CN111393408A - 一种制备天然黄酮硒的方法 - Google Patents

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宋昆元
陈伟伟
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Abstract

本申请公开了一种制备天然黄酮硒的方法，所述方法包括以下步骤：(1)在热水中加入黄酮化合物，搅拌均匀后调为碱性；(2)加入二氧化硒水溶液，搅拌；(3)冷却至20‑30℃时调节pH至3.0‑5.5，搅拌均匀；(4)冻干，粉碎，混匀，得产品。其优点表现在：得到了一种硒含量高，安全性高，抗肿瘤的天然黄酮硒；制备过程中未使用任何有机溶剂，减少污染，操作安全；以水为溶剂，基本无三废产生；操作简单。

Description

一种制备天然黄酮硒的方法
技术领域
本申请涉及医药技术领域，尤其是涉及一种制备天然黄酮硒的方法。
背景技术
黄酮类化合物广泛分布于各种植物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、清除自由基、增强免疫力、保护心血管系统、降低血糖、延缓衰老、抗菌、抗炎、调节毛细管的脆性和渗透性等功效。近年来大量的研究结果表明黄酮类化合物多数通过与生命必需元素之间的协同发挥作用。
硒是人体必需的一种微量元素，具有抗氧化、抗癌、防癌、保护骨髓造血、延缓衰老等多种生物活性，同时对一些重金属元素(如汞、砷、银等)具有解毒作用。人体摄入硒有两种来源，一种是无机硒，一种是有机硒。无机硒一般指亚硒酸钠和硒酸钠，有较大的毒性，且不易被吸收，不适合人和动物使用。有机硒包括简单的硒醚、二硒醚和有机硒的氧化物等。有机硒同无机硒相比，具有生物利用度高、生物活性强、毒性低、环境污染小等特点。近年来合成的有机硒类化合物，如硒化壳聚糖、含硒蛋白、硒多糖、硒化卡拉胶、硒化茶多酚等硒的小分子或生物大分子化合物在抗肿瘤、治疗心血管疾病、抗衰老及提高机体免疫力等生物活性方面明显高于未经硒化的相应化合物。植物活性硒是人类和动物允许使用的硒源。利用硒独特的化学和生物学性质合成生物活性高且毒性低的有机硒化合物一直目前药物研究的热点之一。
发明内容
本申请提供一种制备天然黄酮硒的方法。
本申请采用下述技术方案：
一种制备天然黄酮硒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)在热水中加入黄酮化合物，搅拌均匀后调为碱性；
(2)加入二氧化硒水溶液，搅拌；
(3)冷却至20-30℃时调节pH至3.0-5.5，搅拌均匀；
(4)冻干，粉碎，混匀，得产品。
进一步地，步骤(1)中，所述黄酮化合物为茶多酚、二氢杨梅素、白杨素、黄芩素或杨梅素等。
进一步地，步骤(1)中，热水中加入黄酮化合物后，加热30-60min。
进一步地，步骤(1)中，调节pH至8-11。
进一步地，步骤(2)中，搅拌时间为30-90min。
进一步地，步骤(3)中，使用盐酸溶液、冰醋酸溶液、硫酸溶液或氢溴酸溶液等调节pH。
进一步地，黄酮化合物与二氧化硒的质量之比为1:0.1-10。
本申请的有益效果如下：
(1)本申请的方法得到了一种硒含量高，安全性高，抗肿瘤的天然黄酮硒。
(2)制备过程中未使用任何有机溶剂，减少污染，操作安全。
(3)本申请的方法以水为溶剂，基本无三废产生。
(4)本申请的方法的操作非常简单。
附图说明
图1为天然黄酮硒指纹图谱。
图2为天然黄酮硒指纹图谱。
图3为天然黄酮硒热重分析结果。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1：制备试验
(1)在热水中加入二氢杨梅素(450g)，加热30min，搅拌均匀后使用氢氧化钠溶液调节pH至11；
(2)加入二氧化硒(100g)水溶液，搅拌；
(3)冷却至20-30℃时使用盐酸溶液调节pH至4.0，搅拌均匀；
(4)冻干，粉碎，混匀，得产品。
实施例2：制备试验
(1)在热水中加入二氢杨梅素(450g)，加热30min，搅拌均匀后使用氢氧化钠溶液调节pH至11；
(2)加入二氧化硒(150g)水溶液，搅拌；
(3)冷却至20-30℃时使用盐酸溶液调节pH至4.0，搅拌均匀；
(4)冻干，粉碎，混匀，得产品。
实施例3：制备试验
(1)在热水中加入二氢杨梅素(450g)，加热30min，搅拌均匀后使用氢氧化钠溶液调节pH至11；
(2)加入二氧化硒(200g)水溶液，搅拌；
(3)冷却至20-30℃时使用盐酸溶液调节pH至4.0，搅拌均匀；
(4)冻干，粉碎，混匀，得产品。
实施例4：天然黄酮硒对ICR小鼠毒性试验
(1)试剂及材料
灭菌注射用水
来源：广东艾希德药业有限公司
性状：无色透明液体
批号：180416205
规格：500ml/瓶
储存条件：RT
