CN107753946B - 一种适配体修饰的靶向载药纳米粒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适配体修饰的靶向载药纳米粒及其制备方法和应用,该靶向载药纳米粒是以介孔二氧化硅纳米粒为载体,在其孔道内部包载抗癌药物和光敏剂,并在其表面修饰能识别癌细胞表面特异性蛋白的核酸适配体。该靶向载药纳米粒能靶向识别肿瘤细胞并发挥化疗/光动力治疗的联合疗效,可用于制备抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种核酸适配体修饰的装载有抗癌药物阿霉素(DOX)和光敏剂血卟啉(Hp)的介孔二氧化硅载药纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是一种威胁全球公共健康的疾病,而且至今难以治愈。肿瘤单一药物化疗的效果往往达不到理想的肿瘤治疗效果,且容易导致耐药。因此,肿瘤的药物化疗与其他的抗肿瘤治疗方法,如光热治疗和光动力治疗等的联合治疗具有明显优势。同时,肿瘤细胞表面具有许多的特异性蛋白,如EGFR、EpCAM、HER2等,而这些蛋白在正常细胞中不表达或者表达量很低。因此,其可作为肿瘤治疗药物作用的靶点。
光动力疗法是近年来广泛运用的肿瘤消融方法,已被运用于多种浅表肿瘤。在有效杀伤癌组织的情况下,光动力疗法有创伤小、选择性杀伤肿瘤细胞、毒副作用小、抗癌谱广、可重复治疗、可姑息治疗、消灭隐性癌病灶等优点。但由于光敏剂被肿瘤组织选择性吸收、贮存的特异性不够高等缺点,使该疗法的杀伤范围较局限。
阿霉素(DOX)是一种广谱的抗肿瘤药物,可以抑制肿瘤细胞DNA和RNA的合成,对各种周期的肿瘤细胞都有杀伤作用。血卟啉(Hp)是由血红蛋白酸水解后产生的内源卟啉,可用作光敏剂和激光联合应用。光敏剂可吸收光子的能量跃迁到激发态,激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧,生成活性很强的单态氧,单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应,产生肿瘤细胞毒性作用,进而导致肿瘤细胞受损乃至死亡,但对人体正常细胞毒性低。
核酸适配体是一段能特异性识别癌细胞表面靶点的DNA或RNA序列,与传统抗体相比,它具有体积小、生物相容性好、稳定、易于大规模合成等优点。在作为靶向基团时,核酸适配体由于体积较小,产生的位阻很少,从而加大了和靶点的结合能力。
介孔二氧化硅纳米粒(MSN)是一种广泛用于疾病的诊断和治疗的纳米材料。它独特的介孔结构、可变的粒径、良好的生物相容性和稳定的化学特性,让MSN成为一种理想的纳米载体。
基于以上背景,本发明设计了一种以核酸适配体为靶向基团的靶向载药纳米粒,其是通过在MSNs中装载化疗药物DOX和光敏剂Hp并在MSNs表面修饰一种核酸适配体,使其具有识别靶细胞的能力,并能发挥化疗和光动力治疗的联合疗效,可用于肿瘤治疗。
发明内容
本发明针对肿瘤化疗与光动力治疗的联合治疗比单一药物治疗具有明显优势,但目前存在靶向给药载体特异性差、光动力治疗特异性不够高等缺点,合成了一种适配体修饰的靶向载药纳米粒,其能够发挥化疗/光动力治疗的联合疗效,并具有核酸适配体的特异性识别能力,能够增加给药载体对肿瘤细胞的靶向识别能力,从而实现对肿瘤细胞的准确给药、准确释放光敏剂的效果。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种适配体修饰的靶向载药纳米粒,其是以介孔二氧化硅纳米粒为载体,在其孔道内部包载抗癌药物和光敏剂,并在其表面修饰能识别癌细胞表面特异性蛋白的核酸适配体,使其具有靶向能力。
所述介孔二氧化硅纳米粒的粒径为100-400 nm。
所述抗癌药物为阿霉素(DOX),其装载量为10wt%-30wt%;所述光敏剂为血卟啉(Hp),其装载量为1wt%-5wt%。
核酸适配体的连接量为10-100 pmol/mg。
所述适配体修饰的靶向载药纳米粒的制备方法,是将介孔二氧化硅纳米粒表面经氨基化修饰后,与能特异性识别癌细胞表面EGFR的核酸适配体E-Apt连接,再将抗癌药物DOX和光敏剂Hp载入介孔二氧化硅纳米粒的孔道中,制得所述适配体修饰的靶向载药纳米粒;其具体包括以下步骤:
1)在碱性条件下将十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯混合反应,并在酸性醇溶液下回流去除模板剂十六烷基三甲基溴化铵,得到羟基修饰的纳米粒MSN-OH;
2)利用3-氨丙基三乙氧基硅烷对所得MSN-OH进行修饰,得到氨基修饰的纳米粒MSN-NH2;
3)在EDC/NHS作用下,将所得MSN-NH2与靶向EGFR的核酸适配体E-Apt进行共价连接,得到适配体修饰的纳米粒E-MSN;
4)在磷酸缓冲液中,将所得E-MSN与DOX及Hp混合进行装载,得到靶向载药纳米粒E-MSN-DH。
所述适配体修饰的靶向载药纳米粒可用于制备抗肿瘤药物。
本发明一方面以MSN作为药物阿霉素和光敏剂血卟啉的载体,以达到运载药物并发挥化疗/光动力治疗联合疗效的目的;另一方面以核酸适配体作为靶向基团对MSN进行修饰,使其具有靶向目标细胞的能力,从而达到靶向给药、靶向释放光敏剂的目的。
本发明的效益在于:
(1)本发明以MSN作为药物载体进行氨基修饰,使其能有效包载带羧基的血卟啉,而利用血卟啉的羧基与阿霉素的氨基作用,可使两种药物有效包载入MSN孔道中,并能通过控制纳米粒的粒径很好的控制阿霉素与血卟啉的装载和释放;
(2)本发明利用核酸适配体做为靶向基团修饰于MSN表面,能够使装载的药物有效靶向人体内的肿瘤细胞,使其死亡。
(3)本发明所用到的核酸适配体和光敏剂可以针对不同的靶细胞、不同细胞表面的特异性抗原和不同的肿瘤部位、肿瘤大小而进行可以改变,因此可适用于治疗多种癌症。
附图说明
图1为本发明实施例4制备的E-MSN-DH的粒径分布图。
图2为本发明实施例4制备的E-MSN-DH与DOX的紫外吸收对比图。
图3为本发明实施例4制备的E-MSN-DH与Hp的荧光对比图。
图4为本发明实施例4制备的E-MSN-DH和MSN-DH在PC-9细胞中的摄取情况比较图。
图5为本发明实施例4制备的MSN-DH和E-MSN-DH的体外细胞毒性实验。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
实施例1
取1.0 g十六烷甲基三甲基溴化铵(CTAB),溶于480 mL超纯水中,80℃条件下不断搅拌,然后缓慢滴加3.5 mL NaOH溶液(2M),随后逐滴加入5 mL TEOS(加入时间要大于10min),80℃继续反应2 h;反应结束后,待反应液冷却到室温,过滤得到白色沉淀,分别用二次水和甲醇各洗3次,将沉淀分散于酸性乙醇(浓盐酸:乙醇=5:1,v/v)中加热回流24小时,回流结束后离心分离以去除未反应的模板剂CTAB,将所得的固体物质冷冻干燥,得到白色固体MSN-OH。
实施例2
取1.0 g实施例1所得MSN-OH,溶于30 mL无水甲苯中,130℃条件下不断搅拌,随后逐滴加入0.6 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),130 ℃条件下继续搅拌17 h;反应结束后,待反应液冷却到室温,过滤,所得固体用甲苯洗3次,再将所得的固体物质干燥,即可得到MSN-NH2。
实施例3
分别将7 mmoL羧基修饰的靶向EGFR的核酸适配体E-APt与8 mg的EDC、8 mg的NHS加入到5 mL的超纯水中,搅拌15 min后加入10 mg实施例2所得MSN-NH2,再继续搅拌12 h;然后将反应混合液在15000 rpm下离心10 min,移除上清,干燥,得E-MSN。
实施例4
称取DOX及Hp,避光混合溶于PBS中,制得浓度均为0.5 mg/mL的母液;然后将5 mg实施例3所得E-MSN加入到母液中,避光搅拌24 h后在8000 rpm下离心10min,得E-MSN-DH;取上清测定DOX和Hp的含量,DOX和HP的装载量分别为:182.5mg/g和15.7mg/g。所得E-MSN-DH的粒径分布如图1所示。
分别将E-MSN-DH与DOX溶于二甲亚砜,分别测定其紫外吸收,结果如图2所示。由图2可见,DOX在495nm处有特征吸收峰,E-MSN-DH在499nm处有紫外吸收峰,表明DOX已经成功装载到E-MSN上。
分别将E-MSN-DH与Hp溶于二甲亚砜,于激发波长402nm处测定其荧光光谱,结果如图3所示。由图3可见,E-MSN-DH在627nm处有Hp的特征峰,表明Hp已成功装载到E-MSN上。
