CN104324380A - 一种纳米药物载体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种纳米药物载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米药物载体及其制备方法和应用。本发明的纳米药物载体，是一种介孔二氧化硅复合粒子，包括内核、中层和外层，其中，内核是纳米介孔二氧化硅粒子；中层设置在内核的表面，包括至少一层自组装层，自组装层包含相互结合的刀豆球蛋白A和糖元；外层为转铁蛋白层，设置在中层的表面。本发明采用层层自组装制膜技术，在纳米介孔二氧化硅粒子表面形成至少一层刀豆球蛋白A-糖元自组装层，最后形成以转铁蛋白为外层的超分子层状膜。本发明的纳米药物载体，生物相容性好，制备工艺简单，且具有肿瘤靶向和刺激响应双重特性。

Description

一种纳米药物载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及药物递送系统，具体涉及一种由功能蛋白膜调控的肿瘤靶向及刺激响应型纳米药物载体及其制备方法和应用。
背景技术
开发一种药物能选择性地破坏患病细胞而不影响健康细胞，这一想法最初由诺贝尔奖获得者、化学疗法创始人Paul Ehrlich在20世纪初提出，Ehrlich称其为“魔法子弹”(magic bullets)。在过去的几十年里，研究人员在开发这种具有特定靶向性的理想药物上取得了一定的进展。在药物制剂领域，人们探索并实践着注射、口服、经皮以及眼部、肺部黏膜给药等各种靶向方法，靶向途径不断拓宽。此外，新型靶向给药载体脂质体()等靶向制剂已上市使患者受益。纳米药物载体的出现以及其在细胞和分子生物学上的深入研究为人们开拓了新的视野。基于纳米尺度的药物载体能够通过EPR效应(Enhanced Permeability and Retention)从肿瘤血管中渗出，装载的药物相对于自由的药物分子而言利用度更高。但要要实现智能的药物输送，必须赋予纳米载体其靶向性和响应性，从而避免药物在传输过程是发生降解或提早泄露，使药物特异性地被输送至肿瘤部位，并对其特殊生理环境做出响应，对药物释放的时间和地点进行调控。
但随着研究的逐渐深入，鉴于体内生理环境的复杂性，人们越来越认识到靶向纳米给药系统仍面临着诸多挑战。以往药物载体的设计往往较为简单，难以应对体内复杂的生理环境。只针对体内某一环节，机制较为简单。目前人们已经开始设计更为复杂的自适应型给药系统或智能型给药系统，即通过对给药载体进行多重复合设计，使其能够随时间或体内环境的变化而发生自我调节，或者对外部刺激产生响应，从而顺利通过体内各种生理屏障，实现更好的靶向效果。
正常组织的pH值为7.4，肿瘤细胞由于增殖异常，长期处于缺氧状态，无氧酵解产生乳酸，其组织周边pH值在6.8左右。除此之外，肿瘤细胞中的内涵体和溶酶体中酸性更强，用电子及化学探针等方法测量肿瘤细胞中早期内涵体的pH值在6.0左右，有的甚至低于5.4，而晚期内涵体的pH值一般在5.0左右，有的甚至低于4.0。肿瘤中的这些酸性环境可以作为信号用于触发快速药物释放及细胞器靶向。
纳米介孔二氧化硅由于其生物相容性好、粒径孔径均在纳米尺度可调、高比表面积、良好的溶酶体逃逸能力等特点成为理想的胞内药物运输载体。已有大量研究通过在纳米介孔二氧化硅(MSN)表面引入功能化“纳米盖”，赋予其更好的药物控释和靶向性功能。以纳米介孔二氧化硅为药物载体根据其控释机理可分为两大类，一是通过化学改性对MSN介孔孔道进行羧基、氨基等化学修饰，通过该基团与药物进行共轭连接，利用连接单元对酸性或还原性的微环境的敏感性，从而控制药物释放；二是先将药物装载至介孔孔道中，利用量子点、纳米四氧化三铁、聚电解质、牛血清白蛋白等颗粒或大分子对介孔孔道进行封堵，通过调控该封端剂的开关来调控药物的释放或保留。其中后者由于对药物分子的化学结构、溶解性、电负性等均没有要求，单纯通过物理负载将药物储存在介孔孔道中，能够更好地保留药物的化学结构和活性，因此具有广阔的应用前景。
但是，目前大部分纳米介孔二氧化硅载药体系仍存在不足，限制了其临床应用：1).响应条件不符合肿瘤细胞内生理环境；2).药物在到达肿瘤部位之前的正常生理环境下提前逸散；3).制备过程繁琐，通常需要对纳米盖进行复杂的化学修饰，进而将靶向分子络合至MSN载体表面。
因此，需要构思一种制备更为简便、靶向作用强、响应释放条件符合肿瘤细胞实际生理环境的新型纳米介孔二氧化硅药物控释载体。
发明内容
本发明的目的是针对现有的肿瘤靶向给药系统存在的不足，提供一种新型功能蛋白膜调控的肿瘤靶向及刺激响应型纳米药物载体。
本发明的第一方面，提供一种介孔二氧化硅复合粒子，包括内核、中层和外层，其中，
所述内核是纳米介孔二氧化硅粒子；
所述中层设置在所述内核的表面，包括至少一层自组装层，所述自组装层包含相互结合的刀豆球蛋白A和糖元；
所述外层为转铁蛋白层，设置在所述中层的表面。
在另一优选例中，所述中层和所述外层之间还具有一层刀豆球蛋白A层。
在另一优选例中，所述转铁蛋白为人体来源的铁饱和转铁蛋白。
在另一优选例中，所述中层具有1-15层自组装层，较佳地为2-10层自组装层。
在另一优选例中，所述介孔二氧化硅复合粒子在pH 4.0-6.0下所述中层和所述外层发生解离。
在另一优选例中，所述介孔二氧化硅复合粒子在温度高于200℃至550℃时所述中层和所述外层发生热解，失重率达到20-30％。
在另一优选例中，所述介孔二氧化硅复合粒子具有以下一个或多个特征：
(1)所述纳米介孔二氧化硅粒子的孔径为1.5-30nm；
(2)所述纳米介孔二氧化硅粒子的粒径为50-300nm；
(3)所述介孔二氧化硅复合粒子的平均粒径为60-350nm；
(4)所述介孔二氧化硅复合粒子在温度高于200℃至550℃时所述中层和所述外层发生热解，失重率达到20-30％。
