提取卵转铁蛋白的方法，其特征在于：步骤(7)中抽滤后的蛋白溶液尽可能多加入几次水不断稀释，超滤先过30KDa超滤膜除掉乙醇、盐分、多余亚铁离子和分子量小于30KDa的蛋白，收集大于30KDa的蛋白溶液后再过50KDa的超滤膜收集大于50KDa这边浓缩的卵转铁蛋白溶液，超滤完后加入水进行完全回流来收集管道、超滤膜间残留的蛋白。
9.一种工业化提取卵转铁蛋白的蛋白铁产品，其特征在于，其生产过程包括以下步骤：
(1)将鳌合亚铁的卵转铁蛋白与乳酸亚铁、维生素C、叶酸、益气补血的中药粉混合；鳌合二价铁的卵转铁蛋白、乳酸亚铁、维生素C、叶酸、益气补血中药成分重量比为30:(0.1～0.3):(0.5～0.7):(0.005～0.01):(6～10)；所述的益气补血的中药粉为当归、黄芪、党参、阿胶、大枣、枸杞、白芍、茯苓、熟地黄等中的两至三种中药(生药粉或提取物)组方；
(2)辅料及片剂成型：
将(1)中的主料与药用辅料填充剂、崩解剂、润滑剂混合后压片成产品。
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