KR20150081789A

KR20150081789A - 난백 단백질 연속분리공정 방법

Info

Publication number: KR20150081789A
Application number: KR1020140001623A
Authority: KR
Inventors: 안동욱; 아베이라순어 산둔; 이현용
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-01-07
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2015-07-15

Abstract

본 발명은 난백 단백질 연속분리공정 방법에 관한 것으로, 난백으로부터 라이소자임, 오보뮤신, 오보트랜스페린과 오보알부민을 순차적으로 분리함으로써 고수율, 고순도의 분리할 수 있는데 가장 먼저 난백 단백질로부터 라이소자임을 먼저 분리시키고, 다음 단계로 오보뮤신을 분리시킨 후 오보알부민과 오보트랜스페린을 분리시키는 방법으로 라이소자임의 경우 약 89%, 오보알부민과 오보 뮤신의 경우 97-99%, 오보트랜스페린의 경우 83%의 수율을 나타내고, 순도 역시 라이소자임은 95% 이상, 오보알부민과 오보트랜스페린은 85% 이상, 오보뮤신 85%이상으로 매우 순수하게 분리되어 우리 몸에 유용한 4가지 난백단백질을 대량 생산을 가능하게 하여 양계 산업의 부가가치를 높일 수 있고 식품, 의약품 및 화장품등에 적용하여 다양한 제품을 만들 수 있다.

Description

난백 단백질 연속분리공정 방법{Sequential separation of lysozyme, ovomucin, ovotransferrin and ovalbumin from egg white}

본 발명은 난백 단백질 연속분리공정 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 계란의 난백으로부터 유용한 단백질인 오보알부민, 오보트랜스페린, 라이소자임, 오보뮤신의 4가지 단백질을 연속적 분리공정에 의하여 순차적으로 분리하는 방법에 관한 것이다.

오보알부민 (54%), 오보트랜스페린 (13%), 라이소자임 (3.5%)과 오보뮤신 (3.5%)은 난백 단백질에 주요 단백질로서 각각 여러 가지 기능성을 가지며, 식품, 의약 원료 및 항균 제제 등에 널리 이용되고 있다.

오보알부민은 인산기가 결합되어 있는 당단백질로 분자량이 45 kda이며 등전점이 4.5인 단백질로 385개의 아미노산 중 절반은 소수성이며 이중 3분에 1은 전하를 띠고 있다. 오보알부민은 동물세포 배양이나 기능성 펩타이드 생산에 폭넓게 이용되고 있지만 오보알부민의 영양학적 가치에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 오브알부민의 경우 1900년 대 초 황산암모늄과 아세트산을 이용해 분리가 되었지만, 낮은 순도, 낮은 수율 및 대량 생산의 어려움 등의 문제점이 발생되었다. 이후 Datta et al.등에 의해 고순도로 분리할 수 있는 polyether sulfone(PES) flat disk membrane방법 및 electrophoretic 방법, foam fractionation, liquid chromatographic 방법 등 많은 방법이 연구되었지만 이들 방법 역시 높은 순도와 수율을 나타내는 효율적인 생산이 불가능한 상황이다.

