CN108047310A - 一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法 - Google Patents

一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108047310A
CN108047310A CN201810148455.6A CN201810148455A CN108047310A CN 108047310 A CN108047310 A CN 108047310A CN 201810148455 A CN201810148455 A CN 201810148455A CN 108047310 A CN108047310 A CN 108047310A
Authority
CN
China
Prior art keywords
selenium
grifola frondosus
chelating
pentapeptide
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810148455.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108047310B (zh
Inventor
赵立娜
陈紫红
刘斌
于志颖
林占熺
赵超
童爱均
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liaoning Heyi Health Biotechnology Co.,Ltd.
Shanghai Zhicha Technology Co ltd
Original Assignee
Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujian Agriculture and Forestry University filed Critical Fujian Agriculture and Forestry University
Priority to CN201810148455.6A priority Critical patent/CN108047310B/zh
Publication of CN108047310A publication Critical patent/CN108047310A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108047310B publication Critical patent/CN108047310B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法。该肽的氨基酸序列为：KELTF。制备方法为：以灰树花蛋白为原料，采用碱性蛋白酶对其进行酶解，酶解液经分离纯化、冷冻干燥得到硒螯合肽。该螯合肽不仅可以螯合硒元素，将无机硒转化为有机硒，且其能够借助肽在小肠内的吸收、转运特点以配合物的整体形式被主动吸收。该多肽仍具有抗氧化、增强免疫力、降血糖等生物活性等生物活性，为食药用菌资源的资源化利用开辟了新的途径，具有广阔的市场前景。

