CN114410711A - 一种纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法 - Google Patents

一种纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及淀粉改性技术领域，具体的是一种纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法。一种纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：(1)纳米淀粉(Nano starch)的制备；(2)磺化纳米淀粉(SN‑starch)的制备；(3)硒氢化钠(NaSeH)储备液的制备；(4)将步骤(2)制备的SN‑starch加入无水乙醇和去离子水的混合溶剂体系中，并将上述NaSeH储备液在氮气保护下，加入到SN‑starch乳液中，然后在适宜的温度条件下反应一定时间，反应结束后洗涤，冷冻干燥，制得硒化纳米淀粉(Se‑SN‑starch)样品。本发明的Se‑SN‑starch表现出与类似谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)明显的抗氧化催化活力优势，使其在富硒功能食品开发领域的应用更具潜力，不仅可以扩大改性淀粉的应用范围，而且可以为抗氧化的食品和药物提供新的功能材料。

Description

一种纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法
技术领域
本发明涉及淀粉改性技术领域，具体的是一种纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法。
背景技术
谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是一种含硒酶，可清除人体内过量的自由基，维持体内活性氧代谢平衡。GPx的开发应用对抑制和治疗氧化性疾病具有重要意义。然而，天然GPx具有如来源有限、稳定性低、提取成本高、产量低等缺点，使其应用受到较大限制。构建GPx人工模拟物，并研究相关的催化行为及机制，是解决上述天然GPx存在问题主要手段。
淀粉作为一种典型的可生物降解的天然多糖，通过纳米技术工艺生产的淀粉纳米颗粒对人类健康无害受到更多关注。纳米淀粉是一种由淀粉通过物理或化学方法制备的尺寸为50-200nm的淀粉纳米颗粒。纳米淀粉由于其丰富性和功能性能，特别是它们的可再生性、生物相容性、低密度和高生物降解性而具有重要的经济意义。与无机纳米粒子相比，还表现出高比表面积、形态多样和高比强度。另一个优点是其表面含有丰富的羟基，这有助于形成良好的化学性质，并使它们为衍生化和掺入做好准备的功能特性。由于这些优点，纳米淀粉在制备纳米复合材料方面具有巨大的应用潜力，这方面引起了广泛关注。此外，并用于生物医学设备、污染净化、乳液、生物传感器和生物标志物。
富硒淀粉能够有效地模拟谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的抗氧化催化活性，其催化活力是经典小分子抗氧化硒酶(二苯基二硒，PhSeSePh)的1.53×105倍。富硒淀粉的合成制备能够为开发富硒功能产品提供了新技术。但是富硒淀粉基本保持原淀粉的结构，颗粒比较大。同时，淀粉颗粒的不同形状和尺寸分布对食品的许多方面产生重要影响，包括最终产品的味道、质地、外观和功能等感官特征。颗粒的包封和释放特性以及颗粒的生物活性也受颗粒大小的影响很大。
与富硒淀粉相比，纳米淀粉的特征功能特性主要归因于具有更大的表面积与质量比。能使其负载更多的含有生物活性物质，并通过功能性食品进行递送和靶向生物活性，同时富硒淀粉属于微米级颗粒，使其在食品药物在体内吸收以及传输等方面具有一定的应用局限性。纳米淀粉具有较大的表面积，可以负载更多的活性中心，同时纳米尺度的优势可以弥补传统淀粉在应用上的缺陷，拓展应用范围。纳米淀粉对人类健康无害，使其在食品药品以及化妆品方面受到广泛的关注。
淀粉内部结晶区和无定形区构成了淀粉结构，以天然淀粉为原料制备纳米淀粉，一般可以分为淀粉纳米晶和淀粉纳米颗粒两种。淀粉纳米晶是通过一定的物理和化学方法获得的淀粉结晶部分，而淀粉纳米颗粒属于无定形部分。纳米淀粉的制备方法通常为水解法，再生法和机械法，水解法常用于制备纳米晶，而其他两种方法常用于制备及含有晶体结构又含有非晶体结构的纳米颗粒。