오보트랜스페린은 콘알부민이라고 불리우는 난백 단백질에서 두 번째로 많이 차지하고 있는 단일체 당단백질로서 한 분자 당 2개의 철 이온과 결합할 수 있는 능력을 지닌 transferrin의 일종이다 . 또한 686개의 아미노산 잔기를 가지고 있으며, 15개의 이황화 결합과 4개의 monnose와 8개의 N-acetylglucosamine으로 구성된 한 개의 glycan 사슬로 당화되어있다. 오보트랜스페린은 화학적, 물리적 활성이 다른 두 가지 형태를 가지고 있는데 철 이온이 제거 된 apo- 형태와 철 이온이 결합된 holo- 형태로 나눌 수 있다. apo-오보트랜스페린은 무색을 띠는 반면 holo 오보트랜스페린은 철 이온이 결합되어 있기 때문에 연한 핑크색을 나타내며, Holo-오보트랜스페린은 apo 형태보다 화학적, 물리적 조건에 저항력이 더 좋은 것으로 알려져 있다. 현재까지 연구된 오보트랜스페린 분리 방법 중 Ion exchange chromatography 방법이 가장 널리 이용되는 방법이지만 대량 생산이 어렵고 비용 및 공정 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 연구에서는 오보트랜스페린을 CM-Toyoperal 650M cation exchange 방법으로 분리하였지만 수율이 21%로 매우 낮다고 보고하였다. 반면 Omana et al. 와 Wu and Lopez 는 Anion exchange chromatography 방법을 이용하여 분리하였는데 이때 수율은 80%로 높았지만 resin 이용 시 문제점 때문에 대량 생산의 어려움이 있다고 보고 하였다. Ko and Ahn 연구에 의하면 에탄올을 이용하여 오보트랜스페린의 대량 생산이 가능하다고 보고하였다. 이 방법 역시 apo-형 오보트랜스페린 생산 시 철 이온 제거 단계를 거쳐야 하므로 추가적인 비용 및 시간이 든다는 단점 및 용매를 이용하기 때문에 식품으로 사용이 제한된다는 단점이 있다.

라이소자임은 N-Acetyl-muramic-hydrolase이라 불리우며, 동물의 체액과 조류의 난백에 존재하여 이들 생물체에 침입한 박테리아의 세포벽을 파괴시켜 세균 감염을 막는 역할을 하는 용균효소이다. 난백 라이소자임은 129개의 아미노산으로 된 단일 펩티드체인이며, 분자량 14.4 KDa, 등전점 11.1의 염기성 단백질로서 시스테인을 8분자 가지고 있으며 이것에 의해 만들어지는 S-S결합이 4개 있고 따라서 매우 안정한 효소이다. 또한 자연계에 존재하는 많은 다른 효소들과는 달리 보인자(cofactor)가 없이 항균 활성을 나타낸다. 초기 라이소자임은 황산암모늄 침전법으로 분리되었지만 이는 라이소자임의 pH 조절 등의 어려움이 있어 이후 이온교환 크로마토그래피를 이용한 분리가 많이 연구되었다. 특히 Carboxymethyl cellulose (CMC) 수지는 염기성 조건에서 난백으로부터 라이소자임을 분리할 수 있는 수지이지만 CMC 수지 자체가 다루기 힘들고 입자 크기가 매우 작아 분리 속도가 늦다는 단점이 있다. Chang et al. 은 β-mercaptoethanol 및 여러 화학약품을 이용하여 분리하는 방법을 연구하였지만 이 방법 역시 인체에 사용이 불가능한 단점을 보였다. 현재까지 난백에서 라이소자임 분리에 대한 연구가 많이 이루어져 있음에도 불구하고 고순도, 고수율 및 대량생산이 가능한 분리 방법은 아직 확립되어 있지 않은 상황이다.

오보뮤신은 분자량이 대단히 큰 항산화 당단백질 (5.5-8.3×10³ kDa)로 섬유상 구조를 가지며 당 함량이 다른 2종의 subunit (α-오보뮤신, β-오보뮤신)로 이루어져 있다. α-오보뮤신의 당 함량은 약 15%인데 대하여 β-오보뮤신은 50% 정도의 당을 함유하며 농후 난백의 gel구조의 유지에는 불용성 오보뮤신인 β-오보뮤신의 기여가 크다. 초기 오보뮤신의 분리는 난백의 pH를 4.5로 낮춰 줌으로써 침전시켜 분리시켰으며 , 이후 dual-column gel filtration 및 β-mercaptoethanol , calcuim chloride 등을 이용한 연구가 진행되었다. Wang and Wu 에 의한 최근 연구에서는 pH와 NaCl을 이용한 분리가 연구되어지고 있다.

