CN101926828B - 提取琵琶甲中抑菌物质、水溶性多糖和甲壳素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从琵琶甲中提取抑菌物质、水溶性多糖及甲壳素的方法，以琵琶甲成虫为原料，烘干、粉碎后用脱脂剂脱脂，溶剂及水依次提取，得溶剂提抑菌物和水提抑菌物；再用溶剂和水超声波提取，得水溶性琵琶甲多糖，然后微波加热水解脱除蛋白、酸液脱无机盐，得到琵琶甲甲壳素。所提抑菌物对细菌具有一定抑菌能力，所得水溶性琵琶甲多糖具有提高免疫效果，得到的琵琶甲甲壳素灰分低、纯度高。在本发明中利用不同极性的溶剂实现对琵琶甲中抑菌物质、水溶性多糖及甲壳素的提取。工艺简单，操作方便，最大程度综合利用资源，实现对琵琶甲所含各种活性成分的利用，还能减少环境污染，减低产品成本，增加企业效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取方法，尤其是一种从琵琶甲中提取抑菌物质、水溶性多糖及甲壳素的方法，属于物质提取技术领域。
背景技术
昆虫的药用价值在我国历代药书中都有很多记载，通过近年来的研究与实践表明：药用昆虫能够直接或间接地用于治疗人类的多种疾病，且治疗效果显著，作用范围广，尤其是采用现代分析方法和药理药效试验，进一步发现药用昆虫的药理作用大致有下列几种：抗菌消炎，抑制肿瘤，提高免疫力，抗溃疡，抗过敏，凝血及抗凝血等。因此，可以说药用昆虫与其它药用植物、微生物一样，已形成了我国中药、民族民间药的重要天然药物资源。
多糖是生物体内的重要大分子物质之一，具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等多种生理功能，在医药和食品领域显示了很好的应用前景，因而受到人们的广泛关注。但是目前多糖研究主要以真菌、植物为主，动物多糖相对较少，昆虫多糖极少有人涉及。
甲壳素(Chitin)又名几丁质、甲壳质等，化学名为β-(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D葡聚糖，广泛存在于节肢动物门甲壳纲动物的虾、蟹的甲壳、以及昆虫纲(如鞘翅目、双翅目翅膀等)的甲壳、和真菌类低等植物如酵母、霉菌菌丝细胞和藻类细胞及高等植物(如蘑菇)的细胞壁中。甲壳素是一种天然高分子聚合物，属线性多糖类，为白色或灰白色无定形、半透明固体，吸水能力大于50％，其分子间存在着-O…H-O-型及-O…H-N-型氢键的强烈作用，使甲壳素分子结构规整，易于结晶。甲壳素及其衍生物具有良好的吸湿性、成膜性、气透性、降解性、生物相容性、无毒副作用以及不污染环境等诸多优良性能，在环保、纺织工业、医药保健、农业、食品和化妆品等方面得到广泛应用。目前工业化生产甲壳素的原料主要来自水产品虾、蟹的壳体。昆虫是地球上种类最多、数量最大的生物类群，其体壁中含有丰富的甲壳素，因此，昆虫是一极为丰富的甲壳素资源。
喙尾琵琶甲(Blaps rhynchoptera Fairmaire)为鞘翅目(Coleoptera)拟步虫科(Tenebrionidae)琵琶甲属(Blaps Fabiricus，1775.)昆虫，在云南民间长期作为药用昆虫而被广泛使用，具有调节人体免疫功能和抗菌消炎作用，民间用于治疗发烧、咳嗽、哮喘、胃炎、疥疮、肿瘤等疑难杂症，是一种具有重大利用价值的民族药用昆虫。
目前对琵琶甲的利用较少，中国专利02134188.5公开了一种以云南琵琶甲提取物作为主要成分的抗菌消炎制剂，该制剂中的琵琶甲提取物是以乙醇或其它醇作为溶剂进行提取的，且提取得到的琵琶甲提取物具有清热解毒、抗菌消炎的作用，可用于治疗急慢性气管炎、咽炎、牙周炎、牙龈炎及无名肿毒等症。但还没有形成对琵琶甲综合利用的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从琵琶甲中提取抑菌物质、水溶性多糖及甲壳素的方法，以充分利用琵琶甲中有效成分。
