CN101104646A - 硒化琼枝麒麟菜多糖的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的硒化琼枝麒麟菜多糖的制备方法,采用亚硒酸钠在稀硝酸的催化作用下对琼枝麒麟菜多糖进行硒化,制备方法简单,环保,便捷,经济;产品表现出更高的生物活性,可以很好地应用于抑制癌细胞药物制备方面,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种化学合成方法,具体涉及硒化琼枝麒麟菜多糖的制备方法及应用。
背景技术
硒与机体免疫功能、抗氧化能力等密切相关。适当增加硒的摄入量,对改善机体免疫功能、增强抗癌能力、维持身体健康和预防某些疾病的发生等方面都具有明显的作用。在我国,克山病和大骨节病的发病区均处于低硒地带,而且补硒已经成了对克山病和大骨节病防治的一种有效措施。硒还是一些酶活性部位的基本组成部分,在体内以硒代半胱氨酸形式参与谷胱甘肽过氧化物酶、碘化甲腺原氨酸脱碘酶等多种蛋白质的形成,能有效清除活性氧自由基,防止细胞损伤,具有重要的生理学作用。研究还表明,美国低硒地区心血管疾病死亡率比高硒地区明显高。这主要与硒的抗脂质过氧化有关。有关硒的临床也用研究表明,硒对癌症有一定抑制作用,是化疗和放疗的良好辅助药物。而且,硒具有抗氧化特性和清除自由基的作用,这对预防衰老有积极作用。硒对慢性乙型肝炎的治疗具有一定的作用,可以明显改善慢性乙肝病人乏力等症状。
同时,硒又是极毒元素,零价硒有灰色、黑色和红色三种形态,灰色和黑色零价硒为粉末状态,不溶于水,营养剂量范围小,使用时剂量难以控制。但是将其制备成纳米颗粒后,从黑色变为红色;从不溶于水变为透明胶体溶液,显示出了高活性与低毒性。
许多天然多糖和化学合成的多糖能抑制多种病毒,如艾滋病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、流感病毒、白血病病毒和反转录病毒等。尤其是硫酸化多糖,因为是一类多聚阴离子,带有负电荷,能与病毒外膜糖蛋白上带有正电荷的氨基酸残基相互作用,且在结构上与细胞表面糖胺聚糖-硫酸乙酰肝素类似,能以受体竞争抑制方式阻止病毒与寄主细胞结合,同时它又含有许多细胞表面分子的模拟配体,能够直接与细胞结合,阻碍病毒吸附。因此,可干扰反转录病毒及其他病毒的吸附和侵入,抑制各种反转录病毒的逆转录酶活性以及病毒抗原的表达和病毒合胞体的形成。
硒多糖引起了人们的极大兴趣。目前,硒多糖的制备方法主要有两种即生物富集法和化学合成法,生物富集法的缺点是制备周期长,条件不易控制,大批量生产可行性困难。化学合成法有专利CN 1014522B《硒化卡拉胶的制法》,用浓硝酸溶解硒粉然后与角叉菜胶反应得到了一种有机硒多糖-硒化角叉菜胶,其不足之处在于单质硒粉与浓硝酸会生成有毒的硒化氢,同时也产生浓硝酸的分解产物,对环境有较大的污染,且硒含量较低;另一个是专利CN 1121414C《硒化多糖化合物及其制备方法》,将多糖与亚硒酸或其盐在酸性溶液中经钡离子催化,并加热反应数小时后得到硒多糖,然后用稀硫酸除去反应液中的钡离子,过滤后的溶液加入氯化铁溶液,NH3-NH4Cl调节pH值,除去未反应的亚硒酸根离子进行提纯,存在使用有毒的钡离子、后处理繁琐、不能充分利用亚硒酸盐等不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种硒化琼枝麒麟菜多糖的制备方法。
本发明的另一个目的是提供所述方法制备的硒化琼枝麒麟菜多糖的应用。
本发明的硒化琼枝麒麟菜多糖的制备方法,是采用亚硒酸钠在稀硝酸的催化作用下对琼枝麒麟菜多糖进行硒化得到,包括以下步骤:
(1)提取琼枝硫酸多糖;
(2)琼枝硫酸多糖加热溶解于硝酸体积分数为0.1%~1.0%的水溶液;
(3)加入亚硒酸钠,加热到50~100℃搅拌5~12h至反应完全;
(4)冷却后,采用无水碳酸钠调节pH值为5~6,微孔滤膜过滤或离心后的溶液对水透析;
(5)步骤(4)得到的透析液中加入抗坏血酸,至溶液无红色时停止透析,减压浓缩;