在另一优选例中，所述介孔二氧化硅复合粒子，相对于纳米介孔二氧化硅粒子，在约1532cm-1和约1468cm-1处具有典型的酰胺基团振动峰。
本发明的第二方面，提供第一方面所述的介孔二氧化硅复合粒子的制备方法，包括以下步骤：
(a)提供纳米介孔二氧化硅粒子作为内核；
(b)所述纳米介孔二氧化硅粒子带正电后分散到含有刀豆球蛋白A溶液后，再分散到含有糖元的溶液，在纳米介孔二氧化硅粒子表面形成一层自组装层，任选地重复上述步骤形成数层自组装层；
(c)将步骤(b)获得的粒子分散到含有刀豆球蛋白A溶液后，再分散到转铁蛋白溶液中获得所述的介孔二氧化硅复合粒子。
本发明中采用的纳米介孔二氧化硅粒子，可以采用本领域已知的各种方法制备，没有特别的限制。在另一优选例中，采用以下步骤制备纳米介孔二氧化硅粒子：配制十六烷基三甲基溴化铵水溶液。加入适量氨水，调节溶液pH至12以上；通过分液漏斗将正硅酸乙酯逐滴加入，反应完毕后，抽滤分离得到白色固体产物；将干燥后的该固体产物经高温煅烧去除模板剂，即可获得纳米介孔二氧化硅粒子。
在另一优选例中，将介孔纳米二氧化硅分散在聚乙烯亚胺溶液(0.1-5mg/mL，较佳地为0.5-4.5mg/mL)中使所述纳米介孔二氧化硅粒子带正电。
在另一优选例中，所述制备方法包括以下一个或多个特征：
(1)所述步骤(b)或所述步骤(c)的含有刀豆球蛋白A溶液中所述刀豆蛋白A的浓度(或含量)为0.2-5mg/mL，较佳地为0.5-3mg/mL，更佳地为0.8-2.5mg/mL；
(2)所述步骤(b)的含有糖元的溶液中所述糖元的浓度(或含量)为0.2-5mg/mL，较佳地为0.5-3mg/mL；
(3)所述步骤(b)中所述纳米介孔二氧化硅粒子的质量与所述含有刀豆球蛋白A溶液的体积比为1-60mg:1ml，较佳地为10-50mg:1ml，更佳地为30-45mg:1ml；
(4)所述步骤(b)中所述纳米介孔二氧化硅粒子的质量与所述含有糖元的溶液的体积比为1-60mg:1ml，较佳地为10-50mg:1ml，更佳地为30-45mg:1ml；
(5)所述转铁蛋白溶液中转铁蛋白的浓度(或含量)为0.2-5mg/mL，较佳地为0.5-3mg/mL；
(6)所述步骤(b)获得的粒子的质量与所述含有刀豆球蛋白A溶液的体积比为1-60mg:1ml，较佳地为10-50mg:1ml，更佳地为30-45mg:1ml；
(7)所述步骤(b)获得的粒子的质量与所述转铁蛋白溶液的体积比为1-60mg:1ml，较佳地为10-50mg:1ml，更佳地为30-45mg:1ml。
本发明的第三方面，提供第一方面所述的介孔二氧化硅复合粒子的用途，用于制备药物载体。
在另一优选例中，所述药物载体是刺激响应型药物载体。
在另一优选例中，所述药物载体是肿瘤靶向型药物载体
在另一优选例中，所述药物载体是肿瘤靶向及刺激响应型药物载体。
在另一优选例中，所述药物载体在模拟胞外的pH条件下(pH 6.8-7.4)能够抑制药物泄漏，在模拟胞内内涵体的pH条件下(pH 4.5-6.0)中层及外层发生解离，从而诱导药物释放。
本发明的第四方面，提供一种复合物，包含：
第一方面所述的介孔二氧化硅复合粒子；和
抗癌药物。
在另一优选例中，所述抗癌药物选自：阿霉素、5-氟尿嘧啶、白消安、博莱霉素、长春花碱、多西紫杉醇、环磷酰胺、吉西他滨、甲胺嘌呤、卡铂、卡培他滨、洛莫司汀、羟基脲、顺铂、丝裂霉素、依托泊苷、紫杉醇、吉非替尼。
在另一优选例中，将介孔二氧化硅复合粒子分散在抗癌药物溶液中获得所述复合物。
本发明的第五方面，提供一种药物组合物，包含第四方面所述的复合物和药学上可接受的载体。
本发明的第六方面，提供第四方面所述的复合物或第五方面所述的药物组合物的用途，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述肿瘤包括(但不限于)：肝癌、肺癌(包括纵隔癌)、口腔上皮癌、鼻咽癌、甲状腺癌、食道癌、淋巴癌、胸腔癌、消化道癌、胰腺癌、肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌、胆囊癌、胆管癌、中枢神经癌、睾丸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、肉癌、脑癌、血癌(白血病)、宫颈癌、胶质瘤、胃癌、或腹水瘤。
本发明的介孔二氧化硅复合粒子，是由功能蛋白膜调控的肿瘤靶向及刺激响应型纳米药物载体。本发明以纳米介孔二氧化硅作为药物载体，利用刀豆球蛋白Con A和糖单元间的生物可逆键和为驱动力，以刀豆球蛋白A和糖元、转铁蛋白为组装单元，以层层自组装技术在纳米介孔二氧化硅表面构筑了多层蛋白膜结构，进行药物负载后，获得具有肿瘤靶向性和刺激响应性的纳米给药系统。
本发明具有制备方法简单温和、生物相容性好、响应条件生理化以及肿瘤靶向效率高等特点，适用于多种肿瘤的靶向治疗。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是透射电镜图。
图2是红外光谱图。
图3是热重表征图。
图4是不同pH条件下抗肿瘤药物阿霉素的释放曲线。
图5是转铁蛋白和刀豆球蛋白的生物特异性结合力表征图。
图6是共聚焦显微镜表征人肝癌细胞HepG2对肿瘤靶向及刺激响应型纳米药物载体的特异性摄取结果图。
图7是流式细胞分选仪表征肿瘤靶向及刺激响应型纳米药物载体对人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L02的选择性结果图。
图8是共聚焦显微镜表征肿瘤靶向及刺激响应型功能蛋白膜在人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L02中的解离行为结果图。
图9是共聚焦显微镜表征肿瘤靶向及刺激响应型纳米给药系统在人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L02中的药物释放行为结果图。