(2)药物配制
1000mg试剂通过灭菌注射用水制备成4ml溶液
(3)试验动物
品种和品系：ICR小鼠
级别：SPF级
性别：雌雄各半
来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司
实验动物质量合格证号：2008001635879
实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2018-0006
动物数量：订购雌雄各6只，共12只用于实验
实验开始时动物年龄：6～10w
实验开始时动物体重：20g±20％
适应环境时间：3天，与实验时相同饲养条件
动物编号方式：每个鼠笼均佩挂有实验编号、实验组别、实验人员姓名、动物品种和性别等信息的身份卡片，小鼠用尾根部画线标号。
(4)环境
动物房环境保持温度23±2℃，湿度40～70％，12小时明暗交替。动物每笼2～4只饲养，每周更换两次垫料(玉米芯垫料，苏州埭川商贸有限公司)。
(5)食物和饮水
适应期饲喂SPF大小鼠生长繁殖饲料Co60灭菌，购自北京科澳协力饲料有限公司。实验动物用水采用高压灭菌过滤水。
(6)动物选择和进食
用于实验的动物将保持健康状况。实验过程中动物自由饮食和饮水。
(7)试验方法
7.1分组
适应期过后，12只实验动物分为2组，雌雄各半，根据体重分别经口灌胃给予溶剂对照或受试物：
Figure BDA0002476078280000041
7.2临床症状
观察给药后动物临床症状，笼边观察1周，有异常记录。
7.3体重
给药前称量动物体重。
7.4试验结束
实验结束动物采用吸入过量CO2方法安乐死。
(8)数据统计
实验数据以Mean±SEM表示；两组间数据采用非配对t检验，p<0.05认为是有显著性差异。
(9)结果
临床观察和死亡率
Vehicle组和AQ-C-a 5000mg/kg组动物在实验期间均未表现出肉眼可见明显异常。死亡率为0％。
实施例5：天然黄酮硒体外肿瘤细胞实验
(1)实验器材
Figure BDA0002476078280000051
(2)试剂
Figure BDA0002476078280000052
Figure BDA0002476078280000061
(3)实验细胞
Figure BDA0002476078280000062
(4)实验方法
4.1细胞培养
4.1.1显微镜下观察细胞状态，细胞无污染，细胞汇合度约90％左右；
4.1.2弃上清，每皿加入5mL PBS洗一遍，加3mL胰酶，消化3min；或换液5mL；
4.1.3轻轻吹打细胞，离心管收集细胞，离心1000rpm，5min；
4.1.4弃上清，部分细胞新鲜培养基重悬，传至新的细胞培养皿扩大培养，传代比例3：8；
4.1.5根据实验计划继续传代并进一步扩大培养，汇合度约90％左右。
4.2药物配制
称取30.28mg，用0.4ml DMSO溶解，得母液，在稀释至工作浓度。
4.3CCK-8铺板加药及检测
4.3.1细胞种板：将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，配制成细胞悬液，按3000-5000细胞每孔接种于96孔板，每孔加100μl，置于CO2(5％)培养箱中37℃下培养过夜贴壁，边缘孔用无菌PBS填充。
4.3.2将不同浓度的化合物加入96孔板，每个样本浓度设3个重复。
4.3.3 CCK-8反应：所有孔中分别加入10μl CCK-8溶液，轻轻敲击培养板混匀，培养箱中孵育2小时。
4.3.4测吸光度值：使用酶标仪测定450nm光吸收值，按公式计算药物对细胞的抑制率。
(5)数据分析
以Graghpad-prism5.0作图，计算每个细胞每种药物对应时间点的IC50值。
(6)实验结果
Figure BDA0002476078280000071
实施例6：天然黄酮硒指纹图谱
(1)仪器
双三元高效液相色谱仪，U3000-CAD
中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2012.130723版本
(2)试剂
甲醇，色谱级
乙酸，色谱级
超纯水，18.2MΩ.cm@25℃
(3)色谱条件
Figure BDA0002476078280000081
(4)溶液配制
50％乙腈溶液的配制：取乙腈1000ml，加纯化水1000ml，混匀，即得。
供试品溶液的配制：移取中控样品溶液约1ml，置于50ml容量瓶中，加入50％乙腈溶液稀释至刻度，超声10min，过滤，摇匀，作为供试品溶液。
(5)测试
精密吸取供试品溶液10μl注入双三元高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
色谱图中最高峰的峰高应在50-300pA，若供试品溶液最高峰超出此范围，调整4.2中控样品的稀释倍数。
