CN103463639B - 一种控制释放系统及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于介孔氧化硅纳米粒子的控制释放系统及其制备方法。本发明所述的控制释放系统是基于酶、抑制剂和底物三者之间的竞争性结合原理，通过介孔氧化硅材料表面的改性和修饰，制备一种刺激响应型的控制释放系统。在没有底物存在下，本发明所述的介孔氧化硅纳米粒子可达到“零提前释放”；当环境中有相应的底物时，介孔被打开，控制性地释放负载分子，并对相应的底物有较好的选择性。该方法具有材料合成简单，选择性好，“零提前释放”及可于相应底物存在下控制性释放负载分子的优点。

Description

一种控制释放系统及其制备方法

技术领域

本发明属于控制释放领域。具体而言，本发明涉及以介孔氧化硅纳米粒子为载体，基于酶、抑制剂和底物三者之间的竞争性结合原理设计合成的控释系统及其制备方法。

技术背景

介孔氧化硅材料是一个集材料、物理、化学等多学科于一体的综合领域。它具有较大的比表面积(>900m²/g）、高度有序的介孔结构(>0.9cm³/g）、大的孔容积及在2～10nm内连续可调的孔径等结构特征，且易于进行表面和孔内壁的功能化，生物相容性较好，这使得它成为优良的控制释放及离子吸附分离的载体，在药物控制释放领域的应用日趋广泛(Science.1995,267(5199):865-867)。

目前已报导的可以被用来作为暂时封闭介孔的堵孔剂（cap）有CdS纳米粒子、Au、Fe₃O₄磁性纳米粒子、聚合物及大分子（如环糊精和轮状化合物）等。相应的刺激cap打开、释放负载分子的刺激源则有pH、温度、氧化还原电势、光及酯酶等(J.Am.Chem.Soc.,2003,125(15):4451-4459;J.Am.Chem.Soc.,2009,131(19):6833-6843;Angew.Chem.Int.Ed.,2009,121(32):5998-6001;J.Am.Chem.Soc.,2009,131(39):14075-14080)。然而，很多用到的cap试剂和相应的刺激源都有一定的缺陷，如缺乏生物相容性，对生物体系有很大毒性及不能保证药物的“零提前释放”等。尽管目前已有文献报导可以用抗原或酶等生物大分子来作为cap试剂，然后用具有生物相容性的分子如核苷酸等作为刺激源来打开介孔，引起负载分子的释放，但是用生物分子作为“生物介孔门（biogate）”来用于控制释放系统的研究仍处于初级阶段。

在本发明中，我们基于酶、抑制剂和底物三者之间的竞争性结合原理，通过介孔氧化硅材料表面的改性和修饰，设计并合成了有望应用于生物体内的控释系统。该方法具有材料合成简单，选择性好，“零提前释放”及可于相应底物存在下控制性释放负载的优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一类基于介孔氧化硅纳米粒子的控制释放纳米粒子或系统，其由经小分子抑制剂硅烷化的介孔氧化硅纳米粒子与相应的酶结合而得到，其基本设计理念如图1所示。

本发明的另一目的在于提供该基于介孔氧化硅纳米粒子的控制释放纳米粒子或系统的制备方法。

根据本发明，所述的介孔氧化硅纳米粒子的粒径为80～500nm。

根据本发明，所述的小分子抑制剂为4-氨基安替比林，2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，氨酪酸，HMG-CoA，二氢叶酸或乙酰胆碱。

根据本发明，所述的堵孔剂为：辣根过氧化物酶(HRP)，葡萄糖氧化酶(GOD)，伴刀豆球蛋白(ConA)，GABA转氨酶，HMG-CoA还原酶，二氢叶酸还原酶，或乙酰胆碱酯酶。

根据本发明，所述的底物为鲁米诺，葡萄糖，2-氨基-3-炔基丁酸，洛伐他汀，甲氨蝶呤或毒扁豆碱。

本发明提供的基于介孔氧化硅纳米粒子的控制释放纳米粒子或系统的制备方法，包括以下步骤：

(a1)、将介孔氧化硅纳米粒子分散在溶剂中，用小分子抑制剂对其表面进行功能化；

(a2)、将表面经小分子抑制剂进行功能化后的介孔氧化硅纳米粒子分散在溶剂中，与酶充分反应，将介孔堵上，即得到所述基于介孔氧化硅纳米粒子的控制释放纳米粒子或系统。

根据本发明，所述介孔氧化硅纳米粒子采用水热法制备，所述的模板剂为阳离子表面活性剂，优选十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。

所述溶剂包括：甲苯、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、水中的一种或它们的混合物。

本发明提供的基于介孔氧化硅纳米粒子的控制释放纳米粒子或系统可以与相应的底物充分接触，从而达到控制释放的目的。该系统具有材料合成简单，选择性好，“零提前释放”及可于相应底物存在下控制性释放负载的优点。

