JP2002532383A

JP2002532383A - 生物学的液体からペプチドを製造する方法及びその方法で得られるペプチド

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Publication number: JP2002532383A
Application number: JP2000570193A
Authority: JP
Inventors: セルファースフィッセール; イシドラレチオ
Original assignee: ニゾフードリサーチ
Priority date: 1998-09-15
Filing date: 1999-09-15
Publication date: 2002-10-02
Also published as: AU6194499A; ATE242782T1; CA2342395A1; AU768673B2; NZ510539A; DE69908790D1; WO2000015655A1; EP1114060A1; EP1114060B1

Abstract

(57)【要約】関心のあるペプチドのアミノ酸配列を含む1種以上のタンパク質を含有する生物学的液体から少なくとも1種の該ペプチドを製造するための方法であり、ここで該液体は、該ペプチドドメインを含むタンパク質が吸着するためにクロマトグラフィー基材と接触され、吸着された物質は該ペプチドを生成するように加水分解され、未結合の物質を取り除くためにこの基材は洗浄され、ペプチドがクロマトグラフィー基材から脱着され、任意に更に精製される方法が提供されている。好ましくはクロマト膜が使用され、かつ加水分解は酵素的に行われることが好ましい。本発明の方法により得ることができるペプチドで、好ましくは生物学的活性を有するものも特許請求されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の技術分野本発明は、生物学的液体中に生じるタンパク質からの興味深いペプチドを製造す
る方法に関する。この方法は、乳汁、ホエー又は血液のような液体からの、クロ
マトグラフィーのいくつかの形、それに続くこれらのタンパク質の断片化、及び
関心のあるペプチドの選択を含む更なる工程による、タンパク質の分離に関する
。本発明は更に、この方法から得ることができるペプチドにも関する。

【０００２】発明の背景近年、原核生物からヒトに及ぶ多くの生物が、それらの宿主防御システムの一部
としてペプチドを使用することが広く認められている。中でも、陽イオンペプチ
ドが、様々な抗犠牲物特性を示す重要なクラスを形成している。様々なペプチド
が、抗菌特性、抗内毒素特性、抗生−増強特性(antibiotic-potentiating)又は
抗真菌特性を有することができ、そのためこれらは抗微生物剤の新規クラスとし
て、並びに遺伝子導入による疾患抵抗性の植物及び動物の作出のための基剤(bas
is)として使用するために開発されている。検証のためには、例えばR.E.W. Hanc
ock及びR. Lehrer、Tibtech、16:82-88 (1998)を参照のこと。

【０００３】 W. Lee Maloy及びU. Prasad Kari(Biopolymers、37:105-122 (1995))は、昆虫、
カブトガニ、カエル及び哺乳類に由来するこれらのペプチドの構造が、同様に、
複数のArg及びLys残基の存在に起因する正味の陽イオン電荷の特徴、並びに殆ど
の場合に両親媒性の構造を形成する能力を有することを報告している。ペプチド
の配列及び構造は非常に多様であるにもかかわらず、大部分の宿主防御ペプチド
は、病原体の細胞膜の直接溶解により作用するように見える。それらの基本的構
造は、それらの細胞膜との相互作用を促進し、かつそれらの両親媒性の特徴は、
それらが膜に組込まれ、最終的にその構造を破壊することを可能にする。この執
筆者らは、これらの宿主防御ペプチドを、線状ペプチドと1〜3個のジスルフィド
結合を伴う環状ペプチドの二つの構造上の種類に分けた。より確定的でない4種
の個別の群への抗微生物ペプチドの分類が、D. Destoumleuxら(J. Biol. Chem.
、45:28398-28406 (1997))により示されている。これらの群は、アミノ酸配列、
二次構造、及び機能的類似性を基にしている：(i) 両親媒性α-ヘリックスを形
成する線状塩基性ペプチド、(ii)1〜6個の分子内ジスルフィド橋を有するペプチ
ド、(iii)プロリンが豊富なペプチド、及び(iv)グリシンが豊富な抗微生物ペプ
チド又はポリペプチド(9〜30kDa)である。これらの循環血中の抗微生物ペプチド
全ての作用様式、広範な活性、分子多様性、及び非細胞傷害性は、これらを薬学
的又は農学的用途での治療的物質として非常に魅力的なものにしていることが記
されている。

【０００４】 W.E. Robinsonら（J. Leukoc. Biol.、63:94-100 (1998)）は、ウシ好中球の細
胞質顆粒から単離された抗微生物トリデカペプチドアミドであるインドリシジン
(indolicidin)の抗-HIV-1活性を報告している。同様に、D. Winderら(Biochem B
iophys. Res. Commun.、242:608-612 (1998))は、(陽イオン)抗微生物ペプチド
であるセクロピン(cecropin)及びメリチンをコードしている遺伝子の発現は、ヒ
ト細胞において抗腫瘍作用を有することを明らかにした。

【０００５】 K. Natarajan及びJ.A. Cowan (Chemistry and Biology、5:147-154 (1998))は、
ヒトパーフォリンのアミノ末端に相当している合成の溶菌ペプチドの液中構造を
基に、該ペプチドの陽イオン領域と脂質頭基(headgroups)の間の強力な静電的相
互作用が、恐らく膜を弱体化し、該ペプチドの比較的中性／疎水性伸長の挿入を
促進し、かつこれが溶菌経路を代表していると仮定した。これは、この構造モデ
ルは、恐らくその他の陽イオン抗微生物ペプチドのメカニズムを理解する上で関
連があることにも言及している。 T. Wieprechtら(Biochemistry、36:12869-12880 (1997))は、両親媒性、抗菌ペ
プチドの膜活性に及ぼす陽性帯電したヘリックス面に対する角度の影響を報告し
ている。両親媒性、ほとんどαヘリックス状のコンホメーション及び陽性の正味
電荷が、膜破壊活性を決定する主要な構造上のモチーフとして認識されている。
総陽イオンペプチド電荷の増大は、より大きい抗菌活性を生じることが多い。

【０００６】ラクトフェリンは、乳汁のホエー画分に存在する鉄結合性タンパク質である。こ
のタンパク質は、乳汁の主要抗微生物成分であり、乳児の感染症からの防御に寄
与すると考えられている。非常に多くの研究が、ラクトフェリンの強力な静菌作
用を、時にはその殺菌作用及び抗ウイルス活性を明らかにしている。ラクトフェ
リンは、一部の炎症作用を緩和することができ、かつ様々な免疫系成分の調節に
おいて役割を担っている。検証のために、例えばL. Sanchezらの論文、Arch. Di
s. Child.、67:657-661を参照のこと。