本发明通过下列技术方案完成：一种提取琵琶甲中抑菌物质、水溶性多糖及甲壳素的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、按琵琶甲∶脱脂溶剂＝1∶2～6的质量比，在琵琶甲中加入脱脂溶剂，搅拌混匀，室温下静置脱脂18～26小时，过滤分离得滤液和脱脂滤渣，滤液在温度为25～40℃、真空度为0.1MP条件下，浓缩回收脱脂溶剂后得提取物；脱脂滤渣于室温下自然晾干；
B、在上述脱脂滤渣中，按脱脂滤渣∶溶剂＝1∶2～6的质量比加入溶剂，搅拌混匀，室温下浸渍12～24小时后过滤得滤液和滤渣，在滤渣中再加入相同质量比的溶剂，搅拌混匀，室温下浸渍12～24小时后过滤得滤液和滤渣，如此重复浸提至少3次，合并滤液，浓缩回收溶剂后，得提取的琵琶甲抑菌物；滤渣于室温下自然晾干；
C、在上述B步骤的滤渣中，按滤渣∶水＝1∶4～10的质量比加水，室温下超声波提取1小时，过滤得滤液和滤渣，滤液浓缩、干燥后得提取的琵琶甲水提抑菌物；滤渣于室温下自然晾干；
D、在上述C步骤的滤渣中，按滤渣∶水＝1∶4～20的质量比加水，50～100℃温度下，超声波提取0.5～2小时，离心分离出液体和固体渣，在固体渣中加水至没过固体渣，重复在50～100℃温度下，超声波提取0.5～2小时，离心分离出液体和固体渣，如此重复提取2～4次，合并各次液体，经过滤后，将滤液浓缩至原体积的1/10，得浓缩液；
E、在上述D步骤的浓缩液中，按浓缩液∶乙醇＝1∶4～5的体积比加入质量浓度为95％的乙醇静置20～26小时，以沉淀多糖，离心分离得液体和沉淀物，在液体中重复加入相同量的乙醇再次沉淀，如此反复沉淀三次，得液体和沉淀物；在沉淀物中，按沉淀物∶水＝1∶2～5的质量比加水溶解，离心分离去除不溶物得液体；合并各次液体，经浓缩、干燥后，得提取的琵琶甲水溶性多糖；
F、在D步骤分离出的固体渣中，按固体渣∶溶剂＝1∶5～10的质量比加入质量浓度为1～15％的溶剂，加热至50～90℃温度，过滤分离出滤液和滤渣，滤渣经水洗至中性后甩干水份，按滤渣∶脱盐剂＝1∶10～15的质量比，在滤渣中加入浓度为0.1～2mol/L的盐酸溶液，室温下反应5～100分钟脱除无机盐，过滤得滤液和滤渣，滤渣经水洗至中性后，干燥，得提取的琵琶甲甲壳素。
所述A步骤中的琵琶甲预先粉碎至过40目筛，以便加速提取，并提高得率。
所述A步骤的脱脂溶剂为石油醚，或者正己烷，或者6号溶剂油中的一种，均为工业级产品。
所述B步骤的溶剂为乙酸乙酯，或者乙酸甲酯，或者乙酸异丙酯中的一种，均为工业级产品。
所述F步骤的溶剂为氢氧化钠或者氢氧化钾溶液中的一种。
所述F步骤的加热为常规的电加热、温箱加热，或者常规的微波炉加热，以脱出其中的蛋白质。
所述过滤、浓缩、干燥均在现有技术的常规设备上按常规方法完成的。
所述质量/体积比为：kg/L，或者g/ml，或者mg/mL。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：采用上述方案，可在同一提取工艺过程中，同时获得琵琶甲抑菌物质、琵琶甲水溶性多糖和琵琶甲甲壳素，将琵琶甲昆虫中的有用、有价成分充分、有效分离提取出来，有利于琵琶甲昆虫资源的综合利用与开发，发挥琵琶甲昆虫的资源优势，让其为人类造福，本发明的提取工艺简单，操作方便，投资小，节能，资源利用率高，还能减少环境污染，减低产品成本，增加产品附加值，提高企业效益。