本发明还涉及该基于介孔氧化硅纳米粒子的控制释放纳米粒子或系统在控制释放领域的应用。

在一具体实施方式中，所述的控制释放纳米粒子或系统的前体选自：

然后将该前体与相应的酶结合而得到。

在一具体实施方式中，所述控释粒子或系统的载体，即式I和式II中的MCM-41，为介孔氧化硅纳米粒子，经表面功能化而具有异氰酸酯基、炔基等活性基团。

在一具体实施方式中，所述方法中的小分子抑制剂用以结合酶分子。

在一具体实施方式中，所述方法中的酶是用作堵孔剂(cap)，来抑制负载分子如药物的释放。

在一具体实施方式中，所述方法中的底物用于竞争性结合酶分子，从而使其从介孔氧化硅纳米粒子介孔口脱落。

在一具体实施方式中，本发明所述的介孔氧化硅纳米粒子或系统可以用于负载分子的控制释放。

本发明还提供一类控制释放的方法，所述方法包括使本发明的介孔氧化硅纳米粒子或系统与相应的底物接触，从而打开介孔，释放负载分子。

在一具体实施方式中，所述方法包括将本发明的介孔氧化硅纳米粒子均匀分散在相应的底物溶液中。

在一具体实施方式中，所述方法包括将底物及本发明的控释粒子或系统的混合液进行超声，使其充分接触，进而反应。

在一具体实施方式中，所述方法还包括将底物及本发明的控释粒子或系统的混合液进行超声后离心，取上层清夜通过紫外分光光度计测量其吸光度。

在一具体实施方式中，所述底物为液体样品。

在一具体实施方式中，本发明所述的介孔氧化硅纳米粒子或系统通过底物与酶的结合能力要大于酶与小分子抑制剂的结合能力的原理来使底物将酶竞争性结合下来，从而打开介孔，释放负载。

在一具体实施方式中，本发明的控释纳米粒子或系统中负载分子的释放可以通过紫外分光光度计来检测。

在一具体实施方式中，本发明所述的介孔氧化硅纳米粒子在没有刺激源存在时，可达到负载分子的“零提前释放”。

在一具体实施方式中，本发明所述的介孔氧化硅纳米粒子在相应刺激源的存在下，负载分子的释放速率与底物的浓度成正比。

附图说明

图1显示以介孔氧化硅纳米粒子为载体，基于酶、抑制剂与底物竞争性结合的控释系统设计示意图。

图2显示介孔氧化硅纳米粒子N4(▲)和N5(■)的释放曲线图。

图3显示介孔氧化硅纳米粒子N5在不同鲁米诺(底物)浓度下的释放曲线图。

图4显示介孔氧化硅纳米粒子P5(●)和P6(▲)的释放曲线图。

图5显示介孔氧化硅纳米粒子P6在不同葡萄糖(底物)浓度下的释放曲线图。

图6显示介孔氧化硅纳米粒子P6对不同种类糖的选择性(葡萄糖：1×10^-3mol/L，其它糖：1×10^-2mol/L；30μL，PBS）。

具体实施方式

本发明控制释放的基于介孔氧化硅纳米粒子的纳米粒子含有经小分子抑制剂功能化的介孔氧化硅纳米粒子和与所述小分子抑制剂结合的堵孔剂。

本发明中，介孔氧化硅纳米粒子可以是本领域周知的各种具有生物相容性的或不具有生物相容性的介孔氧化硅纳米粒子。通常采用水热法制备介孔氧化硅纳米粒子，例如使用阳离子表面活性剂，优选十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，作为模板剂，使其在适当条件下与正硅酸乙酯反应，形成本发明的介孔氧化硅纳米粒子。因此，在一优选实施例中，适用于本发明的介孔氧化硅纳米粒子是阳离子表面活性剂与正硅酸乙酯的反应产物，更优选是CTAB与正硅酸乙酯的反应产物。

可通过控制反应的条件等来控制介孔氧化硅纳米粒子的粒径。对本发明的介孔氧化硅纳米粒子的粒径并没有特别的限制，通常在80～500nm的范围之内，例如可以是100～400nm、100～300nm、200～400nm不等。

适用于本发明的小分子抑制剂指用于对介孔氧化硅纳米粒子的表面进行功能化的小分子化合物，该小分子化合物能与堵孔剂结合。

小分子抑制剂可通过接头分子而连接到介孔氧化硅纳米粒子上。这类接头分子通常是包含三烷氧基硅烷部分的分子，例如，做为示例性的例子，氨基烷基三烷氧基硅烷。应理解，本文所述烷基可以是C1-12直链或支链烷基，例如C1-6烷基、C1-4烷基等。本文所述烷氧基可以是C1-12直链或支链烷氧基，例如C1-6烷氧基、C1-4烷氧基等。一个具体实施例中，所述接头部分是氨基丙基三乙氧基硅烷。

用于本发明的堵孔剂可以是各种合适的酶，包括但不限于辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，伴刀豆球蛋白，GABA转氨酶，HMG-CoA还原酶，二氢叶酸还原酶，或乙酰胆碱酯酶。这种酶能通过结合亲和力与所述小分子抑制剂结合，从而堵住介孔氧化硅纳米粒子的介孔口，阻止介孔氧化硅纳米粒子所容纳的活性成分如药物释放。

适用于本发明的底物可以是能与介孔氧化硅纳米粒子所含的酶结合的各自底物，且所述底物与酶的结合亲和力应大于所述酶与小分子抑制剂的结合亲和力，以使得底物能与所述小分子抑制剂竞争性结合酶，从而将酶从所述小分子抑制剂上脱离，最终打开介孔口，释放出介孔氧化硅纳米粒子中所容纳的负载分子（如各种药物活性成分、染料、指示剂等等）。