发明内容
为了克服现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法。
本发明所提供的技术方案是：
一种纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)先将木薯淀粉乳液沸水浴中进行糊化，加入普鲁兰酶在60℃下酶解6h，酶解结束后将上清液放在4℃条件下储存12h，然后进行洗涤和冷冻干燥，制备得到纳米淀粉(Nanostarch)；
(2)再将纳米淀粉分散于NaOH溶液中，滴加对甲苯磺酰氯(p-TsCl)的乙腈溶液，在40℃条件下反应6小时，反应过程中过程中使体系pH>12.5，然后用乙醇和去离子水交替洗涤至中性，冻干，制得磺化纳米淀粉(SN-starch)；
(3)将硒和硼氢化钠(NaBH4)在氮气保护氛围下，加入50mL的除氧的去离子水，室温条件下，制得硒氢化钠(NaSeH)储备液；
(4)将步骤(2)制备的SN-starch均匀分散在无水乙醇溶液中，得到SN-starch浆液，然后将上述NaSeH储备液在氮气保护下加入到SN-starch乳液中，然后在温度20-80℃下反应2-14小时，反应结束后，在氮气氛围下过滤，洗涤，在-55℃下冷冻干燥24h，制得硒化纳米淀粉(Se-SN-starch)样品。
作为优选，步骤(1)中普鲁兰酶的酶活与淀粉质量比为50U/g。
作为优选，步骤(2)中NaOH的浓度为0.15M。
作为优选，步骤(2)中对甲苯磺酰氯与乙腈溶液的质量体积比为3g/10mL。
作为优选，步骤(4)中无水乙醇溶液中无水乙醇与去离子的体积比分别为9-3:1-7。
作为优选，步骤(4)中无水乙醇溶液中无水乙醇与去离子的体积比分别为7:3。
作为优选，步骤(4)中所述的NaSeH储备液中NaSeH与Ts的摩尔比为2-14:1。
作为优选，步骤(4)中NaSeH储备液中NaSeH与Ts的摩尔比为10:1。
作为优选，步骤(4)中反应时间10小时。
作为优选，步骤(4)中反应温度60℃。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
(1)本发明制备的Se-SN-starch在同样的测定条件下最高催化活力是经典小分子仿生GPx(二苯基二硒，PhSeSePh)的4.18×105倍，与已报道的硒化淀粉(Se-starch)相比，Se-SN-starch的最高催化活力是其最高催化活力的2.73倍。Se-SN-starch表现出明显的抗氧化催化活力优势，使其在富硒功能产品开发领域的应用更具潜力。
(2)本发明制备的Se-SN-starch纳米尺度的优势可以弥补传统淀粉在应用上的缺陷，拓展应用范围。纳米淀粉对人类健康无害，使其在食品药品以及化妆品方面受到广泛的关注。不仅可以扩大改性淀粉的应用范围，而且可以为抗氧化的食品和药物提供新的功能材料。
附图说明
图1为纳米硒化淀粉的制备路线；
图2为改变反应时间(A)、反应温度(B)、NaSeH与对甲苯磺酰基(Ts)的摩尔比(C)和乙醇体积比例(D)制备Se-SN-starch的硒含量变化图；
图3为Se-SN-starch、SN-starch、Nano starch、Cassava starch的红外谱线图；
图4为Se-SN-starch、SN-starch、Nano starch、Cassava starch的XRD图；
图5为Nano starch(A)、SN-starch(B)、Se-SN-starch(C)的粒径分布图；
图6为Nano starch(A)、SN-starch(B)、Se-SN-starch(C)的SEM图；
图7.为固定TNB为150μM，改变系列浓度CUOOH(A)和H2O2(B)时Se-SN-starch的催化速率；固定NBT的浓度为150μM，改变系列浓度CUOOH(C)和H2O2(D)时Se-SN-starch的催化速率；
图8以ArSH(TNB，NBT)和ROOH(CUOOH，H2O2)为底物测定Se-SN-starch的GPx催化活力。
具体实施方式
下面结合具体例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：
一种纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：