【０００７】ラクトフェリン由来のいくつかの生体活性のあるペプチドが報告されている。例
えば90年代初期に、ヒトラクトフェリンのテトラペプチドが、血小板凝集、ADP-
活性化された血小板へのフィブリノーゲン結合、及びセロトニン放出のインヒビ
ターとして説明され；これは、ラット、モルモット及びイヌにおいて、抗血栓性
であった。E. Mazoyerら、Eur. J. Biochem.、194:43-49 (1990)；L. Drouetら
、Nouv. Rev. Fr. Hematol.、32:59-62 (1990)；G. Wuら、Haemostasis、22:1-6
(1992)を参照のこと。

【０００８】ヒト又はウシのラクトフェリンペプチドのいくつかは、抗菌特性を有する。ペプ
シンが生じたラクトフェリンの水解物は殺菌特性を示し、これは未消化のラクト
フェリンのものよりもより強力であることがわかっている。更にラクトフェリン
のN-末端に由来する強力な抗菌ペプチド断片であるラクトフェリシンと称するも
のが、この水解物から単離された。例えば、W. Bellamyら、J. Appl. Bacteriol
.、73:472-479 (1992)及びBiochim. Biophys. Acta、1121:130-136 (1992)；M.
Tomitaら、 J. Dairy .Sci.、74:4137-4142 (1991)；K. Yamauchiら、Infect. a
nd Immun.、61:719-728 (1993)；及び、E.M. Jonesら、J. Appl. Bacteriol.、7 7 :208-214 (1994)を参照のこと。

【０００９】 Y.-C. Yooらは(Biochem. Biophys. Res. Commun.、297:624-628 (1997))、ウシ
のラクトフェリシン活性が、THP-1ヒト単球性白血病細胞のアポトーシスを誘導
することを報告している。日本国特開平第08 073499 A号(1996年3月公開)は、ヒトラクトフェリンに由来し
、かつ免疫賦活剤として、特にサイトメガロウイルスによる感染症の予防に有用
であるといわれているようなペプチドを開示している。 Z.-Y. Qianらは(Biochim. Biophys. Acta、1243:25-32 (1995))は、ヒツジ及び
ヒトのラクトフェリンのペプシン水解物を単離しかつ特徴決定し、これらが血小
板凝集の阻害作用を発揮することを明らかにした。特に、ペプチドの正電荷及び
特定のコンホメーションが、ラクトフェリンの血小板表面のそれらの受容体への
結合に非常に重要であることがわかった。

【００１０】ホスホペプチドに由来するカゼインは、一般に高度に陰性帯電していて、これは
小腸内でのカルシウム核形成及び沈殿において重要な役割を果たしていることが
記載されている。D.G. Schmidtら、Neth. MilK Dairy J.、41:121-136 (1987)、
及びR. Satoら、Biochim. Biophys. Acta、1077:413-415 (1991)を参照のこと。
国際公開公報第87/07615号及び米国特許第5,015,628号は、う歯の予防における
カゼインホスホペプチドの特定の役割を開示している一方で、P. Schupbachらは
(J. Dent. Res.、75:1779-1788 (1996))は、同じく陰性帯電したカゼイノマクロ
ペプチド(caseinomacropeptide)の同様の効力を報告している。 P.W.J.R. Caessensらは(J. Agric. Food Chem.、41:1856-1862 (1999))、高度に
陰性帯電したN-末端配列を有するウシのβ-カゼイン由来の両親媒性ペプチドが
、生体システムのエマルション−安定化特性に寄与していることを報告している
。

【００１１】前述の先行技術及びそれに引用された参考文献は、その内容が本願明細書に組入
れられているが、これは天然のペプチド又はペプチド断片の構造−活性相関、特
にヒト及び動物の免疫応答に関連するものを含む非常に興味深い機能的特性を示
している。ラクトフェリン及びその水解物の調製及び単離の様々な方法が、先行技術におい
て説明されている。例えば、国際公開公報第89/04608号、第93/02098号、第93/1
3676号、欧州特許出願第0253395号、第0556083号、仏国特許第2613725号及びオ
ランダ国特許第8601814号を参照とすることができ、ここでは、特に帯電した分
子の分離に、陽イオン-交換手段を含む技術が適用されている。

【００１２】欧州特許出願第0519726号は、関心のあるペプチドのアミノ酸配列を含むタンパ
ク質を単離する第一の工程、単離されたウシラクトフェリン又はラクトフェリン
を含有するウシ乳汁タンパク質の加水分解により得られた抗微生物ペプチドを含
むペプチド混合物を、疎水性クロマトグラフィー基材又は陽イオン-交換クロマ
トグラフィー基材と接触させ、抗微生物ペプチドを吸着する工程、この基材を洗
浄し抗微生物ペプチド以外のペプチドを溶離する工程、洗浄した基材から溶液中
に抗微生物ペプチドを脱着する工程、及び任意に、脱着した抗微生物ペプチド溶
液を脱塩する工程を含み、これにより少なくとも90質量％純度の抗微生物ペプチ
ドが得られるような、高純度の抗微生物ペプチドの大規模製造法を開示している
。この方法は、かなり煩雑であり、従って経費がかかり、かつラクトフェリンよ
りも若干低い比活性を有するが比較的簡便に従って安価な方法で製造されたラク
トフェリンを基にした抗菌製品が、多くの用途にとって満足できるものではない
ことは容易に想像される。

【００１３】同様の、乳汁中のカゼインのような出発タンパク質のより小さい断片への酵素に
よる切断、それに続くクロマトグラフィー精製工程による活性ペプチドの調製法
が、国際公開公報第97/16460号及び日本国特開平第03 255095 A号に開示されて
いる。これらの方法は、本発明の方法とは異なり、様々なペプチド断片を生じる
。国際公開公報第97/16460号は、増殖促進活性を伴うカゼイン断片を開示してい
るのに対し、日本国特開平第03 255095 A号は、アデノシン-5'-二リン酸及びコ
ラーゲンにより引き起こされた血小板凝集のインヒビターとしての、血栓症治療
のためのカゼインペプチドを開示している。