优选的是，所使用的酶及其底物是生物相容性的。例如，所述底物本身就是人体或动物体自身所携带的，例如血液中天然存在的（例如葡萄糖），或者人为给予的（例如各种药物，如鲁米诺，2-氨基-3-炔基丁酸，洛伐他汀，甲氨蝶呤或毒扁豆碱）。

因此，为了使本发明的控制释放的纳米粒子具有生物相容性，可根据人体或动物体自身所具有的或可给予的底物来选择所述控制释放的纳米粒子的堵孔剂。再根据所述底物与所述堵孔剂的结合亲和力来选择适当的小分子抑制剂，以使小分子抑制剂与堵孔剂的结合亲和力小于堵孔剂与底物的结合亲和力。

因此，可根据实际的情况选用合适的、生物相容的各种小分子抑制剂和堵孔剂。例如，适用于本发明的小分子抑制剂可选自：4-氨基安替比林，2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，氨酪酸，HMG-CoA，二氢叶酸或乙酰胆碱。适用于本发明的堵孔剂可选自：辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，伴刀豆球蛋白，GABA转氨酶，HMG-CoA还原酶，二氢叶酸还原酶，或乙酰胆碱酯酶。适用于本发明的底物可选自：鲁米诺，葡萄糖，2-氨基-3-炔基丁酸，洛伐他汀，甲氨蝶呤或毒扁豆碱。

本发明的控释纳米粒子可以是以干燥的形式存在，也可以溶液的形式存在。本发明包括含有本发明所述控制释放的纳米粒子的控制释放系统。应理解，本发明的控制释放系统指能够控制活性分子例如药物的释放的一种产品。该系统可以是简单的仅含有本发明控释纳米粒子的产品，也可以是含有本发明控释纳米粒子和其它成分例如药学上可接受的载体或赋形剂的一种组合物或混合物。本领域技术人员能根据该组合物的用途来选用适当的药学上可接受的载体或赋形剂。例如，合适载体或赋形剂的一些例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素等。

本发明的基于介孔氧化硅纳米粒子的控制释放的纳米粒子的例子包括由如式I或II所示的前体与相应的酶分子结合得到的纳米粒子：

式中，MCM-41指未修饰的介孔氧化硅纳米粒子，可如本申请所述制备，也可采用现有已知的MCM-41介孔材料。

本发明的控制释放的纳米粒子或系统用于控制活性成分的释放。因此，本发明的系统还可含有活性成分例如药物。所述药物优选是化合物。可用于本发明的药物包括但不限于抗癌药物，治疗糖尿病的药物等等。例如，适用于本发明的药物可选自：喜树碱、9-氨基-2-(2-二甲氨基-乙基)-10-硫杂-2,8-二氮杂-环戊二烯并[a]非那烯-1,3-二酮、双萘法德、胰岛素、白消安、顺铂、丝裂霉素C、卡铂、秋水仙碱、长春碱、紫杉醉、多西他赛、托泊替康、阿霉素、铭托泊普、5-氮杂胞普、5-氟尿啼吮,甲氛蝶吟,5-氟-2’-去氧尿苷、羟基脲，硫代鸟嘌呤、赫赛汀、马法兰、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、长春新碱、表阿霉素、阿克拉霉素、博莱霉素、米托蒽醌、氟达拉滨、奥曲肽、他莫昔芬、吉西他滨、伊立替康、吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、尼罗替尼、达沙替尼等。本发明控释纳米粒子所负载的分子也可是上述药物的任一组合物，以用于治疗相同或不同的疾病或症状。

本发明可用于控制释放的基于介孔氧化硅的纳米粒子可通过以下步骤制备：

(a1)将介孔氧化硅纳米粒子分散在溶剂中，用小分子抑制剂对其表面进行功能化；和

(a2)将表面经小分子抑制剂功能化的介孔氧化硅纳米粒子分散在溶剂中，与堵孔剂充分反应，将介孔堵上，即得到所述基于介孔氧化硅纳米粒子的控制释放纳米粒子。

可采用水热法制备介孔氧化硅纳米粒子。示范性的制备介孔氧化硅纳米粒子可参见本申请的实施例2和3。也可直接使用现有技术已知的（如市售的）各种硅系介孔材料。

根据本发明的一个实施例，介孔氧化硅粒子在表面被修饰之前，在80～400℃（例如100～300℃、100～250℃不等）条件下，静置8～12小时。

用小分子抑制剂功能化介孔氧化硅纳米粒子之前，可先使小分子抑制剂与适当的接头分子反应，然后再使其与介孔氧化硅纳米粒子反应，从而通过接头分子上的反应性官能团（例如硅烷氧基部分）共价连接到介孔氧化硅纳米粒子上。或者，也可先用接头分子对介孔氧化硅纳米粒子进行修饰，使其与介孔氧化硅纳米粒子共价连接，然后再使小分子抑制剂连接到经接头分子修饰的介孔氧化硅纳米粒子上。示例性的小分子抑制剂、接头分子以及经小分子抑制剂功能化的介孔氧化硅纳米粒子的例子可见本发明的式I和II。

获得经小分子抑制剂功能化的介孔氧化硅纳米粒子后，可在溶剂中使其与堵孔剂反应，通过小分子抑制剂与堵孔剂的相互结合而将介孔堵上。

对步骤a1和a2中所用的溶剂并无特殊限制，通常可选用甲苯、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、水中的一种或多种。