KR 10-0472910

[문헌1] Chang, H. M, Yang, C. C., and Chang, Y. C. 2000. Rapid separation of lysozyme from chicken egg white by reductants and thermal treatment. J. Agric. Food Chem. 48: 161-164. [문헌2] Alderton, G., Ward, W. H., and Fevold, H. L. 1945. Isolation of lysozyme from egg white. J. Biol. Chem. 157: 43-58.

본 발명은 난백으로부터 고수율, 고순도의 오보알부민, 오보트랜스페린, 라이소자임 및 오보뮤신을 분리할 수 있는 효율적인 방법을 확립함과 동시에 현재까지 시도되지 않은 연속분리공정을 확립하므로써 대량 생산을 가능하게 하고 양계 산업의 부가가치를 높이는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 유용 난백 단백질의 순차적 분리를 위해 본 연구자들의 분리공정을 토대로 네가지 유용 난백 단백질(오보알부민, 오보트래랜스페린, 오보뮤신 및 오보알부민)을 순차적, 가장 효율적으로 분리할 수 있도록 연속 분리공정 조건을 확립하여 수율 및 순도를 비교하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 난백 단백질 연속분리공정 방법은 난백에서 순차적으로 분리한 4가지 단백질인 라이소자임, 오보뮤신, 오보트랜스페린 및 오보알부민 단백질의 수율은 라이소자임의 경우 약 89%, 오보알부민과 오보 뮤신의 경우 97-99%, 오보트랜스페린의 경우 83%의 높은 수율을 나타내며, 순도 역시 라이소자임은 95% 이상, 오보알부민과 오보트랜스페린은 85% 이상, 오보뮤신 85%이상으로 매우 순수하게 분리되었다고 할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 방법은 초기 난백 수용액에서 라이소자임, 오보뮤신, 오보트랜스페린 및 오보알부민을 분리할 때 매 단계에서 단백질 변성을 일으키지 않고 각 단백질의 조건에 맞게 순차적으로 분리 할 수 있는 방법으로 대량 생산 이용에 매우 용이하다.

도 1은 SDS-PAGE of egg white proteins collected over the sequential separation steps(난백단백질의 순차적 분리공정). Lane 1 = Marker(표시), Lane 2 = Egg white(난백), Lane 3 = Egg white after removing lysozyme(라이소자임제거후 난백), Lane 4 = Lysozyme separated(라이소자임분리), Lane 5 = Egg white after removing lysozyme and ovomucin(라이소자임과 오보류신제거후 난백), Lane 6= Ovomucin dissolve at pH 12.0(PH가 12.0인 오보류신), Lane 7= Supernatant after ammonium sulfate and citric acid precipitation(황산암모늄과 구연산 침전 후 상등액), Lane 8 = Separated crude ovotransferrin(분리된 오보트랜스페린), Lane 9 = Supernatant after removing ovotransferrin(오보트랜스페린을 제거한 후 상층액), Lane 10 = Purified ovotransferrin(정화된 오보트랜스페린), Lane 11 = Purified ovalbumin after heat treatment(열처리후 정화된 알부민).
도 2는 Effect of pH on the solubility of ovomucin(오보뮤신이 용해도 PH의 효과). Tube 1= pH 7.0, Tube 2= pH 8.0, Tube 3= pH 9.0, Tube 4= pH 10.0, Tube 5= pH 11.0 and Tube 6 = pH 12.0
도 3은 Effect of pH on the SDS-PAGE of ovomucin(오보뮤신의 SDS-PAGE에 PH가 미치는 영향). Lane 1= Marker, Lane 2 = pH 7.0, Lane 3 = pH 8.0, Lane 4 = pH 9.0, Lane 5 = pH 10.0, Lane 6= pH 11.0 and Lane 7 = pH 12.0.
도 4는 Western blot pictures of ovotransferrin, ovalbumin and lysozyme(오보트랜스페린,오보알부민,라이소자임의 estern blot 그림). Mr = Marker, Sa = Purified protein, St = Standard protein
도 5는 Schematic diagram for the separation of lysozyme, ovotransferrin, ovomucin and ovalbumin from egg white(난백에서 라이소자임,오보트랜스페린,오보뮤신및 알부민의 분리에 대한 회로도)

본 발명은 계란의 난백으로부터 유용한 단백질인 오보알부민, 오보트랜스페린, 라이소자임, 오보뮤신의 4가지 단백질을 연속적 분리공정에 의하여 순차적으로 분리하는 방법에 관한 것이다.