【００１４】国際公開公報第95/25437号は、改善された色質(colour quality)を伴う植物性タ
ンパク質水解物を開示しており、これは、a)タンパク質-含有植物粉末の、該タ
ンパク質の等電領域を越えるpHでの、おそらく吸着剤の存在下での抽出、及びb)
得られたタンパク質水解物の、吸着剤の存在下での、それ自身公知の方法でのア
ルカリ、酸及び／又は酵素による加水分解により得られる。日本国特開昭第48 010543 B号(Derwent 1973-19518U)は、例えばサバ肉のような
、動物性タンパク質を、吸着剤(酸性クレー、活性炭、ベントナイトなど)及び／
又はイオン交換樹脂の存在下で加水分解し、苦味又は悪臭のない水解物を得るこ
とによる、タンパク質分解酵素による食用タンパク質の製造を開示している。得
られた水解物は、この酵素を不活化するために加熱し、かつ低温殺菌し、固形分
及び脂肪及び油分を分離した。苦味分を含まない溶液を更に減圧下で濃縮し、タ
ンパク質89％を含有する粉末を得た。

【００１５】 J. Leonilら(Colloques INSERM、174:65-68 (1989))は、酵素的膜リアクターに
おける、乳汁タンパク質β-カゼインのトリプシン消化により、期間内に断片の
放出速度が異なる生物学的に活性のあるペプチドを得ることを説明している。日本国特開平第09 077681 A号(Derwent 1997-241659)は、有効成分として、Stre
ptococcus lactisに由来するペプチドであるニシン(nisin)を含有する抗-HIV剤
を開示している。有用で期待できる特性を伴うペプチドに関する興味が募るにつれて、このような
ペプチドを製造する効率的方法の必要性が増大している。本発明は、比較的簡単
かつ安価なこのような方法を提供することを目的としている。

【００１６】発明の概要本発明の態様に従い、生物学的液体から少なくとも1種の関心のあるペプチドを
製造する方法で、下記の工程を含む方法が提供される： a) 関心のあるペプチドのアミノ酸配列を含むタンパク質を1種以上含有する生物
学的液体を、クロマトグラフィー基材と接触させ、該配列を含む該タンパク質を
吸着する工程； b)この吸着された物質に加水分解を施し、該タンパク質を断片化し、かつ実質的
に吸着されている該ペプチドを製造する工程； c)基材を洗浄し、未結合の物質を取り除く工程； d)この残留し実質的に吸着されたペプチドを該クロマトグラフィー基材から脱着
する工程、及び任意に、 e)更に、脱着された関心のあるペプチドを精製する工程。

【００１７】更に前述の基材は、結合していない物質を除去するために、加水分解工程の前に
洗浄されることが好ましい。クロマトグラフィー基材は、好ましくはイオン-交
換体又は一部のアフィニティーカラム材であり、かつ最も好ましくは類似の特性
を有するクロマト膜である。この加水分解は、酵素を使用して行われることが好
ましい。適当な酵素は、例えば、ペプシン、キモシン、トリプシン、プラスミン
、キモトリプシン、スブチリシン及びサーモリシンがある。好ましい生物学的液
体は、乳汁、ホエー及び他の乳汁製品、血液、血清、卵白、培養細胞、培養細胞
からの抽出物、及び植物細胞がある。

【００１８】本発明の別の態様において、本方法により得ることができる様々なペプチドが提
供される。これらのペプチドの多くは新規のものである。好ましい実施態様にお
いて、該ペプチドは実質的に純粋な形状である。別の好ましい実施態様において
該ペプチドは生物学的活性がある。更に別の本発明の態様において、該ペプチドは、例えば抗微生物、抗ウイルス又
は抗腫瘍活性を基に、様々な治療及び診断を目的とした医薬組成物(医薬又は食
品として許容できる塩を含有する)における使用に適している。本発明のこれら及びその他の実施態様及び利点は、当業者には、以下の詳細な説
明及び「特許請求の範囲」を参照することで明らかであろう。

【００１９】発明の詳細な説明塩基性残基の非対称のクラスターが、生体膜に親和性を示す様々なペプチドに
おいて認められる。これらの陽イオンペプチドは、他の活性に加えて、細胞膜透
過性の増大を誘導することにより、感受性のある微生物を殺傷することが示され
ている。タンパク質水解物からのこれらのペプチドの単離は、最初の前駆体タン
パク質の単離、その後の酵素的タンパク質水解物からの陽イオンペプチドの精製
を意味しているので、これは概して煩雑なものである。同じくこれは、関心のあ
る特定の特性を有する陰イオンペプチド又は疎水性ペプチドの単離及び精製に適
応することができる。

【００２０】本願明細書において使用される用語「ペプチド」は、特定の大きさに結び付けら
れることのないタンパク質断片を一般に意味し、従って「オリゴペプチド」及び
「ポリペプチド」を含んでいる。本願明細書において使用される用語「関心のあ
るペプチド」は、いずれかの種類の活性、最も好ましくは生物学的活性を有する
ペプチドを意味する。本願明細書においてクロマトグラフィー技術に関連して使
用される用語「基材」は、一般に樹脂、ゲルもしくは膜、又は他の常用のクロマ
トグラフィー手段を意味する。膜の使用が一般に好ましい。

【００２１】本発明において、徹底した研究及び実験の後に、驚くべきことに、関心のあるペ
プチド又は関心のあるペプチドにおいて濃縮された画分を、関心のあるペプチド
(複数)を含むタンパク質が含有される生物学的液体から、(i)該生物学的液体を
クロマトグラフィー基材と接触する工程、(ii)選択的に結合されたタンパク質を
、関心のある前駆体タンパク質(複数)の中間の単離を必要とせずに、in situ加
水分解する、すなわち該クロマトグラフィー基材上で加水分解する工程、(iii)
結合していないペプチドを洗い流す工程、(iv)関心のあるペプチド又はペプチド
類を該クロマトグラフィー基材から選択的に溶離する工程、かつ任意に、(v)更
に得られたペプチド又はペプチド類を精製する工程を含む方法により、直接かつ
効率的に得ることができることがわかった。

