CN105797131A - 硒肽纳米自乳化粉剂、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种硒肽纳米自乳化粉剂、其制备方法及应用。在一个较为典型的实施方案中，所述制备方法包括：采用内源性的大豆分离蛋白作为双亲性非离子型表面活性剂，刺激性小的中链甘油三酯作为自乳化体系的油相，硒多糖通过美拉德反应与多肽进行结合作为生物活性成分，成乳后冻干，制成所述硒肽纳米自乳化粉剂。本发明的硒肽纳米自乳化粉剂具有优异生物相容性及生物利用度，复溶性好，便于储存及食用，且其制备工艺简单、质量稳定，适合批量化生产。

Description

硒肽纳米自乳化粉剂、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种自乳化制剂，特别涉及一种硒肽纳米自乳化粉剂的制备和应用，属于食品制剂领域。
背景技术
硒是人体必需的微量元素，某些疾病如癌症、肿瘤、心血管疾病等都与体内缺硒有关，但硒不能由机体自主合成，只能从体外摄取。硒在体内的主要功能形式为30余种硒蛋白，是谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GPX)家族、硫氧还原蛋白还原酶(thioredoxinreductase,TR)家族、碘甲腺原氨酸脱碘酶(iodothyroninedeiodinase,ID)家族等的重要组成部分。硒蛋白具有抗氧化、调节免疫力、防治肿瘤、清除自由基等生理作用。无机硒化合物毒性大,半数致死量LD50通常在1.0mg/kg左右，大大限制了硒的应用。硒多糖是硒与多糖结合的一种有机化合物，兼有硒和多糖的活性，生物活性普遍高于多糖和硒，自然界中尤其是在植物中普遍存在，如大蒜硒多糖的生物活性明显优于多糖或亚硒酸钠，且易被机体吸收和利用。
人体内的许多活性物质都是以多肽的形式存在的，多肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内的相关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制DNA转录或影响特异的蛋白质合成，最终产生特定的生理效应。此外，多肽也是涉及人体内多种细胞功能的重要物质，多肽可以参与细胞的合成并调节细胞的功能活动；多肽在人体内作为神经递质传递信息，也可以作为运输工具，将人体摄取的各种营养物质与各种维生素、生物素、钙以及对人体有益的微量元素输送到人体的各个细胞、器官和组织。
纳米食品目前还没有确切的定义，它是生命技术与生物技术的最前沿分支，综合了多门最前沿科学技术的发展。纳米食品旨在通过对人类可食的天然物、合成物、生物生成物等原料进行分子、原子工程技术改造。食品经超微细加工后，某些结构会发生改变，使得其力学、热学、光学、磁性、化学性质发生显著改变，因而具有优异的表面效应、小尺寸效应和量子效应。用于食品包装的纳米复合高分子材料的微观结构不同于一般材料，其微观结构排列紧密有序，优越的性能体现在它的低透氧率、低透湿率、阻隔二氧化碳和具有抗菌表面等特性，大大提高吸收率，加快营养成分在体内的运输，可以实现食品的保质、保鲜、保味，并延长食品贮藏时间。
自乳化是将油、表面活性剂、助表面活性剂等在环境温度(通常为人体的平均温度37℃)及温和搅拌的条件混合在一起，加入水相进行稀释后自发形成一种水包油型的均一液体。自微乳化制剂通过消化道进入体内，在胃肠道的轻微蠕动下，可在胃肠液中自发形成粒径范围在100～500nm，甚至小于50nm的水包油型乳剂或微乳，内容物以易溶解的状态存在的，可以快速的分布于整个胃肠道中，减少了体系中的内容物与胃肠壁的直接接触引起的刺激。