图10是MTT法测定肿瘤靶向及刺激响应型功能蛋白膜对抗肿瘤药物阿霉素对人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人胃癌细胞MGC-803、人正常肝细胞L02、小鼠成肌细胞C2C12的毒性调控作用结果图。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次研发出一种新型的药物载体，是一种介孔二氧化硅复合粒子，核芯是纳米介孔二氧化硅粒子，纳米介孔二氧化硅粒子表面具有一层或多层包含相互结合的刀豆球蛋白A和糖元的自组装层，最外的自组装层的表面具有转铁蛋白层。本发明的药物载体，利用外层转铁蛋白对肿瘤细胞的靶向功能，内层刀豆球蛋白A-糖元对肿瘤细胞内低pH环境的响应解离功能，可以实现载体对抗肿瘤药物的靶向传输、定点释放。在此基础上，完成了本发明。
术语
刀豆球蛋白A是从巨刀豆中提取得到的一种球蛋白型植物凝集素，其在pH6.8以上为四聚体，每个亚基对应一个糖结合位点。在酸性条件下，蛋白发生解聚形成二聚体，糖结合位点由四个变成两个。糖元是由葡萄糖结合而成的支链多糖，能够与刀豆球蛋白A发生具有pH依赖特性的特异性结合。
转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR,又称CD71)是细胞膜表面的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，TfR在正常细胞中受体表达水平较低，而快速增殖的肿瘤细胞由于对铁的需求增加使得其受体表达约为正常细胞的100倍。
转铁蛋白(transferrin，Tf)是含有两条N-寡糖链的单链糖蛋白，其分子量为7.7kDa，糖含量约6％，也能够与刀豆球蛋白A发生基于糖残基的生物特异性结合。
根据国际纯粹与应用化学协会(IUPAC)的定义，孔径小于2纳米的称为微孔；孔径大于50纳米的称为大孔；孔径在2到50纳米之间的称为介孔(或称中孔)。介孔材料是一种孔径介于微孔与大孔之间的具有巨大比表面积和三维孔道结构的新型材料。介孔二氧化硅具有包裹量大、比表面积大(＞900m2/g)、内外表面易修饰、孔道有序、孔径可调(2-10nm)、无毒、生物相容性好及热力学稳定性高等特点，是理想的纳米容器储存和释放载体。
介孔二氧化硅复合粒子
本发明以刀豆球蛋白A、糖元和转铁蛋白为组装单元，以该生物特异性结合力为驱动力，利用层层自组装制膜技术，在纳米介孔二氧化硅粒子表面形成一层或多层刀豆球蛋白A-糖元自组装层，并形成以转铁蛋白为外层的超分子层状膜，利用外层转铁蛋白对肿瘤细胞的靶向功能，刀豆球蛋白A-糖元对肿瘤细胞内环境的响应解离功能，实现载体对抗肿瘤药物的靶向传输、定点释放。
具体地，本发明的介孔二氧化硅复合粒子包括内核、中层和外层，其中，
所述内核是纳米介孔二氧化硅粒子；
所述中层设置在所述内核的表面，包括至少一层自组装层，所述自组装层包含相互结合的刀豆球蛋白A和糖元；
所述外层为转铁蛋白层，设置在所述中层的表面。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
介孔纳米二氧化硅的制备：将一定质量的十六烷基三甲基溴化铵溶解于适量去离子水中，加热搅拌至完全溶解。加入适量氨水，调节溶液pH至12以上。通过分液漏斗将正硅酸乙酯逐滴加入，反应完毕后，抽滤分离得到白色固体产物。将干燥后的该固体产物经高温煅烧去除模板剂，即可获得介孔纳米二氧化硅。
层层自组装蛋白多层膜的构建：称取一定质量的介孔纳米二氧化硅，分散在带正电的聚电解质溶液中，使介孔纳米二氧化硅带上正电荷。离心洗涤后依次将纳米粒子分散在刀豆球蛋白A溶液和糖元溶液中，重复该步骤，直至在介孔纳米二氧化硅表面获得指定层数的层层自组装蛋白多层膜。最后将该纳米粒子依次重分散在刀豆球蛋白A溶液和转铁蛋白溶液中，对该蛋白膜进行靶向修饰。本发明还以FITC标记的刀豆球蛋白A取代刀豆球蛋白A，制得具有荧光标记的层层自组装蛋白多层膜，以研究该多层膜的响应性。
肿瘤靶向及刺激响应型给药系统的构建：将上述包覆了蛋白多层膜的纳米粒子(即介孔二氧化硅复合粒子)分散在较高浓度的阿霉素溶液中，振荡过夜。离心并洗去未被负载的游离药物分子，冷冻干燥后即得肿瘤靶向及刺激响应型给药系统。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它包含安全有效量范围内的活性成分，以及药学上可接受的载体。
本发明所述的“活性成分”是指本发明所述的复合物，包含本发明的介孔二氧化硅复合粒子；和抗癌药物。
本发明所述的“活性成分”和药物组合物可以用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。
“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有10-200mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片。
“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。
在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明复合物或药物组合物可以单独给药，或者与其他治疗药物(如化疗药)联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明复合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的有益之处在于：
(1)本发明利用刀豆球蛋白与糖基间的生物特异性结合力，在介孔纳米二氧化硅表面通过层层自组装构建刀豆球蛋白A-糖元为中层、转铁蛋白为外层的超分子层状膜，获得具有肿瘤靶向和刺激响应双重特性的纳米药物载体。
(2)本发明的纳米药物载体生物相容性好，制备简单，可靶向选择多种肿瘤细胞，响应条件符合细胞微环境。