附图说明
图1为现有的标样甲壳素红外光谱图；
图2为本发明制备的琵琶甲甲壳素红外光谱图；
图3为本发明所制备的琵琶甲甲壳素的X-衍射图谱与现有的标样甲壳素的X-衍射图谱对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
A、将市购的琵琶甲用常规烘干机烘干水分后，粉碎至过40目筛，按琵琶甲粉∶脱脂溶剂＝1∶2的质量/体积比，在10kg琵琶甲粉中加入20L石油醚，搅拌混匀，室温下静置脱脂26小时，过滤分离得滤液和脱脂滤渣，滤液在温度为25℃、真空度为0.1MP条件下浓缩回收石油醚，得石油醚提取物，得率为4.53％；脱脂滤渣于室温下自然晾干；
B、在上述A步骤的脱脂滤渣中，按脱脂滤渣∶溶剂＝1∶2的质量/体积比，在10kg滤渣中加入20L乙酸乙酯，搅拌混匀，室温下浸渍24小时后过滤得滤液和滤渣，在滤渣中再加入相同质量/体积比的乙酸乙酯，搅拌混匀，室温下浸渍24小时后过滤得滤液和滤渣，如此重复浸提3次，合并3次滤液，浓缩回收乙酸乙酯后，得提取的琵琶甲乙酸乙酯提抑菌物，得率为2.53％；滤渣于室温下自然晾干；
C、在上述B步骤的滤渣中，按滤渣∶水＝1∶4的质量比，在10kg滤渣中加蒸馏水40kg，室温下超声波提取1小时，用200目滤布过滤得滤液和滤渣，滤液真空浓缩、干燥，得提取的琵琶甲水提抑菌物，得率为24.27％；滤渣于室温下自然晾干；
D、在上述C步骤的滤渣中，按滤渣∶水＝1∶4的质量比，在10kg滤渣中加入40L水，50℃温度下，超声波提取2小时，离心分离出液体和固体，在固体中加水至没过固体，重复在50℃温度下，超声波提取2小时，离心分离出液体和固体渣，如此提取2次，合并液体，用分子量为5000的中空纤维超滤膜过滤去除小分子物质，再真空浓缩至原体积的1/10，离心去除不溶物，得浓缩液；
E、在上述D步骤的浓缩液中，按浓缩液∶乙醇＝1∶4的体积比，在10L浓缩液中加入40L质量浓度为95％的乙醇静置20小时，以沉淀多糖，之后离心分离得液体和沉淀物，在液体中重复加入相同量的乙醇再次沉淀，如此反复沉淀三次，得液体和沉淀物；在沉淀物中，按沉淀物∶水＝1∶2的质量比加水溶解，离心分离去除不溶物得液体；合并各次液体，经浓缩、干燥后，得提取的琵琶甲水溶性多糖，得率3.1％；
F、在D步骤分离出的固体渣中，按固体渣∶溶剂＝1∶5的质量/体积比，在10kg固定渣中加入50L质量浓度为15％的氢氧化钠溶液，微波炉加热至50℃，用200目滤布过滤分离出滤液和滤渣，将滤渣洗至中性并甩干水份；按滤渣∶脱盐剂＝1∶10的质量比，在滤渣中加入浓度为0.1mol/L的盐酸液，室温下反应5分钟脱除无机盐，用200目滤布过滤得滤液和滤渣，滤渣经水洗至中性后，干燥，得提取的琵琶甲甲壳素，甲壳素中灰分含量0.20％，氮含量7.2％，收率15.5％。
实施例2
A、将市购的琵琶甲用常规烘干机烘干水分后，粉碎至过40目筛，按琵琶甲粉∶脱脂溶剂＝1∶6的质量/体积比，在10kg琵琶甲粉中加入60L正己烷，搅拌混匀，室温下静置脱脂18小时，过滤分离得滤液和脱脂滤渣，滤液在温度为40℃、真空度为0.1MP条件下浓缩回收正己烷，得正己烷提取物，得率为4.98％；脱脂滤渣于室温下自然晾干；
B、在上述A步骤的脱脂滤渣中，按脱脂滤渣∶溶剂＝1∶6的质量/体积比，在10kg滤渣中加入60L乙酸甲酯，搅拌混匀，室温下浸渍12小时后过滤得滤液和滤渣，在滤渣中再加入相同质量/体积比的乙酸甲酯，搅拌混匀，室温下浸渍12小时后过滤得滤液和滤渣，如此重复浸提3次，合并3次滤液，浓缩回收乙酸甲酯后，得提取的琵琶甲乙酸甲酯提抑菌物，得率为2.28％；滤渣于室温下自然晾干；