(6)加入相当于步骤(5)得到的浓缩液3~5倍体积的无水乙醇进行沉淀,0~4℃低温下放置8~12h,离心,用无水乙醇洗涤沉淀物,室温干燥。
优选方案如下:步骤(5)中抗坏血酸的用量为亚硒酸钠用量的2倍;所述亚硒酸钠与琼枝硫酸多糖的质量比为0.8∶1~1∶1。
所述减压浓缩是在250ml单颈圆底烧瓶装入冷却液安装在RE-52AA型旋转蒸发仪中,控温60℃,压力-0.9MPa,中速旋转蒸发。
步骤(1)所述提取琼枝硫酸多糖是从采自海南省琼海市麒麟菜基地的琼枝麒麟菜干品中提取,提取方法如下:将洗净晾干的琼枝麒麟菜剪碎后加入蒸馏水,置于沸水浴中搅拌提取2h,提取液温度为80~90℃,用的确良布抽滤,滤渣加沸水浴提取1~2次,每次15min,抽滤,合并滤液,用旋转蒸发仪减压浓缩至原体积的1/3~1/4,浓缩后的提取液加入3~5倍的95%乙醇,搅拌,析出沉淀,沉淀放置8~12h,抽滤,分别用无水乙醇、丙酮洗涤,室温干燥,得琼枝硫酸多糖。
本发明的硒化琼枝麒麟菜多糖的制备方法,也可以包括以下步骤:
(1)提取琼枝硫酸多糖;
(2)琼枝硫酸多糖加热溶解于硝酸体积分数为0.1%~1.0%的水溶液;
(3)加入亚硒酸钠,加热到50~100℃,搅拌5~12h至反应完全;
(4)冷却后,过滤,减压浓缩,加入抗坏血酸还原,用相当于还原得到的反应产物3~5倍体积无水乙醇沉淀,离心,得到红色沉淀,用无水乙醇洗涤;
(5)冷冻干燥。
优选方案:步骤(4)所述抗坏血酸的用量为亚硒酸钠用量的2倍;所述亚硒酸钠与琼枝硫酸多糖的质量比为0.8∶1~1∶1。
所述减压浓缩是在250ml单颈圆底烧瓶装入冷却液安装在RE-52AA型旋转蒸发仪中,控温60℃,压力-0.9MPa,中速旋转蒸发。
步骤(1)所述提取琼枝硫酸多糖是从采自海南省琼海市麒麟菜基地的琼枝麒麟菜干品中提取,提取方法如下:将洗净晾干的琼枝麒麟菜剪碎后加入蒸馏水,置于沸水浴中搅拌提取2h,提取液温度为80~90℃,用的确良布抽滤,滤渣加沸水浴提取1~2次,每次15min,抽滤,合并滤液,用旋转蒸发仪减压浓缩至原体积的1/3~1/4,浓缩后的提取液加入3~5倍的95%乙醇,搅拌,析出沉淀,沉淀放置8~12h,抽滤,分别用无水乙醇、丙酮洗涤,室温干燥,得琼枝硫酸多糖。
上述方法制备的硒化琼枝麒麟菜多糖可以用于制备抑制人体癌细胞药物。具体包括制备抑制人喉上皮细胞癌HEp-2细胞、人白血病K562细胞和人肺癌H-460细胞、结肠癌细胞LOVO或宫颈癌细胞Hela药物。
得到的硒化琼枝麒麟菜多糖在紫外扫描区间无蛋白质和核酸吸收峰,280nm和260nm,说明麒麟菜中蛋白质含量低,不需要进行去蛋白处理。其红外光谱特征与κ-卡拉胶相似,说明琼枝麒麟菜中的硫酸多糖主要属于κ-卡拉胶。所含单糖主要成分为3,6-内醚半乳糖。κ-卡拉胶的结构如下:
β-(1→3)-D-半乳糖-4-硫酸基
α-(1→4)-3,6-内醚-D-半乳糖
本发明以琼枝麒麟菜中提取出的海藻多糖为原料,稀硝酸催化下与亚硒酸钠反应合成硒化麒麟菜多糖。硫酸多糖与硒结合形成的硒多糖保持了硫酸多糖的基本构型和生理功能,且有机态的硒极为有效地提高了硒的生物可利用度及其作为生物必需微量元素的生理功能,毒性和副作用比无机硒大大降低,因此可作为一种安全、有效、健康的硒营养源。
本发明提供的制备方法,是在H+催化剂存在条件下,直接方便地利用相对稳定的亚硒酸钠做为无机硒的供给体,将亚硒酸根键合到多糖分子上,避免毒副产物的生成;没有引入其他有毒的无机离子,多余的亚硒酸钠通过透析简单地除去,简化了后处理的操作;将多余的亚硒酸钠还原为纳米硒,沉淀、过滤后得到产品,进一步简化了后处理操作,也充分利用了原料,还复合了纳米硒与硒多糖,起到了增效作用,使产品的生物活性更好。
传统方法中,除去钡离子的反应液加入氯化铁溶液,NH3-NH4Cl溶液调节pH 3~12,搅拌促反应,静置,离心分离,除去未反应的亚硒酸根离子。经多次试验,此方法不能有效除去溶液中的亚硒酸钠,反而向溶液中引入了铁离子。本发明采用透析法可有效除去过量的亚硒酸根,无机化合物和小分子低聚糖同时被透析除去。本发明还初步揭示了不同透析时间对产物性质的影响,见图3、4、5。