1. 라이소자임 분리

난백 단백질로부터 lysozyme을 분리하기 위해 carbozymethyl cellulose (CMC)와 amberlite FPC 3500 양이온 교환수지를 이용하였다. 사용 전 pH를 9.3으로 유지 시킨 수지를 난백 단백질에 각각 여러 농도로 처리한 후 최적 수지 함량을 정하였다. 수지 처리 후 연속적으로 저어주면서 4°C에서 밤새 방치하였다. 이후 수지를 감압 여과장치를 통해 걸러준 후 수지에 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 증류수로 3~5회 세척 후 0.1M glycine-NaOH buffer (pH 9.3)용액으로 한번 세척하였다. 세척된 수지에서 라이소자임을 용리하기 위해 0.5 M NaCl이 함유된 0.1M glycine-NaOH buffer (pH 9.3)를 처리하였다. 용리된 라이소자임 용액에서 한외여과기를 이용하여 염을 제거하고 농축한 후 동결건조시켰다.

2. 오보뮤신 분리

라이소자임이 제거 된 난백 상등액을 5M HCl로 pH 4.5로 조절하여 오보뮤신을 침전시켰다. 이를 3,400×g에서 30분간 원심 분리하여 침전물을 모으고 이를 증류수로 3회 세척 후 10배 증류수를 넣어 균질 시킨 후 pH를 12.0으로 조절하여 오보뮤신을 최종 분리하였다.

3. 오보트랜스페린과 오보알부민의 분리

난백 단백질에 황산암모늄과 시트르산을 함께 처리하여 오보알부민 이외의 다른 난백 단백질을 침전 시키므로써 상등액을 모아 오보알부민을 분리하였다. 오보알부민 분리에 대한 최적조건을 찾기 위해 4가지 농도의 시트르산 (2.5%-10%)과 4가지 농도의 황산암모늄 (5-20%)을 이용하여 총 16 단계의 처리구를 만들어 실험을 실시한 후 시트르산과 황산암모늄의 최적 농도를 정하였다.

오보알부민는 난백에 선택된 최적 농도인 시트르산 (2.5%)과 황산암모늄 (5%)을 처리해 다른 난백 단백질을 침전시켜 분리하는데, 이때 침전물에 남아있을 오보알부민을 추가로 분리해 내기 위해 침전물에 2배 증류수를 처리해 침전물을 잘 녹인 후 시트르산과 황산암모늄을 처리해 4°C에서 밤새 방치하였다. 이후 4.500 x g에서 20분 간 원심 분리한 후 상등액을 모아 한외여과기로 염을 제거하였다. 모아진 상등액으로부터 불순물을 제거하기 위해 70°C에서 15분 간 열처리 하여 침전물을 제거하였다. 최종 상등액은 동결 건조한 후 수율을 계산하였다. 오보알부민의 수율은 난백에서 오보알부민의 이론적 수치를 이용하여 계산하였으며 모든 실험은 3회 반복하여 실시하였다.

이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것이 아님은 당업자에게 있어서 명백한 사실이다. 즉, 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 당업자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

실험 1 : 유용 단백질의 순차적 분리공정

확립된 개별 난백 단백질 분리공정을 토대로 개별적이 아닌 순차적으로 분리할 수 있는 조건을 확립하였다. 가장 효율적으로 분리할 수 있도록 어떤 단백질을 우선적으로 분리해야 할지 선택하고, 각 단백질 분리에 적용되는 분리 방법을 기준으로 연속 분리공정 조건을 확립하여 수율 및 순도를 비교하였다.