C、在上述B步骤的滤渣中，按滤渣∶水＝1∶10的质量比，在10kg滤渣中加蒸馏水100kg，室温下超声波提取1小时，用200目滤布过滤得滤液和滤渣，滤液真空浓缩、干燥，得提取的琵琶甲水提抑菌物，得率为28.4％；滤渣于室温下自然晾干；
D、在上述C步骤的滤渣中，按滤渣∶水＝1∶20的质量比，在10kg滤渣中加入200L水，100℃温度下，超声波提取0.5小时，离心分离出液体和固体，在固体中加水至没过固体，重复在100℃温度下，超声波提取0.5小时，离心分离出液体和固体渣，如此提取4次，合并4次液体，用分子量为5000的中空纤维超滤膜过滤去除小分子物质，再真空浓缩至原体积的1/10，离心去除不溶物，得浓缩液；
E、在上述D步骤的浓缩液中，按浓缩液∶乙醇＝1∶5的体积比，在10L浓缩液中加入50L质量浓度为95％的乙醇静置26小时，以沉淀多糖，之后离心分离得液体和沉淀物，在液体中重复加入相同量的乙醇再次沉淀，如此反复沉淀三次，得液体和沉淀物；在沉淀物中，按沉淀物∶水＝1∶5的质量比加水溶解，离心分离去除不溶物得液体；合并各次液体，经浓缩、干燥后，得提取的琵琶甲水溶性多糖，得率4.2％；
F、在D步骤分离出的固体渣中，按固体渣∶溶剂＝1∶10的质量/体积比，在10kg固定渣中加入100L质量浓度为1％的氢氧化钾溶液，微波炉加热至90℃，用200目滤布过滤分离出滤液和滤渣，将滤渣洗至中性并甩干水份；按滤渣∶脱盐剂＝1∶15的质量比，在滤渣中加入浓度为2mol/L的盐酸液，室温下反应100分钟脱除无机盐，用200目滤布过滤得滤液和滤渣，滤渣经水洗至中性后，干燥，得提取的琵琶甲甲壳素，甲壳素中灰分含量0.12％，氮含量6.7％，收率13.5％。
实施例3
A、将市购的琵琶甲用常规烘干机烘干水分后，粉碎至过40目筛，按琵琶甲粉∶脱脂溶剂＝1∶4的质量/体积比，在10kg琵琶甲粉中加入40L 6号溶剂油，搅拌混匀，室温下静置脱脂22小时，过滤分离得滤液和脱脂滤渣，滤液在温度为30℃、真空度为0.1MP条件下浓缩回收6号溶剂油，得6号溶剂油提取物，得率为4.84％；脱脂滤渣于室温下自然晾干；
B、在上述A步骤的脱脂滤渣中，按脱脂滤渣∶溶剂＝1∶4的质量/体积比，在10kg滤渣中加入40L乙酸异丙酯，搅拌混匀，室温下浸渍18小时后过滤得滤液和滤渣，在滤渣中再加入相同质量/体积比的乙酸异丙酯，搅拌混匀，室温下浸渍18小时后过滤得滤液和滤渣，如此重复浸提3次，合并3次滤液，浓缩回收乙酸异丙酯后，得提取的琵琶甲乙酸异丙酯提取抑菌物，得率为2.87％；滤渣于室温下自然晾干；
C、在上述B步骤的滤渣中，按滤渣∶水＝1∶7的质量比，在10kg滤渣中加蒸馏水70kg，室温下超声波提取1小时，用200目滤布过滤得滤液和滤渣，滤液真空浓缩、干燥，得提取的琵琶甲水提抑菌物，得率为26.8％；滤渣于室温下自然晾干；
D、在上述C步骤的滤渣中，按滤渣∶水＝1∶10的质量比，在10kg滤渣中加入100L水，70℃温度下，超声波提取1小时，离心分离出液体和固体，在固体中加水至没过固体，重复在70℃温度下，超声波提取1小时，离心分离出液体和固体渣，如此提取3次，合并3次液体，用分子量为5000的中空纤维超滤膜过滤去除小分子物质，再真空浓缩至原体积的1/10，离心去除不溶物，得浓缩液；
E、在上述D步骤的浓缩液中，按浓缩液∶乙醇＝1∶4.5的体积比，在10L浓缩液中加入45L质量浓度为95％的乙醇静置23小时，以沉淀多糖，之后离心分离得液体和沉淀物，在液体中重复加入相同量的乙醇再次沉淀，如此反复沉淀三次，得液体和沉淀物；在沉淀物中，按沉淀物∶水＝1∶3.5的质量比加水溶解，离心分离去除不溶物得液体；合并各次液体，经浓缩、干燥后，得提取的琵琶甲水溶性多糖，得率3.8％；