本发明与现有技术相比具有如下优点:
1、制备方法简单,步骤简便,目标产物产率高,克服了传统合成的有机硒多糖含硒量低,环保,便捷,经济;
2、避免了使用有毒的钡离子,也没有有毒气体产生,无毒副产物,克服了传统合成的中间体难合成等问题;
3、多余的亚硒酸钠还原为纳米硒,既充分利用了原料,也发挥了无机硒和有机硒协同作用,从而使产品表现出比硒多糖和纳米硒更高的生物活性;
4、本发明为制备攻克人类癌细胞药物打下了厚实的基础。
附图说明
图1是本发明方法制备得到的硒化琼枝麒麟菜多糖的红外光谱图;
图2是亚硒酸钠的红外光谱;
图3是透析1天后硒化琼枝麒麟菜多糖化合物的红外光谱图;
图4是透析后的硒化琼枝麒麟菜多糖化合物的红外光谱,其中,a线表示透析3天的,b线表示透析12天的;
图5是未透析和透析3天后的硒化琼枝麒麟菜多糖化合物的红外光谱,其中c线表示未透析的,d线表示透析3天的;
图6是硒化琼枝麒麟菜多糖分散纳米硒的红外光谱;
图7是硒化琼枝麒麟菜多糖分散的纳米硒的XRD谱图;
图8是硒化琼枝麒麟菜多糖的核磁共振光谱;
图9是硒化琼枝麒麟菜多糖透析三天后的核磁共振光谱。
具体实施方式
实施例1
(1)提取琼枝硫酸多糖,使用的是常规方法,这里不作赘述;
(2)0.5g多糖放入150mL三口烧瓶中,加入硝酸体积分数为0.1%的水溶液100mL,加热35℃,搅拌使多糖全部溶解,得10mg/mL的多糖溶液;
(3)加入2.00g亚硒酸钠,加热到50℃搅拌反应12h;
(4)反应液冷却后,无水碳酸钠调节pH值5~6,微孔滤膜过滤或4500r/m条件下离心后的溶液对水透析;
(5)加入4.00g抗坏血酸,无红色时停止透析,减压蒸馏至10~20mL;
(6)用3倍体积无水乙醇沉淀,冰箱0℃中放置8h,4500r/m条件下离心操作20min,沉淀用无水乙醇洗涤,室温干燥得硒化琼枝麒麟菜多糖。
实施例2
(1)提取琼枝硫酸多糖,使用的是常规方法,这里不作赘述;
(2)2.00g多糖放入150mL三口烧瓶中,加入硝酸体积分数为1.0%的水溶液100mL,加热60℃,搅拌使多糖全部溶解;
(3)加入0.5g亚硒酸钠,加热到100℃搅拌反应5h;
(4)反应液冷却后,无水碳酸钠调节pH值5~6,微孔滤膜过滤或4500r/m条件下离心后的溶液对水透析;
(5)加入1.00g抗坏血酸,无红色时停止透析,减压蒸馏至10~20mL;
(6)用4倍体积无水乙醇沉淀,冰箱中2℃放置12h,4500r/m条件下离心操作30min,沉淀用无水乙醇洗涤,室温干燥得硒多糖。
实施例3
(1)提取琼枝硫酸多糖,使用的是常规方法,这里不作赘述;
(2)1.0g多糖放入150mL三口烧瓶中,加入硝酸体积分数为0.5%的水溶液100mL,加热50℃,搅拌使多糖全部溶解;
(3)加入1.00g亚硒酸钠,加热到70℃搅拌反应8h;
(4)反应液冷却至3℃后,无水碳酸钠调节pH值5~6,微孔滤膜过滤或4500r/m条件下离心后的溶液对水透析;
(5)加入2.00g抗坏血酸,无红色时停止透析,减压蒸馏至10~20mL;
(6)用5倍体积无水乙醇沉淀,冰箱4℃中放置10h,4500r/m条件下离心操作30min,沉淀用无水乙醇洗涤,室温干燥得硒化琼枝麒麟菜多糖。
实施例4按实施例1、2、3的条件进行到步骤(3)后,分别进行以下步骤:
A
(4)反应液冷却至5℃后过滤,减压浓缩至原体积的1/4,加入约4.00g抗坏血酸还原,用5倍体积无水乙醇沉淀,4500r/m条件下离心操作30min,得到红色沉淀,无水乙醇洗涤;
(5)0℃冷冻干燥。
B
(4)反应液冷却至10℃后过滤,减压浓缩至原体积的1/5,加入约1.00g抗坏血酸还原,用3倍体积无水乙醇沉淀,4500r/m条件下离心操作25min,得到红色沉淀,无水乙醇洗涤;
(5)-5℃冷冻干燥。
C