第一步，木薯淀粉乳液沸水浴中进行糊化，加入普鲁兰酶(酶活与淀粉质量比为50U/g)在60℃下酶解6h，酶解结束后将上清液放在4℃条件下储存12h，然后进行洗涤和冷冻干燥制备纳米淀粉。
第二步，纳米淀粉溶于NaOH(0.15M)溶液中，滴加对甲苯磺酰氯(p-TsCl)的乙腈溶液(3g/10mL)，在40℃条件下反应6小时，反应过程中过程中使体系pH>12.5，然后用乙醇和去离子交替洗涤至中性，冻干制得SN-starch。
第三步，硒和硼氢化钠在氮气保护氛围下，加入50mL的除氧的去离子水，室温条件下制得硒氢化钠(NaSeH)储备液。
第四步，SN-starch加入50mL无水乙醇和水的混合溶剂体系中，将上述NaSeH储备液在氮气保护下，加入到SN-starch乳液中，然后在60℃条件下反应10小时，反应结束后洗涤，冷冻干燥制得Se-SN-starch样品。
具体可参见图1，图1为纳米硒化淀粉的制备路线。
图2为改变反应时间(A)、反应温度(B)、NaSeH与对甲苯磺酰基(Ts)的摩尔比(C)和乙醇体积比例(D)制备Se-SN-starch的硒含量变化图。
如图2所示，改变反应时间(A)、反应温度(B)、NaSeH与对甲苯磺酰基的摩尔比(C)和乙醇体积比例(D)各因素对Se-ca-starch的硒含量均影响较大。申请人对上述几种影响因素进行了详细的研究，具体如下：
首先，在乙醇体积比例为50％，NaSeH与对甲苯磺酰基(Ts)的摩尔比为6:1倍，反应温度为40℃，时间设定为2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h的体系下进行硒化改性反应，测定改性淀粉的硒含量结果如图2A所示。
在10h内，随着反应时间的延长，硒化淀粉的硒含量逐渐增大。而当反应时间超过10h后，淀粉的硒含量逐渐降低，可能是反应时间过长引起淀粉和Ts之间发生的可逆反应，进而使其硒含量降低，因此，NaSeH与SN-starch的优化反应时间为10h。
其次，设定反应时间为6h，乙醇体积比例为50％，NaSeH与对甲苯磺酰基的摩尔比为6:1倍，反应温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的反应体系下进行硒化亲核取代反应，硒含量的测定结果如图2B所示。
当反应温度从20℃增加到60℃时，淀粉的硒含量是随着温度的升高而增大，主要是因为当温度升高时，反应体系中的硒氢化钠等分子与磺化淀粉酯的碰撞次数增加，体系反应活性增大，进而使淀粉中的硒含量增大。然而，硒含量随着温度的进一步升高而降低了。对这些结果的一个可能解释是亲核取代反应在低温下占主导地位，而在高温下淀粉发生糊化覆盖Ts基团导致与NaSeH难以接触。因此，NaSeH与SN-starch的优化反应温度为60℃。
再次，设定反应时间为6h，乙醇比例为50％，反应温度为40℃，硒氢化钠与Ts基团的摩尔比为2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、12:1、14:1的条件下进行改性反应，测定硒含量的结果如图2C所示。
在NaSeH未超过Ts基团摩尔量的10倍时，随NaSeH用量增加，NaSeH和对Ts基团发生的有效碰撞几率增大，反应效率提高，淀粉中的硒含量增大。而当NaSeH的量超过10倍时，因为NaSeH具有强碱性，强碱作用可能会导致导致淀粉中磺酰基的水解反应发生，从而使淀粉的硒含量减少。因此，NaSeH与Ts基团的优化摩尔比为10:1。
最后，设定反应时间为6h，温度为40℃，硒氢化钠与双键的摩尔比为6:1倍，乙醇/水体系中的体积比例分别为30％、40％、50％、60％与70％、80％、90％的条件下进行改性反应，测定的硒含量结果如图2D所示。
在乙醇比例低于70％时，随着乙醇量的增加，淀粉的硒含量增加；而在乙醇比例高于70％时，随着乙醇量的增大，淀粉的硒含量逐渐降低，这可能是因为在乙醇比例由小增大到70％的过程中，反应体系的极性逐渐变小，对辛烯基琥珀酸酐的溶解性增大，有利于亲核反应的发生。但是，当乙醇比例大于70％时，反应体系极性进一步减小，不利于亲核取代反应的发生，而且乙醇过多会导致淀粉表面自由度较高的淀粉分子链段再聚集，进而降低亲核反应的效率，导致硒化淀粉的硒含量呈现下降趋势。因此，乙醇的优化用量为体积比70％。
图3为Se-SN-starch、SN-starch、Nano starch、starch的红外谱线图，是合成过程中的红外谱图，表示其合成过程中官能团的变化。