目前常见的自乳化制剂在室温下大多呈液态，不利于储存及运输，使用时被包装在软胶囊或硬胶囊中，因而使生产过程复杂化、成本高、制剂成分易与胶囊壳相容、长期储存还可能发生胶囊泄露，并且还存在剂型单一的缺点。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种硒肽纳米自乳化粉剂、其制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例中提供了一种硒肽纳米自乳化粉剂的制备方法，其包括：
(1)配置原料，所述原料包括0.45～1.1重量份的硒多糖、0.45～1.1重量份的多肽、25～53重量份的油相、44～50重量份的表面活性剂和1.3～2.0重量份的助表面活性剂，其中所述表面活性剂选用大豆分离蛋白；
(2)将所述表面活性剂热变性后的水溶液稀释至浓度为2wt％～5wt％；
(3)将所述多肽与所述硒多糖于超纯水中均匀混合，调节形成的混合物至弱碱性，反应温度为60℃～90℃，并加入适用于美拉德反应的催化剂，回流反应3h～5h，之后转移至8k～14kDa的透析袋并于超纯水氛围中透析；
(4)将步骤(3)最终所获溶液与所述油相及助表面活性剂均匀混合，超声成乳；
(5)将步骤(2)最终所获溶液调节至弱碱性，并在40℃-60℃持续搅拌30min以上，之后缓慢加入步骤(4)制得的油包水初乳液，其后混合均匀，并以800～1200bar的压力下高压均质，获得水包油包水乳液；
(6)将步骤(5)所获的水包油包水乳液冷冻干燥，所得固体粉末即所述硒肽纳米自乳化粉剂。
进一步的，所述硒多糖可优选但不限于海藻硒多糖。
进一步的，所述多肽可优选但不限于大豆蛋白肽。
进一步的，所述油相可优选自中链甘油三酯，例如可以为辛酸癸酸甘油三酯，但不限于此。
进一步的，所述助表面活性剂可优选自但不限于PEG2000和油酸钠中的任意一种或两种的组合。
进一步的，所述原料还可包含0～0.5重量份的交联剂。
进一步的，所述交联剂可选用但不限于氯化钙。
进一步的，所述适于美拉德反应的催化剂可选用但不限于氯化铁。
在一较为优选的实施方案中，步骤(4)中超声成乳的条件包括：超声功率为300～600W，超声时间为5～15min。
在一较为优选的实施方案中，步骤(6)包括：向所述的水包油包水乳液中加入葡萄糖，至形成的混合物中包含5wt％～10wt％葡萄糖，之后于-20℃至-80℃的超低温条件下，例如温度为-80℃冰箱中预冻，再冷冻干燥，收获的固体粉末即为所述硒肽纳米自乳化粉剂。
本发明实施例还提供了一种利用前述方法制备的硒肽纳米自乳化粉剂。
进一步的，所述硒肽纳米自乳化粉剂的PDI(Polydispersityindex，多分散性指数)小于0.19，分散于水形成的微乳的平均粒径为100～300nm。
进一步的，所述硒肽纳米自乳化粉剂在温和的环境中(一般即体温37℃左右)搅拌的条件混合在一起，加入水相进行稀释后自发形成一种水包油型均一乳液。
进一步的，所述硒肽纳米自乳化粉剂复溶于水，口服经由消化道到达胃肠道时，易于通过胃肠壁水化层，能够保护油相中包覆的硒多糖免于胃液的侵蚀，在小肠液中快速释放。
本发明实施例还提供了所述硒肽纳米自乳化粉剂的用途。
例如，本发明实施例提供了由所述的硒肽纳米自乳化粉剂分散于水相体系中自发形成的水包油型均一乳液。
例如，本发明实施例提供了一种制剂，包含所述的硒肽纳米自乳化粉剂，所述制剂的形态包括粉剂、片剂或胶囊。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
(1)提供的硒肽纳米自乳化粉剂具有理化性质稳定、生物利用度高等特点，当以水稀释后，可自发形成粒径在100-300nm的微乳，大大提高了硒多糖的溶出速度及其在水溶液氛围中的稳定性，口服后经消化道弥散至胃部时，水相中的大豆分离蛋白能够被胃蛋白酶消化，而油相能保证内部的硒多糖免于胃液的侵蚀，继而，在弱碱性的小肠液中油相经由胰酶水解释放内容物，硒多糖得以更多的被小肠上皮细胞吸收，因而大大提高了其生物利用度。