Description

一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法。
背景技术
硒（Se）是人体必需的一种重要矿质元素，具有重要的生理功能，已有的大量研究表明很多种疾病都与硒营养状况密切相关。人体主要是通过饮食获得硒，人工补硒的方法是口服含硒制剂。一般补硒的方法是用无机硒化合物（亚硒酸钠和硒酸钠）制成口服制剂。但是，无机硒强化剂吸收和利用的效果不理想，生物有效性低，而且具有较强的毒副作用，最低致死量相对较小，中毒量与需要量之间范围小，存在较大的安全隐患，因而被严格限制其使用。研究显示，无机硒经生物转化后的有机硒化合物毒性低，吸收率更高，生物利用率和生物活性也更高，在激发免疫反应上比无机硒显著。
灰树花(Grifola frondosa)，又称贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、麻栗窝菌等，具有很高的营养价值和药用价值。灰树花是我国大面积栽培的食用菌，其蛋白质含量丰富，高达31.5%，远高于香菇、银耳、金针菇、黑木耳等常见食用菌。灰树花氨基酸中必需氨基酸占45.5%，也高于一般食用菌。因而提取灰树花中的蛋白质，利用其水解产生得到的多肽，与普通动植物蛋白相比具有更丰富的生物活性和更高的营养价值。
利用生物技术对灰树花进行蛋白质资源的深加工，联合应用超滤、凝胶过滤和高效液相色谱法对生物活性肽进行筛选和提取分离，得到纯的多肽，利用质谱法对多肽序列进行测定，得到特异性硒元素螯合肽的序列。这种多肽不仅可以螯合硒元素，将无机硒转化为有机硒，且其能够借助肽在小肠内的吸收、转运特点以配合物的整体形式被主动吸收。该多肽仍具有抗氧化、增强免疫力、降血糖等生物活性，具有重要的研究意义和价值，同时能提高食药用菌的附加价值，为食药用菌资源的利用开辟了新的途径，具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法。本发明利用碱性蛋白酶酶解灰树花蛋白制备的硒螯合肽，可以螯合硒元素，将无机硒转化为有机硒，提高了人体硒的吸收率；同时该肽还具有抗氧化、增强免疫力、降血糖等生物活性。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种灰树花硒螯合五肽，所述肽的氨基酸序列为：KELTF。
一种如上所述的灰树花硒螯合五肽的制备方法：以灰树花蛋白为原料，采用碱性蛋白酶对其进行酶解，酶解液经分离纯化、冷冻干燥得到硒螯合肽。
酶解条件为：底物浓度3wt%，酶解pH为10.0、温度50℃、酶解时间为1h、酶-底物的质量比为1:20。
所述分离纯化的具体步骤为：先将酶解液过0.22µm滤膜，通过3 kDa和10 kDa 的超滤膜将酶解液分成不同分子量的溶液冻干；测定和收集具有最高硒螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3 ml/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高硒螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用体积分数为0-50%的乙腈溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，流速为4 ml/min，洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为18%乙腈和82%水的洗脱峰，采用LC/MS液质联用质谱仪分析得出保留时间为12.78 min处的峰为灰树花硒螯合五肽。
本发明的有益效果在于：
本发明立足于多肽具备与矿质元素离子螯合的作用位点，能够与其形成稳定的化合物，且多肽-矿质元素螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、可同时补充氨基酸和矿质元素的理论基础，以来自于灰树花的灰树花蛋白为原材料，通过对碱性蛋白酶的切割条件、分离纯化条件的控制，制备得到具有高硒螯合活性的肽，使硒螯合活性得以高效地实现；为灰树花的资源化利用提供了新思路。
附图说明
图1为纯化灰树花蛋白源硒螯合肽的 LC/MS微阵列图。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种灰树花硒螯合五肽的制备方法，具体步骤如下：
本发明所采用的灰树花蛋白来自于实验室自制，酶购自购买于北京索莱宝科技有限公司(中国·北京)。
称取3.0g灰树花蛋白溶解于100ml蒸馏水中，然后用2mol/L NaOH调节其pH至10.0。先将该溶液水浴加热到50℃，接着再按酶-底物质量比1:20，加入相应量的酶，酶解时间1h。接着在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再10000rpm离心10分钟。上清液收集后备用，所述酶为碱性蛋白酶。
利用膜超滤技术行分离上清，首先将上清溶液过0.22µm 滤膜，再通过3 kDa和10kDa 的超滤膜将上清液液分成不同分子量的溶液冻干，测定和收集各分子量范围样品并测定硒螯合活性；对膜超滤技术分离的具有最高硒螯合活性的样品再进行下一步的分离，用Sephadex G-25凝胶过滤色谱（长100cm，外径2.0cm）进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3 mL/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高硒螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用0-50%（v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4 mL/min，洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为18%乙腈和82%水的洗脱峰，采用LC/MS液质联用质谱仪分析得出保留时间为12.78min处的峰，冷冻干燥，制得硒螯合肽。
1、测序
对纯化的特异性硒螯合肽利用ESI质谱仪(WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS, WatersCo., U.S.A) 测定特异性硒螯合肽的氨基酸序列。所述硒螯合肽的氨基酸序列为：KELTF。
2、螯合肽的硒螯合力测试
采用比色法测定硒螯合肽对硒离子的螯合作用，采用3,3'-二氨基联苯胺比色法测定硒含量。
1）标准曲线的制作
硒标准溶液：准确称取2.1940g干燥的亚硒酸钠，溶于蒸馏水，定容至1L，制备成含硒1g/L的硒贮备液，临用时用蒸馏水稀释成5mg/mL的硒标准溶液。
取5个锥形瓶，分别放入2.0、4.0、。6.、8.0、10.0 mL的硒标准溶液，各加蒸馏水至40mL蒸馏水，用1mol/L HCl 调节pH至2~3后，加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液2mL，然后加入0.5%的3,3'-二氨基联苯胺（DBA）2mL，置于60℃水浴50min（避光）震荡，取出用1 mol/LNaOH溶液调节pH至7.0~7.5，准确加入10mL甲苯，震荡摇匀2min，静置3~4min分层，然后将甲苯层于420nm处测定溶液的吸光度（甲苯做空白）。所得到的标准曲线是y=0.00385x+0.02753，y代表吸光度，x代表硒的标准质量浓度µg/mL。
2）称取多肽溶液6mL，按亚硒酸钠溶液和多肽溶液体积比为4:6加入亚硒酸钠（0.5mol/L），搅拌均匀，调节pH至9.0，在50℃条件下持续反应90min，冷却4500r/min离心10min去除固体，加入5倍体积分数为95%乙醇，沉淀静置12h，4500r/min离心10min去除上清液，用等体积无水乙醇洗涤数次，干燥得螯合物粉末。称取灰树花蛋白肽-硒螯合物0.2g，放入100mL小烧杯中，加入5mL消化液，在电炉上消化至无色透明为止，用40wt% NaOH溶液和5wt% NaOH溶液调节pH至7.0，后定容至50mL，待测。将定容好的溶液放至10mL离心管中（保存），取0.5mL样液，加入40mL蒸馏水，用1mol/L HCl 调节pH至2~3后，加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液2mL，然后加入0.5wt%的3,3'-二氨基联苯胺（DBA）2mL，置于60℃水浴50min（避光）震荡，取出用1 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0~7.5，准确加入10mL甲苯，震荡摇匀2min，静置3~4min分层，然后将甲苯层于420nm处测定溶液的吸光度（甲苯做空白）；将吸光度代入标准曲线方程中，得到硒的标准质量浓度；然后将硒的标准质量浓度代入下列公式：
式中：p为从标准曲线中查得的相当于硒的标准质量浓度/（µg/mL）；V为甲苯萃取所得的样品体积/mL；m为样品的质量/g；N为用于测定的样品体积占总定容后样品的体积分数/%；计算得到KELTF的硒螯合力为100.13mg/g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 氨基酸序列
<400> 1
Lys Glu Leu Thr Phe
1 5

Claims (5)