(4)反应液冷却至15℃后过滤,减压浓缩至原体积的1/10,加入约2.00g抗坏血酸还原,用4倍体积无水乙醇沉淀,4500r/m条件下离心操作20min,得到红色沉淀,无水乙醇洗涤;
(5)-10℃冷冻干燥。
实施例5在本实施例中,对硒化琼枝麒麟菜多糖的生物活性进行了大量的实验。
一、材料
细胞株
人喉上皮细胞癌HEp-2细胞株,人白血病K562细胞株,人大细胞肺癌H460细胞株,结肠癌细胞LOVO,宫颈癌细胞Hela细胞株,由暨南大学微生物免疫教研室中心提供。
麒麟菜多糖
按照本发明步骤(1)提取的麒麟菜多糖用PBS配制成8mg/ml的原液,用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH为7.2,高压蒸汽消毒,置4℃冰箱备用,用前用RPMI1640液稀释。其红外光谱图见图1,核磁共振光谱见图8。
硒化琼枝麒麟菜多糖
本发明方法制备得到,用紫外分光光度方法测定知含硒量为0.4mg/g,用PBS配制成8mg/ml的原液,用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH为7.2,高压蒸汽消毒,置4℃冰箱备用,用前用RPMI1640液稀释。其未透析的红外光谱图见图5,其透析1天后的红外光谱图见图3,透析3天和12天后的红外光谱图见图4,透析3天后的核磁共振光谱见图9。
纳米硒复合的硒多糖
多糖与亚硒酸钠反应质量比为1∶0.8,按照本发明方法制备得到,用PBS配制成8mg/ml的原液,用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH为7.2,高压蒸汽消毒,置4℃冰箱备用,用前用RPMI1640液稀释。其红外光谱图见图6,XRD谱图见图7。
亚硒酸钠
Na2SeO3为国产分析纯,含量97%,相当于含硒量44.3%,用PBS配制成90μmol/L母液,置4℃冰箱备用,用前用RPMI1640液稀释。其红外光谱图见图2。
噻唑喃
MTT(Sigma)用pH7.2的PBS配制成5.0g/L,过滤除菌,4℃避光保存。
二甲亚砜
DMSO为国产分析纯,用pH7.2的PBS配制成30%体积分数备用。
研究70℃时硝酸体积分数0.5%反应10h,透析1d得到的硒化琼枝麒麟菜多糖I对人喉上皮细胞癌HEp-2细胞,人白血病K562细胞和人肺癌H-460细胞,结肠癌细胞LOVO,宫颈癌细胞Hela的抑制作用,此条件下合成硒化琼枝麒麟菜多糖的含硒量最高,为0.413mg/g。
二、硒化琼枝麒麟菜多糖对HEp-2细胞的抑制作用
如表1、2、3所示,表是不同浓度硒化琼枝麒麟菜多糖对HEp-2细胞的抑制率;表2是不同浓度粗多糖对HEp-2细胞的抑制率;表3是不同浓度亚硒酸钠对HEp-2细胞的抑制率。
表1
4000 0.521 0.301 0.314 0.3787±0.123 71.53 P<0.01
2000 0.516 0.540 0.659 0.5717±0.077 57.02 P<0.01
1000 0.769 0.681 0.834 0.7613±0.077 42.76 P<0.01
500 0.763 1.087 0.856 0.902±0.167 32.18 P<0.01
250 1.191 1.194 1.133 1.1727±0.034 11.83 P>0.05
125 1.391 1.087 1.172 1.2167±0.166 8.52 P>0.05
阴性对照 1.324 1.273 1.393 1.330±0.060 0
说明:硒化琼枝麒麟菜多糖主要制备条件为70℃,硝酸体积分数0.5%反应10h,透析1天,制备方法参照实施例1、2、3。
表2
粗多糖(μg/mL) OD 抑制率(%)P(与细胞对照比)
4000 0.578 0.614 0.590 0.594±0.018 55.36 P<0.01
2000 0.788 0.812 0.802 0.801±0.012 39.80 P<0.01
1000 1.161 1.140 1.153 1.151±0.011 13.43 P<0.01
