CN110511293B - 一种基于响应面法优化中亚白及多糖超声辅助提取的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于响应面法优化中亚白及多糖超声波辅助提取的方法，该方法将中亚白及粉碎后，过筛分离杂质，石油醚脱脂，乙醇脱色素，自然风干后用水为溶剂，利用Design Expert 8.0.6软件进行Box‑Behnken设计，以多糖得率为响应值，采用三因素三水平的响应面分析法优化中亚白及多糖的超声辅助提取，提取完毕后，提取液进行离心，浓缩，无水乙醇沉淀，再离心，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，制备出中亚白及多糖。与传统方法相比，本发明所述方法所需时间显著缩短，温度显著降低，且抗氧化活性更高，易于扩大规模生产，是制备中亚白及多糖的理想方法之一。本研究可为中亚白及多糖在抗氧化和抗衰老功能性食品中的应用开发提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于响应面法优化中亚白及多糖超声辅助提取的方法，通过该方法获得的中亚白及多糖可作为治疗或预防抗氧化疾病相关的药物或保健品的制备原料。
背景技术
中亚白及(TUBER SALEP)，又名欧白及为兰科植物Orchis chusua D.Don的干燥块茎。功能与主治:生湿生热，壮阳生精，养心生血等。中亚白及国内分布于吉林、黑龙江、四川，国外分布于苏联、日本等。中亚白及是一个很好的葡甘聚糖(16-55％)的来源。
多糖又称多聚糖，是由糖苷键结合的糖链，至少要超过十个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，通式为(C6H10O5)n。多糖来源非常的广泛，例如大多数高等植物、微生物(细菌和真菌)和动物体内均有多糖的存在。多糖在细胞与细胞信息交流、细胞吸附、以及免疫系统分子识别方面扮演着极其重要的作用。多糖已成为天然药物及保健品研发中的重要组成部分，国外多数制药公司都有从事糖类药物的研发。研究发现多糖具有抗氧化，抗肿瘤，抗凝血及免疫调节等多种功能，在医药、食品、化妆品和环境治理等领域具有广阔的应用前景。目前，有很多种多糖已被发现有体内外的抗氧化作用，多糖能够消除活性氧自由基，对活性氧产生的伤害有明显的改善作用。因此，近年来，关于多糖的抗氧化研究越来越受到人们的关注，已成为当今研究的“热点”。随着社会的发展和生活质量的提高，药品消费也逐渐从以化学药品为主向以天然资源为原料的植物药转变，中药在治疗、康复保健和提高人体免疫能力方面有独特的优势，己成为世界医药产业的重要组成部分。
多糖提取已应用多种先进技术，包括红外辅助提取、H2O2辅助提取、酶辅助提取、微波辅助提取和超临界流体萃取等。每种提取方法都有其优缺点。例如，红外及微波辅助提取要求高温，在高温下会导致一些热不稳定性成分损失，活性降低等；超临界流体提取成本较高，难以工业化生产。因此，需要一种新的有效的提取方法来避免这些缺点。近年来，超声辅助提取(UAE)作为一种方便、快速、低损伤、环保的方法，正受到人们的重视。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种基于响应面法优化中亚白及多糖超声辅助提取的方法。该方法将中亚白及粉碎后，机械粉碎，并过筛分离杂质，石油醚脱脂，乙醇脱色素，自然风干后用水为溶剂，超声辅助提取，并用响应面法优化条件，进行离心，浓缩，无水乙醇沉淀，再离心，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，制备出中亚白及多糖。相对于传统方法相比，该方法所需时间显著缩短，温度显著降低，且生物活性更高，易于扩大规模生产，是制备中亚白及多糖的理想方法之一。
本发明所述的一种基于响应面法优化中亚白及多糖超声辅助提取的方法，按下列步骤进行：
a、将中亚白及块茎干制品用粉粹机粉碎、过40目筛，温度4℃下自封袋保存；
b、将步骤a所得中亚白及粗粉末在温度60℃下用石油醚索氏回流脱脂20h，抽滤，滤渣在流动空气下挥发溶剂；
c、将步骤b所得中亚白及脱脂样品在温度60℃下用乙醇索氏回流20h除去色素以及小分子，抽滤，滤渣在流动空气下挥发溶剂；
d、利用Design Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken设计，以多糖得率为响应值，在超声功率390W，提取温度60℃,提取总时间50min，4s关，4s开条件下得到提取液；
e、将步骤d所得中亚白及提取液离心，去除残渣，在温度55℃下进行减压浓缩至1/3，再用4倍体积95％乙醇进行沉淀，在温度4℃下放置12h，收集沉淀后在温度为-70至-80℃，压力为8-15Pa冷冻干燥，时间为10-15小时，得到中亚白及多糖。