【００２２】本発明の方法において使用される出発材料は、いずれかのタンパク質又はそれら
の配列内の関連するドメインを含むタンパク質混合物であることができる。この
方法は、このようなタンパク質又はタンパク質の混合物が、乳汁、ホエー又は他
の乳汁画分、血液又は血清、卵白、細胞培養物又は細胞培養物の抽出物、もしく
は植物タンパク質溶液のような生物学的液体から得られる場合に特に適している
。好ましい本発明の実施態様において、細胞培養物又は細胞培養物の抽出物は、
野生型又は遺伝子が変更された宿主生物(例えば、細菌、酵母、真菌、細胞株又
は植物細胞)から得ることができ、かつ関心のあるペプチドの1種以上の前駆体形
を含んでいる。しかし、関心のあるペプチド配列を含むタンパク質を含有するい
かなる液体も全て使用することができることが理解されるであろう。本発明の目
的のためには、このような液体も用語「生物学的液体」内に含まれる。

【００２３】例えば、帯電したペプチドの単離が望ましい場合、出発材料は、水又は緩衝液、
好ましくは関心のあるペプチドをイオン交換体に結合するのに適したpHの低イオ
ン強度の緩衝液中に、溶解又は分散することができる。通常、精製工程は不要で
あるか、又は溶液もしくは分散液のイオン交換体への接触の前に必要とされる。
何らかの不溶性の物質が存在する場合には、これは、精密ろ過、限外ろ過又は遠
心分離のような通常の方法で取り除くことができる。イオン交換の手順は、液体からのタンパク質／ペプチド成分の単離に関して説明
されている。例えば、ラクトフェリン及びラクトペルオキシダーゼは、ビーズ床
イオン交換を用いてチーズホエーから単離される。前述の参考文献を参照のこと
。

【００２４】強又は弱陽イオンもしくは陰イオン-交換基材(樹脂、ゲル、又は膜)のいずれか
を、連続流れ又はバッチ式クロマトグラフィー技術を用いる、関心のあるタンパ
ク質の濃縮に使用することができる。陽イオン-交換体における使用のために、
カルボキシメチル、メチルスルホネート、スルホプロピル、又はスルホン酸のよ
うな様々な基を選択することができる。同様に、陰イオン-交換体における使用
のために、ジメチルアミノエチル又は4級アンモニウムのような官能基を適用す
ることができる。このマトリックスは、通常無機化合物、合成樹脂、多糖などを
基にしていて、強力なイオン交換膜が好ましい。このような膜において、官能基
は、大きい孔径で、非圧縮性(non-compressible)の化学的に非常に安定した多孔
質セルロース膜(例えばSartorius)の内側表面に共有結合している。

【００２５】その後結合したタンパク質は、加水分解、好ましくは酵素により加水分解される
。しかし、望ましいならば、酸又はアルカリによる加水分解、任意に酵素による
加水分解との組合せを使用することもできる。この加水分解は、in situで、す
なわち選択的に結合されたタンパク質を単離することなく、行うことができる。
この基材は、結合していない物質を実質的に取り除くために、加水分解の前に水
及び／又は適当な緩衝液で洗浄されることが好ましい。好ましい本発明の実施態様において、選択的に結合されたタンパク質は、ペプシ
ンにより酵素的に消化される。しかし関心のあるペプチドを製造するためにクロ
マトグラフィー基材に結合された関心のあるタンパク質を切断することが可能な
あらゆる酵素(各々その至適pHで又はその近傍で)を使用することができ、プロテ
アーゼ又はペプチダーゼが好ましい。適当な酵素は、例えば、キモシン(pHおよ
そ3.0)、トリプシン、プラスミン、キモトリプシン、スブチリシン及びサーモリ
シン(全て中性pHで)がある。

【００２６】例えば、陽イオンペプチドの単離が望ましい場合、他のタンパク質断片、すなわ
ち主に非-陽イオンペプチドを除去するための、陽イオン-交換体及び好ましくは
陽イオン-交換膜の洗浄が、通常、関心のあるタンパク質の加水分解直後に開始
される。この工程は、水及び／又は緩衝液、好ましくは低イオン強度の緩衝液を
用い、低又は中性のpHで適宜に行うことができ、このpHは、結合した陽イオンペ
プチド又はペプチド類のpIよりも約1pH単位低い値が好ましい。例えば、これら
の断片の洗浄は、水又は10mMリン酸ナトリウム緩衝液で、あるいは例えば10mM炭
酸水素アンモニウム緩衝液のような揮発性緩衝液で行うことができる。望ましい
ならば、副生物画分を、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥のような常法により乾燥し
、かつ更に用いることができる。膜に結合された陽イオンペプチドは、その後1
種以上の適当な緩衝液、好ましくは揮発性緩衝液、例えば異なる濃度のアンモニ
ア液を用い、通常の方法で溶離され、従って脱塩工程が省略される。必要である
ならば、例えばリン酸緩衝液の2M塩化ナトリウムのような高イオン強度の緩衝液
を使用することができる。

【００２７】溶離工程には、更に得られたペプチド画分のそれ自身公知の方法による精製が続
くことが適している。例えば、必要であるならば、ペプチド又はペプチド類を含
有する溶液の脱塩が、限外ろ過、透析、適当なカットオフ値の膜を用いる電気透
析、ゲル浸透クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又は高
速液体クロマトグラフィーのような技術により適宜に行われる。望ましいならば
、後者の技術は更にペプチド又はペプチド類の精製に使用することができる。

【００２８】本発明の方法で得られたペプチドは、望ましいならば、常法により修飾すること
ができる。例えばシステイン残基を含有するペプチドは、これらの残基間にジス
ルフィド橋を有することが多い。これらのペプチドは、例えば化学的還元による
、ジスルフィド橋の対応するチオール基への転換によって修飾することができる
。得られるチオール基を有するペプチドの生物学的活性は通常影響を受けない。

【００２９】典型的例において、本発明の方法は、出発材料としてチーズホエーを用いる、ラ
クトフェリン(LE)由来の抗菌ペプチドの小規模製造にうまく適用される。様々な
種(ウシ、ヤギ又はヒツジ)から得たチーズホエー、又はそれらの混合物を用いる
と、これは、未消化のLFよりも非常に高い活性(少なくとも12倍以上の効力)を伴
うペプチドの画分を生じる。しかし、当業者には、本方法は、関心のあるペプチ
ド断片を含むいずれかのタンパク質にうまく使用することができ、このタンパク
質は生物学的液体中で複合体混合物として存在してもしなくとも良いことが明ら
かであろう。