실험 2 : SDS-PAGE

계란 난백에서 분리된 라이소자임, 오보뮤신, 오보트랜스페린 및 오보알부민을SDS-PAGE을 이용하여 확인하였다. Mini-protein Ⅱ cell를 이용하여 만들어진 10% SDS- polyacrylamide gel에 각 샘플을 주입한 다음 100 volt에서 전기영동 시키고 coomassie Brilliant Blue R-250을 이용하여 염색한 후 탈색과정을 거쳐 단백질 밴드를 확인하였다.

실험 3 : Western-Blot

Western-blot은 SDS-PAGE에 의하여 전기 영동된 gel를 nitrocellulose membrane에 전이시킨 후 전이된 membrane을 phosphate- buffered saline (PBS)에 5% skim milk가 첨가된 용액에서 1시간 동안 blocking 하였다.

라이소자임의 경우 membrane에 일차항체인 rabbit polyclonal 항체와 4°C에서 밤새 반응 시킨 후 membrane을 PBST 용액으로 10분 간격을 두고 3회 세척하였다. ECL 기질용액으로 반응시키고 x-ray 필름에 감광시켜 결과를 확인하였다.

오보트랜스페린의 경우 일차항체와 4°C에서 밤새 반응 시킨 후 membrane을 PBST 용액으로 10분 간격을 두고 3회 세척하였다. 일차 항체에서 반응된 membrane을 AP12가 부착된 Rabbit anti-mouse IgG (H+L) 이차 항체가 첨가된 용액에 1시간 동안 반응시킨 다음 PBST용액에 3회 세척 후 ECL 기질용액으로 반응시키고 x-ray 필름에 감광시켜 결과를 확인하였다.

오보알부민의 경우 membrane에 일차항체인 anti-ovalbumin 항체와 4°C에서 밤새 반응 시킨 후 membrane을 PBST 용액으로 10분 간격을 두고 3회 세척하였다. 일차 항체에서 반응된 membrane을 AP¹²가 부착된 Rabbit anti-mouse IgG (H+L) 이차 항체가 첨가된 용액에 1시간 동안 반응시킨 다음 PBST용액에 3회 세척 후 ECL 기질용액으로 반응시키고 x-ray 필름에 감광시켜 결과를 확인하였다.

본 발명에서는 여러 가지 이온교환 수지 중에서 Amberlite FPC 3500 양이온 교환수지를 선택하여 라이소자임 분리 정도를 비교하였다. Amberlite FPC 3500 수지 이용 시 수지와 단백질 결합 및 단백질 용리 등에 pH 조건이 매우 중요한데 본 연구에서는 예비 실험을 통해 pH 9.3 조건에서 분리율이 가장 좋은 것을 확인하였다.

도 1의 결과를 살펴보면 이 amberlite FPC 3500 수지를 이용하여 분리하였을 때 80% 이상의 수율 및 95% 이상의 순도를 나타내는 것을 알 수 있었다.

오보 뮤신 단백질은 다른 단백질 특히 라이소자임과 결합하려는 경향이 강하기 때문에 첫 번째 스텝으로 난백에서 라이소자임을 제거하는 단계를 거쳐야 오보뮤신의 순도를 높일 수 있다. 또한 이전 연구를 통해 서로 다른 완충액을 이용한 원심분리 및 pH 조건 변화가 오보 뮤신 분리에 큰 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다 . 이를 토대로 본 연구팀의 연속 분리공정에서는 예비 실험을 통해 난백 단백질의 pH를 4.5-5.0으로 조절하고 3,400×g에서 30분 간 원심 분리하여 난백에서 고 순도의 오보 뮤신을 분리하였다. 이와 같이 단순한 pH 조절 및 낮은 속도의 원심분리 조건은 대량 생산 시 매우 유리한 조건이라고 할 수 있다. 또한 본 발명에서는 물에 녹지 않는 오보 뮤신을 pH 4.5에서 분리 후 다시 염기 조건 (pH 7.0- pH 12.0)으로 변화 시키면서 오보 뮤신의 최적 solubility 조건을 확립하였다(도면 1).