所述的方法获得的中亚白及多糖在制备治疗或预防抗氧化疾病的药物原料中的用途。
本发明所述的一种基于响应面法优化中亚白及多糖超声辅助提取方法，其优点是得到多糖得率较其他方法高，易于放大中试，其在保留多糖原有的物理和化学性质以及营养成分基础上，通过在较低温度下对多糖进行超声辅助提取，不但降低了提取时间，且得到的多糖较传统方法具有更高的抗氧化活性，避免了传统传统方法导致有些化合物失去活性，结构改变等的缺点。从天然植物中寻找新抗氧化剂，是现代医药和食品行业发展的新方向。研究多糖及其衍生物的抗氧化作用，开发新的天然抗氧化剂，具有重要的现实意义。本研究可为中亚白及多糖在抗氧化和抗衰老功能性食品中的工业化开发提供参考。
附图说明
图1为本发明响应面法得到的3-D曲线图-超声功率和提取温度对得率的影响图；
图2为本发明响应面法得到的3-D曲线图-超声功率和提取时间对得率的影响图；
图3为本发明响应面法得到的3-D曲线图-提取时间和提取温度对得率的影响图；
图4为本发明响应面法得到的等高线图-超声功率和提取温度对得率的影响图；
图5为本发明响应面法得到的等高线图-超声功率和提取时间对得率的影响图；
图6为本发明响应面法得到的等高线图-提取时间和提取温度对得率的影响图；
图7为本发明两种提取方法提取多糖的DPPH自由基清楚实验结果；
图8为本发明两种提取方法提取多糖的ABTS自由基清楚实验结果；
图9为本发明两种提取方法提取多糖的羟自由基清楚实验结果。
具体实施方式
实施例1(响应面法)
a、将中亚白及块茎干制品用粉粹机粉碎、过40目筛，温度4℃下自封袋保存；
b、将步骤a所得中亚白及粗粉末在温度60℃下用石油醚索氏回流脱脂20h，抽滤，滤渣在流动空气下挥发溶剂；
c、将步骤b所得中亚白及脱脂样品在温度60℃下用乙醇索氏回流20h除去色素以及小分子，抽滤，滤渣在流动空气下挥发溶剂；
d、利用Design Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken设计了3因素3水平BBD实验，以多糖得率为响应值，在超声功率390W，提取温度60℃，提取总时间50min，4s关，4s开条件下得到提取液，如表1设计出17个实验；
e、将步骤d所得中亚白及提取液离心，去除残渣，在温度55℃下进行减压浓缩至1/3，再用4倍体积95％乙醇进行沉淀，在温度4℃下放置12h，收集沉淀后在温度为-70--80℃，压力为8-15Pa冷冻干燥，时间为10-15小时，得到中亚白及多糖；
其中利用Design-Expert软件(V8.0.6)设计，用超声波细胞粉粹机(比朗仪器有限公司，上海，中国)将步骤c所得中亚白及脱色素样品在表1条件下进行19次提取，并运用公式：提取率(％)＝(C×N×V)/M计算提取液的得率{公式中C代表多糖浓度(mg/mL)；N代表稀释因子；V代表体积(mL)；M代表原材料质量(g)}，最后对数据进行多元回归拟合，确定中亚白及多糖得率(Y)与超声功率(A)、提取温度(B)、提取时间(C)的二元多项回归方程：得率＝49.00-1.39A+1.22B+0.55C+1.60AB-0.44AC+0.042BC-4.42A2-3.39B2-6.51C2
表1响应面条件：
采用方差分析评价回归模型的显著性和适应度，所得方差分析结果如表2所示，相应面曲线图(图1-3)和等高线图(图4-6)；结果表明：模型P值(可能性)小于0.0001，表明该模型对提取率响应显著；模型F值为31.44，表明噪声发生的概率只有0.01％；失拟的P值为0.0944，F值为4.36，表明失拟相对于纯误差不显著，验证了模型的有效性；回归模型中，相关系数R2为0.9759，调整后的确定系数adj-R2为0.9448，变异系数(CV)为2.75，表明实验值与预测值具有较高的相关性；方差分析表明：变量A、B、C、AB、A2、B2、C2、对提取率有显著影响；三个自变量的P值的顺序为C>B>A，说明超声功率(A)对产量的影响最大，而提取时间(C)对产量的影响不显著(P>0.05)。超声波功率与时间(AB)的相互作用项对产率也有显著影响(P<0.05)；
表2回归模型方差分析
A:超声功率(W)；B:提取温度(℃)；C:提取时间(min)
R2＝0.9759；Adj-R2＝0.9448；注:*表示：显著；**表示：极显著；ns表示：不显著；验证实验：
根据实验设计中最佳方案，结合到实际情况，修正实验操作设置的条件为超声功率386W,提取温度61℃,提取时间50min；实验重复3次，实得中亚白及多糖得率为49.12±0.6％，近似于响应面法计算所得理论值，表明响应面法优化所得的回归方程具指导意义。
实施例2(对比)
热水提取：
a、将中亚白及块茎干制品用粉粹机粉碎，过40目筛，温度4℃下自封袋保存；
b、将步骤a所得中亚白及粗粉末在温度60℃下用石油醚索氏回流脱脂20h，抽滤，滤渣在流动空气下挥发溶剂；