(3)本发明制备方法简单，无须对药物或载体进行修饰，利用刀豆球蛋白A的糖结合功能制得了具有肿瘤靶向和刺激响应双重特性的蛋白超分子膜。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
以下实施例中，Con A代表刀豆球蛋白A，Gly代表糖元，Tf代表转铁蛋白，MSN代表介孔纳米二氧化硅，下标n代表刀豆球蛋白A-糖元自组装多层膜的层数，上标D代表负载了抗肿瘤药物阿霉素，纳米粒子的结构通过将组成单元按从外到内的顺序依次排列表示，例如靶向纳米载药颗粒Tf/ConA(Gly/Con A)4-MSND是指外层为转铁蛋白、中层为4个双层的刀豆球蛋白A-糖元自组装多层膜、内核为负载有抗肿瘤药物阿霉素的纳米颗粒。
实施例1
肿瘤靶向及刺激响应型药物载体(介孔二氧化硅复合粒子及复合物)的制备
将1.116g的十六烷基三甲基溴化铵溶解于480mL去离子水中，50℃下搅拌至完全溶解。加入52.8mL氨水，调节溶液pH至12以上。通过分液漏斗逐滴加入5.6mL正硅酸乙酯，反应完毕后，抽滤分离得到白色固体产物。将干燥后的该固体产物经高温煅烧去除模板剂，即可获得介孔纳米二氧化硅MSN，其透射电镜照片如图1所示，粒径约为50-100nm。
称取200mg介孔纳米二氧化硅，分散在5mL聚乙烯亚胺溶液中(4mg/mL,0.5M NaCl溶液)，使介孔纳米二氧化硅带上正电荷。离心洗涤后将纳米粒子分散于5mL刀豆球蛋白A溶液中(2mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mMCa2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌30min后离心、洗涤。加入5mL糖元溶液(2mg/mL，Tris-HCl缓冲液)，同样缓慢搅拌30min后离心、洗涤。重复一次上述刀豆球蛋白A和糖元的组装步骤，即可在介孔纳米二氧化硅表面构建两个双层的蛋白超分子膜。最后将该纳米粒子依次重分散在刀豆球蛋白A(2mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)和转铁蛋白溶液中(2mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌30min后离心、洗涤。
将上述包覆了蛋白多层膜的纳米粒子分散在4mg/mL阿霉素溶液中，振荡过夜。离心并洗去未被负载的游离药物分子，冷冻干燥后即得肿瘤靶向及刺激响应型载药介孔二氧化硅复合粒子。
实施例2
将1.116g的十六烷基三甲基溴化铵溶解于480mL去离子水中，50℃下搅拌至完全溶解。加入52.8mL氨水，调节溶液pH至12以上。通过分液漏斗逐滴加入5.6mL正硅酸乙酯，反应完毕后，抽滤分离得到白色固体产物。将干燥后的该固体产物经高温煅烧去除模板剂，即可获得介孔纳米二氧化硅。
称取150mg介孔纳米二氧化硅，分散在5mL聚乙烯亚胺溶液中(4mg/mL,0.5M NaCl溶液)，使介孔纳米二氧化硅带上正电荷。离心洗涤后将纳米粒子分散于5mL刀豆球蛋白A溶液中(1.5mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌30min后离心、洗涤；加入5mL糖元溶液(2.5mg/mL，Tris-HCl缓冲液)，同样缓慢搅拌30min后离心、洗涤。重复六次上述刀豆球蛋白A和糖元的组装步骤，即可在介孔纳米二氧化硅表面构建七个双层的蛋白超分子膜。该样品记为(Gly/Con A)7-MSN，其透射电镜照片如图1所示，粒径约60-100nm。最后将该纳米粒子依次重分散在刀豆球蛋白A(2.5mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)和转铁蛋白溶液中(2.5mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌35min后离心、洗涤。
将上述包覆了蛋白多层膜的纳米粒子分散在4mg/mL 5-氟尿嘧啶溶液中，振荡过夜。离心并洗去未被负载的游离药物分子，冷冻干燥后即得肿瘤靶向及刺激响应型载药介孔二氧化硅复合粒子。
实施例3
将1.116g的十六烷基三甲基溴化铵溶解于480mL去离子水中，50℃下搅拌至完全溶解。加入52.8mL氨水，调节溶液pH至12以上。通过分液漏斗逐滴加入5.6mL正硅酸乙酯，反应完毕后，抽滤分离得到白色固体产物。将干燥后的该固体产物经高温煅烧去除模板剂，即可获得介孔纳米二氧化硅。
称取180mg介孔纳米二氧化硅，分散在5mL聚乙烯亚胺溶液中(4mg/mL,0.5M NaCl溶液)，使介孔纳米二氧化硅带上正电荷。离心洗涤后将纳米粒子分散于5mL刀豆球蛋白A溶液中(2mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mMCa2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌30min后离心、洗涤；加入5mL糖元溶液(2mg/mL，Tris-HCl缓冲液)，同样缓慢搅拌30min后离心、洗涤。重复九次上述刀豆球蛋白A和糖元的组装步骤，即可在介孔纳米二氧化硅表面构建十个双层的蛋白超分子膜。最后将该纳米粒子重分散在刀豆球蛋白A溶液中(2.5mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌35min后离心、洗涤。该样品记为Con A(Gly/Con A)10-MSN，其透射电镜照片如图1所示，粒径约60-100nm。