도 2와 도 3의 결과를 살펴보면 우선 pH를 높일수록 오보 뮤신이 물에 더 잘녹아 오보뮤신 수용액의 색이 투명해 지는 것을 관찰 할 수 있었으며 SDS-PAGE 결과를 통해서도 역시 확인 할 수 있었다.

오보알부민 연구는 초기 Hopkins 연구 방법인 아세트산에 녹인 황산암모늄을 이용한 침전법을 주로 이용하였는데 이는 매우 고농도의 황산암모늄이 필요하다는 단점을 보였다. 이를 보완하고자 본 발명에서는 약산 조건에서 낮은 농도의 황산암모늄을 처리하여 난백 단백질에서 오보알부민 외에 기타 다른 단백질 (오보트랜스페린 포함)을 침전시키므로써 오보알부민과 오보트랜스페린을 분리하였다.

라이소자임과 오보뮤신이 이미 제거된 난백 수용액에 예비 실험을 통해 선택된 농도인 황산암모늄 (5%), 시트르산 (2.5%)을 일차적으로 처리하여 일차 침전물을 모은 후 일차 침전물 내에 함께 침전된 오보 알부민을 제거하기 위해 비교적 낮은 농도인 황산암모늄(2%), 시트르산 (1.5%)을 재 첨가하여 이차 침전을 시킴으로써 오보트랜스페린의 순도 및 오보 알부민의 수율을 높일 수 있었다.

오보트랜스페린이 분리되고 남은 난백 상등액을 70°C에서 15분간 열처리 해주므로써 오보 알부민 이외의 불순물을 제거 할 수 있었다 (도면 1, Lane 11).

난백에서 순차적으로 분리한 4가지 단백질인 라이소자임, 오보뮤신, 오보트랜스페린 및 오보알부민의 western blot 결과는 도 3에 나타내었으며, 최적 분리 방법에 대한 모식도는 도 4에 언급하였다.

아래 표 1은 분리된 각 단백질의 수율을 나타낸 표로 라이소자임의 경우 약 89%, 오보알부민과 오보 뮤신의 경우 97-99%, 오보트랜스페린의 경우 83%의 수율을 나태내었다. 이와 같은 결과는 이전 연구자인 Tankrathok et al(2009)의 결과와 비교했을 때 비교적 높은 수율이라고 할 수 있다 (라이소자임: 55%, 오보알부민: 54%, 오보트랜스페린: 21%).

순도 역시 라이소자임은 95% 이상, 오보알부민과 오보트랜스페린은 85% 이상, 오보뮤신 85%이상으로 매우 순수하게 분리되었다고 할 수 있다.

연속분리방법을 사용한 알부민,라이소자임,오보트랜스페린과 오보류신의 산출

Sample	Weight (g)	Yield %
Ovalbumin¹	16.63	100
Lysozyme¹	1.08	100
Ovotransferrin¹	3.69	100
Ovomucin¹	1.08	100
Final Ovalbumin²	16.24±0.75	97.70±4.47
Final Lysozyme²	0.96±0.02	88.90±1.93
Final Ovotransferrin²	3.07±0.17	83.20 ± 5.33
Final Ovomucin²	1.078±0.05	99.97± 2.25

1.계란 흰자를 2배 희석한 계란 흰자용액의 오보알부민과 라이소자임의 양(난백 단백질은 흰자의 11%이고 총단백질의 알부민 54%,라이소자임 3.5%, 오보트랜스페린 12%와 오보뮤신 3.5%이다) 난백의 원래양은 복제량당 280g.

2.알부민,라이소자임,오보트랜스페린과 오보뮤신 생산. n=3.