同样地，本发明对步骤a1和a2的反应物的用量、反应时间、温度等并没有特殊的限制。技术人员可根据实际的制备情况选择适当的反应条件。示例性的制备过程可见本申请实施例部分。

可采用不同的方法测试本发明控释纳米粒子或系统的性能。例如，可将本发明的介孔氧化硅纳米粒子均匀分散于相应的测试体系中，然后与相应的刺激源(底物溶液)经超声充分接触，使介孔打开，负载分子释放。根据本发明，可用染料分子作为负载分子，替换活性成分，用于表征。这类染料分子包括但不限于异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，或罗丹明B。

接触时间以及所使用的介孔氧化硅纳米粒子的量可由技术人员根据实际情况而定，例如根据底物在相应体系中的含量等因素而确定接触时间和粒子的用量。

在使刺激源与本发明的介孔氧化硅纳米粒子接触一段时间后，可用离心分离本发明的介孔氧化硅纳米粒子和测试体系，然后通过紫外分光光度计来检测体系中的紫外吸收强度，从而确定负载分子的释放量。

本发明也包括一种控制释放的方法，所述方法包括使本发明的基于介孔氧化硅纳米粒子的控制释放纳米粒子或系统与相应的底物充分接触，从而达到控制释放的目的。

本发明也包括本发明所述控释纳米粒子或系统在制备控释药物组合物中的应用。该控释药物组合物可用于治疗各种疾病，例如癌症，这取决于所述控释纳米粒子或系统中所负载的活性分子。例如，当所述纳米粒子负载的是喜树碱时，所述控释纳米粒子或系统可用于制备治疗喜树碱所能治疗的疾病（例如恶性肿瘤如肠胃道和头颈部癌、肝癌等，银屑病，疣，急慢性白血病以及血吸虫病引起的肝脾肿大等）的药物。

在一具体实施例中，本发明所述的控释纳米粒子或系统在没有刺激源(底物)存在时，可达到负载分子（例如药物）的“零提前释放”。

在一具体实施例中，本发明所述的控释纳米粒子或系统在相应刺激源(底物)的存在下，负载分子（例如药物）的释放速率与底物的浓度成正比。

在优选的实施例中，本发明所述的控释纳米粒子或系统对相应的底物具有较好的选择性。

应理解，本文中，所述“控释纳米粒子”既包括单个粒子，也包括多个粒子的混合物。

下文将以具体实施例的方式描述本发明，其目的在于更好的理解本发明的内容。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，而非限制性的。实施例中所使用的试剂，除非另有说明，否则都是从市场上常规购得。其用法和用量都可根据常规的用法和用量使用。

实施例1

在100mL三口烧瓶中加入4-氨基安替比林（2.03g,10.0mmol）及50mL无水四氢呋喃，氩气保护下缓慢滴加用10mL无水四氢呋喃溶解的3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷（3.72g,15.0mmol），滴加完毕，加热至回流，反应4h。停止反应，冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，得黄色固体。重结晶（己烷:THF=8:1,v/v）后得3.58g黄色粉末状固体，即为化合物1-1，收率89.2%。熔点：142.3-143.6℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.81(s,1H),7.49(t,J=8.0Hz,2H),7.40(d,J=7.6Hz,2H),7.34(d,J=7.2Hz,1H),6.06(s,1H),3.78-3.83(m,6H),3.06(s,3H),2.90-2.95(m,2H),2.28(s,3H),1.36-1.44(m,2H),1.22(t,J=7.2Hz,9H),0.50(t,J=8.4Hz,2H);¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ162.5,157.0,149.7,134.5,129.3(2C),127.0,124.3(2C),110.7,58.3(3C),42.9,36.2,23.8,18.3(3C),12.2,7.6.IR(KBr):3359,3290,2973,1627,1546,1297,1233,1073,950,768cm^-1.C₂₁H₃₄N₄O₅Si[M+H⁺]的HRMS(ESI)m/z，计算值451.2377,实际值451.2396;[M+Na⁺]计算值473.2196,实际值473.2191。

实施例2

在2000mL烧瓶中加入正十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（3.00g,8.2mmol）及1440mL的去离子水，搅拌下加入2mol/L NaOH水溶液（10.50mL,21.0mmol），加热至80℃，CTAB基本溶解，反应液呈无色澄清透明溶液。向该反应液中滴加正硅酸乙酯（TEOS）（15.00mL,67.3mmol），1小时内滴加完毕，于80℃反应2h。停止加热，趁热过滤，滤饼分别用去离子水和无水甲醇洗三次。将滤饼置于90℃烘箱内干燥8h，得4.85g白色粉状固体N1。

实施例3

在500mL单口圆底烧瓶中加入18.00mL 37.4%的浓盐酸、320mL无水甲醇和3.00g含有模板CTAB的介孔氧化硅纳米粒子N1，加热至回流反应24h。停止反应，抽滤，滤饼用无水甲醇多次洗涤后置于红外烘箱中干燥，得2.14g白色粉末状固体N2。