由图3可知，与淀粉相比，纳米淀粉的官能团结构未发生明显变化。对甲苯磺酰氯改性后，1174、665、552cm-1处出现了磺酸基-SO3H的特征峰，1598cm-1出现酯基-CO-的特征峰,814cm-1出现苯环-CH-弯曲振动的特征峰,证明在淀粉的葡萄糖环上引人了—SO3H基团，发生了磺化反应。与SN-starch的红外谱相比，Se-SN-starch对甲苯磺酰基等特征官能团在反应体系中消失，说明对甲苯磺酰基作为离去基团消失，受保护的羟基容易与NaSeH发生亲核取代反应，硒成功改性到纳米淀粉骨架上，与Se-SN-starch硒含量测试结果相一致。Se-SN-starch与纳米淀粉相比具有相同的结构，表明改性过程淀粉具有纳米结构稳定性。
图4为Se-SN-starch、SN-starch、Nano starch、starch的XRD谱线图，表示其合成过程中晶体结构的变化。
X射线衍射技术是一种重要的结构测试手段，可以检测淀粉样品的晶体结构变化，进而分析淀粉样品的结构稳定性变化。木薯淀粉、Nano starch、SN-starch和Se-SN-starch的X射线衍射图谱如图4所示。所有淀粉样品的XRD图像由峰值衍射和散射衍射组成，表明淀粉样品颗粒由非结晶区和晶区两部分构成。木薯淀粉样品均显示出典型的A型衍射图谱，即在15、17、18和23°处具有衍射峰。Nano starch的衍射峰位于5.6、17、19、22和24°处，显示出典型的B型晶体结构。这与木薯淀粉不同，这由于较短的淀粉分子链在低温下重新结合，促进了B型微晶堆积。Nano starch样品相较于木薯淀粉结晶度有所提高(46.5％)，木薯淀粉在通过糊化和普鲁兰酶脱支后，形成双螺旋链而重新缔合，在重结晶条件下聚集成有序的不同形态。SN-starch和Se-SN-starch只在17和22°处出现衍射峰，这是由于磺酰化反应和硒化反应都在强碱性的条件下进行，NaOH通过孔隙渗入Nano-starch内部破坏了晶型结构，从而导致结晶度降低。
图5为Se-SN-starch合成过程中的扫描电镜图。
富硒木薯淀粉(A)、Nano starch(B)、SN-starch(C)和Se-SN-starch(D)的SEM图像如图5所示。粒径在3-10μm范围内的富硒木薯淀粉显示出具有球状或半球形结构。观察到Nano starch呈球形，颗粒大小主要在300～400nm范围内，一般以聚集形式存在。淀粉分子间的羟基容易形成氢键，冷冻干燥过程中，水分会发生升华，进而颗粒会收缩，在氢键作用下容易发生聚集。SEM图像上，SN-starch的颗粒变大，颗粒的直径为400～500nm范围内，这是由于相邻的纳米颗粒通过疏水的Ts基团聚集形成聚集体，进而形成较大的纳米颗粒。Se-SN-starch颗粒粘连更严重，颗粒增大。同时，碱性的反应环境使Se-SN-starch颗粒的形状发生了改变。图6为Se-SN-starch合成过程中的粒径分布图。
通过动态光散射测定的粒径分布如图6所示，Nano starch、SN-starch和Se-SN-starch的平均粒径分别为为413nm、578nm和862nm。通过动态光散射观察到的粒径一般大于SEM观察到的粒径，动态光散射法得到的纳米粒径反映了纳米粒子在水溶液中的水合直径，而SEM观察到的是干燥纳米粒子的直径。SEM形貌及粒径分布表明改性过程中形成特殊的纳米结构。
如图7所示，固定苯硫酚底物TNB或NBT的浓度为150μM，改变过氧化物底物CUOOH或H2O2的浓度，记录TNB或NBT吸光值的变化量计算催化速率v0。
可见，当四种不同底物组合TNB+CUOOH、TNB+H2O2、NBT+CUOOH、NBT+H2O2进行催化活力测定时，催化活力均是先增加最后达到平衡，Se-SN-starch均能表现出与天然GPx类似的典型饱和动力学催化行为。
对评价天然GPx和仿生GPx的抗氧化活性而言，常用的评价方法是基于Hilvert教授报道及相关改进方法的直接测定方法，能够更加方便有效的评价仿生材料GPx的抗氧化催化活力。同样，本研究借鉴该方法评价Se-SN-starch的抗氧化活性。
如图示8所示，Se-SN-starch的抗氧化催化速率是以苯硫酚类底物和过氧化物类底物为双底物进行测定的。苯硫酚类底物有3-羧基-4-硝基苯硫酚(TNB)和4-硝基苯硫酚(NBT)两种，其中，TNB比NBT多一个羧基，TNB形成氢键能力较强，NBT疏水性更强；过氧化物类底物有枯烯过氧化氢(CUOOH)和双氧水(H2O2)两种，其中，CUOOH比H2O2多一个对异丙苯基，H2O2形成氢键能力较强，CUOOH疏水性更强。