【００３０】本発明の方法のクロマトグラフィー工程は、クロマト膜を用いて行われるのが好
ましいが、他のクロマトグラフィー技術、例えば疎水性相互作用又はアフィニテ
ィークロマトグラフィーを、1個以上のカラム又はバッチ式のいずれかで、使用
することもできる。膜基材の方法は、ビーズ基材のシステムと比較して、大きい
流量で(およそ12倍)が可能であり、より迅速に行うことができるので、一般に好
ましい。加えてこれらの膜基材の方法は、グラム量又はキログラム量にさえも、
容易に大規模化することができる。

【００３１】本発明の方法は、比較的単純であり、従って一般に先行技術の方法よりも、経済
的かつ技術的により魅力的なものである。これは、前駆体タンパク質の中間での
精製を必要とすることなく、高収率で関心のある選択された活性を伴うペプチド
を提供する。その上、先行技術の方法とは明確に区別される本発明の方法を使用
することにより、多くの新規ペプチドが得られる。好ましい本発明の実施態様に
おいて、この方法は、適当な給源(ヒト又は動物、例えばウシ、ヤギ、ヒツジ、
ウマ)から得た乳汁又はホエーからの、望ましい特性を有する、ラクトフェリシ
ン及びその誘導体の製造に使用される。同じくカゼイン、例えば精製されたウシ
のβ-又はα_S2-カゼインも、様々な種類の機能上の特性を有するペプチドの製造
に適した好ましい給源である。その他の適当な出発材料は、例えば、血液、血清
、卵白、培養細胞及びそれらの抽出物、並びに植物細胞がある。

【００３２】本発明の更なる態様において、その多くは新たなものである、発明的方法により
得られたペプチドが、好ましくは実質的に純粋な形状で提供される。生物学的活
性のあるペプチドが好ましい選択である。これらのペプチドを特に有用なものに
している関心のある生物学的活性は、抗微生物、抗ウイルス、抗腫瘍、抗炎症、
及び抗血栓活性を含んでいる。明らかにこれらの生物学的活性はとりわけ、出発
の生物学的液体及びそれに含まれたタンパク質の性質に左右される。好ましい本
発明の実施態様は、例えばニシンAもしくはニシンZ又はそれらの混合物のような
、いずれかの形状でのニシンの調製である。適当な出発材料は、例えば実施例６
に例示したような前駆体型である。あるいは、新規ペプチドを含むこれらのペプチドは、化学合成又は微生物学的又
は植物によるもののような、その他の当該技術分野において公知の方法により製
造することができる。

【００３３】本発明は更に、先に説明した本発明の方法により得ることができる、下記のアミ
ノ酸配列(1)〜(8)から選択されたアミノ酸配列を有する関心のあるペプチド、又
はそのカルボキシ末端に1級アミドを有するそれらの誘導体であり、これらの誘
導体がペプチドの生物学的特性を妨害又は損なうことがないものを提供する： (1) VYQHQKAMKPWIQPKT (=配列番号：1) (2) VYQHQKAMKPWIQPKTKVIPY (=配列番号：2) (3) VYQHQKAMKPWIQPKTKVIPYVRY (=配列番号：3) (4) VYQHQKAMKPWIQPKTKVIPYVRYL (=配列番号：4) (5) PEWSKC*YQWQRRMRKLGAPSITC*IRRTSA (=配列番号：5)(*=ジスルフィド橋に
より連結されている) (6) PEWSKCYQWQRRMRKLGAPSITCIRRTSA (配列番号：6) (7) TQRKTRNGFRVPLARE (=配列番号：7) (8) APRKNVRW (配列番号：8)。

【００３４】本発明の方法は、主に陽イオンペプチドの製造について説明されているが、異な
る電荷のペプチド、又は疎水性ペプチド及びさもなければ特定の特性を基にクロ
マトグラフィー基材に特異的に結合されたペプチドの製造にも適している。

【００３５】本発明は更に、好ましくは抗微生物及び／又は抗ウイルス及び／又は抗腫瘍活性
を伴う医薬組成物の調製のための、先に定義した、配列(1)〜(8)から選択された
アミノ酸配列を有するペプチド、又はそれらのカルボキシ末端にアミドを有する
それらの誘導体で、その誘導体は該ペプチドのいかなる生物学的特性も妨害又は
破壊することなないものの使用を明らかにしている。本発明は、いかなる点においても本発明を限定するようには構成されていない下
記の方法及び実施例により、更に例証されるであろう。

【００３６】材料及び方法分析法 1. 逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC) 分析用RP-HPLCは、高感度アクセサリーブロック(accessory block)(Waters Ass.
社)、ISS-100注入器(Perkin-Elmer社)、Waters Model 680勾配制御装置及びKrat
os 783検出装置(Kratos Analytical社)と組合せた、2個のM 6000Aポンプを用い
て行った。寸法が250 mm x 4.6 mmのWidepore C₁₈カラム(Bio-Rad Laboratorie
s社)を、ガードカラムC₁₈カートリッジ(Bio-Rad社)と共に用いた。この装置を、
データの捕捉及び処理システム(Turbochrom, Perkin-Elmer社)に連結した。溶媒
Aは、アセトニトリル−水−トリフルオロ酢酸(TFA)の混合物(100:900:1、v/v/v)
であり、かつ溶媒Bも同じ成分を含有した(900:100:0.8、v/v/v)。

【００３７】主として、ペプチドは、70分間に及ぶ、溶媒A中のBの0％から50％までの直線勾
配を用い、流量0.8ml/分で溶離した。ニシン又はニシン前駆体の画分は、10分間
に及ぶ溶媒A中のBの10％から25％までの直線勾配、その後50分間に及ぶ溶媒A中
溶媒Bの25から30％の直線勾配を、流量0.8ml/分で用いて溶離した。β-カゼイン
画分は、下記の直線勾配工程で溶離した：溶媒A中のBの10から16％を2分間、そ
の後定組成溶離を2分間；Bの26％までを8分間；Bの35％までを4分間、及びその
後Bの38％までを42分間。溶離液の吸光度を、220nmでモニタリングした。試料濃
度はおよそ1mg/mlであり、かつ注入容量は50μlであった。

【００３８】2. 質量分析(MS)及びタンデム質量分析(MS/MS) 各精製したペプチドの質量を、Quattro II三台の四重極装置(Micromass社)を用
いる質量分析により評価した。試料を、50％アセトニトリル、0.3％ギ酸中に溶
解し、かつこの50％アセトニトリル中の試料溶液を、4μl/分で、電気噴霧(elec
trospray)境界面を通して、シリンジポンプタイプ22(Harvard Apparatus社、サ
ウスナティック、MA, USA)で注入することにより分析した。窒素を、噴霧及び乾
燥用の気体として用いた。キャピラリーは3.9kVに維持し；円錐電圧(cone volta
ge)は30Vであった。MS/MSは、第二の四重極装置中にアルゴン0.5Pa(5x10^-3mba)
を用いて行った。Windows NTワークステーション上でMasslynxソフトウェアver.
2.2(Micromass社)を用いて、自動でピーク認識及び娘イオンのスキャニングを行
った。

