CN102675486A

CN102675486A - 用于大量生产硒化环糊精的方法

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Publication number: CN102675486A
Application number: CN2011100609938A
Authority: CN
Inventors: 闫岗林; 王程; 龚平生; 吕绍武; 吕莉敏; 罗贵民; 赵刚; 赵杨; 徐亚维; 沈娜; 魏馨; 张新研
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2011-03-15
Filing date: 2011-03-15
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明提供了一种用50立升反应器大量生产含硒环糊精的方法，属于人工模拟酶领域。含硒环糊精是一种具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性的人工模拟酶，它能有效地清除人体内的自由基，从而有效预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病、肿瘤、皮肤病等由自由基紊乱诱发的疾病。本发明采用化学合成法，以环糊精疏水空腔作为酶的底物结合部位，以双硒桥为催化基团，将二者配置在一起。成功的制备出具有较高GPX活性的小分子含硒环糊精。本发明所述的含硒环糊精具有制备工艺简单、可大量生产、GPX活性高、稳定性好等特点，含硒环糊精已在治疗白内障(ZL 00133040.3)及保健饮料(ZL 03119442.7)等抗氧化药物保健方面获得国家发明专利。

Description

用于大量生产硒化环糊精的方法

技术领域

本发明属于人工模拟酶领域，特别涉及用于大量生产具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的硒化环糊精(2-SeCD)的方法。

背景技术

在分子水平上模拟酶活性部位的微环境，吸收酶中对催化起主导作用的因素，设计和合成较天然酶简单的蛋白分子或非蛋白分子，即设计人工模拟酶是当今自然科学领域中的前沿课题之一。人工酶分子具有与天然酶媲美的催化功能，而且稳定性又大大提高，在化工、酶学、医药学等领域具有广阔的应用前景。为此，美国和欧洲国家都把对酶的人工模拟列入未来研究的发展规划。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是生物体内重要的含硒酶。它具有优良的抗氧化性质，对治疗和预防白内障、克山病、心血管病、炎症及癌症等疾病具有很大潜力。但由于该酶不稳定，来源有限，分子量大会引起人体免疫反应等缺点，极大限制了该酶在医药学方面的开发和应用。对GPX的人工模拟可克服天然酶的上述弱点，并引起科学工作者的广泛重视。Ebselen是人工模拟的GPX的突出代表，其催化机制及生物学活性己被详细研究过。动物实验表明，Ebselen具有广谱抗炎活性，对糖尿病、肿瘤、心血管疾病均有疗效。但作为药物，Ebselen最大缺点是活性低、水溶性差。所以，开发小分子GPX模拟物具有重要意义。目前关于GPX的模拟物的研究日趋成熟，但是大多依然停留在基础实验研究阶段，并没有开发应用。本发明为了进一步研究硒化环糊精性质及促进其在化工、酶学、医药学等领域早日得到应用，对实验制备含硒环糊精进行放大，以期得到大量较高的活性和产物，为以后的进一步研究提供方便。

发明内容

以β-环糊精的2位羟基大量制备含硒环糊精来举例说明制备过程：

1.双硒桥联环糊精的合成路线(1)：

1)将β-环糊精的2位羟基用对甲苯基磺酰氯活化制成β-环糊精-2位羟基苯基磺酸脂；

2)-环糊精-2位羟基苯基磺酸脂的硒化：用硒氢基取代苯基磺酸脂基；

3)硒氢基在空气中氧化：硒氢基在空气中氧化生成双硒桥联环糊精。

2.大量制备含硒环糊精方法包括以下步骤：

1)NaHSe制备；

2)2-位硒桥联β-CD的合成，包括β-CD 2-位磺酰化和硒化2-OTs-β-CD；

3)分离纯化。

步骤1)NaHSe制备，其过程为：将0.25Kg NaBH₄溶解在装有1.5L水的玻璃容器中(3.5L)，再将0.25Kg硒粉缓慢加入到NaBH₄的溶液中，盖上一插有进样和放出硒化氢气体的两根玻璃管的胶盖，排气的管插入氢氧化钠溶液中。此时可以看到水中产生大量气体，并伴随有热量放出。由于反应过于剧烈，还伴有少量H₂Se气体产生，必须在通风橱中以冷水浴中进行，以控制反应速度，反应结束后，有大量盐析出。NaHSe极易氧化，故应通入N₂保存。其反应方程式如下：