500 1.220 1.230 1.227 1.226±0.005 7.82 P>0.05
250 1.165 1.193 1.131 1.163±0.031 12.56 P<0.01
125 1.100 1.181 1.139 1.14±0.0410 14.29 P<0.01
阴性对照 1.324 1.273 1.393 1.330±0.060 0
表3
Na2SeO3(μg/mL) OD 抑制率(%) P(与细胞对照比)
200 0.529 0.557 0.523 0.540±0.0186 66.17 P<0.01
100 1.047 0.668 0.859 0.858±0.190 35.49 P<0.01
50 0.584 1.021 0.804 0.803±0.219 39.62 P<0.01
25 0.792 0.712 0.754 0.753±0.040 43.38 P<0.01
12.5 0.834 0.961 0.899 0.898±0.0635 32.48 P<0.01
6.25 0.923 0.983 0.955 0.954±0.030 28.17 P<0.01
3.125 1.287 1.324 1.307 1.306±0.0185 1.8 P>0.05
阴性对照 1.324 1.273 1.393 1.330±0.060 0
三、硒化琼枝麒麟菜多糖对人白血病细胞K562的抑制作用
表4是不同浓度硒化琼枝麒麟菜多糖对人红白血病细胞(K562)的抑制作用。
表4
4000 0.198 0.196 0.266 0.220±0.0398 88.37 P<0.01
3000 0.428 0.420 0.444 0.431±0.0122 77.22 P<0.01
2000 0.606 0.673 0.723 0.667±0.0587 64.75 P<0.01
1000 0.702 0.762 0.795 0.753±0.0471 60.20 P<0.01
500 0.783 1.073 1.213 1.023±0.2198 45.93 P<0.01
250 1.632 1.572 1.910 1.705±0.1803 9.88 P>0.05
阴性对照 1.840 1.978 1.858 1.892±0.0750 0
四、硒化琼枝麒麟菜多糖对人肺癌细胞H-460的抑制作用研究
表5是不同浓度硒化琼枝麒麟菜多糖对人肺癌细胞H-460的抑制作用。
表5
1000 0.924 0.907 0.826 0.886±0.0524 34 P<0.01
250 1.009 1.004 0.971 0.995±0.0206 26 P<0.01
62.5 1.064 1.06 0.980 1.035±0.0474 23 P<0.01
15.6 1.076 1.056 0.976 1.036±0.0529 23 P<0.01
3.9 1.177 1.164 1.132 1.158±0.0232 14 P<0.01
1 1.222 1.211 1.179 1.204±0.0223 10 P<0.01
阴性对照 1.362 1.316 1.349 1.342±0.0237 0
结果与讨论
本发明合成的硒化琼枝麒麟菜多糖对HEp-2细胞有良好的抑制作用,明显优于同浓度粗多糖和亚硒酸钠,且抑制率随浓度增加而增大,在浓度为4000μg/ml时,达71.53%。硒多糖对K562细胞和H460细胞有一定的抑制作用,从中浓度开始表现出对K562细胞增殖较明显的抑制作用,并随着浓度的升高,OD值不断降低,浓度为4000ug/mL时,抑制率达88.37%,低剂量时硒多糖对K562和H460细胞抑制作用不明显。
六、不同浓度纳米硒复合的硒多糖的生理活性实验
(一)不同浓度纳米硒复合的硒多糖对HEp-2的抑制活性
表6不同浓度纳米硒复合的硒多糖对HEp-2细胞的抑制率。
表6
1000 0.1454 0.1381 0.1148 0.0834±0.0092 78.51 P<0.01