实施例4

在50mL单口茄形烧瓶中加入化合物1-1（900.00mg,2.0mmol）及50mL无水甲苯，搅拌溶解后为淡黄色澄清透明溶液，加入2.5g上述制备的介孔氧化硅纳米粒子N2，氩气保护下加热至回流，反应24h后冷却并过滤，滤饼用甲苯及无水甲醇多次洗涤后置于红外烘箱中干燥，得2.42g淡黄色粉末状固体N3。由元素分析结果计算可得，N3表面小分子固载量约为0.73mmol/g（根据C、N含量进行计算，粒子N2中C、N含量分别为1.22%和<0.3%；粒子N2中C、N含量分别为14.45%和3.62%)。

实施例5

在50mL单口茄形烧瓶中加入罗丹明B（690.00mg,1.4mmol）及25mL水，搅拌溶解后为玫红色溶液，加入1.8g上述制备的介孔氧化硅纳米粒子N3，氩气保护下室温反应24h。停止反应，抽滤，滤饼用水多次洗涤后置于红外烘箱中干燥，得1.92g玫红色粉末状固体N4。

实施例6

在25mL单口茄形烧瓶中加入32mg辣根过氧化酶（HRP）及10mL水，搅拌溶解后为棕黄色澄清透明溶液，加入200.00mg上述制备的介孔氧化硅纳米粒子N4，氩气保护下，冰浴下反应24h。停止反应，反应液离心，用水多次洗涤后置于冷冻干燥机中干燥，得142.00mg粉红色粉末状固体N5。

实施例7

在250mL单口茄形烧瓶中加入75mL无水乙醇，冰浴冷却下向此无色澄清透明溶液中缓慢滴加AcCl（21.30mL,300.0mmol），滴加完毕室温搅拌15分钟，即得HCl-EtOH溶液。

在500mL单口茄形烧瓶中加入化合物NaN₃（13.00g,200.0mmol）及200mL乙腈，冰浴冷却下向此白色浑浊液中缓慢滴加磺酰氯（16.10mL,200.0mmol），滴加完毕后室温下过夜反应。将反应液用冰浴冷却，向其中分批加入咪唑（25.90g,380.0mmol），为白色浑浊液，室温反应三小时。将反应液用400mL乙酸乙酯稀释，然后依次用水（2×400mL）、饱和碳酸氢钠水溶液（2×400mL）洗两次，有机层用无水MgSO₄干燥，过滤，滤液用冰浴冷却，搅拌下缓慢滴加上述制备的HCl-EtOH溶液，有白色固体生成。滴加完毕，冰浴搅拌10min后过滤，滤饼用乙酸乙酯（3×100mL）洗三次，得到25.27g白色针状晶体，即为化合物2-1a，收率60.5%。熔点：101.2-103.4℃，文献值100.4-102.3℃。¹H NMR(400MHz,D₂O):δ9.38(d,J=5.2Hz,1H),7.96(s,1H),7.55(s,1H);¹³C NMR(100MHz,D₂O):δ137.6,123.0,120.1.

实施例8

在50mL单口茄形烧瓶中加入2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖盐酸盐（864.00mg,4.0mmol），CuSO₄·5H₂O（10.00mg,40.0μmol），K₂CO₃（1.10g,8.0mmol）及20mL无水甲醇，然后向此粉蓝色浑浊液中加入化合物2-1a（1.00g,4.8mmol），室温下搅拌反应2h。停止反应，将反应液减压蒸馏除去低沸点溶剂，用PhMe(2×40mL)共沸蒸馏两次除去反应液中残留的水，得黄色固体，将此黄色固体用20mL吡啶溶解，然后滴加Ac₂O（3.04mL,32.00mmol），滴加完毕室温搅拌下反应3h。反应完毕减压蒸馏除去溶剂，用80mL水将得到的棕色油状物溶解，然后用EtOAc（3×45mL）萃取，有机层用无水MgSO₄干燥，过滤。滤液减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析（PE/EtOAc=3/1,v/v）得1.15g无色油状液体，即为化合物2-1b，收率76.4%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ5.56(d,J=8.4Hz,1H),5.15-5.04(m,2H),4.34-4.30(m,1H),4.08(t,J=12.4Hz,1H),3.82(d,J=7.2Hz,1H),3.68(t,J=8.4Hz,1H),2.21(s,3H),2.12-2.04(m,9H);¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ170.58,169.82,169.65,168.60,92.56,72.71,69.73,67.70,62.53,61.36,20.91,20.72,20.66,20.58.MS(ESI)m/z 396.1[M+Na⁺].

实施例9

在50mL单口茄形烧瓶中加入化合物2-1b（187.00mg,0.5mmol）、LiOH·H₂O（126.00mg,3.0mmol）、2mL无水甲醇、2mL THF及1mL H₂O，反应液为淡黄色澄清透明液，室温反应3h。向反应液中加入用无水MeOH预处理过的阳离子交换树脂(DowexX8,50～100目），搅拌15分钟后，过滤。滤液减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析（CHCl₃/MeOH=8/1,v/v）得57.00mg淡黄色油状液体，即为化合物2-1c（α/β混合物），收率69.5%。¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δ5.20(s,1H),4.53(d,J=8.0Hz,1H),3.91-3.79(m,4H),3.74-3.66(m,2H),3.38(t,J=9.2Hz,1H),3.11(t,J=9.2Hz,2H);¹³C NMR(100MHz,CD₃OD):δ95.8,91.9,76.6,75.1,71.7,71.2,70.8,70.2,68.1,63.9,61.3,61.2.MS(ESI)m/z 204.3[M-H]^-.