选用TNB+CUOOH、TNB+H2O2、NBT+CUOOH、NBT+H2O2四个体系测定的催化活力见表1。
表1.pH 7.0(50mM PBS)条件下Se-SN-starch催化苯硫酚(ArSH，150μM)还原过氧化物(ROOH，250μM)的催化速率(v0)
Figure BDA0003487560350000091
由表1可知，Se-SN-starch在同样的测定条件下最高催化活力是经典小分子仿生GPx(PhSeSePh)的4.18×105倍，与已报道的硒化淀粉(Se-starch)相比，Se-SN-starch的最高催化活力是其最高催化活力的2.73倍。结果表明，Se-SN-starch的纳米结构有利于负载更多的活性中心发挥更高的抗氧化催化活性。Se-SN-starch在TNB+CUOOH、TNB+H2O2、NBT+CUOOH、NBT+H2O2四个体系中都呈现出类似天然GPx的的饱和动力学特征，Se-SN-starch表现出明显的催化活力优势，使其在富硒功能食品开发领域的应用更具潜力。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)先将木薯淀粉乳液沸水浴中进行糊化，加入普鲁兰酶在60℃下酶解6h，酶解结束后将上清液放在4℃条件下储存12h，然后进行洗涤和冷冻干燥，制备得到纳米淀粉(Nanostarch)；
(2)再将纳米淀粉分散于NaOH溶液中，滴加对甲苯磺酰氯(p-TsCl)的乙腈溶液，在40℃条件下反应6小时，反应过程中过程中使体系pH>12.5，然后用乙醇和去离子水交替洗涤至中性，冻干，制得磺化纳米淀粉(SN-starch)；
(3)将硒和硼氢化钠(NaBH4)在氮气保护氛围下，加入50mL的除氧的去离子水，室温条件下，制得硒氢化钠(NaSeH)储备液；
(4)将步骤(2)制备的SN-starch均匀分散在无水乙醇溶液中，得到SN-starch浆液，然后将上述NaSeH储备液在氮气保护下加入到SN-starch乳液中，然后在温度20-80℃下反应2-14小时，反应结束后，在氮气氛围下过滤，洗涤，在-55℃下冷冻干燥24h，制得硒化纳米淀粉(Se-SN-starch)样品。
2.根据权利要求1所述的纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中普鲁兰酶的酶活与淀粉质量比为50U/g。
3.根据权利要求1所述的纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中NaOH的浓度为0.15M。
4.根据权利要求1所述的纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中对甲苯磺酰氯与乙腈溶液的质量体积比为3g/10mL。
5.根据权利要求1所述的纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中无水乙醇溶液中无水乙醇与去离子的体积比分别为9-3:1-7。
6.根据权利要求5所述的纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中无水乙醇溶液中无水乙醇与去离子的体积比分别为7:3。
7.根据权利要求1所述的纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的NaSeH储备液中NaSeH与Ts的摩尔比为2-14:1。
8.根据权利要求7所述的纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中NaSeH储备液中NaSeH与Ts的摩尔比为10:1。
9.根据权利要求1所述的纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中反应时间10小时。
10.根据权利要求11所述的纳米淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中反应温度60℃。
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