(2)提供的硒肽纳米自乳化粉剂改善了液体剂型及软胶囊在生产、储存、使用方面的不足，显著提高了硒元素及多肽的口服生物利用度、且制备工艺简单易行，为工业化生产提供了可行性途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中空载纳米乳(2.5wt％油相比例，2wt％SPI热分解液)的粒径测试图。
图2为本发明实施例1中荷载硒肽MRPSs的纳米乳(2.5wt％油相比例，2wt％SPI热分解液)的粒径测试图。
图3为本发明实施例1中荷载硒肽MRPSs的纳米乳(2.5wt％油相比例，2wt％SPI热分解液)的透射电镜图。
图4为本发明实施例1中HCT-116与荷载硒肽MRPSs的纳米乳共孵育4h后MTT实验测定的细胞活率测试图。
图5为本发明实施例1中荷载硒肽MRPSs(2.5wt％油相比例，2wt％SPI热分解液)的纳米乳在模拟胃液中的释放曲线图。
图6为本发明实施例1中荷载硒肽MRPSs(2.5wt％油相比例，2wt％SPI热分解液)的纳米乳在模拟小肠液中的释放曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
如前所述，鉴于现有技术的诸多不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。在其中的一些典型的实施方案中，主要是运用固体自乳化系统，以大豆分离蛋白(SPI)热变性溶液作为表面活性剂，对油包水型的硒肽美拉德反应产物(MaillardReactionProducts，MRPs)初乳进行再包载，形成稳定乳液后进行冷冻干燥，形成了硒肽纳米自乳化粉剂(亦可认为是硒肽固体自乳化制剂)，该剂型大大提高了内容物的稳定性，规避了液体制剂在生产、储存及使用方面的不足。
进一步的，本发明的硒肽纳米自乳化粉剂是一种蛋白稳定的硒肽美拉德反应产物的自乳化可溶性冲剂。其显著特征是，该固体自乳化可溶性粉剂预先加水复溶，可自发形成粒径在100-300nm的水包油型负载硒肽美拉德产物的微乳，大大提高了硒多糖的溶出速度及其在水溶液氛围中的稳定性。口服后经消化道弥散至胃部时，水相中的大豆分离蛋白能够被胃蛋白酶消化，而油相能保证内部的硒多糖免于胃液的侵蚀。在弱碱性的小肠液中油相经由胰酶水解释放内容物，硒多糖得以更多的被小肠上皮细胞吸收，因而大大提高了其生物利用度。
本发明的硒肽纳米自乳化粉剂改善了液体剂型及软胶囊在生产、储存、使用方面的不足，显著提高了硒元素及多肽的口服生物利用度、且制备工艺简单易行，为工业化生产提供了可行性途径。
在本发明的一较为具体的实施案例中，一种硒肽纳米自乳化粉剂的原料的主料包括硒多糖和大豆蛋白肽，辅料包括油相、表面活性剂、助表面活性剂和交联剂等，各组分所占的质量百分比(wt％)如下所示：硒多糖0.45％～1.1％；多肽0.45％～1.1％；油相25～53％；表面活性剂44％～50％；助表面活性剂1.3％～2.0％；交联剂0～0.5％。
其中，所述油相可选用LABRAFACLIPOPHILEWL1349(辛酸癸酸甘油三酯)。
其中，所述的表面活性剂可选用SPI。
其中，所述的助表面活性剂可选用PEG2000和油酸钠中的一种或几种。
其中，所述的交联剂可选用氯化钙。
而在该较为具体的实施案例中，一种制备所述硒肽纳米自乳化粉剂的方法包括如下步骤：
(1)表面活性剂储备液的制备：称取适宜量的大豆分离蛋白(SPI)用超纯水稀释至5％～6％(wt％)，磁力搅拌至分散均匀，然后调整溶液至中性，并加热回流使SPI变性失活。
(2)油包水初乳液的制备：
多肽-硒多糖的美拉德反应-水溶液体系，反应底物多肽与硒多糖质量比为1：1或1.1:1，初始时调节体系为弱碱性，控制反应温度为60℃～90℃，加入少许FeCl3作催化剂，回流反应至溶液呈褐色或红褐色，转移至8k～14kDa透析袋并于超纯水的氛围中透析过夜，收集透析袋中的溶液备用。