实施例10

在100mL单口茄形烧瓶中加入炔丙醇（3.50mL,60.5mmol）、Et₃N（11.70mL,121.0mmol）及50mL无水DMF，氩气保护下滴加(3-异氰酸酯基丙基)三乙氧基硅烷（3.00g,12.1mmol），反应液为淡黄色澄清透明液，滴加完毕，室温反应18h。停止反应，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析（PE/EtOAc=8/1,v/v）得2.10g淡黄色粘稠状液体，即为化合物2-2a，收率57.2%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ4.68(s,2H),3.80-3.85(m,6H),3.19-3.23(m,2H),2.47(s,1H),1.60-1.68(m,2H),1.24(t,J=6.8Hz,9H),0.64(m,2H);¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ155.4,78.4,74.4,58.5,52.3,43.5,23.2,18.3,14.7,7.6.

实施例11

在2000mL烧瓶中加入正十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（3.00g,8.2mmol）及1440mL的去离子水，搅拌下加入2mol/L NaOH水溶液（10.50mL,21.0mmol），加热至80℃，CTAB基本溶解，反应液呈无色澄清透明溶液。向该反应液中滴加正硅酸乙酯（TEOS）（15.00mL,67.3mmol），1小时内滴加完毕，于80℃反应2h。停止加热，趁热过滤，滤饼分别用去离子水和无水甲醇洗三次。将滤饼置于90℃烘箱内干燥8h，得4.85g白色粉状固体P1。

实施例12

在500mL单口圆底烧瓶中加入18.00mL 37.4%的浓盐酸、320mL无水甲醇和3.00g含有模板CTAB的介孔氧化硅纳米粒子P1，加热至回流，反应24h。停止反应，抽滤，滤饼用无水甲醇多次洗涤后置于红外烘箱中干燥，得2.14g白色粉末状固体P2。

实施例13

在100mL单口茄形烧瓶中加入化合物2-2a（1.36g,4.5mmol）及30mL无水甲苯，搅拌溶解后为淡黄色澄清透明溶液，加入1.00g上述制备的介孔氧化硅纳米粒子P2，Ar气保护下加热至回流，反应24h。停止反应，抽滤，滤饼依次用正己烷、二氯甲烷、丙酮、无水甲醇及水洗涤后置于红外烘箱中干燥，得1.27g淡黄色粉末状固体P3。由元素分析结果计算可得，P3表面小分子固载量约为1.21mmol/g（根据C、N含量进行计算，粒子P2中C、N含量分别为2.56%和<0.3%；粒子P3中C、N含量分别为12.74%和2.10%)。

实施例14

在50mL单口茄形烧瓶中加入化合物2-1c（60.00mg,0.3mmol）、214.00mg上述制备的介孔氧化硅纳米粒子P3及6mL水，向此淡黄色浑浊液中加入用4mL水溶解的CuSO₄·5H₂O（150.00mg,0.6mmol），然后缓慢滴加进入用10mL水溶解的抗坏血酸钠（1.19g,6.0mmol），滴加完毕后室温搅拌下过夜反应。停止反应，过滤，滤饼用大量水洗，置于红外烘箱中干燥，得270.00mg淡黄色粉末状固体P4。由元素分析结果计算可得，P4表面小分子固载量约为0.56mmol/g（根据C、N含量进行计算，粒子P2中C、N含量分别为2.56%和<0.3%；粒子P4中C、N含量分别为11.08%和3.12%)。

实施例15

在50mL单口茄形烧瓶中加入罗丹明B（240.00mg,0.2mmol）及25mL水，搅拌溶解后为玫红色溶液，加入700.00mg上述制备的介孔氧化硅纳米粒子P4，氩气保护下室温反应24h。停止反应，抽滤，滤饼用水多次洗涤后置于红外烘箱中干燥，得720.00mg玫红色粉末状固体P5。

实施例16

在50mL单口茄形烧瓶中加入210.00mg葡萄糖氧化酶（GOD）及15mL水，搅拌溶解后为淡黄色澄清透明溶液，加入400.00mg上述制备的介孔氧化硅纳米粒子P5，氩气保护，冰浴下反应24h。停止反应，反应液离心，用水多次洗涤后置于冷冻干燥机中干燥，得520.00mg粉红色粉末状固体P6。

实施例17

在50mL单口茄形烧瓶中加入喜树碱（488.00mg,1.4mmol）及25mLDMSO，搅拌溶解后为淡黄色溶液，加入1.8g上述制备的介孔氧化硅纳米粒子N3，氩气保护下室温反应24h。停止反应，抽滤，滤饼用水多次洗涤后置于红外烘箱中干燥，得1.91g淡黄色粉末状固体S4。

实施例18

在25mL单口茄形烧瓶中加入32mg辣根过氧化物酶（HRP）及10mL水，搅拌溶解后为棕黄色澄清透明溶液，加入200.00mg上述制备的介孔氧化硅纳米粒子S4，氩气保护下，冰浴下反应24h。停止反应，反应液离心，用水多次洗涤后置于冷冻干燥机中干燥，得140.00mg黄色粉末状固体S5。