综合分析MSN、(Gly/Con A)4-MSN、(Gly/Con A)7-MSN及Con A(Gly/ConA)10-MSN的透射电镜照片(如图1所示)，可见包覆了多层膜后，纳米介孔二氧化硅的介孔孔道被蛋白膜所覆盖，并且随着多层膜层数的增加，纳米粒子表面颗粒状的结构愈发明显，而从Con A(Gly/Con A)10-MSN的透射电镜照片则能够直接观察到粒径与刀豆球蛋白A尺寸相符合的颗粒状结构，较为直接地证明了多层膜的成功组建。
实施例4
将1.116g的十六烷基三甲基溴化铵溶解于480mL去离子水中，50℃下搅拌至完全溶解。加入52.8mL氨水，调节溶液pH至12以上。通过分液漏斗逐滴加入5.6mL正硅酸乙酯，反应完毕后，抽滤分离得到白色固体产物。将干燥后的该固体产物经高温煅烧去除模板剂，即可获得介孔二氧化硅MSN，其透射电镜照片如图1所示。
称取200mg介孔纳米二氧化硅，分散在5mL聚乙烯亚胺溶液中(4mg/mL,0.5M NaCl溶液)，使介孔纳米二氧化硅带上正电荷。离心洗涤后将纳米粒子分散于5mL刀豆球蛋白A溶液中(2mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mMCa2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌30min后离心、洗涤。加入5mL糖元溶液(2mg/mL，Tris-HCl缓冲液)，同样缓慢搅拌30min后离心、洗涤。重复三次上述刀豆球蛋白A和糖元的组装步骤，即可在介孔纳米二氧化硅表面构建四个双层的蛋白超分子膜，该样品记为(Gly/Con A)4-MSN。
为了直接研究多层膜的解离行为，将刀豆球蛋白A进行FITC荧光标记，其余操作均同上，制得表面包覆四个双层蛋白超分子膜的纳米粒子，该样品记为(Gly/Con AFITC)4-MSN。
将(Gly/Con A)4-MSN分散在刀豆球蛋白A溶液(2mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌30min后离心、洗涤，该样品记为Con A(Gly/Con A)4-MSN。
将Con A(Gly/Con A)4-MSN分散到转铁蛋白溶液中(2mg/mL，10mMTris-HCl缓冲液，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌30min后离心、洗涤，该样品记为Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSN。
将Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSN分散在4mg/mL阿霉素溶液中，振荡过夜。离心并洗去未被负载的游离药物分子，冷冻干燥后即得靶向纳米载药颗粒(载药复合物)，该样品记为Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSND。
实施例5
称取200mg实施例1制备的介孔纳米二氧化硅，分散在5mL聚乙烯亚胺溶液中(1mg/mL,0.5M NaCl溶液)，使介孔纳米二氧化硅带上正电荷。离心洗涤后将纳米粒子分散于5mL刀豆球蛋白A溶液中(1mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌30min后离心、洗涤。加入5mL糖元溶液(1mg/mL，Tris-HCl缓冲液)，同样缓慢搅拌30min后离心、洗涤。重复四次上述刀豆球蛋白A和糖元的组装步骤，即可在介孔纳米二氧化硅表面构建五个双层的蛋白超分子膜，该样品记为(Gly/Con A)5-MSN。
将(Gly/Con A)5-MSN分散在刀豆球蛋白A溶液(1mg/mL，10mM Tris-HCl缓冲液，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌40min后离心、洗涤，该样品记为Con A(Gly/Con A)5-MSN。
将Con A(Gly/Con A)5-MSN分散到转铁蛋白溶液中(1mg/mL，10mMTris-HCl缓冲液，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)，缓慢搅拌40min后离心、洗涤，该样品记为Tf/Con A(Gly/Con A)5-MSN。
将Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSN分散在5mg/mL多西紫杉醇溶液中，振荡过夜。离心并洗去未被负载的游离药物分子，冷冻干燥后即得载药的复合物。
实施例6
以实施例4制备的各种粒子为例，进行性能表征。
MSN和(Gly/Con A)4-MSN的透射电镜照片如图1所示，表明通过层层自组装这一制膜技术，在介孔二氧化硅表面构建了膜状结构。
MSN、(Gly/Con A)4-MSN的红外分析谱图如图2所示，相对于纳米介孔二氧化硅粒子，包覆了蛋白膜后的纳米材料在1532cm-1和1468cm-1处具有典型的酰胺基团振动峰，进一步证明了蛋白膜的成功构建。
对MSN、(Gly/Con A)4-MSN进行热重分析(如图3所示)可知，在温度高于200℃至550℃时所述中层和所述外层发生热解，失重率达到20-30％(蛋白膜的比重在20％-30％左右)。
实施例7
药物载体吸附和多层膜调控药物释放的能力
称取10mg荧光标记的介孔二氧化硅复合粒子，即(Gly/ConAFITC)4-MSN，分别分散至1mL不同pH值的释放介质(pH 7.4PBS、pH 5.5醋酸/醋酸钠缓冲液，pH 5.0醋酸/醋酸钠缓冲液)中，样品避光放置于37℃恒温振荡箱中，每隔1h离心后取出500μL释放介质测量其荧光强度，同时补充500μL相同的新鲜释放介质，以上清中荧光强度为纵坐标作图，研究多层膜的解离行为。
如图4中(A)所示，在中性条件下，多层膜能够始终保持稳定；在pH 5.5下，多层膜能够发生一定程度的解离；在pH 5.0条件下，多层膜迅速发生响应，其在前2h的解离程度达到了前12h的一半左右。该层层自组装多层膜具备在中性环境中保持结构稳定，弱酸性条件下发生不同程度解离的特性。