1.一种灰树花硒螯合五肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为：KELTF。
2.一种如权利要求1所述的灰树花硒螯合五肽的制备方法，其特征在于：以灰树花蛋白为原料，采用碱性蛋白酶对其进行酶解，酶解液经分离纯化、冷冻干燥得到硒螯合肽。
3.根据权利要求2所述的灰树花硒螯合五肽的制备方法，其特征在于：酶解条件为：底物浓度3wt%，酶解pH为10.0、温度50℃、酶解时间为1h、酶-底物的质量比为1:20。
4.根据权利要求2所述的灰树花硒螯合五肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化的具体步骤为：先将酶解液过0.22µm滤膜，通过3 kDa和10 kDa 的超滤膜将酶解液分成不同分子量的溶液冻干；测定和收集具有最高硒螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3 ml/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高硒螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用体积分数为0-50%的乙腈溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，流速为4 ml/min，采用LC/MS液质联用质谱仪分析得出保留时间为12.78 min处的峰为灰树花硒螯合五肽。
5.根据权利要求4所述的灰树花硒螯合五肽的制备方法，其特征在于：所述的梯度洗脱为：洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为18%乙腈和82%水的洗脱峰。
CN201810148455.6A 2018-02-13 2018-02-13 一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法 Active CN108047310B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810148455.6A CN108047310B (zh) 2018-02-13 2018-02-13 一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810148455.6A CN108047310B (zh) 2018-02-13 2018-02-13 一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108047310A true CN108047310A (zh) 2018-05-18
CN108047310B CN108047310B (zh) 2019-10-18

Family

ID=62125591

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810148455.6A Active CN108047310B (zh) 2018-02-13 2018-02-13 一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108047310B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114478692A (zh) * 2021-12-24 2022-05-13 华南农业大学 一种高抗氧化活性富硒肽及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103936823A (zh) * 2014-03-06 2014-07-23 福州大学 一种金属螯合肽及其制备方法
CN105695547A (zh) * 2016-03-30 2016-06-22 福建农林大学 一种灰树花蛋白肽-硒螯合物的制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103936823A (zh) * 2014-03-06 2014-07-23 福州大学 一种金属螯合肽及其制备方法
CN105695547A (zh) * 2016-03-30 2016-06-22 福建农林大学 一种灰树花蛋白肽-硒螯合物的制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114478692A (zh) * 2021-12-24 2022-05-13 华南农业大学 一种高抗氧化活性富硒肽及其应用
CN114478692B (zh) * 2021-12-24 2023-03-21 华南农业大学 一种高抗氧化活性富硒肽及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108047310B (zh) 2019-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102370671B (zh) 灵芝子实体中的有效部位、提取方法及其用途和制剂
US10835552B2 (en) Method for preparing linseed polysaccharide having antiviral activity and immunological activity, and use of the linseed polysaccharide
CN105695547A (zh) 一种灰树花蛋白肽-硒螯合物的制备方法
WO2012024291A1 (en) Methods for preparing a fermented ginseng concentrate or powder
CN101104646A (zh) 硒化琼枝麒麟菜多糖的制备方法及应用
CN110655556A (zh) 一种免疫调节肽的制备及方法
CN114832022B (zh) 一种桑黄子实体酚类活性物质的制备及其在调节肠道菌群、尿酸代谢中的应用
CN105603032A (zh) 一种灵芝蛋白肽-硒螯合物的制备方法
CN108047310B (zh) 一种灰树花硒螯合五肽及其制备方法
CN103740797B (zh) 一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法
CN111718974B (zh) 绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用、活性肽及其应用
CN102786417B (zh) 绿原酸晶iii型表征及制备方法与在药品和保健品中应用
CN108047306B (zh) 一种灰树花硒螯合肽及其制备方法
CN111269292B (zh) 具有促进组织修复的家蝇多肽及其制备方法与应用
CN108059652B (zh) 一种利用蛋白酶解法制备的灰树花硒螯合肽
CN115490780B (zh) 马尾藻岩藻多糖粗提物的提取方法及应用
CN101167755B (zh) 具有抗肿瘤活性的蜈蚣多糖蛋白复合物的制备方法及用途
CN114989248B (zh) 一种具有抗炎抗氧化活性的忧遁草多肽及其制备方法和应用
CN101036631A (zh) 一种银杏叶纯化冻干粉制备工艺
CN102787154B (zh) 一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段分离、鉴定方法
CN109232758A (zh) 一种榆黄蘑菌糠多糖及其提取工艺和应用
CN108276474B (zh) 一种特异性硒元素螯合肽及其制备方法
CN108047307A (zh) 一种食药用菌源硒螯合肽及其制备方法
CN112961212B (zh) 一类ace抑制肽及其制备方法和应用
CN1218960C (zh) 白果蛋白GAPIIa及其制备方法与用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230731

Address after: 820, No. 8-8 Puhe Road, Shenbei New District, Shenyang City, Liaoning Province, 110121

Patentee after: Liaoning Heyi Health Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 200135 Building 1 and building 2, No. 333, Haiyang 1st Road, Lingang New District, China (Shanghai) pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai

Patentee before: Shanghai Zhicha Technology Co.,Ltd.

Effective date of registration: 20230731

Address after: 200135 Building 1 and building 2, No. 333, Haiyang 1st Road, Lingang New District, China (Shanghai) pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai

Patentee after: Shanghai Zhicha Technology Co.,Ltd.

Address before: No. 15, Cangshan District, Fujian, Fuzhou, Fujian

Patentee before: FUJIAN AGRICULTURE AND FORESTRY University