본 발명은 초기 난백 수용액에서 라이소자임, 오보뮤신, 오보트랜스페린 및 오보알부민을 분리할 때 매 단계에서 단백질 변성을 일으키지 않고 각 단백질의 조건에 맞게 순차적으로 분리 할 수 있는 방법으로 대량 생산 이용에 매우 용이하다.

Claims

난백 단백질로부터 고수율, 고순도의 라이소자임, 오보뮤신, 오보트랜스페린과 오보알부민을 순차적으로 분리하는 방법에 있어서,
난백 단백질로부터 Amberlite FPC 3500 양이온 교환수지를 이용하여 PH 9.3의 조건에서 수지처리하여 라이소자임을 분리하고,
상기 라이소자임이 분리된 난백 상등액을 5M HCl로 pH 4.5로 조절하여 오보뮤신을 분리하고,
상기 오보뮤신이 분리된 난백에 농도가 2.5%인 시트르산과 5%인 황산암모늄을 처리해 오보트랜스페린과 오보 알부민을 분리하는 난백 단백질 연속분리공정 방법.
제 1항에 있어서,
라이소자임 분리시에, 난백 단백질로부터 Amberlite FPC 3500 양이온 교환수지를 이용하여 PH 9.3의 조건에서 수지처리 후, 연속적으로 저어주면서 4°C에서 밤새 방치한 후 수지를 감압 여과장치를 통해 걸러준 후, 증류수로 3~5회 세척 후 0.1M glycine-NaOH buffer (pH 9.3)용액으로 세척하여 0.5 M NaCl이 함유된 0.1M glycine-NaOH buffer (pH 9.3)를 처리하여 라이소자임을 분리하는 것을 특징으로 하는 난백 단백질 연속분리공정 방법.
제 2항에 있어서,
상기 분리된 라이소자임 용액에서 한외여과기를 이용하여 염을 제거하고 농축한 후 동결건조 시키는 것을 특징으로 하는 난백 단백질 연속분리공정 방법.
제 1항에 있어서,
오보뮤신 분리시에, 라이소자임이 제거된 난백 상등액을 5M HCl로 PH 4.5로 조절하고 3,400×g에서 30분간 원심 분리하여 난백에서 고순도의 오보뮤신을 분리하는 것을 특징으로 하는 난백 단백질 연속분리공정 방법.
제 1항에 있어서,
오보알부민과 오보트랜스페린 분리시에, 오보알부민은 난백에 선택된 최적 농도인 시트르산 (2.5%)과 황산암모늄 (5%)을 처리해 다른 난백 단백질을 침전시켜 분리하는데, 이때 침전물에 남아있을 오보알부민을 추가로 분리해 내기 위해 침전물에 2배 증류수를 처리해 침전물을 잘 녹인 후 시트르산과 황산암모늄을 처리해 4°C에서 밤새 방치한 후, 4.500 x g에서 20분간 원심 분리한 후 상등액을 모아 한외여과기로 염을 제거하고 모아진 상등액으로부터 불순물을 제거하기 위해 70°C에서 15분간 열처리 하여 침전물을 제거하여 오보알부민을 분리하는 것을 특징으로 하는 난백 단백질 연속분리공정 방법.
제 5항에 있어서,
상기 침전물에 남아있을 오보알부민을 추가로 분리해 내기 위해 침전물에 2배 증류수를 처리해 침전물을 잘 녹인 후 시트르산과 황산암모늄을 처리해 4°C에서 밤새 방치한 후 난백에 선택된 최적 농도인 시트르산(2.5%)과 황산암모늄(5%)을 처리해 다른 난백 단백질을 침전시켜 오보알부민을 분리하는 것을 특징으로 하는 난백 단백질 연속분리공정 방법.
제 5항, 6항에 있어서,
상기 오보알부민을 분리한 후, 4.500 x g에서 20분간 원심 분리한 후 상등액을 모아 한외여과기로 염을 제거하고 모아진 상등액으로부해 오보트랜스페린을 분리하는 것을 특징으로 하는 난백 단백질 연속분리공정 방법.