称取10mg实施例4制备的纳米载药颗粒(Gly/Con A)4-MSND，分散于1mLDMSO中，以破坏表面蛋白超分子膜并溶解负载于介孔孔道中的药物分子。离心，测上清中特征吸收峰处吸光度，直至没有药物再被释放出来，累积计算药物释放量即可得材料中的药物含量。
称取10mg的上述纳米载药颗粒(Gly/Con A)4-MSND，分别分散至1mL不同pH值的释放介质(pH 7.4PBS、pH 6.8PBS、pH 6.0PBS、pH 5.5醋酸/醋酸钠缓冲液，pH 5.0醋酸/醋酸钠缓冲液,pH 4.0醋酸/醋酸钠缓冲液)中，样品避光放置于37℃恒温振荡箱中，每隔1h离心后取出500μL释放介质测量其特征吸收峰处吸光度，同时补充500μL相同的新鲜释放介质，做累积释放曲线。
如图4中(B)和(C)所示，在模拟人体正常体液的pH 7.4环境下，12h内药物几乎没有释放，这与多层膜在pH 7.4条件下保持结构稳定的实验结果一致，表明自组装层牢固地固定在MSN表面，从而保证该纳米载药粒子在体内循环的过程中保持稳定，避免药物提前逃逸产生副作用。
该纳米载药颗粒模拟胞内弱酸性条件的释放行为与其多层膜的解离行为基本一致。在模拟内涵体内弱酸性环境的pH 5.5下，多层膜解离程度不高，但交联度下降，因此“打开”介孔孔道并诱导药物释放，12h后释放率约45％；在pH 5.0下(模拟溶酶体内pH环境)，多层膜迅速发生解离，7h后释放率即达到50％，12h释放率约70％。
综上，在蛋白膜的调控作用下，本发明的刺激响应型介孔二氧化硅复合粒子实现了对药物的可控释放，并且响应条件符合生理环境，是理想的胞内药物运输载体。
实施例8
刀豆球蛋白A与转铁蛋白间生物特异性结合力
当配体A和配体B都能与受体R键和，且分子A的亲和力更高时，首先将高亲和力配体A与受体预混合，然后加入低亲和力的配体B时，受体将优先与配体A相互作用，只有极少部分的配体A被配体B从结合位点上被置换，因此只会有很少的表观热量变化。
基于以上理论，本发明首次采用等温滴定量热仪(ITC 200，Micarcal，Inc.)研究了转铁蛋白和刀豆球蛋白A的热力学结合并在刀豆球蛋白A的糖结合位点已被高亲和力配体甲基-α-D-吡喃甘露糖苷占据时，对转铁蛋白与其的竞争性热力学结合进行了研究，证明了转铁蛋白与Con A间的相互作用是基于转铁蛋白Tf的糖链与Con A间的生物特异性结合。
具体操作如下：
首先将转铁蛋白(记为Tf)和刀豆球蛋白A配成溶液，过220nm滤膜后高速离心(8000rpm，3min)脱气。设定实验温度25℃，参比功率5μcal/sec，搅拌速度1500rpm；加样200μL刀豆球蛋白A溶液于样品池中，40μL转铁蛋白溶液于注射器中，每隔120s滴一滴，每滴1.5μL，采用Microcal，Inc提供的Origin插件进行数据处理，采用单结合模型计算得到结合常数、结合位点数、摩尔结合焓等热力学参数。为了进一步研究两者间的生物特异性结合力，将刀豆球蛋白A和甲基-α-D-吡喃甘露糖苷预混合(摩尔比＝1：100)，4℃下保存2h使其充分键和后，装载200μL于样品池中，将转铁蛋白溶液装载于注射器中，刀豆球蛋白A浓度及转铁蛋白浓度均与上一实验保持一致，进行滴定。
图5中A的照片显示，转铁蛋白与刀豆球蛋白A在pH 7.4条件下发生交联生成沉淀，并且该过程被刀豆球蛋白A的高亲和力配体甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(Me-α-man)所抑制，初步证明转铁蛋白与刀豆球蛋白A间存在基于生物特异性结合的相互作用。图5中C表明甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(Me-α-man)是刀豆球蛋白A的高亲和力配体。
采用等温滴定量热仪对二者间的亲和力(图5中B、D)进行进一步研究表明，刀豆球蛋白A与转铁蛋白之间的结合常数为5.71×106M-1，是单糖Me-α-man的近800倍；两者间的结合位点数约为0.188，即平均每个转铁蛋白上有5.3个可与Con A单体发生结合的糖结合位点。
图5中D表明，me-α-man的存在使转铁蛋白向刀豆球蛋白A滴定过程放出的热量大大减少，证明转铁蛋白与刀豆球蛋白A的结合与糖识别过程有关。虽然根据计算结果转铁蛋白-刀豆球蛋白A结合常数要大于me-α-man-刀豆球蛋白A，转铁蛋白有竞争性地取代me-α-man与刀豆球蛋白A结合的可能。由于刀豆球蛋白A溶液中me-α-man大量存在，实际上将抑制转铁蛋白的取代性结合，导致滴定过程中放出的热量大大减少，有力地证明了刀豆球蛋白A和转铁蛋白间的生物特异性结合。
实施例9
肿瘤靶向性
以人肝癌细胞系HepG2为细胞模型，将介孔二氧化硅用FITC进行荧光标记，以介孔二氧化硅(MSN)和未修饰转铁蛋白的介孔二氧化硅复合粒子(ConA(Gly/Con A)4-MSN)为对照组，并采用在培养介质中加入游离转铁蛋白进行预孵育，以占据细胞表面转铁蛋白受体结合位点的手段，通过共聚焦显微镜和流式细胞仪分别进行半定量和定量分析，进一步研究靶向介孔二氧化硅复合粒子在转铁蛋白受体介导下对肿瘤细胞的特异性识别。
具体操作如下：将HepG2细胞以2×104/孔的密度接种于NEST激光共聚焦专用玻底培养皿中，使之贴壁生长。为了进行游离转铁蛋白竞争实验，其中一组(命名为Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSN+竞争因子Tf组)在共培养22h后移除细胞培养液，加入含200μg/mL转铁蛋白的细胞培养液进行预孵育。2h后移除各孔培养液，并分别加入含50μg/mL不同功能化纳米药物载体的细胞培养液。共培养4h后，移除含纳米颗粒的细胞培养液，用PBS冲洗3次，除去未被摄取的纳米粒子，加入1％的戊二醛溶液固定15min，用DAPI标记细胞核，通过激光共聚焦显微镜(Nikon A1R)观察纳米粒子和药物在胞内的分布情况。波长设置如下：DAPI通道404.3nm处激发，450.0nm处接收；FITC通道(即MSN)488.0nm处激发，525.0nm处接收，60倍油镜下观察，如图6所示，自左向右分别为MSN组、Con A(Gly/Con A)4-MSN组、Tf/Con A(Gly/ConA)4-MSN组、Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSN+竞争因子Tf组。