4NaBH₄+2Se+7H₂O→2NaHSe+14H₂↑+Na₂B₄O₇

步骤2)中β-CD 2-位磺酰化过程为：1.6Kg纯度为96％的β-CD溶于20L NaOH(0.15mol/L)溶液中，在室温条件下，同时缓慢加入含1.6Kg p-TsCl的丙酮溶液4L和1mol/L NaOH溶液约10L，使溶液保持在pH＞12.5，4h加入完毕，再搅拌1h，加入1mol/L HCl中和至中性，滤去不溶物，得到产物为β-CD-2-位羟基苯磺酸脂溶液34L，简称2-OTs-β-CD。硒化2-OTs-β-CD过程为：将34L 2-OTs-β-CD溶液密封，通高纯氮去氧，加入2.0L NaHSe，60℃反应36h，然后使反应体系通入过滤后的空气充分氧化约24h，3500rpm离心10min，用5.0L的过滤器双层滤纸抽滤除硒，上清用5L的旋转蒸发器浓缩，得到6.5L含硒酶上清液。

步骤3)分离纯化，其过程为：取100毫升含硒酶上清液，上G-25柱(8×175cm)分离纯化(流速1.1ml/min)，254nm紫外监测收集第二峰，浓缩，再次上G-25柱分离，干燥，得淡黄色粉末，即为2-SeCD产品。

2.大量制备含硒环糊精方法与实验室制备含硒环糊精方法的差异：

表1NaHSe制备反应体系的比较

表2β-CD 2-位磺酰化反应体系的比较

表3硒化2-OTs-β-CD反应体系的比较

3.大量制备的含硒环糊精的结构表征

(1)元素分析

表4 2-SeCD中碳、氢元素百分比

从元素分析表4中可以看出放大产物的C、H含量基本接近理论值，证明产物分子式为C₈₄H₁₃₈Se₂·6H₂O。

(2)红外光谱分析

表5红外光谱分析(KBr压片)

从表5中数据可以看出，红外光谱出现了磺酸酯的特征吸收峰1177，1364cm^-1和苯环的特征吸收峰1598，1496，845，815cm^-1，而在SeCD中磺酸酯和苯环的特征吸收峰消失，说明磺酸酯已被-she置换下来，而CD的结构特征未变化。

(3)核磁共振分析

表6 2-SeCD的¹HNMR、¹³CNMR谱

利用D₂O为溶剂测定了2-SeCD的¹HNMR、¹³CNMR，根据表6数据可以看出2位羟基取代的结构特征，结果表明硒氢基被引入环糊精2位。

(4)质谱分析

2-SeCD的分子量由激光质谱测定为2393.7(理论值：C₈₄H₁₃₈Se₂，2393)，进一步证明化合物的双硒桥联结构。

(5)硒价态及含量分析

利用X-射线光电子能谱技术，以镁作靶，测定了模拟物中硒的价态为-1价。标准物硒代胱氨酸的电子能谱图的Se电子结合能为55.1eV，模拟物的电子结合能为54.9eV，表明硒的价态与标准物很接近。进一步说明模拟物中硒的结合形式与硒代胱氨酸一致，为硒桥联形式。综合上述结构表征分析，可以确定双硒桥联环糊精的结构为：

3.大量制备的含硒环糊精的GPX活性分析

实验室产物GPX活力：6.0U/μmol，大量制备产物GPX活力为：5.2U/μmol。从活力测定结果来看放大实验产物具有较高的GPX活力，达到原产物的80％。而其活力略低于原产物的原因可能是由于大体系中环糊精硒化后氧化不充分形成了不规则的聚合体。

4.大量制备的含硒环糊精对细胞生长抑制

用结晶紫分析的方法鉴定2-SeCD处理的HeLa细胞死亡百分率在剂量和时间上的关系，结果见图1。从图1的数据可以看出，当2-SeCD的浓度高于100μM时，2-SeCD抑制HeLa细胞生长表现出时间和剂量的关系。当2-SeCD的浓度为25μM和50μM时，2-SeCD降低细胞死亡率。

当用低浓度的2-SeCD(25μM和50μM)处理48h后，细胞的死亡率减少，但是当我们用高浓度的2-SeCD(100μM和200μM)处理48h后，细胞的死亡率分别为77.36和86.49％。在时间关系的研究中，被2-SeCD处理的细胞在培养24h时，细胞死亡率发生显著的增加。并且，随培养时间的增加，100μM和200M 2-SeCD处理的细胞死亡率持续增加。故可判定2-SeCD引起的HeLa细胞生长抑制。

5.大量制备的含硒环糊精对细胞的毒性

为了检测高浓度2-SeCD引起的HeLa细胞死亡是否是凋亡，我们检查了死亡细胞的形态学变化和DNA片段。当HeLa细胞同100μM 2-SeCD共同培养24h时，同没有用2-SeCD处理的HeLa细胞比较，处理后的细胞在形态学上有显著的改变(见图2A，2B)。2-SeCD处理的HeLa细胞显示为细胞膜多泡、凋亡小体和染色质浓缩等凋亡的特征(见图2C)，而未处理的细胞没有这些特征。