【００３９】3. N-末端配列分析精製したペプチドのN-末端部分を、変換試薬(conversion agent)として水を溶媒
とする25％TEAを用いる、気相式シークエンサー(Model 470A, Applied Biosyste
ms社)で配列分析することにより同定した。得られるフェニルチオヒダントイン(
PTH)アミノ酸を、PTH C-18カラム(2.1 mm x 220 mm) (Applied Biosystems社)を
備えたPTHアナライザー(Model 120A. Applied Biosystems社)を用いるRP-HPLCに
よりオンラインで分析した。

【００４０】4. 抗菌活性のアッセイペプチド混合物及び／又は単離されたペプチドの抗菌活性を、指標微生物として
Micrococcus flavus DSM 1790を用いる平板拡散アッセイにより決定した。M. fl
avusは、MFブロス(0.1％ショ糖、1％ペプトン、0.3％肉エキス、0.2％NaCl、0.1
5％酵母エキス、pH7.0)上で増殖した。ペプチド混合物を、2回蒸留水中の濃度0.
2mg/mlから50mg/mlで試験した。マイクロタイター法を用いて、様々な微生物、すなわちE. coli (2種の異なる
株)、Listeria innocua、Bacillus cereus、Micrococcus flavus及びStreptococ
cus thermophilusに対する液体媒質中でのペプチドの最小阻害濃度(MIC)を決定
した。

【００４１】実施例１ α_S2-カゼインからの抗菌活性を伴うペプチド混合物の調製ウシ乳汁から単離したα_S2-カゼインを、2回蒸留水に濃度0.1mg/mlになるよう溶
解し、かつpHを1M HClを添加し3.0に調節した。使用前に、陽イオン-交換膜(Sar
torius Sartobind S MA 100；Sartorious社、ドイツ)を、やや酸性の2回蒸留水(
pH 3.0)で予備平衡化した。この過程は、2-mm光路フローキュベットを備えたUV
検出器(モデルEM-1 Econo UV Monitor、Bio-Rad社)でモニタリングした。α_S2-
カゼイン溶液1000mlを、室温で、ポンプを使って流量20ml/分で、陽イオン-交換
膜を通して流した。その後陽イオン-交換膜を、酸性にした水(pH3.0)で洗浄し、
未結合の物質を取り除いた。膜に結合したα_S2-カゼインを、ブタペプシン(Sigm
a Chemical社)の水溶液(25mg/ml、pH3.0)100mlを、20 ml/分、逆フローで循環す
ることにより、37℃で6時間加水分解した。この陽イオン-交換膜を、酸性水pH3.
0で、その後10mM炭酸水素アンモニウム緩衝液ですすぎ、ギ酸で(pH7.0)ベースラ
インレベルに達するよう調節した。最後に、膜から陽イオン抗菌ペプチドを7Mア
ンモニア液により脱着し、これを凍結乾燥し、粉末状の活性生成物を得た。この
活性生成物は、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)でモニタリングし(図
2)、かつこのペプチドを、質量分析(MS)及びタンデム質量分析(MS/MS)により同
定した。この生成物から得た主要なペプチドの質量及びアミノ酸配列を表1にま
とめた。これら4種のペプチド間の比は、過剰な加水分解(一晩中)の後、短い配
列 (質量1982.9) へと偏っていた。

【００４２】

【表１】表1. α_S2-カゼインの陽イオン-交換膜上での加水分解後に得られた陽イオン抗菌ペプチドの質量及びアミノ酸配列

【００４３】実施例２ヤギホエーからの抗菌活性のあるペプチドの調製使用前に、実施例１に記した陽イオン-交換膜を、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(
pH7.0)で予備平衡化した。この過程は、2-mm光路のフローキュベットを備えたUV
検出器でモニタリングした(モデルEM-1 Econo UV Monitor、Bio-Rad社)。精密ろ
過したヤギのチーズホエー1000ml(pH6.5)(以後「出発材料」と称す)を、室温で
、ポンプを使って流量20ml/分で、陽イオン-交換膜を通して流した。この陽イオ
ン-交換膜を、酸性化した2回蒸留水(pH3.0)、あるいは2回蒸留水又は10mMリン酸
緩衝液で洗浄し、未結合の物質を取り除いた。陽イオン-交換膜に結合した物質
は、ブタペプシン(Sigma Chemical社)の水溶液(25mg/ml、pH3.0)100mlを、20 m
l/分、逆フローで循環することにより、37℃で一晩加水分解した。この陽イオン
-交換膜を、酸性水pH3.0で、その後7Mアンモニア液で、ベースラインレベルに達
するまですすいだ。最後に、強力に結合したペプチドを、2M NaClで溶離した。2
M NaCl画分を、Sep-Pak（登録商標）C₁₈周囲カートリッジ(Waters Ass.社)を用
い、水を溶媒とするアセトニトリル0から100％の直線勾配で脱塩した。アセトニ
トリルを蒸発させた後、この画分を凍結乾燥し、粉末状の活性生成物を得た。こ
の活性生成物は、RP-HPLC(図3)及びMSでモニタリングし、かつこの画分の主要ペ
プチドの配列を、N-末端配列決定及びMSデータから得た。この生成物の主要ペプ
チドの質量及び配列を表2にまとめた。このデータは、この活性ペプチドがヤギ
ラクトフェリン断片であることを示している。

【００４４】

【表２】表2. 出発材料としてヤギのチーズホエーを用いる陽イオン -交換膜上での加水
分解後に得られた陽イオン抗菌ペプチドの質量及びアミノ酸配列 * ジスルフィド橋により連結

【００４５】実施例３ヒツジホエーからの抗菌活性のあるペプチドの調製実験条件は、精密ろ過したヒツジチーズホエー(pH6.5)を出発材料として使用し
た以外は、上記実施例２に記したものであった。得られた活性生成物は、RP-HPL
C(図4)及びMSでモニタリングし、かつこの画分の主要ペプチドの配列を、N-末端
配列決定及びMSデータから得た。この生成物の主要ペプチドの質量及び配列を表
3にまとめた。このデータは、この活性ペプチドがヒツジラクトペルオキシダー
ゼ断片であることを示している。