F、在D步骤分离出的固体渣中，按固体渣∶溶剂＝1∶7的质量/体积比，在10kg固定渣中加入70L质量浓度为10％的氢氧化钠溶液，微波炉加热至70℃，用200目滤布过滤分离出滤液和滤渣，将滤渣洗至中性并甩干水份；按滤渣∶脱盐剂＝1∶13的质量比，在滤渣中加入浓度为1mol/L的盐酸溶液，室温下反应50分钟脱除无机盐，用200目滤布过滤得滤液和滤渣，滤渣经水洗至中性后，干燥，得提取的琵琶甲甲壳素，甲壳素中灰分含量0.18％，氮含量6.9％，收率15.6％。
采用滤纸片法对实验例1的乙酸乙酯及水提取物质进行抑菌能力测定，所用指示菌为：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonase aeruginose)、藤黄球菌(Micrococcus luteus)、大肠杆菌(Eseheriehia coli)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、面包酵母(Saccharomyces)、微紫青霉(Penicillium janthinellum)；培养基为营养肉汁培养基、PDA培养基以及酵母菌培养基；结果如表1。
表中：“++++”表示抑菌效果很好，抑菌圈在25mm以上，“+++”表示抑菌效果较好，抑菌圈在15mm以上，“++”表示抑菌效果一般，抑菌圈在5mm以上，“+”表示抑菌效果不好，抑菌圈小于5mm，“-”表示没有抑菌效果，没有抑菌圈。
可见琵琶甲乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄球菌效果较好，对绿脓杆菌、大肠杆菌的抑制效果略差，对真菌基本没有抑制能力；琵琶甲水提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄球菌有一定抑制效果，对其它则没有效果。
表1 乙酸乙酯和水提取物质抑菌能力测定结果
用本发明实验例2提取的水溶性琵琶甲多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠免疫功能的调节能力的实验。采用腹腔注射环磷酰胺(Cy)诱导免疫低下小鼠模型，观察水溶性琵琶甲多糖对模型小鼠单核-巨噬细胞系统炭粒廓清能力的影响，阳性对照药为匹多莫德。
设低、高两个剂量组，分别按各相关剂量口服给与各粗多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬功能测定结果如表2所示：
表2 水溶性琵琶甲多糖对Cy诱导免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
注：与正常组相比：△P＜0.05，△△P＜0.01；
与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.01
由结果可知模型组动物炭粒廓清碳指数K低于正常组(P＜0.05)，其吞噬指数α也明显低于正常组(P＜0.01)，表明形成环磷酰胺造成的小鼠免疫低下模型；阳性对照匹多莫德组能明显提高改模型小鼠炭粒廓清指数K(P＜0.05)及吞噬指数α(P＜0.01)；水溶性琵琶甲多糖能不同程度提高改模型小鼠炭粒廓清指数K及吞噬指数α。
水溶性琵琶甲多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠胸腺指数及脾指数结果如表3所示：
表3 水溶性琵琶甲多糖对Cy诱导免疫低下小鼠胸腺及脾指数的影响
注：与正常组相比：△△△P＜0.01