高浓度2-SeCD诱导的凋亡通过DNA凝胶电泳得到进一步的证实，见图3。2-SeCD处理的细胞显示出一个清楚的DNA特征梯形条带，并且同2-SeCD表现出时间和剂量相关。当细胞与2-SeCD共同培养24h时，条带2(用25μM 2-SeCD处理)同条带1(空白对照)相似，但是条带3(用100μM 2-SeCD处理)同条带1可以看出明显的区别。时间过程研究显示出现明显的凋亡特征DNA条带从24h开始，一直持续到36h和48h(条带lane 3，4，5)。这些都是凋亡明显的特征，证明2-SeCD引起的HeLa细胞死亡是凋亡。

本发明有如下特点：

1.制备方法简单，合成步骤少，产率高，可扩大生产。

2.人工酶模型简单，以环糊精空腔为底物结合部位，以双硒桥为催化基团。

3.本发明大量制备的含硒环糊精性质稳定，可保持GPX活性不变，促进实际应用。双硒桥联环糊精作为药物可克服天然GPX不稳定，来源有限，分子量大会引起人体免疫反应，不易过膜等缺点。

4.具有优良的抗氧化性，已在治疗白内障、保健饮料、化妆品和其他抗氧化药物等方面获得专利，在预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病、肝损伤、呼吸系统疾病、风湿与类风湿、皮肤病、肿瘤等由自由基紊乱诱发的疾病具有非常大的应用潜力。

附图说明

图1.不同剂量2-SeCD和不同时间作用下HeLa细胞死亡率

图2.2-SeCD诱导24h后的HeLa细胞形态学改变

图3.不同剂量2-SeCD和不同时间诱导后的HeLa细胞DNA ladder 。

Claims

1.一种由合成路线(1)所制取的含硒环糊精，其特征在于：所述的环糊精可以为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精中的任何一种，用化学法活化环糊精上的羟基，再以NaHSe取代羟基变成硒氢基，在环糊精上引入酶的催化集团，经氧化得到具有GPX活性的含硒环糊精；

2.一种如权利要求1所述的含硒环糊精，其特征在于：活化β-环糊精的2位羟基所得到的含硒环糊精结构式如(2)所示；

3.如权利要求1或2所述的含硒环糊精，其特征在于：具有较高的谷胱甘肽过氧化物酶活性；

4.如权利要求1或2所述的含硒环糊精的大量制备方法(以β-环糊精为例)，其特征在于由以下步骤：

1)NaHSe制备；

3)分离纯化。

5.如权利要求4所述的含硒环糊精的大量制备方法，其特征在于，步骤1)NaHSe制备，其过程为：将0.25Kg NaBH₄溶解在装有1.5L水的玻璃容器中(3.5L)，再将0.25Kg硒粉缓慢加入到NaBH₄的溶液中，盖上一插有进样和放出硒化氢气体的两根玻璃管的胶盖，排气的管插入氢氧化钠溶液中。此时可以看到水中产生大量气体，并伴随有热量放出。由于反应过于剧烈，还伴有少量H₂Se气体产生，必须在通风橱中以冷水浴中进行，以控制反应速度，反应结束后，有大量盐析出。NaHSe极易氧化，故应通入N₂保存。其反应方程式如下：

4NaBH₄+2Se+7H₂O→2NaHSe+14H₂↑+Na₂B₄O₇

6.如权利要求4所述的含硒环糊精的大量制备方法，其特征在于，步骤2)中β-CD 2-位磺酰化过程为：1.6Kg纯度为96％的β-CD溶于20LNaOH(0.15mol/L)溶液中，在室温条件下，同时缓慢加入含1.6Kg p-TsCl的丙酮溶液4L和1mol/L NaOH溶液约10L，使溶液保持在pH＞12.5，4h加入完毕，再搅拌1h，加入1mol/L HCl中和至中性，滤去不溶物，得到产物为β-CD-2-位羟基苯磺酸脂溶液34L，简称2-OTs-β-CD。

7.如权利要求4所述的含硒环糊精的大量制备方法，其特征在于，步骤2)中硒化2-OTs-β-CD过程为：将34L2-OTs-β-CD溶液密封，通高纯氮去氧，加入2.0LNaHSe，60℃反应36h，然后使反应体系通入过滤后的空气充分氧化约24h，3500rpm离心10min，用5.0L的过滤器双层滤纸抽滤除硒，上清用5L的旋转蒸发器浓缩，得到6.5L含硒酶上清液。

8.如权利要求4所述的含硒环糊精的大量制备方法，其特征在于，步骤3)分离纯化，其过程为：取100毫升含硒酶上清液，上G-25柱(8×175cm)分离纯化(流速1.1ml/min)，254nm紫外监测收集第二峰，浓缩，再次上G-25柱分离，干燥，得淡黄色粉末，即为2-SeCD产品。