500 0.1362 0.1367 0.1426 0.0891±0.0021 77.03 P<0.01
250 0.1595 0.2403 0.1524 0.1347±0.0282 65.28 P<0.01
125 0.1949 0.1922 0.1919 0.1436±0.0010 62.98 P<0.01
62.5 0.2123 0.2252 0.2219 0.1704±0.0387 56.07 P<0.01
31.25 0.2088 0.2411 0.2458 0.1825±0.0116 52.95 P<0.01
阴性对照 0.4204 0.3940 0.4976 0.3879±0.0311 0
结果与讨论
不同浓度的样品对Hep-2的抑制率都随着样品浓度的增加而有所上升,说明样品的抑制率都是随着浓度的增加而增加。在高浓度时纳米硒复合的硒多糖表现了很高的生物抑制活性,在1000μg/ml浓度时抑制率达最高为78.51%,由于在较低浓度(31.25μg/ml)时仍然有明显的抑制率(P<0.01),说明低浓度时样品仍有抑制肿瘤细胞的可能性,本样品的总硒含量28.45%。
(二)不同浓度硒多糖分散的纳米硒对LOVO的抑制活性
表7是不同纳米硒复合的硒多糖浓度对lovo细胞的抑制率。
表7
2000 0.1845 0.1658 0.1945 0.0803±0.0084 91.31 P<0.01
1000 0.2436 0.2745 0.2145 0.1429±0.0173 84.54 P<0.01
500 0.3145 0.2952 0.2854 0.1970±0.0085 78.67 P<0.01
250 0.3852 0.4024 0.4204 0.3013±0.0102 67.39 P<0.01
125 0.4676 0.4572 0.4555 0.3588±0.0037 61.17 P<0.01
62.5 0.5845 0.5487 0.6123 0.4805±0.0184 48.00 P<0.01
31.25 0.6247 0.6461 0.6154 0.5274±0.0090 42.93 P<0.01
阴性对照 0.9677 1.0899 1.0186 0.9241±0.0354 0
结果与讨论
纳米硒复合的硒多糖样品对LOVO细胞的抑制作用随样品浓度增加逐渐加强。当浓度超过65.5μg/ml时,各组OD值均显著低于对照组(P<0.05,P<0.01),硒化麒麟菜多糖从中浓度开始表现出对LOVO细胞增殖较明显的抑制作用,并随着浓度的升高,OD值不断降低,对LOVO细胞增殖的抑制作用明显增强,在浓度为2000μg/ml时,抑制率达最高为91.31%但是当浓度低到31.25μg/ml的时候低浓度样品已经没有明显的抑制作用(P>0.05),而纳米硒复合的硒多糖抑制作用仍然比较明显(P<0.01)。
(三)不同浓度纳米硒复合的硒多糖对Hela的抑制活性
表8是不同纳米硒复合的硒多糖浓度对lovo细胞的抑制率。
表8
2000 0.1845 0.1658 0.1945 0.0803±0.0084 91.31 P<0.01
1000 0.2436 0.2745 0.2145 0.1429±0.0173 84.54 P<0.01
500 0.3145 0.2952 0.2854 0.1970±0.0085 78.67 P<0.01
250 0.3852 0.4024 0.4204 0.3013±0.0102 67.39 P<0.01
125 0.4676 0.4572 0.4555 0.3588±0.0037 61.17 P<0.01
62.5 0.5845 0.5487 0.6123 0.4805±0.0184 48.00 P<0.01
31.25 0.6247 0.6461 0.6154 0.5274±0.0090 42.93 P<0.01
阴性对照 0.9677 1.0899 1.0186 0.9241±0.0354 0