与模型组相比：*P＜0.05
由结果可知模型组动物与正常组动物相比胸腺指数和脾指数明显降低(P＜0.001)；阳性对照与水溶性琵琶甲多糖不能提高小鼠胸腺指数和脾指数。通过实验，可以看出水溶性琵琶甲多糖可提高小鼠非特异免疫功能，但对免疫器官胸腺和脾脏指数无明显改善作用；
用本发明实施例3提取的水溶性琵琶甲多糖以静脉注射考察了其对正常小鼠免疫调节功能。
(1)腹腔巨噬细胞功能测定
表4 水溶性琵琶甲多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
注：*与对照组比较差异有显著性意义P＜0.05
由表4，水溶性琵琶甲多糖能使小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数大幅度升高，且低、中、高三个剂量组的吞噬指数和吞噬百分率与对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05)，说明水溶性琵琶甲多糖对小鼠体内腹腔巨噬细胞吞噬功能有一定的增强作用。
(2)免疫脏器重量测定
表5 水溶性琵琶甲多糖对小鼠免疫脏器重量的影响
注：*与对照组比较差异有显著性意义P＜0.05 △与低剂量组比较差异有显著性意义P＜0.05 ▼与中剂量组比较差异有显著性意义P＜0.05
由表5可以看出，随着水溶性琵琶甲多糖剂量的提高，小鼠脾脏重量明显增加，当剂量为30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg时，脾指数与对照组与对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05)，而且，高剂量的脾指数与低、中剂量组相比有较大的差距，统计学上有显著性差异，这表明水溶性琵琶甲多糖剂量会明显影响小鼠的脾脏指数。与脾脏不同，胸腺指数随着水溶性多糖剂量增加，依次降低，但是与对照组相比仍有显著性差异(P＜0.05)，且高、低剂量组之间也有显著性差异，剂量效应关系明显。
(3)PHA刺激淋巴细胞转化试验
表6 水溶性琵琶甲多糖对PHA刺激小鼠淋巴细胞转化的影响
注：*与对照组比较差异无显著性意义P＞0.05
由表可知，在接受水溶性琵琶甲多糖低、中、高三个剂量组后，小鼠淋巴细胞的转化率略有升高，但与对照组比较差异无显著性意义(P＞0.05)，所以水溶性琵琶甲多糖在本实验条件下对小鼠淋巴细胞的转化率影响不明显。
(4)血清溶血素测定由试验
表7 水溶性琵琶甲多糖对小鼠溶血素OD值的影响
注：*与对照组比较差异有显著性意义P＜0.05
由表7可知，水溶性琵琶甲多糖高、中、低三个剂量组对小鼠血清溶血素的影响较大，对照组OD值较低，实验组的OD值有了大幅度的提高，与对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05)，由此可知水溶性琵琶甲多糖可以明显增加小鼠溶血素的OD值，因此具有体液免疫功能。
通过观察非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫功能实验，认为本发明提取的水溶性琵琶甲多糖具有增强免疫调节功能。
取本发明实验例4制备的琵琶甲甲壳素样品进行红外检测和X-衍射检测，所用仪器为美国PE公司paragon 1000型红外光谱仪和日本理学D/MAX-3B型X-衍射仪。
本发明制备的琵琶甲甲壳素和甲壳素标样进行红外光谱分析(图1为甲壳素标样，图2本发明制备样品)，根据谱图对照分析，均有相同的特征峰：