结果表明，HepG2细胞对未进行转铁蛋白修饰的MSN摄取均十分有限，而在蛋白膜的最外层连接上转铁蛋白后，在细胞核周围出现了大量的MSN粒子，表明通过对MSN进行转铁蛋白修饰，大大提高了HepG2细胞对纳米粒子的摄取效率。而竞争实验进一步表明，该摄取是在转铁蛋白受体介导下的特异性摄取。
实施例10
肿瘤靶向性
本实施例以人肝癌细胞系HepG2和人正常肝细胞L02为细胞模型。
将HepG2细胞和L02细胞以40×104/孔的密度接种于6孔板使之贴壁生长。为了进行游离转铁蛋白竞争实验，其中一组HepG2细胞(命名为Tf/ConA(Gly/Con A)4-MSN+竞争因子Tf组)在共培养22h后移除细胞培养液，加入含200μg/mL转铁蛋白的细胞培养液进行预孵育。2h后移除各孔培养液，并分别加入含50μg/mL不同功能化纳米药物载体的细胞培养液。共培养4h后，移除含纳米颗粒的细胞培养液，用PBS冲洗2遍，加入胰酶消化1-2分钟，收集细胞至离心管中，1000rpm/5min离心，并以PBS清洗两遍。为防止黏附在细胞表面的纳米粒子对实验结果产生干扰，加入1mL 0.4％台盼蓝溶液淬灭胞外荧光，用PBS洗掉残余的台盼蓝送流式细胞仪检测，结果如图7所示。
结果表明，HepG2细胞和L02细胞对未修饰的MSN的摄取率均在20％左右；MSN被(Con A/Gly)4多层膜(自组装层)修饰后，可能由于Con A和细胞膜表面的某些糖蛋白发生特异性结合，介导了一部分内吞，HepG2细胞和L02细胞的摄取率均提高到了30％左右；多层膜(自组装层)最外层连接上Tf后，体系被赋予了优良的靶向性能，HepG2细胞表面由于存在大量的TfR1和TfR2，与纳米粒子表面的Tf发生特异性识别而介导了大量的内吞，摄取率达到了60％。同时由于纳米粒子表面Con A的糖结合位点大部分已被Tf所占据，粒子与细胞膜表面糖蛋白的特异性结合不再存在，L02细胞的摄取率降低至25％左右。
以上结果表明，本发明的介孔二氧化硅复合粒子具有优异的肿瘤靶向性。
实施例11
纳米药物载体在肿瘤细胞和正常细胞内的解离行为
将介孔二氧化硅用红色荧光探针Texas Red进行标记,刀豆球蛋白A用绿色荧光探针FITC进行标记，合成双重荧光标记的纳米药物载体，并将该纳米粒子与细胞共培养，采用共聚焦荧光显微镜对纳米药物载体的摄取和多层膜的解离行为进行研究。
具体操作如下：分别将HepG2和L02细胞以2×104/孔的密度接种于NEST激光共聚焦专用玻底培养皿中，贴壁生长24h后移除细胞培养液，加入含20μg/mL双重荧光标记的纳米药物载体的细胞培养液，分别孵育3h、8h、24h后，用PBS冲洗3次，除去未被摄取的纳米粒子，加入1％的戊二醛溶液固定15min，用DAPI标记细胞核，通过激光共聚焦显微镜(Nikon A1R)观察纳米粒子和药物在胞内的分布情况。
波长设置如下：DAPI通道404.3nm处激发，450.0nm处接收；FITC通道(即Con A)488.0nm处激发，525.0nm处接收；Texas Red通道(即MSN)561.0nm处激发，595.0nm处接收，60倍油镜下观察，结果如图8所示。
结果表明，HepG2细胞对靶向药物载体的摄取明显多于L02细胞，并且在HepG2细胞胞浆中观察到了分散的绿色荧光，表明靶向纳米药物载体进入细胞后，多层膜在胞内弱酸性环境的刺激下发生解离，释放Con A-FITC。
实施例12
纳米载药系统在肿瘤细胞和正常细胞内的药物释放行为
利用阿霉素本身自发荧光的特性，将介孔二氧化硅用红色荧光探针TexasRed进行标记，并在其表面构建靶向蛋白多层膜(以未包覆靶向蛋白膜的MSN载药颗粒即MSND为对照组)，负载药物后与细胞共培养，在共聚焦荧光显微镜下观察该载药纳米颗粒的摄取和药物释放行为。
具体操作如下：
分别将HepG2和L02细胞以2×104/孔的密度接种于NEST激光共聚焦专用玻底培养皿中，贴壁生长24h后移除细胞培养液，加入阿霉素含量为0.5μg/mL的上述荧光标记的载药纳米颗粒的细胞培养液，分别孵育3h或8h后，用PBS冲洗3次，除去未被摄取的纳米粒子，加入1％的戊二醛溶液固定15min，用DAPI标记细胞核，通过激光共聚焦显微镜(Nikon A1R)观察纳米粒子和药物在胞内的分布情况。
波长设置如下：DAPI通道404.3nm处激发，450.0nm处接收；DOX通道488.0nm处激发，525.0nm处接收；Texas Red通道(即MSN)561.0nm处激发，595.0nm处接收，60倍油镜下观察，结果如图9所示。
将HepG2细胞与材料共培养3h，可以看到其对靶向纳米载药颗粒摄取量和胞内药物水平明显高于未修饰蛋白膜的MSN载药粒子。细胞与靶向纳米载药颗粒共培养后，3h时药物即均匀分散在胞浆之中，使细胞呈现绿色荧光；并且此时由于MSN颗粒仍与药物共存，使其呈现叠加的黄色荧光。
8h时由于药物大部分已经逸出，该纳米载药颗粒呈现红色荧光；并且观察到核质浓缩以及细胞收缩变圆的行为，表明细胞在药物作用下发生凋亡。
而对于L02细胞，细胞对两种纳米粒子的摄取量均很少，且随着时间的增加摄取量并未见提高。但仍然有部分纳米粒子通过网格蛋白介导的途径被摄取，在胞内溶酶体的刺激下发生药物泄漏。
整体来说，药物在L02细胞内的积累量远远低于HepG2，共培养后细胞形态在也维持在正常状态。
实施例13