【００４６】

【表３】表3. 出発材料としてヒツジのチーズホエーを用いる陽イオン-交換膜上での加
水分解後に得られた陽イオン抗菌ペプチドの質量及びアミノ酸配列

【００４７】実施例４ウシホエーからの抗菌活性のあるペプチド混合物の調製実験条件は、精密ろ過したウシのゴーダチーズホエー(pH6.5)を出発材料として
使用した以外は、上記実施例２に記したものであった。得られた活性生成物は、
RP-HPLC(図5)及びMSでモニタリングし、かつこの画分の主要ペプチドの配列を、
N-末端配列決定及びMSデータから得た。この生成物の主要ペプチドの質量及び配
列を表4にまとめた。このデータは、この活性ペプチドがウシラクトフェリン断
片であることを示している。

【００４８】

【表４】表4. 出発材料としてウシのチーズホエーを用いる陽イオン -交換膜上での加水
分解後に得られた陽イオン抗菌ペプチドの質量及びアミノ酸配列 * ジスルフィド橋により連結

【００４９】実施例５精製したウシラクトフェリンからの抗菌活性のあるペプチド混合物の調製実験条件は、10mMリン酸ナトリウム緩衝液中の精製したウシラクトフェリン溶液
(pH7.0)を出発材料として使用した以外は、上記実施例２に記したものであった
。得られた活性生成物は、RP-HPLC(図6)及びMSでモニタリングし、かつこの画分
の主要ペプチドの配列を、N-末端配列決定及びMSデータから得た。この生成物の
主要ペプチドの質量及び配列を表5にまとめた。

【００５０】

【表５】表5. 出発材料として精製したラクトフェリン溶液を用いる陽イオン-交換膜上
での加水分解後に得られた陽イオン抗菌ペプチドの質量及びアミノ酸配列 * ジスルフィド橋により連結

【００５１】実施例６ニシンA前駆体を含有する細胞抽出物からの抗菌活性のあるニシンAの調製ニシンA前駆体調製のために、プラスミドpNZ9111に連結されたLactococcus lact
is株MG1614[Van der Meerら、J. Bacteriol.、175:2573-2588 (1993)]を、0.5質
量％グルコース及び10mg/mlエリスロマイシンを補充したM17ブロス(Difco Labor
atories社、デトロイト、MI、USA)中で早期の定常期(最終光学濃度(600nm)が0.9
〜1.0、pH6.2)に達するまで増殖した。この培養物を、2,500 x gで20分間遠心し
、Lactococcal細胞を除去した。上清を再度10,000 x gで30分間遠心し、かつ2回
蒸留水で10倍希釈後、そのpHを酢酸を用いて4.5〜4.8に調節した。

【００５２】使用前に、陽イオン-交換膜(Sartorius Sartobind S MA 100；Sartorius社、グ
ッティンゲン、独国)を、10mM酢酸アンモニウム緩衝液、pH4.5で平衡化した。こ
の過程は、2-mm光路のフローキュベットを備えたUV検出器でモニタリングした(
モデルEM-1 Econo UV Monitor、Bio-Rad Laboratories社、リッチモンド、CA、U
SA)。10倍希釈した細胞を含まない上清3Lを、室温で、陽イオン-交換膜を通し、
蠕動ポンプ(Verder-Vleuten b.v.、ブロイテン、オランダ)を使って生じた流量2
0ml/分で流した。次に陽イオン-交換膜を、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)
で洗浄し、未結合の物質を取り除いた。膜に結合したニシンA前駆体は、10mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中のトリプシン(Sigma Chemical社、セントルイス
、MO、USA)溶液50mlを、20 ml/分、逆フローで循環することにより、37℃で15分
間加水分解した。加水分解後、膜を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で、ベ
ースラインレベルに達するまですすいだ。最後にニシンを、リン酸緩衝液(pH7.0
)中の1M KClで、陽イオン-交換膜から脱着した。この画分は、平板拡散アッセイ
で試験した場合に、Micrococcus flavusに対する活性を示した。この活性生成物
を、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)(図7)でモニタリングし、かつ単
離したニシンA成分を質量分析により同定した。

【００５３】実施例７ β-カゼインからの陰性帯電したペプチドの調製使用前に、陰イオン-交換膜(Sartorius Sartobind Q MA 100；Sartorius社、グ
ッティンゲン、独国)を、10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.2)で平衡化した。この過程
は、2-mm光路のフローキュベットを備えたUV検出器でモニタリングした(モデルE
M-1 Econo UV Monitor、Bio-Rad Laboratories社、リッチモンド、CA、USA)。10
mM Tris-HCl緩衝液(pH8.2)中のβ-カゼイン(0.1mg/ml)溶液1Lを、室温で、陰イ
オン-交換膜を通し、蠕動ポンプ(Verder-Vleuten b.v.、ブロイテン、オランダ)
を使って生じた流量20ml/分で流した。次に陰イオン-交換膜を、10mMリン酸ナト
リウム緩衝液(pH7.0)で洗浄し、未結合の物質を取り除いた。膜に結合したβ-カ
ゼインは、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中のトリプシン(Sigma Chemical
社、セントルイス、MO、USA)溶液50mlを、20 ml/分、逆フローで循環することに
より、37℃で14時間加水分解した。加水分解しかつ膜を10mM Tris-HCl緩衝液(pH
8.2)で洗浄した後、膜に結合したペプチドを、10 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.2)中
の1M NaClの0から100％の直線勾配で溶離した。最も強力に保持された画分を、
逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)(図8)でモニタリングし、かつこの画
分のペプチドを質量分析で同定した。