取质量比为16:1:40的上述多肽与硒多糖的Millard反应产物(MRPs)溶液、PEG2000、LABRAFACLIPOPHILEWL1349涡旋混匀，探头超声成乳。
(3)水包油包水乳液的制备：取步骤(1)中所得的大豆分离蛋白热分解产物母液用超纯水稀释至浓度为2％～5％(wt％)并调节溶液至弱碱性，60℃油浴磁力搅拌30min以上。取40倍～20倍体积于油相用量的上述稀释液，逐滴缓慢滴加步骤(2)中的油包水初乳，磁力搅拌，加毕，在800～1200Bar高压均质成乳。
(4)粉末制剂的制备：将步骤(3)中制得的乳液加2％～5％(wt％)葡萄糖涡旋混匀，先于超低温冰箱中预冻，然后冷冻干燥并收集干燥后的白色或米白色固体粉末，即为所述硒肽纳米自乳化粉剂。
在该较为具体的实施案例中，通过采用大豆分离蛋白(Soyproteinisolate,SPI)作为双亲性非离子型表面活性剂，刺激性小的中链甘油三酯作为自乳化体系的油相，硒多糖通过美拉德反应(MaillardReaction)与多肽进行结合作为生物活性成分，成乳后冻干制成自乳化粉剂便于储存及食用。其中，硒元素具有防癌抗癌、延缓衰老、调节蛋白质合成和生殖功能等生理作用，多肽与人体的生长、发育、免疫调节和新陈代谢等息息相关。
在本发明的制备工艺中，可以通过对油相的种类、油相比例、表面活性剂的浓度以及助表面活性剂的选择与用量等进行调整，可实现对自乳化制剂的稳定性、自乳化时间以及形成纳米微乳的空间尺寸大小实现调控，所制备的硒肽纳米自乳化粉剂质量均一稳定、复溶性好，其可减小大分子通过胃肠道上皮细胞膜时的障碍，易于通过胃肠壁水化层，促进硒多糖的吸收，无任何的胃肠道刺激性。
以下结合附图和实施例对本发明的技术作进一步的解释说明。
实施例1一种硒肽纳米自乳化粉剂的制备工艺包括：
(1)称取4g大豆分离蛋白转移至100mL圆底烧瓶，加入56mL超纯水，于室温条件以200rpm/min的速度磁力搅拌30min，再以浓度为0.1M的NaOH溶液调pH值＝7.0，油浴加热回流，温度达到120℃后恒温30min，冷至室温并静置2h后备用，即大豆分离蛋白热分解产物母液(亦称SPI热分解液)。
(2)取2g多肽加80mL超纯水溶解并调pH值至8.5，再补加水定容至100mL。另取1g硒多糖及10mgFeCl3固体于100mL圆底烧瓶中，加入前述的2wt％、pH值＝8.5的多肽溶液，磁力搅拌、60℃油浴加热，3h后终止反应，反应液颜色呈褐色，反应液转移至8k-14KDa透析袋中并于超纯水氛围中透析过夜，收集透析后的溶液，即MRPs溶液。
(3)取步骤(2)中最终所获MRPs溶液400μL，加入25mg的PEG2000后涡旋混匀至其全溶，之后移取1mLLABRAFACLIPOPHILEWL1349涡旋混匀，300w探针超声5min成稳定乳液。
(4)取步骤(1)中所得的大豆分离蛋白热分解产物母液，用超纯水稀释成2wt％浓度并调节pH值至10.0。取该稀释液40mL磁力搅拌，并于60℃水浴恒温30min，再向其中逐滴缓慢滴加步骤(3)所获乳液，磁力搅拌200rpm/min，加毕，维持搅拌10min，最后加入50μL浓度为4M的CaCl2溶液，高压均质1000bar经20个循环得均一的白色乳液。
(5)粉末制剂的制备：将步骤(4)中制得的乳液加10％(wt)葡萄糖涡旋混匀，先于-80℃冰箱预冻2h，然后冷冻干燥10h，最后收集干燥后的固体粉末，即为所述硒肽纳米自乳化粉剂(亦称荷载硒肽MRPSs的纳米乳)。
对照例1：该对照例1的工艺与实施例1基本相同，但不包含步骤(2)，且在步骤(3)中直接将PEG-2000溶于油相并超声混匀，最终制得空载纳米乳。
请参阅图1-图2所示分别是对照例1所获空载纳米乳和实施例1所获荷载硒肽MRPSs的纳米乳的粒径测试图。