功能蛋白膜在调控抗阿霉素对不同肿瘤细胞系和正常细胞系细胞毒性中的作用
将靶向载药纳米颗粒(Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSND)和不同的肿瘤细胞系(人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人胃癌细胞MGC-803)和正常细胞系(人正常肝细胞L02、小鼠成肌细胞C2C12)共同培养，以未包覆蛋白膜的介孔二氧化硅载药颗粒(MSND)及无粒子的空白为对照组，利用MTT法评价其对肿瘤细胞的靶向和抑制作用。
具体操作如下：
将细胞以2×104/孔的密度接种于24孔板(每组实验设6个平行实验)，贴壁生长24h后，其中一组(Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSND+竞争因子Tf)加入1mL含200μg/mL转铁蛋白的细胞培养液预孵育30min以占据细胞膜表面的TfR1和TfR2结合位点。各孔移除细胞培养液，加入不同阿霉素含量的介孔二氧化硅载药纳米颗粒(MSND)和靶向载药纳米颗粒(Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSND)悬浮培养液1mL，共培养4h后移除细胞培养液，用PBS冲洗3次，以除去未被细胞摄取的纳米颗粒，继续培养44h。用MTT法对细胞活力进行评价，结果如图10所示。
相对于未包覆多层膜结构的MSN载药体系MSND，该靶向载药纳米载体Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSND对肿瘤细胞的抑制率均得以提高，对正常细胞的毒性均大幅度下降。这是由于介孔二氧化硅复合粒子在转铁蛋白受体介导下被肿瘤细胞快速内吞，并在肿瘤胞内微环境的刺激下迅速释放药物，因此对肿瘤细胞的抑制性更强；而正常细胞只能通过网格蛋白介导的非特异性内吞摄取靶向载药纳米颗粒，载药体系毒性大幅降低。且加入竞争因子Tf后，靶向载药纳米颗粒对肿瘤细胞的毒性下降，证明材料对肿瘤细胞的抑制率上升是基于转铁蛋白受体介导的主动靶向。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种介孔二氧化硅复合粒子，其特征在于，包括内核、中层和外层，其中，
所述内核是纳米介孔二氧化硅粒子；
所述中层设置在所述内核的表面，包括至少一层自组装层，所述自组装层包含相互结合的刀豆球蛋白A和糖元；
所述外层为转铁蛋白层，设置在所述中层的表面。
2.如权利要求1所述的介孔二氧化硅复合粒子，其特征在于，所述中层具有1-15层自组装层，较佳地为2-10层自组装层。
3.如权利要求1所述的介孔二氧化硅复合粒子，其特征在于，所述介孔二氧化硅复合粒子在pH 4.0-6.0下所述中层和所述外层发生解离。
4.如权利要求1所述的介孔二氧化硅复合粒子，其特征在于，所述介孔二氧化硅复合粒子具有以下一个或多个特征：
(1)所述纳米介孔二氧化硅粒子的孔径为1.5-30nm；
(2)所述纳米介孔二氧化硅粒子的粒径为50-300nm；
(3)所述介孔二氧化硅复合粒子的平均粒径为60-350nm；
(4)所述介孔二氧化硅复合粒子在温度高于200℃至550℃时所述中层和所述外层发生热解，失重率达到20-30％。
5.一种如权利要求1所述的介孔二氧化硅复合粒子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(a)提供纳米介孔二氧化硅粒子作为内核；
(b)所述纳米介孔二氧化硅粒子带正电后分散到含有刀豆球蛋白A溶液后，再分散到含有糖元的溶液，在纳米介孔二氧化硅粒子表面形成一层自组装层，任选地重复上述步骤形成数层自组装层；
(c)将步骤(b)获得的粒子分散到含有刀豆球蛋白A溶液后，再分散到转铁蛋白溶液中获得所述的介孔二氧化硅复合粒子。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下一个或多个特征：
(1)所述步骤(b)或所述步骤(c)的含有刀豆球蛋白A溶液中所述刀豆蛋白A的浓度为0.1-5mg/mL，较佳地为0.2-3mg/mL；
(2)所述步骤(b)的含有糖元的溶液中所述糖元的浓度为0.2-5mg/mL，较佳地为0.5-3mg/mL；
(3)所述步骤(b)中所述纳米介孔二氧化硅粒子的质量与所述含有刀豆球蛋白A溶液的体积比为1-60mg:1ml，较佳地为10-50mg:1ml，更佳地为30-45mg:1ml；
(4)所述步骤(b)中所述纳米介孔二氧化硅粒子的质量与所述含有糖元的溶液的体积比为1-60mg:1ml，较佳地为10-50mg:1ml，更佳地为30-45mg:1ml；
(5)所述转铁蛋白溶液中转铁蛋白的浓度为0.2-5mg/mL，较佳地为0.5-3mg/mL；
(6)所述步骤(b)获得的粒子的质量与所述含有刀豆球蛋白A溶液的体积比为1-60mg:1ml，较佳地为10-50mg:1ml，更佳地为30-45mg:1ml；
(7)所述步骤(b)获得的粒子的质量与所述转铁蛋白溶液的体积比为1-60mg:1ml，较佳地为10-50mg:1ml，更佳地为30-45mg:1ml。
7.如权利要求1-3任一项所述的介孔二氧化硅复合粒子的用途，其特征在于，用于制备药物载体。
8.一种复合物，其特征在于，所述复合物包含：
权利要求1-3任一项所述的介孔二氧化硅复合粒子；和
抗癌药物。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求8所述的复合物和药学上可接受的载体。
10.如权利要求8所述的复合物或权利要求9所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。
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