结果与讨论
各组对Hela细胞的抑制作用随样品浓度增加逐渐加强,浓度较高时对Hela的抑制作用最强(P<0.01),而试验的结果表明随着样品浓度的降低,抑制性也降低,但是在浓度到达31.25μg/ml的时候,仍然还是有较强的抑制作用,P<0.05,数据与表中不同。说明在较低浓度时仍然有抑制作用也就是仍然有抑制Hela细胞的可能性。
七、纳米硒复合的硒多糖与无机纳米硒对比
为了进行对比,按照常规方法制备了无机纳米硒,参照本发明实施例4制备了纳米硒复合硒多糖,同时测定对HepG-2细胞的抑制率。
表9是不同浓纳米硒复合硒多糖对HepG-2细胞的抑制率。
表9
62.5 0.0557 0.0565 0.0537 0.0094±0.0008 90.16 P<0.01
31.25 0.0512 0.0516 0.0539 0.0063±0.0008 93.37 P<0.01
15.625 0.0519 0.0516 0.0489 0.0049±0.0010 94.87 P<0.01
7.8125 0.0565 0.0647 0.0585 0.0140±0.0025 85.34 P<0.01
3.9063 0.0627 0.0641 0.0614 0.0168±0.0008 82.37 P<0.01
1.9531 0.0843 0.0687 0.0641 0.0265±0.0061 72.29 P<0.01
0.9766 0.0858 0.0748 0.0813 0.0347±0.0032 63.63 P<0.01
0.4883 0.0797 0.0870 0.0846 0.0379±0.0021 60.35 P<0.01
阴性对照 0.1352 0.1444 0.1447 0.0955±0.0031 0
表10是不同浓度无机纳米硒对HepG2细胞的抑制率。
表9
62.5 0.0749 0.0678 0.0672 0.0241±0.0025 74.80 P<0.01
31.25 0.0780 0.0762 0.0656 0.0274±0.0039 71.34 P<0.01
15.625 0.0655 0.0734 0.0737 0.0250±0.0027 73.86 P<0.01
7.8125 0.0902 0.0711 0.0697 0.0311±0.0066 67.43 P<0.01
3.9063 0.0782 0.0723 0.0822 0.0317±0.0029 66.84 P<0.01
1.9531 0.0940 0.0737 0.0786 0.0362±0.0061 62.09 P<0.01
0.9766 0.0915 0.0934 0.0859 0.0444±0.0023 53.54 P<0.01
0.4883 0.1160 0.1156 0.1078 0.0672±0.0027 29.60 P<0.05
阴性对照 1.1352 1.1444 1.1447 0.0955±0.0031 0
结果与讨论
纳米硒复合的硒多糖和无机纳米硒对HepG-2细胞的抑制作用都表现出随样品浓度增加逐渐加强的趋势,见表9和10,样品从低中浓度时就开始表现出对HepG-2细胞增殖较明显的抑制作用,并随着浓度的升高,OD值不断降低,对HEp-2细胞增殖的抑制作用明显增强。
结果还表明纳米硒复合硒多糖的抑制率高于无机纳米硒,尤其在低浓度时表现非常明显,在高浓度时纳米硒复合的硒多糖的最高抑制率可达到94.87%,而无机纳米硒的最高抑制率仅可达到74.80%。在低浓度时纳米硒复合的硒多糖的抑制率也可达到60.35%,但是无机纳米硒只有29.60%,造成这种原因可能是两种样品中抑制肿瘤成分的改变所造成的,由此说明有机硒多糖和无机纳米硒的协同抑制肿瘤作用。
从结果可以看到纳米复合的硒多糖不仅简化了合成工艺,充分利用了原料,所得的产品还表现出良好的生物活性,发挥了无机纳米硒和有机硒多糖的协同作用。
Claims (10)
1.一种硒化琼枝麒麟菜多糖的制备方法,其特征是采用亚硒酸钠在稀硝酸的催化作用下对琼枝麒麟菜多糖进行硒化得到,包括以下步骤:
(1)提取琼枝硫酸多糖;
(2)琼枝硫酸多糖加热溶解于硝酸体积分数为0.1%~1.0%的水溶液;
(3)加入亚硒酸钠,加热到50~100℃搅拌5~12h至反应完全;
(4)冷却后,采用无水碳酸钠调节pH值为5~6,微孔滤膜过滤或离心后的溶液对水透析;
(5)步骤(4)得到的透析液中加入抗坏血酸,至溶液无红色时停止透析,减压浓缩;
(6)加入相当于步骤(5)得到的浓缩液3~5倍体积的无水乙醇进行沉淀,0~4℃低温下放置8~12h,离心,用无水乙醇洗涤沉淀物,室温干燥。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征是抗坏血酸的用量为亚硒酸钠用量的2倍;所述亚硒酸钠与琼枝硫酸多糖的质量比为0.8∶1~1∶1。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征是步骤(5)所述减压浓缩是在250ml单颈圆底烧瓶装入冷却液安装在RE-52AA型旋转蒸发仪中,控温60℃,压力-0.9MPa,中速旋转蒸发。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征是步骤(1)所述提取琼枝硫酸多糖是从采自海南省琼海市麒麟菜基地的琼枝麒麟菜干品中提取,提取方法如下:将洗净晾干的琼枝麒麟菜剪碎后加入蒸馏水,置于沸水浴中搅拌提取2h,提取液温度为80~90℃,用的确良布抽滤,滤渣加沸水浴提取1~2次,每次15min,抽滤,合并滤液,用旋转蒸发仪减压浓缩至原体积的1/3~1/4,浓缩后的提取液加入3~5倍的95%乙醇,搅拌,析出沉淀,沉淀放置8~12h,抽滤,分别用无水乙醇、丙酮洗涤,室温干燥,得琼枝硫酸多糖。
5.一种硒化琼枝麒麟菜多糖的制备方法,其特征是采用亚硒酸钠在稀硝酸的催化作用下对琼枝麒麟菜多糖进行硒化得到,包括以下步骤:
(1)提取琼枝硫酸多糖;
(2)琼枝硫酸多糖加热溶解于硝酸体积分数为0.1%~1.0%的水溶液;
(3)加入亚硒酸钠,加热到50~100℃,搅拌5~12h至反应完全;
(4)冷却后,过滤,减压浓缩,加入抗坏血酸还原,用相当于还原得到的反应产物3~5倍体积无水乙醇沉淀,离心,得到红色沉淀,用无水乙醇洗涤;
(5)冷冻干燥。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征是所述抗坏血酸的用量为亚硒酸钠用量的2倍;所述亚硒酸钠与琼枝硫酸多糖的质量比为0.8∶1~1∶1。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其特征是步骤(4)所述减压浓缩是在250ml单颈圆底烧瓶装入冷却液安装在RE-52AA型旋转蒸发仪中,控温60℃,压力-0.9MPa,中速旋转蒸发。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征是步骤(1)所述提取琼枝硫酸多糖是从采自海南省琼海市麒麟菜基地的琼枝麒麟菜干品中提取,提取方法如下:将洗净晾干的琼枝麒麟菜剪碎后加入蒸馏水,置于沸水浴中搅拌提取2h,提取液温度为80~90℃,用的确良布抽滤,滤渣加沸水浴提取1~2次,每次15min,抽滤,合并滤液,用旋转蒸发仪减压浓缩至原体积的1/3~1/4,浓缩后的提取液加入3~5倍的95%乙醇,搅拌,析出沉淀,沉淀放置8~12h,抽滤,分别用无水乙醇、丙酮洗涤,室温干燥,得琼枝硫酸多糖。
9.权利要求1-8之一所述方法制备的硒化琼枝麒麟菜多糖在制备抑制人体癌细胞药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征是在制备抑制人喉上皮细胞癌HEp-2细胞、人白血病K562细胞和人肺癌H-460细胞、结肠癌细胞LOVO或宫颈癌细胞Hela药物中的应用。
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