【００５４】実施例８卵白からの陽性帯電したペプチドの調製使用前に、陽イオン-交換膜(Sartorius Sartobind Q MA 100；Sartorius社、グ
ッティンゲン、独国)を、20mM HEPES緩衝液(pH8.0)で平衡化した。この過程は、
2-mm光路のフローキュベットを備えたUV検出器でモニタリングした(モデルEM-1
Econo UV Monitor、Bio-Rad Laboratories社、リッチモンド、CA、USA)。3個の
卵から白味を分離し、20mM HEPES液(pH8.0)で希釈し、10％(w/v)懸濁液を得た。
この懸濁液を、4℃で攪拌しながら一晩放置し、その上澄み液を10000 x gで30分
間の遠心により収集した。この透明な卵白溶液およそ600mlを、室温で、陽イオ
ン-交換膜を通し、蠕動ポンプ(Verder-Vleuten b.v.、ブロイテン、オランダ)を
使って生じた流量20ml/分で流した。次に陽イオン-交換膜を、20mM HEPES液(pH8
.0)で洗浄し、未結合の物質を取り除いた。膜に結合したタンパク質は、20mM HE
PES液(pH8.0)で中のAlcalase（登録商標）(2.4ユニット/g；Novo Nordisk社、バ
グスバエルド、デンマーク)の1容量％溶液50mlを、20 ml/分、逆フローで循環す
ることにより、60℃で12時間加水分解した。加水分解しかつ膜を20mM HEPES液(p
H8.0)で洗浄した後、膜に結合したペプチドを、7Mアンモニア液で溶離した。こ
の画分を、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)でモニタリングした。図9
を参照のこと。

【００５５】本開示は、従って、あらゆる観点において例証的なものであり限定するものでは
ないと考えられ、本発明の範囲は添付された「特許請求の範囲」により示されて
おり、かつ同等を意味しかつ同等の範囲の全ての変更は本願明細書に包含される
ことが意図されている。

【配列表】

【００５６】

【００５７】

【００５８】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法の好ましい実施態様の概略的かつ例証的説明である。

【図２】陽イオン-交換膜に結合したウシα_S2-カゼインの加水分解後に得られた活性生成
物のRP-HPLCクロマトグラフィーである(α_S2-カゼイン溶液から出発)。

【図３】陽イオン-交換膜に結合したヤギホエータンパク質の加水分解後に得られた活性
生成物のRP-HPLCクロマトグラフィーである(マイクロフィルターを通したヤギホ
エーから出発)。

【図４】陽イオン-交換膜に結合したヒツジホエータンパク質の加水分解後に得られた活
性生成物のRP-HPLCクロマトグラフィーである(マイクロフィルターを通したヒツ
ジホエーから出発)。

【図５】陽イオン-交換膜に結合したウシホエータンパク質の加水分解後に得られた活性
生成物のRP-HPLCクロマトグラフィーである(マイクロフィルターを通したウシホ
エーから出発)。

【図６】陽イオン-交換膜に結合したウシラクトフェリンの加水分解後に得られた活性生
成物のRP-HPLCクロマトグラフィーである(ウシラクトフェリン溶液から出発)。

【図７】 (a) ニシンA前駆体を含有する細胞非含有上清、(b)陽イオン-交換膜に結合した
ニシンA前駆体の加水分解後に得られた活性生成物の、RP-HPLCクロマトグラフィ
ーである。

【図８】陽イオン-交換膜に結合したウシβ-カゼインの加水分解後に保持された陰性帯電
したペプチドを含有する画分のRP-HPLCクロマトグラフィーである(ウシβ-カゼ
イン溶液から出発)。

【図９】陽イオン-交換膜に結合した卵白タンパク質の加水分解後に保持された陽性帯電
したペプチドを含有する画分のRP-HPLCクロマトグラフィーである(ニワトリ卵白
溶液から出発)。大部分の図面において、同定されたペプチドの測定された質量を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 1/12 Ｃ０７Ｋ 1/16 1/16 1/20 1/20 1/22 1/22 7/06 7/06 14/47 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/06 Ｃ１２Ｐ 21/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B064 AG01 CA21 CB06 CE10 CE11 CE12 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA18 BA19 BA23 CA25 CA36 CA38 CA41 DA27 DA42 NA14 ZB26 ZB32 ZB33 4H045 AA10 AA20 AA30 AA40 BA15 BA17 BA18 BA32 EA29 FA70 GA22 GA23 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の工程を含む、生物学的液体からの少なくとも1種の関
心のあるペプチドの製造法： a) 関心のあるペプチドのアミノ酸配列を含むタンパク質を1種以上含有する生物
学的液体を、クロマトグラフィー基材と接触させ、該配列を含む該タンパク質を
吸着する工程； b)前述の吸着された物質に加水分解を施し、該タンパク質を断片化し、かつ実質
的に吸着されている該ペプチドを製造する工程； c)前記基材を洗浄し、未結合の物質を取り除く工程； d)前述の残留し実質的に吸着されたペプチドを該クロマトグラフィー基材から脱
着する工程、及び任意に、 e)更に、脱着された関心のあるペプチドを精製する工程。
【請求項２】更に工程b)の前に、未結合の物質を取り除くために基材を洗
浄する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】前記クロマトグラフィー基材が、陽イオン-交換体である、
請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】前記クロマトグラフィー基材が、陰イオン-交換体である、
請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】前記クロマトグラフィー基材が、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィーのための基材である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】前記クロマトグラフィー基材が、アフィニティークロマトグ
ラフィーのための基材である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】前記クロマトグラフィー基材が、クロマト膜を含む、請求項
１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】前記加水分解が酵素により行われる、請求項１〜７のいずれ
か１項記載の方法。
【請求項９】ペプシン、キモシン、トリプシン、プラスミン、キモトリプ
シン、スブチリシン及びサーモリシンからなる群より選択される1種以上の酵素
が使用される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】前記生物学的液体が、乳汁、ホエー、血液、血清、卵白、
培養細胞、培養細胞抽出物、及び植物細胞からなる群より選択される、請求項１
〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】請求項１〜10のいずれか１項記載の方法により得られる、
下記の配列(1)〜(8)から選択されたアミノ酸配列を有するペプチド、又はそれら
のカルボキシ末端に1級アミドを有するそれらの誘導体で該ペプチドのあらゆる
生物学的特性を妨害しない誘導体： (1) VYQHQKAMKPWIQPKT (2) VYQHQKAMKPWIQPKTKVIPY (3) VYQHQKAMKPWIQPKTKVIPYVRY (4) VYQHQKAMKPWIQPKTKVIPYVRYL (5) PEWSKC*YQWQRRMRKLGAPSITC*IRRTSA (* =ジスルフィド橋による連結) (6) PEWSKCYQWQRRMRKLGAPSITCIRRTSA (7) TQRKTRNGFRVPLARE (8) APRKNVRW。
【請求項１２】好ましくは抗微生物及び／又は抗ウイルス及び／又は抗腫
瘍活性を伴う医薬組成物の調製のための、請求項11記載のペプチドの使用。