c、将步骤b所得中亚白及脱脂样品在温度60℃下用乙醇索氏回流20h除去色素以及小分子，抽滤，滤渣在流动空气下挥发溶剂；
d、将步骤c所得样品使用磁力搅拌器在提取温度为100℃，提取液料比为40mg/mL条件下提取180min，并运用公式1计算提取液的得率；
e、将步骤d所得中亚白及提取液离心去除残渣，在温度55℃条件下进行减压浓缩至1/3；再用4倍体积95％乙醇进行沉淀，在温度4℃下放置12h，收集沉淀后在温度为-70至-80℃，压力为8-15Pa冷冻干燥，时间为10-15小时，得中亚白及多糖。
实施例3
将实施例1和实施例2得到的多糖进行多糖含量用苯酚-硫酸比色法测定，糖醛酸含量用间羟基联苯比色法测定，蛋白含量用BCA法测定，其结果如表3：
表3响应面法优化的超声辅助提取和传统热水提取的比较
实施例4
将实施例1和实施例2得到的多糖进行抗氧化活性实验：
DPPH自由基清除实验：
将100uL各浓度的多糖0.25-5.0mg/mL和100μL新配置的DPPH自由基(0.2mol/L)加到96孔板上。然后立即混合，温度37℃避光反应30min，在517nm下测吸光度值；以BHT为参照：每个实验重复三次，
并以公式计算清除率(其中Ai：未加试样的DPPH·溶液吸光度；Aj：试样与DPPH·混合后的吸光度；A0：仅为样品溶液的吸光度)，其结果如图7所示；两种提取多糖的DPPH自由基清除活性在检测浓度范围内呈正相关，且响应面优化超声辅助提取多糖对DPPH自由基的清除活性明显高于热水提取多糖；
羟自由基清除实验：
将不同浓度0.2-2.0mg/mL的样品70uL与60uL水杨酸-乙醇6mM，以及5uL H2O2(0.1％)混合，在室温下反应30min，在510nm下测量吸光度，以BHT为参照，每个实验重复三次，并运用DPPH自由基清除实验中的公式计算清除率，其结果如图8所示；在一定浓度范围内，随着多糖质量浓度的增加，其清除自由基的能力增强，当浓度达大于0.5mg/mL时，响应面优化超声辅助提取多糖的羟基自由基清除活性显著高于热水提取；
ABTS自由基清除实验：
将50uL不同浓度多糖和150μL ABTS自由基(吸光度在0.7±0.02)混合，在室温反应10分钟后，在730nm出测定吸光度，以BHT为参照，每个实验重复三次，并运用DPPH自由基清除实验中公式计算清除率，其结果如图9所示；在检测浓度范围内，响应面优化超声辅助提取多糖的ABTS自由基清除活性显著高于热水提取。
结论：对超声辅助提取和热水提取的两种多糖进行得率，多糖含量，糖醛酸含量、蛋白含量、抗氧化活性等方面的比较如表3看出：提取方法对多糖的提取有明显的影响，两种多糖中，除了糖醛酸含量相似之外，超声辅助提取多糖的得率49.12±0.6％，多糖含量63.5％，以及蛋白质含量3.16％均高于传统热水提取的32.5％，58.0％，2.64％；此外，从三种抗氧化活性实验比较中可知，超声辅助提取多糖的抗氧化活性均明显高于传统热水提取的多糖，说明超声辅助提取的多糖的活性更好；这是由于超声能更好地分解细胞壁基质，更有效提高有效成分的提取，通过在较低温度下对多糖进行超声辅助提取，避免了传统方法导致有些化合物失去活性，高温引起多糖的降解，结构改变等的缺点；更重要的是，超声辅助提取所用时间50min以及所用温度62℃较传统水提时间180min，温度100℃更低。结果表明：响应面法优化超声辅助提取是有效的，它不但更加有效，更加环保，且较传统方法活性更高，易于扩大规模生产，是制备中亚白及多糖的理想方法之一。
Claims (2)
1.一种基于响应面法优化中亚白及多糖超声辅助提取的方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、将中亚白及块茎干制品用粉粹机粉碎、过40目筛，温度4℃下自封袋保存；
b、将步骤a所得中亚白及粗粉末在温度60℃下用石油醚索氏回流脱脂20 h，抽滤，滤渣在流动空气下挥发溶剂；
c、将步骤b所得中亚白及脱脂样品在温度60℃下用乙醇索氏回流20 h除去色素以及小分子，抽滤，滤渣在流动空气下挥发溶剂；
d、利用 Design Expert 8.0.6 软件进行Box-Behnken 设计，以多糖得率为响应值，在超声功率390 W，提取温度60℃, 提取总时间50 min，4 s关，4 s开条件下得到提取液；
e、将步骤d所得中亚白及提取液离心，去除残渣，在温度55℃下进行减压浓缩至1/3，再用4倍体积95%乙醇进行沉淀，在温度4℃下放置12 h，收集沉淀后在温度为-70至-80℃，压力为8-15 Pa冷冻干燥，时间为10-15小时，得到中亚白及多糖。
2.根据权利要求1所述的方法获得的中亚白及多糖在制备治疗或预防抗氧化疾病的药物原料中的用途。
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