请参阅图3所示是实施例1所获荷载硒肽MRPSs的纳米乳的透射电镜图。
请参阅图4所示是将实施例1所获荷载硒肽MRPSs的纳米乳与HCT-116共孵育4h后，经MTT实验测定的细胞活率。
请参阅图5所示是将实施例1所获荷载硒肽MRPSs的纳米乳在模拟胃液(含1wt％胃蛋白酶和2wt％聚氧乙烯蓖麻油的0.1MHCL/PBS溶液)中的释放曲线。
请参阅图6所示是将实施例1所获荷载硒肽MRPSs的纳米乳在模拟小肠液(含1wt％胰酶和2wt％聚氧乙烯蓖麻油的PBS溶液)中的释放曲线。
可以看到，本发明的硒肽纳米自乳化粉剂可复溶于水，易于通过胃肠壁水化层，且油相中包覆的硒多糖可免于胃液的侵蚀，而在小肠液中快速释放，因此能高效的被人体吸收。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种硒肽纳米自乳化粉剂的制备方法，其特征在于包括：
（1）配置原料，所述原料包括0.45～1.1重量份的硒多糖、0.45～1.1重量份的多肽、25～53重量份的油相、44～50重量份的表面活性剂和1.3～2.0重量份的助表面活性剂，其中所述表面活性剂选用大豆分离蛋白；
（2）将所述表面活性剂热变性后的水溶液稀释至浓度为2wt%~5wt%；
（3）将所述多肽与所述硒多糖于超纯水中均匀混合，且调节形成的混合物至弱碱性，反应温度为60℃~90℃，并加入适用于美拉德反应的催化剂，回流反应3h~5h，之后转移至8k～14kDa的透析袋并于超纯水氛围中透析；
（4）将步骤（3）最终所获溶液与所述油相及助表面活性剂均匀混合，并超声成乳；
（5）将步骤（2）最终所获溶液调节至弱碱性，并在40℃-60℃持续搅拌30min以上，之后缓慢加入步骤（4）制得的油包水初乳液，其后混合均匀，并以800~1200bar的压力下高压均质，获得水包油包水乳液；
（6）将步骤（5）所获的水包油包水乳液冷冻干燥，所得固体粉末即所述硒肽纳米自乳化粉剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述硒多糖包括海藻硒多糖；和/或，所述多肽包括大豆蛋白肽；和/或，所述油相选自中链甘油三酯，所述中链甘油三酯包括辛酸癸酸甘油三酯；和/或，所述助表面活性剂包括PEG2000和油酸钠中的任意一种或两种的组合。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述原料还包含0～0.5重量份的交联剂；所述交联剂包括氯化钙。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述适于美拉德反应的催化剂包括氯化铁。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中超声成乳的条件包括：超声功率300~600W，超声时间为5~15min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）包括：向所述的水包油包水乳液中加入葡萄糖，至形成的混合物中包含5wt%~10wt%葡萄糖，之后于-20℃至-80℃预冻，再冷冻干燥，收集固体粉末即所述硒肽纳米自乳化粉剂。
7.由权利要求1-6中任一项所述方法制备的硒肽纳米自乳化粉剂。
8.如权利要求7所述的硒肽纳米自乳化粉剂，其特征在于：所述硒肽纳米自乳化粉剂的多分散性指数小于0.19，分散于水形成的微乳的平均粒径为100～300nm，对硒肽的包封率在80%以上。
9.由权利要求7-8中任一项所述的硒肽纳米自乳化粉剂分散于水相体系中自发形成水包油型的均一乳液。
10.一种制剂，包含权利要求7-8中任一项所述的硒肽纳米自乳化粉剂，所述制剂的形态包括粉剂、片剂或胶囊。
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