称取DOX及Hp,避光混合溶于PBS中,制得浓度均为0.5 mg/mL的母液;然后将5 mg未经处理的MSN加入到母液中,避光搅拌24 h后在8000 rpm下离心10min,得MSN-DH作为对照。
实施例5
以人非小细胞肺癌细胞系PC-9细胞为测试细胞系。
细胞培养方法:从液氮罐中取出PC-9细胞保种管,在37℃水浴锅中快速溶化解冻,然后1000 rpm离心5 min,吸弃上清液,用1 mL 1640完全培养液将细胞沉淀吹打均匀,转移至培养瓶中,加入4mL 1640培养基后,置于37℃、5% CO2的培养箱中培养24h。
培养结束后,将PC-9细胞消化后铺到6孔板上,待细胞贴壁后,移除培养基,分别与5μg/mL的MSN-DH、E-MSN-DH在37 ℃下孵育2 h;然后用预冷的PBS洗涤2遍,消化后采用流式细胞仪进行分析,结果如图4所示。由图4可见,E-MSN-DH与靶细胞PC-9的识别能力明显高于MSN-DH纳米粒子。
实施例6 细胞毒性实验
选取对数期且生长状态良好的PC-9细胞,经胰蛋白酶消化后,使得细胞浓度为0.5-1×105个/mL,配制成细胞悬液;然后按每孔100 µL细胞悬液的量接种到96孔板,培养24h后加入游离DOX和Hp、MSN-DH和E-MSN-DH(保持各组中DOX和Hp的量相等);另设溶剂对照组和空白对照组,并将实验组分为用或不用近红外光(NIR)照射,用于比较光动力的治疗效果。孵育24h后,吸弃旧培养基,PBS洗3遍,并于每孔中加入90 µL无血清、无酚红的1640培养基和10 µL MTT溶液,继续孵育4 h后,小心吸弃上清液,于每孔中加入150 µL二甲基亚砜,避光振荡10min,使蓝紫色结晶全部溶解,用多功能酶标仪于570 nm波长处测定各孔的吸收度,并按下式计算细胞的存活率:
存活率(%)=(实验组吸收值-溶剂对照组吸收值)/(空白组吸收值-溶剂对照组吸收值)。
纳米粒的细胞毒性结果如图5所示。从图5中可以看出,无论是否使用近红外光照射,E-MSN-DH的细胞毒性均比MSN-DH和D+H强,这表明纳米粒靶向PC-9细胞,可增强其治疗效果;而与D+H和D+H+NIR的差值(D+H和D+H+NIR实验组的细胞存活率分别为85.8%和77%)相比,E-MSN-DH与E-MSN-DH+NIR的差值明显增大(E-MSN-DH和E-MSN-DH+NIR实验组的细胞存活率分别为32.2%和11.5%),说明与D+H和D+H+NIR相比,E-MSN-DH+NIR对PC-9细胞的毒性较E-MSN-DH显著提高,这表明在靶向的基础上联合光动力治疗,可明显增强其抗肿瘤效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种适配体修饰的靶向载药纳米粒的制备方法,其特征在于:将介孔二氧化硅纳米粒表面经氨基化修饰后,与能识别癌细胞表面特异性蛋白的核酸适配体连接,再将抗癌药物和光敏剂载入介孔二氧化硅纳米粒的孔道中,制得所述适配体修饰的靶向载药纳米粒,其具体包括以下步骤:
1)在碱性条件下将十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯混合反应,并在酸性醇溶液下回流去除十六烷基三甲基溴化铵,得到羟基修饰的纳米粒MSN-OH;
2)利用3-氨丙基三乙氧基硅烷对所得MSN-OH进行修饰,得到氨基修饰的纳米粒MSN-NH2;
3)在EDC/NHS作用下,将所得MSN-NH2与靶向癌细胞表面特异性蛋白的核酸适配体进行共价连接,得到适配体修饰的纳米粒E-MSN;
4)在磷酸缓冲液中,将所得E-MSN与抗癌药物及光敏剂混合进行装载,得到靶向载药纳米粒E-MSN-DH;
所述抗癌药物为DOX,其装载量为10wt%-30wt%;所述光敏剂为Hp,其装载量为1wt%-5wt%。
2. 根据权利要求1所述适配体修饰的靶向载药纳米粒的制备方法,其特征在于:所述介孔二氧化硅纳米粒的粒径为100-400 nm。
3. 根据权利要求1所述适配体修饰的靶向载药纳米粒的制备方法,其特征在于:核酸适配体的连接量为10-100 pmol/mg。
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