实施例19

在50mL单口茄形烧瓶中加入喜树碱（69.67mg,0.2mmol）及25mLDMSO，搅拌溶解后为淡黄色溶液，加入700.00mg上述制备的介孔氧化硅纳米粒子P4，氩气保护下室温反应24h。停止反应，抽滤，滤饼用水多次洗涤后置于红外烘箱中干燥，得726.00mg淡黄色粉末状固体M5。

实施例20

在50mL单口茄形烧瓶中加入210.00mg葡萄糖氧化酶（GOD）及15mL水，搅拌溶解后为淡黄色澄清透明溶液，加入400.00mg上述制备的介孔氧化硅纳米粒子M5，氩气保护，冰浴下反应24h。停止反应，反应液离心，用水多次洗涤后置于冷冻干燥机中干燥，得520.00mg淡黄色粉末状固体M6。

实施例21

取两个小烧杯A、B，均加入3mL PBS缓冲液，然后在A烧杯中加入6mg介孔氧化硅纳米粒子N4，B烧杯中加入6mg介孔氧化硅纳米粒子N5。浸泡一定时间后离心，连续测定上清液的紫外吸收强度变化。80分钟后在烧杯B中加入一定量的鲁米诺溶液，继续测定离心后上清液的紫外吸收强度变化。所得结果如图2所示。未经HRP封闭的N4粒子在PBS缓冲液中释放非常迅速，70分钟后释放便达到了稳定。而介孔口已被HRP堵上的N5粒子则在很长一段时间内几乎没有释放，表明HRP可以有效地与4-氨基安替比林结合从而堵上介孔。向含有N5的测试液中加入鲁米诺溶液后，随时间的增加，吸收度逐渐增强，在360分钟时趋于稳定，释放基本完毕。表明鲁米诺可以成功地与4-氨基安替比林竞争性结合HRP，使介孔打开，罗丹明B分子逐渐释放到PBS缓冲液中。

实施例22

取三个小烧杯A、B、C，均加入3mL PBS缓冲液及4mg介孔氧化硅纳米粒子N5，浸泡一定时间后离心，连续测定上清液的紫外吸收强度变化。80分钟后在烧杯B中加入0.1mol/L鲁米诺溶液1微升，烧杯C中加入0.1mol/L鲁米诺溶液10微升，继续测定离心后上清液的紫外吸收强度变化。所得结果如图3所示。在没有鲁米诺存在时，粒子N5在300分钟内基本没有释放；而加入鲁米诺溶液后，随着时间的增加，吸收强度逐渐增强，且鲁米诺浓度较高时，吸收强度增加较快，释放达到平衡时，总的吸收强度更大。表明鲁米诺浓度较高时，竞争性结合速度更快，相同时间内更多的介孔被打开，罗丹明B分子释放更多。综合图2及3可知，N5具有优良的控释性能。

实施例23

取两个小烧杯A、B，均加入3mL PBS缓冲液，然后在A烧杯中加入6mg介孔氧化硅纳米粒子P5，B烧杯中加入6mg介孔氧化硅纳米粒子P6。浸泡一定时间后离心，连续测定上清液的紫外吸收强度变化。80分钟后在烧杯B中加入150微升1mmol/L的葡萄糖溶液，继续测定离心后上清液的紫外吸收强度变化。所得结果如图4所示，未经封闭的P5粒子在PBS缓冲液中释放非常迅速，60分钟后释放基本完毕；而介孔口已被葡萄糖氧化酶堵上的P6粒子则在很长一段时间内几乎没有释放。这说明葡萄糖氧化酶可以有效地与2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖上的羟基位点结合从而堵上介孔。如图4所示，80分钟时向含有P6的测试样品中加入葡萄糖溶液，随着时间的增加，紫外吸收强度逐渐增大，表明葡萄糖已成功结合葡萄糖氧化酶使介孔打开，罗丹明B分子逐渐释放到PBS缓冲液中。350分钟左右紫外吸收强度趋于稳定，表明葡萄糖已与葡萄糖氧化酶充分反应，释放完毕。

实施例24

取两个小烧杯A、B，均加入3mL PBS缓冲液及6mg介孔氧化硅纳米粒子P6，浸泡一定时间后离心，连续测定上清液的紫外吸收强度变化。80分钟后在烧杯B中加入1微升1mmol/L的葡萄糖溶液，连续测定离心后上清液的紫外吸收强度变化。一段时间后，再加入14微升1mmol/L的葡萄糖溶液，继续测定离心后上清液的紫外吸收强度变化。所得结果如图5所示，80分钟时向含有P6的测试样品中加入少量葡萄糖溶液，随着时间的增加，吸收强度逐渐增强，在140分钟时达到平台，说明已有葡萄糖已与葡萄糖氧化酶充分反应，而后在260分钟时另加入葡萄糖溶液，紫外吸收强度继续增大，在325分钟时再次达到平台。说明粒子上仍有部分葡萄糖氧化酶未被反应，在接触到葡萄糖分子时，陆续被竞争性结合下来，越来越多的介孔被打开，使得越来越多的罗丹明B分子进入到PBS缓冲液中，直至葡萄糖与葡萄糖氧化酶反应充分。综合图4及5可知，P6具有优良的控释性能。