(1)3400cm-1，是O-H伸缩振动吸收峰；(2)3270cm-1，是N-H伸缩振动吸收峰；(3)2960cm-1～2879cm-1的三个吸收峰，是C-H伸缩振动吸收峰；(4)分别在1657cm-1、1557cm-1、1315cm-1的吸收峰，分别是酰胺I、II、III谱带，这三个吸收峰是甲壳素的特征吸收峰。(5)1030cm-1～1157cm-1之间的四个吸收峰，是C-O伸缩振动吸收峰；(6)897cm-1，是环伸缩振动吸收峰。
本发明所制备的琵琶甲甲壳素的X-衍射图谱和标样甲壳素的X-衍射图谱(图3)进行比较，甲壳素标样在2θ＝9.28°和2θ＝19.11°处有衍射峰，本发明制备的琵琶甲甲壳素在2θ＝9.04°～9.25°和2θ＝19.05°～19.21°之间有也有明显的甲壳素的结晶特征峰，是一种晶体化合物。
本发明制备的琵琶甲甲壳素的红外光谱、X-射线衍射图谱和甲壳素标样的红外光谱、X-射线衍射图谱基本相同，两者结构一致，结构属于同一种物质。
Claims (2)
1.一种提取琵琶甲中抑菌物质、水溶性多糖及甲壳素的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、按琵琶甲∶脱脂溶剂＝1∶2～6的质量比，在琵琶甲中加入脱脂溶剂，所述脱脂溶剂为石油醚，或者正己烷，或者6号溶剂油中的一种，搅拌混匀，室温下静置脱脂18～26小时，过滤分离得滤液和脱脂滤渣，滤液在温度为25～40℃、真空度为0.1MP条件下，浓缩回收脱脂溶剂后得提取物；脱脂滤渣于室温下自然晾干；
B、在上述脱脂滤渣中，按脱脂滤渣∶溶剂＝1∶2～6的质量比加入溶剂，所述溶剂为乙酸乙酯，或者乙酸甲酯，或者乙酸异丙酯中的一种，搅拌混匀，室温下浸渍12～24小时后过滤得滤液和滤渣，在滤渣中再加入相同质量比的溶剂，搅拌混匀，室温下浸渍12～24小时后过滤得滤液和滤渣，如此重复浸提至少3次，合并滤液，浓缩回收溶剂后，得提取的琵琶甲抑菌物；滤渣于室温下自然晾干；
C、在上述B步骤的滤渣中，按滤渣∶水＝1∶4～10的质量比加水，室温下超声波提取1小时，过滤得滤液和滤渣，滤液浓缩、干燥后得提取的琵琶甲水提抑菌物；滤渣于室温下自然晾干；
D、在上述C步骤的滤渣中，按滤渣∶水＝1∶4～20的质量比加水，50～100℃温度下，超声波提取0.5～2小时，离心分离出液体和固体渣，在固体渣中加水至没过固体渣，重复在50～100℃温度下，超声波提取0.5～2小时，离心分离出液体和固体渣，如此重复提取2～4次，合并各次液体，经过滤后，将滤液浓缩至原体积的1/10，得浓缩液；
E、在上述D步骤的浓缩液中，按浓缩液∶乙醇＝1∶4～5的体积比加入质量浓度为95％的乙醇静置20～26小时，以沉淀多糖，离心分离得液体和沉淀物，在液体中重复加入相同量的乙醇再次沉淀，如此反复沉淀三次，得液体和沉淀物；在沉淀物中，按沉淀物∶水＝1∶2～5的质量比加水溶解，离心分离去除不溶物得液体；合并各次液体，经浓缩、干燥后，得提取的琵琶甲水溶性多糖；
F、在D步骤分离出的固体渣中，按固体渣∶溶剂＝1∶5～10的质量比加入质量浓度为1～15％的溶剂，所述溶剂为氢氧化钠或者氢氧化钾溶液中的一种，加热至50～90℃温度，过滤分离出滤液和滤渣，滤渣经水洗至中性后甩干水份，按滤渣∶脱盐剂＝1∶10～15的质量比，在滤渣中加入浓度为0.1～2mol/L的盐酸溶液，室温下反应5～100分钟脱除无机盐，过滤得滤液和滤渣，滤渣经水洗至中性后，干燥，得提取的琵琶甲甲壳素。
2.如权利要求1所述的提取琵琶甲中抑菌物质、水溶性多糖及甲壳素的方法，其特征在于所述A步骤中的琵琶甲预先粉碎至过40目筛，以便加速提取，并提高得率。
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