按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度。
由本申请实施例制备所得天然黄酮硒化合物之间的相似度均大于0.95。
实施例7：天然黄酮硒硒含量
(1)仪器
电子天平，XPE205
微波消解仪，MWD-520
原子吸收分光光度计，AA-6880
(2)试剂
硝酸，优级纯
超纯水，18.2MΩ.cm@25℃
(3)标准溶液
Se标准溶液，1000mg/L
(4)溶液配制
4.1空白溶液配制
取硝酸7ml，置于微波消解内罐中，放置15分钟预消解，旋紧罐盖，进行微波消解，消解参数见表1，待消解完全，冷却后拿出消解罐，将消解液转移至50ml容量瓶中，用水定容至刻度，再吸取2ml至50ml容量瓶中，加水定容，摇匀备用。
4.2工作标准溶液的配制
精密移取硒标准液(1000mg/L)0ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml分别置于100mL容量瓶中，用2％硝酸稀释至刻度，摇匀。工作标准溶液的浓度分别为0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L。
4.3供试品溶液的配制
取供试品约200mg，精密称定，置于微波消解内罐中，加入硝酸7ml,放置15分钟预消解，旋紧罐盖，进行微波消解，消解参数见表1，待消解完全，冷却后拿出消解罐，将样品消解液转移至50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，再精密移取上述溶液2ml至50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用。
表1微波消解参数
Figure BDA0002476078280000091
Figure BDA0002476078280000101
(5)测定
工作标准溶液的测定：取工作标准溶液，照火焰原子吸收光谱法(中国药典四部通则)测定，浓度从低到高依次检测，记录吸光度值，以标准溶液的浓度值与其对应的吸光度值计算回归方程，相关系数r不得小于0.99。
供试品溶液的测定：取供试品溶液，用空白对照溶液调零，记录供试品溶液的吸光度值。试验数据采用回归方程计算法处理，并按下式计算结果。
(6)计算
Figure BDA0002476078280000102
式中：C为空白修正后的供试品溶液浓度，单位mg/L
V为供试品消化液定容体积，单位为L
f为供试品溶液稀释倍数
W为供试品的取样量按干燥品计，单位为g
(7)结果
检测得天然黄酮硒的硒含量为15.1％。
实施例8：天然黄酮硒热重分析
以10.00℃/min的速度升温至150.00℃；
等温保持20分钟；
以10.00℃/min的速度升温至300.00℃。
结果如图3所示。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种制备天然黄酮硒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)在热水中加入黄酮化合物，搅拌均匀后调为碱性；
(2)加入二氧化硒水溶液，搅拌；
(3)冷却至20-30℃时调节pH至3.0-5.5，搅拌均匀；
(4)冻干，粉碎，混匀，得产品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述黄酮化合物为茶多酚、二氢杨梅素、白杨素、黄芩素或杨梅素。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，热水中加入黄酮化合物后，加热30-60min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，调节pH至8-11。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，搅拌时间为30-90min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，使用盐酸溶液、冰醋酸溶液、硫酸溶液或氢溴酸溶液调节pH。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，黄酮化合物与二氧化硒的质量之比为1:0.1-10。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法制备的天然黄酮硒。
9.如权利要求8所述的天然黄酮硒在制备抗肿瘤的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、胃癌或前列腺癌。
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