实施例25

分别配制10mmol/L的D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖溶液。取四个小烧杯A、B、C、D，均加入3mL PBS缓冲液及6mg介孔氧化硅纳米粒子P6，浸泡一定时间后离心，连续测定上清液的紫外吸收强度变化。待紫外吸收强度稳定后，在烧杯A中加入30微升1mmol/L葡萄糖溶液，烧杯B、C、D中分别加入30微升10mmol/L的D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖溶液，静置24h，离心，测定上清液的紫外吸收强度。所得结果如图6所示。由图可知，在相同的测试条件下，相对D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖等单糖而言，介孔氧化硅纳米粒子P6对葡萄糖有较好的选择性。

实施例26

取两个小烧杯A、B，均加入3mL PBS缓冲液，然后在A烧杯中加入6mg介孔氧化硅纳米粒子S4，B烧杯中加入6mg介孔氧化硅纳米粒子S5。浸泡一定时间后离心，连续测定上清液的喜树碱浓度变化。80分钟后在烧杯B中加入一定量的鲁米诺溶液，继续测定离心后上清液的喜树碱浓度变化。未经封闭的S4粒子在PBS缓冲液中释放非常迅速，70分钟后释放基本完毕，释放量为98.45%；而介孔口已被辣根过氧化物酶封闭的S5粒子则在很长一段时间内几乎没有释放，80分钟时向含有S5的测试样品中加入鲁米诺溶液，随着时间的增加，喜树碱浓度逐渐增大，400分钟左右喜树碱浓度趋于稳定，累计释放量为94.59%。

实施例27

取两个小烧杯A、B，均加入3mL PBS缓冲液，然后在A烧杯中加入6mg介孔氧化硅纳米粒子M5，B烧杯中加入6mg介孔氧化硅纳米粒子M6。浸泡一定时间后离心，连续测定上清液的喜树碱浓度变化。80分钟后在烧杯B中加入150微升1mmol/L的葡萄糖溶液，继续测定离心后上清液的喜树碱浓度变化。未经封闭的M5粒子在PBS缓冲液中释放非常迅速，65分钟后释放基本完毕，释放量为99.32%；而介孔口已被葡萄糖氧化酶封闭的M6粒子则在很长一段时间内几乎没有释放，80分钟时向含有M6的测试样品中加入葡萄糖溶液，随着时间的增加，喜树碱浓度逐渐增大，380分钟左右喜树碱浓度趋于稳定，累计释放量为96.33%。

虽然以具体实施例的方式描述了本发明，但应理解，本发明的范围并不限于上述具体实施方式。在不偏离本发明精神和范围的情况下，本领域技术人员可对本发明做出各种修改和变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

Claims (11)

1.一种可用于控制释放的基于介孔氧化硅的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子含有经小分子抑制剂功能化的介孔氧化硅纳米粒子和与所述小分子抑制剂结合的堵孔剂；

其中，所述小分子抑制剂与所述堵孔剂的结合亲和力小于所述堵孔剂与底物的结合亲和力；

其中，所述小分子抑制剂选自：4-氨基安替比林，2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，氨酪酸，HMG-CoA，二氢叶酸或乙酰胆碱；所述堵孔剂选自：辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，伴刀豆球蛋白，GABA转氨酶，HMG-CoA还原酶，二氢叶酸还原酶，或乙酰胆碱酯酶；和所述底物选自：鲁米诺，葡萄糖，2-氨基-3-炔基丁酸，洛伐他汀，甲氨蝶呤或毒扁豆碱。

2.如权利要求1所述的可用于控制释放的基于介孔氧化硅的纳米粒子，其特征在于，所述介孔氧化硅纳米粒子的粒径为80～500nm。

3.如权利要求1所述的可用于控制释放的基于介孔氧化硅的纳米粒子，其特征在于，所述经小分子抑制剂功能化的介孔氧化硅纳米粒子选自：

和

式中，MCM-41指未修饰的介孔氧化硅纳米粒子。

4.如权利要求1－3中任一项所述的可用于控制释放的基于介孔氧化硅的纳米粒子，其特征在于，所述介孔氧化硅纳米粒子是阳离子表面活性剂与正硅酸乙酯的反应产物。

5.如权利要求4所述的可用于控制释放的基于介孔氧化硅的纳米粒子，其特征在于，所述介孔氧化硅纳米粒子是十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯的反应产物。

6.如权利要求1－3中任一项所述的可用于控制释放的基于介孔氧化硅的纳米粒子，其特征在于，所述可用于控制释放的基于介孔氧化硅的纳米粒子还含有药物。

7.如权利要求4所述的可用于控制释放的基于介孔氧化硅的纳米粒子，其特征在于，所述可用于控制释放的基于介孔氧化硅的纳米粒子还含有药物。

8.一种基于介孔氧化硅纳米粒子的控制释放系统，其特征在于，所述控制释放系统含有权利要求1-7中任一项所述的纳米粒子。

9.一种权利要求1-5中任一项所述的基于介孔氧化硅的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a1)将所述介孔氧化硅纳米粒子分散在溶剂中，用所述小分子抑制剂对其表面进行功能化；

(a2)将所述表面经小分子抑制剂功能化的介孔氧化硅纳米粒子分散在溶剂中，与所述堵孔剂充分反应，将介孔堵上，即得到所述基于介孔氧化硅的纳米粒子。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(a1)所述介孔氧化硅纳米粒子采用水热法制备。

11.如权利要求9-10中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的溶剂选自甲苯、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、水或其混合物。